KR20030089637A - Ｂ형 간염 바이러스 유전자의 표적화된 통합에 의한간세포 암종을 유도하기 위한 마우스 모델 - Google Patents

Ｂ형 간염 바이러스 유전자의 표적화된 통합에 의한간세포 암종을 유도하기 위한 마우스 모델 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간세포 암종의 마우스 모델, 및
a) 관심의 외래 유전자를 표적 부위와 상동인 서열을 갖는 적합한 벡터에 삽입하여, 재조합 표적 벡터를 제작하고;
b) 상기 단계 a)로부터의 표적 벡터를 사용하여 연구된 동물의 ES 세포를 형질감염시키고, 상기 외래 유전자가 특정 부위에 통합된 표적화된 ES 세포를 선별하고;
c) 상기 단계 b)로부터 수득된 표적화된 ES 세포를 상기 동물의 포배에 주입하고 상기 포배를 생체 외에서 배양하여 표적화된 ES 세포를 갖는 배아를 생성시키고;
d) 상기 단계 c)로부터 생성된 배아를 상기 동물의 자궁에 이식하여 상기 외래 유전자를 안정하게 발현하는 자손을 발육시킴
을 포함하는 동물 모델의 확립 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 간세포 암종 발병의 탐색, 그의 조기 진단 및 치료, 및 항암약물의 선별에서 상기 트랜스제닉 마우스의 용도에 관한 것이다.

Description

Ｂ형 간염 바이러스 유전자의 표적화된 통합에 의한 간세포 암종을 유도하기 위한 마우스 모델{A MOUSE MODEL FOR INDUCING HEPATOCELLULAR CARCINOMA BY TARGETED INTEGRATION OF HEPATITIS B VIRUS GENES}
본 발명은 트렌스제닉 동물 모델 및 상기와 같은 모델의 확립 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 관심의 외래 유전자를 배아 줄기(ES) 세포 배양 및 동종 재조합에 의해 동물 게놈에 통합시켜 상기 외래 유전자가 안정하게 발현되는 동물 모델을 생성시키는 방법뿐만 아니라, 상기 방법에 의해 수득된 동물 모델에 관한 것이다.
간세포 암종(HCC)은 세계적으로, 특히 중국을 포함한 아시아와 태평양 지역에 분포된 손꼽히는 악성 질병들 중 하나이다. 매년 백만 명 이상에서 HCC가 발병되는데(Bosch FX, Munoz N. Epidemiology of hepatocellular carcinoma. In: Bannsch P, Keppler D, eds. Liver cell carcinoma. Dordrecht: Kluwer Academic, 1989:3-12), 이중 5 년 생존율이 5% 이하이다. 다수의 병인들, 특히 B형 간염 바이러스(HBV) 감염이 HCC의 발병 및 진행에 관계가 있다. HBV는 환상의 부분 이중 가닥 DNA를 함유하고 RNA 중간체를 통해 복제하는 대략 3.2 kb의 전체 길이를 갖는 DNA 바이러스에 속한다. HBV는 숙주 게놈에 랜덤하게 통합될 수 있으며, 상기 HBV 통합 숙주를 보균자라 칭하고, 상기 보균자는 증상은 없으나 B형 간염 표면 항원(HBsAg)이 발현된 만성 감염 상태에 있다. 세계적으로 3억 5천만 명 이상이 HBV 만성 보균자이며(Zuckerman A.J. More than third of world's population has been infected with hepatitis B virus[Letter]. Br. Med. J. 1999 318:1213), 75% 이상이 아시아와 서 태평양에 존재하는 것(Gust ID. Epidemiology of hepatitis B infection in the Western Pacific and South East Asia. Gut 1996 38(suppl 2): s18-s23)으로 추정되었다. 이들 보균자 중에서 약 20% 이상이 다양한 정도의 만성 간염과 간 경화를 나타내며, 이들 중 일부는 1 차 간세포 암종이 나타날 수도 있다. 임상적 및 전염병학 연구는 HCC에 걸릴 위험성이 HBV 만성 보균자에서 40 내지 50% 정도로 높음을 입증하였다. 간세포 암종에 대해서, 최선의 임상적 접근법은 간암종의 조기 절제술이며, 따라서 조기 진단이 상당히 중요한 것으로 보인다. 그러나, HCC가 나타날 가능성이 있는 보균자를 가장 조기에 진단하는데 편리하게 사용될 수 있는 혈청 또는 간 중의 분자 표지가 아직까지 발견되지 않았다. HBV 유도된 HCC에 원인이 되는 병리학 및 분자 기전에 대한 추가의 연구는 상기와 같은 간 암종의 조기 진단에 큰 의미를 갖는다.
간 세포 암종의 유발 및 진행은 다수의 인자들을 포함한 복잡한 과정이며, 이는 비정상적인 유전자 발현 또는 돌연변이와 이들간의 상호작용과 관련된다.HBV 감염 후, HBV 유전자 발현 산물과 간세포 단백질 또는 핵산간의 상호작용은 정상적인 유전자 발현 및 신호 전달을 방해하여, 원종양유전자의 비정상적인 발현을 촉발시키거나, 또는 종양 억제 유전자를 기능적으로 불활성화시켜 간세포의 비정상적인 성장과 분화를 도출시키고, 최종적으로 간세포 암종을 유발할 수 있다. 그러나, 지금까지 HBV의 표적은 명확하지가 않다. HBV는 통상적으로 배양 세포도, 통상적인 실험 동물들(침팬지가 유일하게 감수성인 실험 동물이다)도 감염시키지 않으므로, HBV 병인에 대한 연구가 어느 정도 제한되어 왔다. 트랜스제닉 동물 기법은 HBV 병인을 연구하는데 새로운 접근법을 제공한다. 키사리와 바비넷(Chisari FV, Pinkert CA, et al. A transgenic mouse model of the chronic hepatitis B surface antigen carrier state. Science 1985 230:1157-1160; and Babinet C, Farza H, et al. Specific expression of hepatitis B surface antigen(HBsAg) in transgenic mice, Science 1985 230:1160-11)은 1985년에 트랜스제닉 기법을 사용하여 다수의 HBV 트랜스제닉 마우스 모델을 성공적으로 확립시켰으며, 이때 이후로 상기와 같은 마우스 모델에 대한 연구는 HBV 유도된 간세포 암종의 병리와 분자 기전에 대한 이해를 크게 증진시켰다. 그러나, 상기와 같은 트랜스제닉 마우스는 전통적인 트랜스제닉 기법에 의해 개발되었으며 이들 중의 외래 유전자는 랜덤하게 염색체 내로 통합되어, 종종 표현형 차이를 생성시키고 표현형 분석을 어느 정도 어렵게 만든다. 따라서, HBV 유도된 HCC의 분자 기전에 대한 최종적인 결론은 아직 이루어지지 않고 있다. 전체 HBV 게놈이 통합된 트랜스제닉 마우스에 대한 국내의 보고서가 공개되었지만, 간 암종에 대한 성공적인 트랜스제닉 마우스 모델에 대한 보고는 지금까지 없다.
80년대 말 이래로, 유전자 표적화 기법을 기본으로 하여 유전자 노크-인(knock-in) 기법이 개발되었으며, 상기 기법은 외래 유전자를 마우스 게놈 상의 특정 부위에 통합시키기 위해 동종 재조합 및 마우스 ES 세포 배양 기술을 사용하여 전통적인 트랜스제닉 기법의 맹점을 제거한다. 뎅(Deng CX, Zhang P, et al. Mice lacking p21CMP/WAP1undergo normal development, but are defective in G1 checkpoint control. Cell 1995 82:675-684)은 마우스가 정상적으로 발육되었고 p21 유전자 제거 후에 간에서 비정상적인 표현형이 존재하지 않음을 발견하였다. 더욱이, 인간 게놈 지도작성의 실행은 생명 과학에서 후 게놈 시기의 시작에 주목하게 하였으며, 단백질체학에 대한 연구가 기능유전체학의 연구에 중요한 도구가 되고 있다.
본 발명은
a) 관심의 외래 유전자를 표적 부위와 상동인 서열을 갖는 적합한 벡터에 삽입하여 재조합 표적 벡터를 제작하고;
b) 상기 단계 a)로부터의 표적 벡터를 사용하여 연구된 동물의 ES 세포를 형질감염시키고, 상기 외래 유전자가 특정 부위에 통합된 표적화된 ES 세포를 선별하고;
c) 상기 단계 b)로부터 수득된 표적화된 ES 세포를 상기 동물의 포배에 주입하고 상기 포배를 생체 외에서 배양하여 표적화된 ES 세포를 갖는 배아를 생성시키고;
d) 상기 단계 c)로부터 생성된 배아를 상기 동물의 자궁에 이식하여 상기 외래 유전자를 안정하게 발현하는 자손을 발육시킴
을 포함하는 동물 모델의 확립 방법에 관한 것이다.
도 1(a) 내지 (d)는 표적 벡터의 제작을 예시하며, 상기 벡터를 HBsAg 유전자를 트랜스제닉 마우스 게놈 상의 특정 부위에 통합시키는데 사용한다.
도 2(a) 내지 (d)는 표적 벡터의 제작을 예시하며, 상기 벡터를 HBV X 유전자를 트랜스제닉 마우스 게놈 상의 특정 부위에 통합시키는데 사용한다.
도 3은 HBsAg의 표적화된 통합을 함유하는 트랜스제닉 마우스로부터의 배아 줄기 세포의 서던 블럿 선별을 나타낸다.
도 4는 HBsAg의 표적화된 통합을 함유하는 트랜스제닉 마우스의 PCR 식별을 나타낸다.
도 5는 HBsAg의 표적화된 통합을 함유하는 트랜스제닉 마우스의 서던 블럿 식별을 나타낸다.
도 6은 HBsAg의 표적화된 통합을 함유하는 트랜스제닉 마우스의 노던 블럿 분석을 나타낸다.
도 7은 15 개월 된 마우스의 간 조직의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 나타낸다.
도 8은 15 개월 된 마우스의 간 조직의 PCNA 염색을 나타낸다.
도 9는 2 개월 된 마우스의 혈청 α-태아 단백질에 대한 시험을 나타낸다.
도 10(a) 내지 (d)는 상이하게 발현된 유전자들에 대한 노던 블럿 분석을 나타낸다.
도 11은 간 단백질의 2 차원(2D) 전기영동에 따른 겔 스캐닝 상을 나타낸다.
첫 번째 태양에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는 표적화 트랜스제닉 벡터의 제작에 관한 것이다:
pLoxpneo(Yang X, Li C, et al. The tumor suppressor SMAD4/DPC4 is essential for epiblast proliferation and mesoderm induction in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998 95:3667-3672)를 초기 표적 벡터로서 사용하고; p21 유전자의 제 2 엑손의 측면에 있는 대략 8 kb의 게놈 DNA 단편을 표적 벡터의 상동 서열로서 사용하였다. 외래 유전자(예를 들어 HBV, HCV, HIV 등으로부터의 바이러스 유전자, 예를 들어 HBsAg, HBX 등)를 p21 유전자의 제 2 엑손에 삽입하였다. 상기 요소를 표적화 트랜스제닉 벡터에 회합시킨 후에, 상기 벡터는 1) 표적화 부위의 상동 서열(이때 상기 표적화 부위는 p21 유전자 좌 또는 간세포에서 전사되고 발현된 다른 유전자 좌일 수 있다); 2) 외래 유전자, 양성 선별 표지(neo) 및 음성 선별 표지(tk)를 포함한다. 상기 외래 유전자는 전체 HBV 게놈, 개별적인 HBV 유전자이거나, 또는 다른 병인 미생물의 전체 게놈 또는 개별적인 게놈일 수 있다. 상기 양성 선별 표지는 neo 유전자 또는 다른 양성 선별 표지, 예를 들어 하이그로미신 B 포스포트랜스퍼라제(hph), 크산틴/구아닌 포스포트랜스퍼라제(gpt), 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(hprt) 등일 수 있다. 상기 음성 선별 표지는 tk 유전자 또는 다른 음성 선별 표지, 예를 들어 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제(HSVtk), 디프테로톡신(DT), 티미딘 키나제 등일 수 있다.
두 번째 태양에서, 본 발명은 하기의 프로토콜을 사용하는 표적화된 ES 세포의 제조에 관한 것이다:
상기 표적 벡터를 선형화하고, 이어서 일렉트로포레이션에 의해 ES 세포에 형질감염시켰다. 새로운 세포 배양 배지와 형질감염된 ES 세포를 혼합한 후에, 상기 ES세포를 영양 세포가 융합 증식된 플레이트에 분배시키고; 24 시간 후에, 상기 배지를 ES 세포의 선별을 위해 강사이클로비어 및 G418을 함유하는 선택 배지로 교환하였으며, 이때 이후로 새로운 선택 배지를 매일 교환하였다. 형질감염 7 일 후에, 세포 클론들을 선별하였다. 구체적으로 말하자면, ES 클론들을 단일 세포 현탁액으로서 분산시키고, 이어서 각각의 ES 클론으로부터의 단일 세포 현탁액을 2 개의 동등한 분액으로 분할하여 각각 영양 세포가 있는 2 개의 96-웰 플레이트 상에 재 도말하였다. 상기 2 개의 플레이트에 대해서, 각 클론들의 위치 및 순서는 동일하였다. 배지를 매일 새로운 ES 세포 배지로 갈고 2 내지 3 일간 배양시킨 후에, 하나의 플레이트는 동결시키고, 다른 것은 트립신 처리하였으며 상기 중의 ES 클론들을 24-웰 플레이트로 옮기고, 배지의 색상이 황색으로 변할 때까지 영양세포 배지에서 배양시켰다. 용해 완충액을 각 웰에 가하고, 이어서 용해된 세포 현탁액을 에펜도르프 튜브로 옮겼다. ES 세포로부터 추출하고 TE 용액에 완전히 용해시킨 후에, 게놈 DNA를 각각 EcoRI 및 BglII로 절단시키고, 생성된 절단물들에 대해 표적 벡터의 5' 단부 밖에 위치한 탐침을 사용하여 서던 블럿을 수행하였다. BglII에 의한 절단에 관하여, 대략 8 kb의 양성 밴드가 야생형 p21 대립 유전자에 대해 나타나는 반면, 상기 양성 밴드는 표적화된 p21 대립 유전자에 대해서는 9 kb로 이동할 것이며, 이는 동종 재조합 후에 원래 BglII 부위의 결실과 neo 유전자를 통한 또 다른 BglII 부위의 도입으로부터 발생된다. EcoRI에 의한 절단에 관하여, 대략 7.7 kb의 양성 밴드가 야생형 p21 대립 유전자에 대해 나타나는 반면, 상기 양성 밴드는 표적화된 p21 대립 유전자에 대해서는 22 kb로 이동할 것이며, 이는 동종 재조합 후에 원래 EcoRI 부위의 결실로부터 발생된다. 양성 밴드 위치가 변경된 ES 세포는 외래 유전자를 함유하는 것이었다.
세 번째 태양에서, 본 발명은 하기 개시되는 바와 같이, 표적화된 ES 세포를 함유하는 트랜스제닉 동물의 제조 방법에 관한 것이다:
먼저, 흥분되지 않은 4 내지 5 주 된 암컷 C57BL/6J 마우스에 5IU 고나도트로핀을 복강 내 주입하였다. 최종 고나도트로핀 주입 48 시간 내에, 상기 마우스에게 5IU 인간 융모막 고나도트로핀을 복강 내 주입하여 상기 마우스를 과 배란시키고, 이어서 강한 수컷 마우스의 우리로 옮겨 이들을 교미시켰다. 3.5 일 후에, 자궁 중의 포배를 수거하였다.
이러는 동안, 주입할 ES 세포를 수 일 전에 해동시키고, 배지를 주입 당일아침에 새로운 ES 배지로 교환하였다. 1 내지 2 시간 후에, 세포를 트립신으로 처리하고 생성된 단일 세포를 브린스터(Brinster)의 BMOC-3 배지에 현탁액으로서 보관하고, 이어서 12 내지 15 개의 작고 둥근 ES 세포를 주입 피펫에 의해 흡입하고, 현미경 하에서 주입 펌프를 밀어내어 ES 세포가 차례차례로 포배강 내로 들어가게 했다. 이어서 상기 주입된 포배들을 브린스터의 BMOC-3 배지가 보충된 소적으로 배양시켜, 이식할 배아들을 수득할 수 있다. 두 번째로, 체중 측정 후 가 임신한 암컷 마우스에게 마취제를 복강 내 주입하고 절개하였다. 이식할 배아들을 이동 피펫을 사용하여 절개 현미경 하에서 자궁으로 서서히 불어넣고, 그 후에 자궁과 장간막을 다시 복강에 넣고 절개부를 봉합하였다.
상기 시술이 성공적인 경우, 17 일 후에 새끼들이 태어날 것이다. 수일 후에 그들의 외피 색상으로부터 고도의 키메릭 마우스가 수득되었는지의 여부를 추론할 수 있다. 고도의 키메릭 마우스를 선택하여 C57BL/6J 마우스와 교미시키면, 순수한 갈색 외피를 갖는 트랜스제닉 자손이 생성될 것이다.
네 번째 태양에서, 본 발명은 하기 개시되는 바와 같은, HBsAg 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스의 표현형의 분석에 관한 것이다:
약 0.5 ㎝의 꼬리 끝 조각을 15 일 된 마우스로부터 절단하여 에펜도르프 튜브에 넣고, 여기에 용해 완충액을 가하여 세포를 용해시키고, 이어서 고도로 농축된 염을 가하여 단백질을 침전시켰다. DNA를 함유하는 상등액을 원심분리에 의해 수거하고 에탄올에 의해 침전시킨 후에, 게놈 DNA가 수득될 수 있다. 상기 DNA를 나중의 사용을 위해 ET 용액에 재 용해시켰다.
주형으로서 게놈 DNA 및 프라이머 쌍을 사용하여 상이한 표현형을 갖는 마우스 자손을 식별하기 위해 PCR을 수행하였다. 프라이머 1(5'-TCTTCTGTTTCAGCCACAGGC-3') 및 프라이머 2(5'-TGTCAGGCTGGTCTGCCTCC-3')를 사용하여 야생형 p21 대립 유전자를 식별하고, 436 pb 밴드를 야생형 및 이종접합 마우스로부터 증폭시킬 수 있다. neo 유전자에 대해 프라이머 3(5'-ATTTTCCAGGGATCTGACTC-3') 및 프라이머 4(5'-CCAGACTGC CTTGGGAAAAGC-3')를 사용하여 neo 유전자를 함유하는 표적화된 대립 유전자를 식별하였다. 프라이머 5(5'-GGACCCTGCACCGAACATGG-3') 및 프라이머 6(5'-GGAATAGCCCCAACGTTTGG-3')을 사용하여 HBsAg 유전자를 식별하였다.
마우스 꼬리 게놈 DNA를 각각 EcoRI 및 BglII로 절단하고, 생성된 절단물들에 대해 표적 벡터의 5' 단부 밖에 위치된 탐침을 사용하여 서던 블럿을 수행하였다. BglII에 의한 절단에 관해서, 대략 8 kb의 양성 밴드가 야생형 p21 대립 유전자에 대해 나타나는 반면, 상기 양성 밴드는 표적화된 p21 대립 유전자에 대해서는 9 kb로 이동할 것이며, 이는 동종 재조합 후에 원래 BglII 부위의 결실과 neo 유전자를 통한 또 다른 BglII 부위의 도입으로부터 발생된다. EcoRI에 의한 절단에 관해서, 대략 7.7 kb의 양성 밴드가 야생형 p21 대립 유전자에 대해 나타나는 반면, HBsAg 유전자를 함유하는 상기 양성 밴드는 표적화된 p21 대립 유전자에 대해서는 대략 22 kb로 이동할 것이며, 이는 동종 재조합 후에 원래 EcoRI 부위의 결실로부터 발생된다.
전체 RNA를 트리졸 시약을 사용하여 마우스 조직으로부터 추출하고, 이어서노던 블럿 분석을 수행하였다. 간단히, 20 ㎍의 전체 RNA를 취하여 포름알데히드 변성된 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, 이어서 상기 RNA를 모세관 이동에 의해 겔로부터 니트로셀룰로즈 멤브레인으로 옮기고, HBsAg 유전자로부터 유래된 탐침과 하이브리드화시켰다. 결과는 HBsAg 유전자가 트랜스제닉 마우스의 간과 비장에서 발현되었음을 나타낸다.
HBsAg 유전자의 발현을 1 단계 HBsAg ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 그러나, 마우스 혈청과 간 균질액을 모두 트랜스제닉 마우스에 대해서 제조하였으며, HBsAG는 혈청으로 분비되지 않고 오직 간 균질액에서만 존재하는 것으로 밝혀졌다.
이종접합 및 동종접합 트랜스제닉 마우스의 성장과 발육은 정상적이었다. 간에서, 림프구 침윤과 지방증이 1 년 후에 관찰될 수 있었으며; 증식 세포 핵 항원(PCNA) 염색은 간세포가 과증식 상태에 있음을 보였다. 15 개월 된 이종접합 마우스는 잘 분화된 간세포 암종으로 발병이 시작되었으며 17 개월 이상된 트랜스제닉 수컷 마우스의 75%는 상기 증상으로 진행할 것이다. 명백한 세포소멸은 관찰되지 않았다.
다섯 번째 태양에서, 본 발명은 하기의 연구들을 포함하는, HBV 유전자 유도된 간세포 암종 모델 마우스로서 트랜스제닉 마우스의 용도에 관한 것이다:
먼저, 전체 RNA를 상이한 개월 수의 야생형 또는 HBV 트랜스제닉 동종접합 마우스의 간으로부터 추출하고 유전자 발현 패턴을 노던 블럿에 의해 분석하여 간세포 암종의 발생과 관련이 있을 수도 있는 유전자들을 찾아, 상기 질병 발생의 분자 기전에 대한 예비 연구를 수행하였다. 두 번째로, 단백질을 상이한 개월 수의 야생형 또는 HBV 트랜스제닉 동종접합 마우스의 혈청 또는 간으로부터 추출하고, 2 차원(2D) 겔 전기영동을 수행하였다. 비교 분석을 수행하여 상이하게 발현된 단백질들을 찾고, 이어서 이들 단백질을 간세포 암종의 유도에 대한 분자 기전과 초기 사건에 대한 집중적인 연구를 수행하고 간세포 암종의 진단 또는 치료를 위한 표적 분자를 선별하기 위해서 펩티드 질량 핑거프린트 프로파일의 분석을 통해 식별하였다. 마지막으로, 약물을 상이한 개월 수의 HBV 유전자 유도된 간세포 암종이 있는 마우스와 야생형 마우스에게 정맥 내 주입, 복강 내 주입 또는 경구 투여 경로에 의해 투여하였다. 꼬리 정맥혈을 수거하고 선행 연구로부터 밝혀진 간세포 암종 관련된 초기 분자를 모니터하여, 치료 계획과 약물 효율을 평가하였다. 18 개월 된 마우스의 간에 대한 조직 생리학적 분석을 수행하고 치료 약물의 효율을 또한 평가하였다.
유전자 노크-인 방법의 이점을 취하여, 본 발명자들은 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 유전자를 동종 재조합 및 ES 세포 배양에 의해 마우스 ES 세포 게놈 상의 특정 부위에 통합시켰다. HBsAg 유전자를 안정하게 발현하는 트랜스제닉 마우스를 미세주입 및 배아 이식을 통해 수득하였다. 상기와 같은 트랜스제닉 마우스는 간에서 B형 간염 표면 항원을 발현하였으며, 이종접합 마우스 및 동종접합 마우스 모두 정상적으로 발육하였다. 간에서, 림프구 침윤 및 지방증이 1 년 후에 관찰될 수 있었으며; 증식 세포 핵 항원(PCNA) 염색은 간세포가 과증식 상태에 있음을 보였다. 15 개월 된 이종접합 마우스는 잘 분화된 간세포 암종으로 발병이시작되었으며(도 7) 17 개월 이상된 트랜스제닉 수컷 마우스의 75%는 상기 증상으로 진행할 것이다. 명백한 세포소멸은 관찰되지 않았다. 상기와 같은 HBV 유전자 유도된 간세포 암종 모델 마우스를 사용하여 간세포 암종의 유도에 대한 분자 기전 및 초기 사건들에 대한 집중적인 연구를 수행하고, 간세포 암종의 조기 진단 또는 치료를 위한 표적 분자들을 선별하고, 중국 전통 의약 및 서구 의약의 치료 효율과 치료 계획을 평가할 수 있다.
본 원에 언급된 문헌들은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용되어 있다. 본 발명을 하기의 실시예들에 의해 상세히 추가로 예시하며, 이들 실시예를 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 해석해서는 안된다.
실시예 1
HBsAg 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 통합 벡터의 제작
HBV cDNA를 포함하는 pADR-1(Gan RB, et al. The complete nucleotide sequence of the cloned DNA of hepatitis B virus subtype adr in pADR-1. Sci. Sin. 30, 507-521(1987))을 BglII 및 BamHI으로 절단하였다. 완전한 길이의 HBsAg 유전자를 포함하는 2.2 kb 단편을 단리시키고 벡터 pLoxpneo의 BamHI 부위에 삽입하여 벡터 pLoxpneo-s1을 수득하였다. 상동 서열의 짧은 가지로서 p21 유전자 좌의 제 2 엑손 상부의 2.0 kb Xho I(충전)-Not I(클론 벡터로부터) 단편을 pLoxpneo-s1의 Hpa I 부위와 Not I 부위 사이에 삽입시켜 벡터 pLoxpneo-a2를 수득하였다. p21 유전자 좌의 제 2 엑손 하부의 6.0 kb Xba I-BglII 단편을 벡터pHSG397에 클로닝시켜 HindIII(충전) 및 EcoRI 부위를 생성시켰다. 마지막으로, 상기 단편들을 동종 서열의 긴 가지로서 벡터 pLoxpneo-s2의 Asp718 I(충전)과 EcoRI 부위 사이에 삽입시켜(도 1) HBsAg 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 표적 벡터 pLoxpneo-HBsAg를 생성시켰다.
실시예 2
HBV X 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 표적 벡터의 제작
HBV cDNA를 포함하는 pADR-1을 XbaI 및 BamHI으로 절단하였다. HBX 유전자 5' 단부와 X 유전자 5'의 측면에 있는 부분을 포함하는 1.15 kb 단편을 단리시키고 벡터 pLoxpneo에 삽입시켜 pLoxpneo-X1 벡터를 수득하였다. HBV cDNA를 포함하는 pADR-1을 BglII 및 BamHI으로 절단시켰다. HBX 유전자의 3' 단부를 포함하는 0.58 kb 단편을 단리시키고 벡터 pLoxpneo-X1에 삽입시켜 전체 HBX 유전자와 그의 5' 단부의 측면에 있는 부분을 함유하는 벡터 pLoxpneo-X2를 수득하였다. 상동 서열의 짧은 가지로서 p21 유전자 좌의 제 2 엑손 상부의 2.0 kb Xho I-Not I 단편을 상기 벡터의 Xho I 부위와 Not I 부위 사이에 삽입시켜 벡터 pLoxpneo-X3을 수득하였다. p21 유전자 좌의 제 2 엑손 하부의 6.0 kb Xba I-BglII 단편을 벡터 pHSG397에 클로닝시켜 HindIII(충전) 및 EcoRI 부위를 생성시켰다. 마지막으로, 상기 단편들을 동종 서열의 긴 가지로서 벡터 pLoxpneo-X3의 Asp718 I(충전) 부위와 EcoRI 부위 사이에 삽입시켜(도 2) HBX 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 표적 벡터 pLoxpneo-HBX를 생성시켰다.
실시예 3
HBsAg 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 마우스 배아 줄기 세포의 생산
1) 영양 세포로서 작용하기 위한 1 차 마우스 배아 섬유아세포의 제조
1. 임신 14 일 된 마우스를 죽이고, 복강을 열어 배아와 함께 자궁을 꺼냈다. 배아를 PBS 중의 자궁으로부터 절제하고, 이어서 멸균 100 ㎜ 페트리 디쉬에 넣었다.
2. 난황 낭, 양막 및 태반을 제거하고, 배아를 새로운 PBS로 2 회 세척하였다.
3. 배아의 머리를 겸자 쌍으로 제거하고 태아 마우스를 멸균 가위로 작은 조각들(1 내지 3 ㎣)로 절단하고, 이어서 PBS가 실질적으로 무색이 될 때까지 PBS로 세척하였다.
4. 조직 조각들을 PBS를 함유하는 15 ㎖ 원심분리 튜브로 옮겨 1000 rpm에서 2 분간 원심분리시켰다.
5. 상등액을 버리고, 0.25% 트립신 5 ㎖을 나머지 부분에 가하고, 37 ℃에서 30 분간 처리하고, 이어서 10% 송아지 태아 혈청이 보충된 DMEM 배지를 가하고, 반복적으로 피펫팅하였다.
6. 튜브들을 1000 rpm에서 2 분간 원심분리시켰다.
7. 상등액을 버렸다. 영양 세포 배지를 가한 후에, 세포들을 150 ㎜ 페트리 디쉬로 옮기고, 5% CO2의 분위기 하에 37 ℃에서 2 내지 3 일간 배양기에서 배양시켰다. 대개는 배아 섬유아세포들이 3 일 내에 페트리 디쉬를 덮을 것이다.
8. 한 페트리 디쉬 중의 배아 섬유아세포를 3 개의 페트리 디쉬로 분배하고, 3 일 후에 영양 세포 배지 + 10% DMSO를 사용하여 동결시켰다. 상기 세포들은 1 차 마우스 배아 섬유아세포였다.
2) 1 차 마우스 배아 섬유아세포의 처리
1 차 마우스 배아 섬유아세포를 그의 생육을 정지시키기 위해서 미토마이신 C로 처리한 후에 영양 세포로서 사용해야 하며, 따라서 상기는 배양된 ES 세포의 과 증식 없이 ES 세포의 생육을 지원할 수 있다.
1. 1 차 마우스 배아 섬유아세포의 튜브를 40 ℃ 수욕에서 신속히 해동시키고, 이어서 세포들을 2 ㎖의 배지를 함유하는 원심분리 튜브로 옮겨 1000 rpm에서 2 분간 원심분리시켰다.
2. 상등액을 버렸다. 새로운 영양 세포 배지를 첨가한 후에, 세포들을 2 개의 100 ㎜ 페트리 디쉬로 옮기고, 37 ℃에서 5% CO2분위기 하에 배양기에서 배양시켰다.
3. 3 일 후에, 세포들을 트립신으로 처리하고, 이어서 6 개의 150 ㎜ 페트리 디쉬로 옮기고, 37 ℃에서 3 일간 배양시켰다.
4. 세포들을 6 개의 150 ㎜ 페트리 디쉬에서 12 개의 150 ㎜ 페트리 디쉬로 옮기고, 37 ℃에서 3 내지 4 일간 배양시켰다.
5. 세포들을 12 개의 150 ㎜ 페트리 디쉬에서 40 개의 150 ㎜ 페트리 디쉬로 옮기고, 37 ℃에서 3 내지 4 일간 배양시켰다.
6. 3.3 ㎖의 PBS를 미토마이신 C(2 ㎎)의 바이알에 가하며, 이때 3 개의 미토마이신 C 바이알을 모으면 총 10 ㎖이 된다. 각각의 페트리 디쉬에 0.25 ㎖의 미토마이신 C를 10 ㎍/㎖의 최종 농도로 가하고, 이어서 37 ℃에서 2 내지 3 시간 동안 배양시켰다.
7. 각각의 페트리 디쉬에, 배지를 버리고, 이어서 세포들을 PBS로 1 회 세척하고, 0.25% 트립신 3 ㎖로 처리하였다. 10 분 후에, 5 ㎖의 영양 세포 배지를 가하여 반응을 종료시켰다.
8. 모든 페트리 디쉬로부터의 세포들을 50 ㎖의 원심분리 튜브에 모았다. 이들 튜브를 1000 rpm에서 2 분간 원심분리시켰다.
9. 동결 배지(15% FCS, 10% DMSO, 75% DMEM) 40 ㎖을 상기 세포들에 가하였다. 반복해서 피펫팅한 후에, 세포들을 40 개의 작은 크기의 튜브로 신속히 나누고, -80 ℃에서 보존하였다. 이렇게 제조된 영양 세포들은 각각의 해동된 작은 크기의 튜브에 대해 3 내지 4 개의 90 ㎜ 페트리 디쉬를 덮을 수 있다.
600 ㎖의 영양 세포 배지의 제조는 하기 제법을 참고할 수 있다:
DMEM 500 ㎖
L-글루타민 6 ㎖
불필수 아미노산 용액(10 mM) 6 ㎖
페니실린 및 스트렙토마이신 용액(5,000 단위 페니실린, 5 ㎎ 스트렙토마이신/100 ㎖)
머캅토에탄올 4 ㎕
송아지 태아 혈청 90 ㎖
이어서 영양 세포 배지를 여과하고 4 ℃에서 보관하였다. LIF 1000 u/㎖을 상기 배지에 가한 후에, 상기 배지를 사용하여 ES 세포를 배양할 수 있다.
3) HBsAg 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 표적 벡터를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 ES 세포를 형질감염시킴
1. 형질감염을 소생 ES 세포를 계대시킨 후 2 일째(36 시간)에 수행하였다.
2. 상기 배지를 형질감염 전 2 시간 째에 새로운 배지로 교환하였다.
3. 상기 배지를 버리고, 이어서 페트리 디쉬를 PBS로 2 회 세척하였다.
4. 0.25% 트립신 1.5 ㎖을 각 100 ㎜ 페트리 디쉬에 37 ℃에서 5 분간 가하였다.
5. ES 세포 배지 3.5 ㎖을 가하고, 20 회 피펫팅하였다. 세포수를 혈구 집계 챔버를 사용하여 집계하였다. 각각의 표적 벡터에 대해서, 형질감염 당 대개 약 2 x 107세포가 필요하다.
6. ES 세포 현탁액을 1000 rpm에서 2 분간 원심분리시키고, 상등액을 버렸다. 세포를 PBS 10 ㎖에 재 현탁시켰다.
7. 세포 현탁액을 1000 rpm에서 2 분간 재 원심분리시키고, 이어서 세포를 PBS에 재 현탁시켜 세포 밀도를 2 x 107세포/㎖로 만들었다.
8. 실시예 1의 선형화된 표적 벡터 45 ㎍을 세포 현탁액 1 ㎖과 혼합하고, 이어서 일렉트로포레이션 큐벳에 넣었다. 상기 큐벳을 실온에서 5 분간 두었다.
9. 유전자 펄서(600 V, 25 μF)를 방전시켰다. 상기 큐벳을 제거하고 실온에서 1 분간 두었다.
10. 일렉트로포레이션 큐벳 중의 세포를 7 ㎖의 새로운 ES 세포 배지와 혼합하고, 이어서 영양 세포로 덮인 4 개의 페트리 디쉬(100 ㎜)에 분배시켰다.
11. 형질감염되지 않은 세포 40 ㎕를 대조군으로서 100 ㎜ 페트리 디쉬에 넣었다.
12. 24 시간 후에, 상기 배지를 ES 세포의 선별을 위해 G418(280 ㎍/㎖) 및 강사이클로비어(2 μM_를 함유하는 선택 배지로 교환하고, 이때부터 매일 새로운 선택 배지로 교환하였다.
13. 개별적인 클론들을 대개는 형질감염 후 7 일부터 가려내었다.
4) 양성 ES 클론의 선별
1. 선택 배지에서 7 내지 8 일간 배양하고 상기 배지를 버린 후에, 형질감염된 ES 세포를 PBS로 1 회 세척하고, 이어서 PBS 10 ㎖로 교환하였다.
2. 200 ㎕의 미세피펫터를 20 ㎕로 조절하고, 이어서 양성 ES 클론들을 현미경 하에서 그의 첨단을 사용하여 가려내었다.
3. 개별적인 클론들을 빈 96-웰 플레이트로 옮겼다. 각각의 100 ㎜ 페트리 디쉬에 대해서, 대개 30 내지 50 개의 클론들을 가려낼 수 있다.
4. 50 ㎕의 0.25% 트립신-EDTA 용액을 각 웰에 가하고, 37 ℃에서 3 내지 5분간 반응시켰다.
5. 각각의 웰에서, 100 ㎕의 ES 세포 배지를 가하고, 미세피펫터 첨단을 사용하여 반복적으로 피펫팅하여 ES 클론들을 단일 세포 현탁액으로 만들었으며, 이때 상기 미세피펫터는 100 ㎕의 8-채널 피펫터이며 80 ㎕로 조절되었다. 각각의 ES 클론으로부터의 단일 세포 현탁액을 2 개의 분액으로 나누고 각각 영양 세포가 있는 2 개의 96-웰 플레이트 상에 재 도말하였다. 상기 2 개의 플레이트에 대해서, 각 클론들의 위치 및 순서는 동일하였다. 배지를 매일 새로운 ES 세포 배지로 변경시키고 2 내지 3 일간 배양시킨 다음, 하나의 플레이트는 동결시키고, 다른 하나는 트립신 처리하고 상기 중의 ES 클론들을 24-웰 플레이트로 옮겨 상기 배지의 색상이 황색으로 변할 때까지 양양 세포 배지에서 배양시켰다.
5) 양성 ES 클론의 동결
1. 상기 배지를 버리고, 이어서 PBS 100 ㎕를 가하였다.
2. PBS를 버린 후에, PBS로 희석된 0.125% 트립신-EDTA 용액 50 ㎕를 가하고, 37 ℃에서 3 내지 5 분간 반응시켰다.
3. 동결 배지(15% DMSO, 20% 송아지 태아 혈청, 65% DMEM) 100 ㎕를 가하였다.
4. 세포를 8-채널 미세피펫터를 사용하여 10 회 이상 피펫팅하였다. 상기 96-웰 플레이트를 밀봉 막을 사용하여 밀봉시키고 플라스틱 주머니로 봉하였으며, 상기 플레이트와 플라스틱 주머니의 표면에 표시를 하였다.
5. 동결 속도를 늦추기 위해서, 상기 플레이트를 먼저 발포 상자에 넣고, 이어서 -80 ℃에서 동결시켰다.
6) ES 클론으로부터 게놈 DNA의 제조
1. ES 세포를 12 웰 플레이트 또는 24 웰 플레이트에서 배양시켰다. 게놈 DNA의 추출에 사용된 ES 세포에 대해서 LIF를 배지에 가할 필요가 없다.
2. 400 ㎕의 세포 용해 완충액(0.5% SDS, 0.1M NaCl, 0.01M EDTA, 0.02M 트리스-Cl(pH 7.6), 프로테아제 K, 100 ㎍/㎖)을 각 웰에 가하고, 이어서 상기 플레이트들을 실온에서 5 분간 두었다. 각 웰 중의 내용물을 에펜도르프 튜브로 옮겼다.
3. 튜브를 50 ℃에서 2 시간 동안 유지시켰다.
4. 200 ㎕의 포화된 NaCl(6M)을 가하였다.
5. 에펜도르프 튜브를 판지 상자에 넣고 200 회 격렬히 진탕시켰다.
6. 에펜도르프 튜브를 10 분간 얼음 위에 두었다.
7. 상기 튜브를 14,000 rpm에서 실온에서 10 분간 원심분리시켰다.
8. 각각의 튜브에 대해서 500 ㎕의 상등액을 깨끗한 에펜도르프 튜브로 옮긴 다음 에탄올 0.8 ㎖을 가하고 혼합하였다.
9. 상기 튜브들을 14,000 rpm에서 5 분간 원심분리시키고, 상등액을 버렸다.
10. 각각의 튜브를 뒤집어 놓고 실온에서 건조시켰다. DNA를 TE 50 내지 100 ㎕에 재 현탁시키고, 상기가 완전히 용해될 때까지(24 내지 48 시간) 37 ℃에서 방치시켰다. 상기 DNA를 PCR 또는 서던 하이브리드화 분석에 사용할 수 있다.
7) 서던 블럿에 의한, HBsAg 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 마우스 배아 줄기 세포의 식별
게놈 DNA를 G418/FIAU 이중 내성 클론으로부터 추출한 후에 각각 EcoRI 및 BglII로 절단하고, 생성된 절단물들에 대해서 표적 벡터의 5' 단부 밖에 위치한 탐침을 사용하여 서던 블럿을 수행하였다. BglII에 의한 절단에 관하여, 대략 8 kb의 양성 밴드가 야생형 p21 대립 유전자에 대해 나타나는 반면, 상기 양성 밴드는 표적화된 p21 대립 유전자에 대해서는 9 kb로 이동할 것이며, 이는 동종 재조합 후에 원래 BglII 부위의 결실과 neo 유전자를 통한 또 다른 BglII 부위의 도입으로부터 발생되었다. EcoRI에 의한 절단에 관하여, 대략 7.7 kb의 양성 밴드가 야생형 p21 대립 유전자에 대해 나타나는 반면, 상기 HBsAg 유전자를 함유하는 양성 밴드는 표적화된 p21 대립 유전자에 대해서 22 kb로 이동할 것이다(도 3).
실시예 4
HBV X 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 마우스 배아 줄기 세포의 제조
실시예 3에 개시된 바와 유사한 방법에 의해서 HBV X 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 마우스 배아 줄기 세포를 수득할 수 있다.
실시예 5
HBsAg 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 트랜스제닉 유전자의 제조
1) 공여 포배의 제조
포배의 수는 다수의 인자들, 예를 들어 마우스 주, 일반적인 건강 상태, 적응, 과 배란의 능력 및 실험 계절 등에 따라 변한다. 보다 많은 포배를 수득하기 위해서 또는 마우스의 수가 제한되는 경우, 흥분되지 않은 마우스에게 전형적으로 호르몬을 복강 내 주입하여 상기 마우스가 보다 많은 난자를 배란하도록, 즉 과 배란하게 만든다. 과 배란시키려는 마우스는 대개 3 내지 5 주된 청년기의 마우스로, 구체적인 나이는 마우스 주에 따라 변할 수 있으며, 예를 들어 암컷 C57BL/6J 마우스에 가장 적합한 나이는 25 일된 것이다.
과 배란된 마우스로부터 포배의 제조:
1. 흥분되지 않은 4 내지 5 주된 암컷 C57BL/6J 마우스(12.5 내지 14 g)를 선택하여, 제 1 일 2:30 pm에 임신한 암컷 혈청 고나도트로핀(PMSG, SIGMA) 51U를 복강 내 주입하였다.
2. 제 3 일 정오 전, 즉 최종 PMSG 주입 후 48 시간 내에, 암컷 마우스에게 인간 융모막 고나도트로핀(HCG, SIGMA) 5IU를 복강 내 주입하여 과 배란시키고, 이어서 강한 수컷 마우스가 있는 우리로 옮겨 이들을 교미시켰다.
3. 제 4 일째 9:00 am 전에, 질전의 존재를 검사하였다. 질전이 있는 마우스를 공여 암컷 마우스로서 사용하여 다른 우리에 넣고, 상기 일을 0.5 일로서 표시하였다. 같은 날 2:30 pm에 흥분한 백색 암컷 쿤밍(Kunming) 마우스(약 24 내지 30 g)를 선택하여 정관-예민한 수컷 마우스와 교미시켰다.
4. 제 5 일째 9:00 am 전에, 질전의 존재를 검사하였다. 질전이 있는 마우스를 수용자 암컷 마우스로서 사용하여 다른 우리에 넣었다.
5. 제 7 일째에, 즉 교미 후 4 일째에, 포배를 공여 암컷 마우스의 자궁으로부터 수거하였다.
포배의 수거 및 배양:
1. 공여 암컷 마우스를 탈구에 의해 죽인 후에, 상기 마우스의 복부를 70% 알콜로 소독하였다. 복부의 중심선을 수평으로 절개하였다.
2. 피부를 개방하여 상기 절개부의 측 방향 쪽으로 잡아당기고, 이어서 복막을 세워 절단하여 복강을 충분히 노출시켰다.
3. 창자 조직을 복막 위로 세워 자궁을 찾고, 이어서 자궁을 양쪽 난관이 자궁 끝과 연결된 곳에서 조심스럽게 절제하여 멸균 60 ㎜ 페트리 디쉬에 놓았다.
4. 난관과 자궁 끝을 각각 자궁 머리와 꼬리로부터 제거하여 방해물이 없는 분리된 자궁을 준비하였다.
5. 충분한 브린스터의 BMOC-3(GIBCO BRL) 배지를 5 ㎖의 1 회용 주사기로 취하였다. 5 게이지 바늘을 올려놓은 후에, 상기 주사기를 해부 현미경 하에서 자궁 강에 삽입하고, 이어서 주사기 플러그를 밀어 넣어 자궁 강을 다른 방향으로 분출시켰다. 자궁은 분출 중에 약간 팽창할 수 있으며 마우스 배아가 신속히 디쉬 바닥으로 가라앉았다.
6. 여러 방울의 배지를 35 ㎜ 페트리 디쉬에 떨어뜨렸으며, 이때 각 소적은 약 200 ㎕였고, 이어서 무기 오일(SIGMA, M-3516)로 덮였다.
7. 배아를 해부 현미경 하에서 분출 피펫으로 수거하여 배양 미세 방울로 옮기고, 이어서 5% CO2의 분위기 하에 37 ℃에서 2 시간 동안 배양기에서 배양시켰다.
2) 포배의 미세주입
ES 세포의 미세주입은 깊이와 입체성의 효과를 갖는 상 콘트라스트 현미경 또는 차동 간섭 현미경(Nikon)을 사용해야 한다. 하나 이상의 저 확대 대물렌즈와 200 배로 확대되는 고 확대 대물렌즈가 장착되고 또한 37 ℃ 등온 대물 스테이지가 장착된 현미 조작기(Marishige)는 항-지진성 플랫폼보다 양호하였다.
미세주입용 피펫의 제조:
ES 세포를 포배에 주입하기 전에, 포배 조작을 위해 준비된 다양한 종류의 피펫들, 예를 들어 배아 전달용 전달 피펫, 미세주입 중 배아 고정을 위한 홀딩 피펫, 및 세포를 포배에 주입하기 위한 주입 피펫이 필요하다.
바늘 제조용 버너를 사용하는 미세주입용 홀딩 피펫의 제조(Narishige, MF-900):
1. 얇은 유리 모세관(Nikon, G-1)을 작은 화염 위에서 길이 약 2 내지 3 ㎝의 얇은 바늘로 잡아당겼다.
2. 유리 모세관을 바늘 제조용 버너의 필라멘트 상에서 유리구가 되게 용융시켰다. 상기 제조된 바늘을 고정시키고 필라멘트와 수평으로 조절하였다. 필라멘트를 가열하고, 이어서 유리 바늘을 60 내지 90 ㎛의 직경에 접근하게 하고 유리 구와 접촉시켰다.
3. 필라멘트 가열을 멈춘 후에, 바늘은 냉각 시 수축되므로 절단되어 무딘 홀딩 피펫을 형성하였다.
4. 다시 필라멘트를 가열하고, 이어서 바늘 끝을 무디게 하기 위해서 상기바늘 끝을 접근시켰으며 12 내지 20 ㎜ 중간 구멍을 가졌다.
5. 바늘을 바늘 끝으로부터 1 ㎝ 떨어져서 가열하여 상기를 30°의 각도로 구부러지게 하였으며, 따라서 상기 바늘 끝은 현미 조작 시야에서 수평이 될 수 있다.
바늘 제조용 버너를 사용하는 주입 피펫의 제조:
1. 유리 모세관을 약 1 ㎝ 길이의 얇은 바늘로 잡아당겼다.
2. 상기 바늘을 바늘 제조용 버너를 사용하여 내경 12 내지 15 ㎛로 뚫어지게 하였으며, 상기 내경이 바로 하나의 ES 세포를 뭉개지지 않게 보유할 수 있다.
3. 상기 바늘을 바늘 끝으로부터 약간 떨어져서 30°의 각으로 구부렸으며, 따라서 바늘 끝이 현미 조작 시야에서 수평이 될 수 있다.
전달 피펫의 제조는 홀딩 피펫의 제조와 유사하며, 유일한 차이는 전달 피펫의 내경이 포배 내경의 1 내지 1.5 배(약 110 내지 130 ㎛)이며, 따라서 포배를 쉽게 넣었다 뺏다할 수 있다는 것이다. 상기 바늘 길이는 약 2 내지 3 ㎝로 배지, 기포 및 일정 수의 포배를 보유한다.
포배 주입의 조작 절차:
1. 파라핀 오일을 충전시킨 후에, 디쉬, 홀딩 피펫의 바늘 튜브 및 주입 피펫의 바늘 튜브를 현미경의 미세 조율을 통해 동일한 초점 수평 수준으로 조절하였다.
2. 주입할 ES 세포를 주입 수일 전에 해동시켰다. 배지를 주일 당일 아침에 새로운 ES 배지로 교환하였다. 1 내지 2 시간 후에, 상기 세포를 트립신 처리하여 단일 세포 현탁액을 제조하고, 이어서 브린스터의 BMOC-3 배지에 보존하였다.
3. 약 10 개의 형태가 통통하고 경계가 확실하며 포배 강이 보다 큰 포배들을 35 ㎜ 페트리 디쉬 중에서 선택하고, 홀딩 피펫과 주입 피펫이 적재된 주입 챔버로 옮기고, 이어서 몇 개의 ES 세포를 분출 피펫을 사용하여 상기 챔버로 흡입하였다.
4. 12 내지 15 개의 작고 둥근 ES 세포를 10 배 배율 하에서 주입 피펫을 사용하여 흡입하였다.
5. 홀딩 피펫을 40 배 배율 하에서 포배의 한쪽에 부착시키고, 이어서 주입 피펫을 포배의 중심과 동일한 수평 수준으로 조절하였다.
6. 주입 피펫의 작동 스틱을 움직여 주입 피펫을 포배의 벽을 통해 포배 강 내로 신속히 관통시키고, 이어서 주입 펌프를 밀어 ES 세포가 차례로 포배 강으로 들어가게 하고, 마지막으로 조심스럽게 잡아 당긴다.
7. 이어서 주입된 포배를 현미 조작 시야의 다른 쪽에 놓고, 다음 포배의 주입을 속행하였다.
8. 모든 주입된 포배들을 10 배 배율 하에서 분출 피펫을 사용하여 보다 큰 디쉬로 흡입시키고, 소적 + 브린스터의 BMOC-3 배지에서 배양시키고, 마지막으로 표시를 하였다.
나머지는 유추하여 추론할 수 있을 것이며, 주입할 포배의 수를 당일의 포배의 상태 및 수용자 마우스의 수를 근거로 결정하였다. 홀딩 피펫 및 주입 피펫을 쉽게 막히거나 들러붙는 경우에만 교환하였다. 미세주입 챔버 중의 소적들을 주입 후 수 시간째에 또는 배지의 pH를 변경시켰을 때 새로 공급하였다.
3) 배아의 자궁으로의 이식
1. 수용자 암컷 마우스를 체중 측정하고, 상기 체중에 따라 마취제(아베르틴)를 복강 내 주입하고 등의 털을 제거하였다.
2. 전달 피펫을 구강-조절 튜브와 연결하고, 이어서 배지, 기포, 배지, 기포, 주입된 포배, 기포 및 약간의 배지를 차례로 흡입하였다.
3. 각각의 수용체 마우스의 등을 75% 알콜로 소독하고, 이어서 제 1 요추 부근의 오른쪽 1 ㎝를 수평 절개하였다. 피부를 오른쪽 난소와 그의 지방층을 복막을 통해 볼 수 있을 때까지 절개부의 측 방향으로 잡아당겼다. 복막 상에 3 ㎜의 개구를 끝이 뾰족한 핀셋으로 찢어냈다.
4. 지방층을 왼손으로 고정시킨 후에, 자궁을 볼 수 있었다. 지방층을 작은 크기의 지혈 핀셋을 사용하여 고정시켰다.
5. 4 게이지 바늘 끝과 전달 피펫을 오른손으로 쥐고 있으면서, 자궁벽을 자궁과 난관 사이의 계면으로부터 2 ㎜ 떨어진 곳에 왼손으로 끝이 뾰족한 핀셋을 사용하여 고정시켰다. 해부 현미경 하에서 바늘 끝을 사용하여 혈관과 떨어진 상기 끝이 뾰족한 핀셋 부근에 구멍을 내고, 이어서 상기 내로 전달 피펫의 앞 부분을 조심스럽게 삽입하고 배아를 자궁 안으로 서서히 불어넣었다.
6. 자궁 및 장간막을 다시 복강으로 집어넣고, 이어서 절개부를 봉하였다.
상기 시술이 성공적이라면, 17 일 후에 새끼들이 태어날 것이며, 수일 후에 그들의 외피 색상으로부터 고도의 키메릭 마우스가 수득되었는지의 여부를 추론할수 있다. 고도의 키메릭 마우스를 선택하여 C57BL/6J 마우스와 교미시키면, 순수한 갈색 외피를 갖는 트랜스제닉 자손이 생성될 것이다.
실시예 6
HBsAg 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 트랜스제닉 마우스의 식별
1) 마우스 게놈 DNA의 제조
1. 약 0.5 ㎝의 꼬리 끝 조각들을 15 일 된 마우스로부터 절단하고, 이어서 에펜도르프 튜브에 넣는다.
2. 각각의 튜브에, 용해 완충액(0.5% SDS, 0.1M NaCl, 0.05M EDTA, 0.01M 트리스-Cl(pH 8.0), 프로테아제 K, 200 ㎍/㎖) 400 ㎕를 가하여 꼬리 끝을 용해시켰다.
3. 상기 튜브들을 50 ℃에서 밤새 배양하였다.
4. 포화된 NaCl(6 M)의 200 ㎕를 각각의 튜브에 가하였다.
5. 에펜도르프 튜브를 판지 상자에 넣고 200 회 격렬히 진탕시켰다.
6. 에펜도르프 튜브를 10 분간 얼음 위에 놓았다.
7. 상기 튜브를 14,000 rpm에서 실온에서 10 분간 원심분리시켰다.
8. 각각의 튜브에 대해서 500 ㎕의 상등액을 깨끗한 에펜도르프 튜브로 옮긴 다음 에탄올 0.8 ㎖을 가하고 혼합하였다.
9. 상기 튜브들을 14,000 rpm에서 5 분간 원심분리시키고, 상등액을 버렸다.
10. 각각의 튜브를 뒤집어 놓고 실온에서 건조시켰다. DNA를 TE 50 내지 100 ㎕에 재 현탁시키고, 상기가 완전히 용해될 때까지(24 내지 48 시간) 37 ℃에서 방치시켰다. 상기 DNA를 PCR 또는 서던 하이브리드화 분석에 사용할 수 있다.
2) 마우스에서 표현형의 PCR 식별
프라이머 1(5'-TCTTCTGTTTCAGCCACAGGC-3') 및 프라이머 2(5'-TGTCAGGCTGGTCTGCCTCC-3')를 사용하여 야생형 p21 대립 유전자를 식별하고, 436 pb 밴드를 야생형 및 이종접합 마우스로부터 증폭시킬 수 있다. neo 유전자에 대해 프라이머 3(5'-ATTTTCCAGGGATCTGACTC-3') 및 프라이머 4(5'-CCAGACTGC CTTGGGAAAAGC-3')를 사용하여 neo 유전자를 함유하는 표적화된 대립 유전자를 식별하였다. 프라이머 5(5'-GGACCCTGCACCGAACATGG-3') 및 프라이머 6(5'-GGAATAGCCCCAACGTTTGG-3')을 사용하여 HBsAg 유전자를 식별하였다(도 4).
3) 서던 블럿 하이브리드화를 사용하는 HBsAg 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 마우스의 식별
마우스 꼬리 게놈 DNA를 각각 EcoRI 및 BglII로 절단하고, 생성된 절단물들에 대해 표적 벡터의 5' 단부 밖에 위치된 탐침을 사용하여 서던 블럿을 수행하였다. BglII에 의한 절단에 관해서, 대략 8 kb의 양성 밴드가 야생형 p21 대립 유전자에 대해 나타나는 반면, 상기 양성 밴드는 표적화된 p21 대립 유전자에 대해서는 9 kb로 이동할 것이며, 이는 동종 재조합 후에 원래 BglII 부위의 결실과 neo 유전자를 통한 또 다른 BglII 부위의 도입으로부터 발생된다. EcoRI에 의한 절단에 관해서, 대략 7.7 kb의 양성 밴드가 야생형 p21 대립 유전자에 대해 나타나는 반면, 돌연변이 후에, HBsAg 유전자를 함유하는 상기 밴드는 표적화된 p21 대립 유전자에 대해서는 대략 22 kb로 이동할 것이다(도 5).
4) 조직으로부터 전체 RNA의 추출
1. 트리졸 2 ㎖을 가한 후에 마우스 조직(간, 비장, 신장 등) 100 ㎎을 균질화기로 균질화시키고, 이어서 실온에서 5 분간 방치시켰다.
2. 0.4 ㎖의 클로로포름을 가하였다. 상기 튜브를 긴밀하게 봉하고, 15 초간 격렬히 진탕시키고, 2 내지 3 분간 방치시키고, 이어서 2 내지 8 ℃에서 15 분간 10,000 내지 12,000 g에서 원심분리시켰다.
3. 수성 상층을 새로운 원심분리 튜브로 옮기고, 이어서 이소프로판올 1 ㎖을 가하여 혼합하였다. 상기 튜브를 실온에서 10 분간 둔 다음, 2 내지 8 ℃에서 10 분간 10,000 내지 12,000 g에서 원심분리시켰다.
4. 상등액을 버렸다. 이어서 펠릿을 2 ㎖ 이상의 75% 에탄올을 가하여 세척하고, 2 내지 8 ℃에서 7500 g 이하의 속도로 5 분간 원심분리시켰다.
5. 상등액을 버렸다. RNA 펠릿을 5 내지 10 분간 공기 건조시키고, 이어서 반복적으로 피펫팅함으로써 RNase-비 함유 수 500 ㎕에 용해시켰다.
6. 상기 RNA를 55 내지 60 ℃에서 유지시키고, 이어서 -70 ℃에서 보관하였다.
5) 노던 하이브리드화를 사용하는 HBsAg 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 마우스의 식별
1. 아가로스 1.5 g을 DEPC-처리된 물 117.2 ㎖에 용해시키고, 이어서 70 ℃로 냉각시키고, 10 ㎎/㎖의 에티디움 브로마이드(EB) 3.5 ㎕, 5 x MOPS(0.1 몰/ℓ의 MOPS(pH 7.0)), 40 밀리몰/ℓ의 아세트산 나트륨, 5 밀리몰/ℓ의 EDTA(pH 8.0)및 2.8 ㎖의 40% 포름알데히드 용액을 가하였다.
2. 20 ㎍의 RNA를 3 배 부피의 장전 완충액(6.7 ㎖의 포름알데히드, 2.2 ㎖의 40% 포름알데히드, 1320 ㎕의 10 x MOPS, 20 ㎕의 브로모페놀 블루 20 ㎎/㎖)에 가하고, 60 ℃로 10 분간 가열하고, 얼음물에서 신속히 식히고, 이어서 샘플을 장전시켰다.
3. 전기영동 장치를 전력 공급원에 연결하였다. 120 내지 160 v의 전압을 겔에 적용시키고 브로모페놀 블루가 장전 벽으로부터 8 ㎝ 이동할 때까지 2 내지 3 시간 동안 실행시켰다. 이 기간 동안 2 극 전기영동 완충액을 매 30 분마다 혼합하였다.
4. 상기 겔을 매번 15 분간 20 x SSC에 2 회 침지시켰다.
5. RNA를 상기 겔에서 20 x SCC를 사용하여 니트로셀룰로즈 멤브레인으로 옮기고, 이어서 상기 멤브레인을 2 x SCC로 5 분간 세척하였다.
6. UV(1200 ㎼/㎠) 하에서 2 분간 가교결합시킨 후에, 상기 멤브레인을 80 ℃에서 45 분간 소성시켰다.
7. 탐침을 프로메가 코포레이션(Promega Corp.)의 프라이머 A 표지 시스템(제품번호 #U1100)을 사용하여 표지하였다. 간단히, 표지할 DNA 단편을 95 내지 100 ℃에서 2 분간 비등시키고, 이어서 얼음물 상에서 신속히 식혔다. 하기의 용액들을 1.5 ㎖의 원심분리 튜브에서 혼합하였다:
용액 부피 최종 농도
5 배 완충액 10 ㎕ 1 x
dNTP(dCTP 없음) 2 ㎕ 각각 dNTP 20 μM
표지할 DNA 단편* 25 ng 500 ng/㎖
[α-32p]dCTP, 50 μCi 5 ㎕ 333 nM
DNA 폴리머라제 (클레나우 단편) 5 단위(1 ㎕) 100 단위/㎖
*표지할 DNA 단편은 SphI 및 SpeI 이중 절단된 플라스미드 pADR-1으로부터 회수된 550 bp 단편이다.
이어서 뉴클레아제-비 함유 수를 50 ㎕의 부피로 가하고 혼합하였다. 실온에서 1 시간 동안 정치시키고 2 분간 비등시킨 다음, 상기 튜브를 얼음물 상에서 신속히 식히고, 이어서 EDTA를 최종 농도 20 mM로 가하여 반응을 종료시켰다.
8. 상기 멤브레인을 6 x SSC에 5 분간 침지시키고, 이어서 65 ℃에서 2 시간 동안 예비 하이브리드화 용액(6 x SSC, 2 x 덴하르트, 0.1% SDS, 100 ㎍/㎖의 변성된 연어 정자 DNA)에서 배양시켰다. 상기 표지된 탐침을 예비 하이브리드화 용액에 가한 후에, 하이브리드화를 65 ℃에서 18 시간 이상 속행시켰다.
9. 상기 멤브레인을 1 x SCC, 0.1% SDS로 실온에서 20 분간 세척하고, 이어서 0.2 x SSC, 0.1% SDS로 65 ℃에서 3 회(매번 20 분간) 세척하였다.
10. 상기 멤브레인을 약간 건조시키고, 이어서 -70 ℃에서 X 선 필름에 노출시켰다.
11. 상기 필름을 현상하였다.
결과를 도 6에 나타내었다.
6) ELISA를 사용하는 HBsAg 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 마우스의 식별
HBsAg에 대한 1 단계 ELISA 키트를 시후안 바이올로지컬 코포레이션(SihuanBiological Corp., Beijing)으로부터 구입하고 하기의 단계들을 사용하였다:
1. 장전 샘플:
㎕ 플레이트를 코팅하였다. 각각의 플레이트에 2 개의 웰을 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로서 정하고, 이어서 대조용 용액 방울(50 ㎕)을 각각 4 개의 웰에 가하였다. 하나의 웰을 블랭크 대조군(임의의 시약들이 첨가되지 않음)으로서 정하였다. 50 ㎕의 시험 샘플을 다른 웰들에 가하였다. 이어서 한 방울(50 ㎕)의 항-HBs-HRP를 각 웰에 가하였다. 상기 플레이트들을 37 ℃에서 30 분간 배양하였다.
2. 세척 플레이트:
각 웰 중의 액체를 버리고, 이어서 상기 웰들을 30 배 희석된 세척 완충액으로 5 회 세척하고, 톡톡 쳐서 건조시켰다.
3. 색의 전개:
한 방울의 색원체 제제 용액 A 및 한 방울의 색원체 제제 용액 B를 각 웰에 가하고, 이어서 상기 플레이트들을 37 ℃에서 15 분간 배양시켜 색을 전개시켰다.
4. 반응의 종료:
한 방울의 종결 완충액을 가하여 반응을 종료시켰다.
5. 결과의 판독:
블랭크 웰을 450 ㎚의 파장에서 등급화하고, 이어서 각 웰의 OD 값을 판독하고, 결과를 하기 식에 따라 계산하였다:
시험 혈청의 S/N=OD/음성 대조군의 평균 OD 값, S/N>2.1일 때, 시험 혈청을양으로서 간주하고, S/N<2.1일 때, 시험 혈청을 음으로서 간주하였다. 음성 대조군의 OD450이 <0.05인 경우, 0.05를 상기 식에 대입하고; OD450>0.05인 경우에는 실제 값을 상기 식에 대입하였다. 결과는 하기와 같다:
샘플 양성 대조군 1 양성 대조군 2 음성 대조군 1 음성 대조군 2 혈청 1 중량 간 균질물 1 중량 혈청 2 중량 간 균질물 2 중량
OD 값 1.777 1.797 0.017 0.016 0.015 0.019 0.015 0.017
S/N 35.54 35.94 0.34 0.32 0.30 0.38 0.30 0.34
S+/- 혈청 1 S+/- 간 균질물 1 S+/- 혈청 2 S+/- 간 균질물 2 S+/+ 혈청 1 S+/+ 간 균질물 1 S+/+ 혈청 2 S+/+ 간 균질물 2
0.015 1.908 0.016 1.879 0.013 2.067 0.015 1.998
0.30 38.14 0.32 37.58 0.26 41.34 0.30 39.94
실시예 7
HBV X 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 트랜스제닉 마우스의 식별
1) PCR에 의한 마우스의 표현형의 식별
프라이머 1(5'-TCTTCTGTTTCAGCCACAGGC-3') 및 프라이머 2(5'-TGTCAGGCTGGTCTGCCTCC-3')를 사용하여 야생형 p21 대립 유전자를 식별하고, 436 pb 밴드를 야생형 및 이종접합 마우스로부터 증폭시킬 수 있다. neo 유전자에 대해 프라이머 3(5'-ATTTTCCAGGGATCTGACTC-3') 및 프라이머 4(5'-CCAGACTGC CTTGGGAAAAGC-3')를 사용하여 neo 유전자를 함유하는 표적화된 대립 유전자를 식별하였다. 프라이머 7(5'-TCTCTGCCAAGTGTTTGCTGACGC-3') 및 프라이머 8(5'-TCGGTCGTTGACATTGCTGAGAGTC-3')을 사용하여 HBX 유전자를 식별하였다.
2) 서던 블럿 하이브리드화를 사용하는 HBX 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 마우스의 식별
추출된 마우스 꼬리 게놈 DNA를 각각 EcoRI 및 BglII로 절단하고, 생성된 절단물들에 대해 표적 벡터의 5' 단부 밖에 위치된 탐침을 사용하여 서던 블럿을 수행하였다. BglII에 의한 절단에 관해서, 대략 8 kb의 양성 밴드가 야생형 p21 대립 유전자에 대해 나타나는 반면, 상기 양성 밴드는 표적화된 p21 대립 유전자에 대해서는 9 kb로 이동할 것이며, 이는 동종 재조합 후에 원래 BglII 부위의 결실과 neo 유전자를 통한 또 다른 BglII 부위의 도입으로부터 발생된다. EcoRI에 의한 절단에 관해서, 대략 7.7 kb의 양성 밴드가 야생형 p21 대립 유전자에 대해 나타나는 반면, 돌연변이 후에, HBX 유전자를 함유하는 상기 밴드는 표적화된 p21 대립 유전자에 대해서는 대략 22 kb로 이동할 것이다.
3) 노던 블럿에 의한 HBX 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 마우스의 식별
HBV cDNA를 함유하는 pADR-1의 BglII 및 BamHI 절단 산물들로부터 회수된 580 bp 단편을 노던 하이브리드화용 탐침으로서 사용하였다. 결과는 HBX 유전자가 마우스의 간과 신장에서 발현됨을 나타내었다.
실시예 8
HBsAg 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 트랜스제닉 마우스의 표현형 분석
1) 헤마톡실린 및 에오신 염색
1. 고정
조직을 20 시간에 걸쳐 중성 포름알데히드 용액(40% 포름알데히드 100 ㎖,물 900 ㎖, 인산 이 나트륨 4 g, 인산 이수소 나트륨 6.5 g)으로 고정시켰다.
2. 건조
70% 에탄올 15 분간
80% 에탄올 15 분간
90% 에탄올 15 분간
95% 에탄올 15 분간
무수 알콜 15 분간
무수 알콜 15 분간
크실렌 15 분간
크실렌 15 분간
3. 매몰(embedding)
건조된 조직을 처리된 파라핀(즉 용융시키고 60 ℃에서 밤새 방치시킨 것)으로 옮기고 2 시간 동안 침지시켰으며, 이 기간 동안 파라핀을 2 회 교환하였다. 이어서 상기 조직을 예열된 매몰 틀로 옮긴 다음 조직의 일부를 따뜻한 핀셋으로 조절하면서 용융 파라핀을 신속히 부었다. 이어서 편평한 플레이트를 올려 놓고 그 위에 일부 용융 파라핀을 붓고, 상기 중의 기포들을 조심스럽게 제거하였다. 상기를 실온에 두어 용융 파라핀을 고형화시켰다.
4. 섹션 절단
덩어리 파라핀을 적합한 크기로 만들고, 연속해서 회전 마이크로톰(MICROM HM340E)(날을 10°의 각으로 조절하였다)으로 얇게 썰었다. 형성된 왁스 칩을 깨끗한 알루미늄 호일로 옮기고, 외과용 블레이드를 사용하여 적합한 크기로 절단하고 각각 슬라이드로 옮겼다. 적합한 양의 물을 가하여 샘플을 상기 수면에 부유시키고, 이어서 상기 슬라이드들을 약 40 ℃의 슬라이드-건조기의 플랫폼 위에 두고, 샘플이 퍼질 때까지 물을 조심스럽게 버렸다. 상기 슬라이드들을 시편 상자에 모으고, 37 ℃에서 밤새 건조시켰다.
5. 헤마톡실린 및 에오신 염색
크실렌 15 분;
크실렌 15 분;
무수 알콜 15 분;
95% 에탄올 5 분;
70% 에탄올 5 분;
물 5 분;
해리스 헤마톡실린 염색액(2.5 g의 헤마톡실린, 25 ㎖의 무수 알콜, 50 g의 칼륨 명반, 1.25 g의 산화 제 2 수은, 20 ㎖의 빙초산, 500 ㎖의 물) 5 분;
흐르는 물로 5 내지 10 분간 세척;
70% 에탄올-염산(70% 에탄올 200 ㎖ + 10 방울의 염산) 15 내지 30 초;
70% 에탄올-수산화 암모늄(70% 에탄올 200 ㎖ + 10 방울의 수산화 암모늄) 1 분;
물 5 분;
이어서 변색 정도를 현미경 하에서 관찰하였다. 세포질이 회색이거나 또는투명해지면, 다음 단계를 수행하였다. 세포질이 아직 청색이면, 상기 단계를 반복하였다.
70% 에탄올 3 분;
에오신 Y 염색액(에오신 Y 0.5 g, 물 5 ㎖에 용해된 화려한 적색 B 50 ㎎, 물 50 ㎖, 빙초산 2 ㎖, 95% 에탄올 390 ㎖) 1 분;
95% 에탄올 5 분;
무수 알콜 5 분;
크실렌 5 분;
크실렌 5 분;
6. 중성 검에 의한 슬라이드의 밀봉
결과를 도 7에 나타내었다.
2) 면역조직화학적 분석
1. 파라핀 섹션을 제조하고, 통상적으로 왁스를 제거하였다.
2. 슬라이드를 내생 페록시다제를 불활성화시키기 위해서 3% 과산화 수소에서 실온에서 10 분간 배양시켰다.
3. 상기 슬라이드를 증류수로 2 분간 3 회 세척하고, 이어서 0.01M 시트르산 완충액(pH 6.0)을 함유하는 용기에 넣었다. 상기 용기를 10 내지 15 분간 마이크로웨이브 오븐에서 가열하여 상기 완충액의 온도를 92 내지 98 ℃로 만들고, 이어서 꺼내어 실온에서 10 내지 20 분간 냉각시켜 항원을 변성시켰다. 상기 슬라이드를 PBS에 5 분간 침지시켰다.
4. 이어서 상기 슬라이드를 5 내지 10% 통상적인 염소 혈청(PBS 희석된 것)으로 차단하고, 실온에서 10 분간 배양시키고, 그 후에 혈청을 버리고, 적합한 비율로 희석된(1% BSA-PBS 희석된) 1 차 항체를 가하고, 37 ℃에서 1 내지 2 시간 동안 또는 4 ℃에서 밤새 배양시켰다.
5. 상기 슬라이드를 PBS로 매번 5 분간 3 회 세척하였다.
6. 이어서 상기 슬라이드에 적합한 비율로 희석된(PBS 희석된) 비오틴-표지된 2 차 항체를 가하고, 37 ℃에서 30 분간 배양시켰다.
7. 상기 슬라이드를 PBS로 매번 5 분간 3 회 세척하였다.
8. 이어서 상기 슬라이드에 적합한 비율로 희석된(PBS 희석된) 양고추냉이 페록시다제-표지된 스트렙트아비딘을 가하고, 37 ℃에서 30 분간 배양시켰다.
9. 상기 슬라이드를 PBS로 매번 5 분간 3 회 세척하였다.
10. 색원체 제제를 사용하여 발색시켰다.
11. 상기 슬라이드를 물로 충분히 세척하고, 반대 염색하고 밀봉시켰다.
결과를 도 8에 나타내었다.
3) 마우스 혈청 중의 α-태아 단백질의 분석
마우스 혈청 중의 α-태아 단백질의 함량을 인간 혈청 중의 α-태아 단백질(α-AFP)의 함량에 대한 정량적인 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 과정은 하기와 같다:
1. 혈청을 혈액 샘플로부터 분리시키고, 4 ℃에서 보관하여 반복적인 동결과 해동을 피하였다.
2. 샘플을 하기의 비율로 가하고:
야생형 표준 웰 샘플 웰
표준(㎕) 20 -
샘플(㎕) - 20
효소-공액물(㎕) 100 100
혼합하고, 37 ℃에서 20 분간 배양하였다. 하나의 웰을 각 실험에서 블랭크로서 정하였다.
3. 각각의 웰에 대해서, 먼저 상기 중의 액체를 버리고, 두 번째로 증류수를 상기에 재 충전시키고, 이어서 10 초 후에 버렸다. 상기 단계를 3 내지 4 회 반복하였다.
4. 한 방울의 색원체 제제 A(50 ㎕), 한 방울의 색원체 제제 B(50 ㎕)를 가하고 적절히 혼합하고, 이어서 발색을 위해 37 ℃에서 15 분간 두었다.
5. 한 방울의 종결 용액(50 ㎕)을 가하였다. 블랭크 웰을 사용하여 0 등급을 매긴 후에, 450 ㎚ 파장에서 각 웰의 OD 값을 판독하였다.
6. 표준 곡선을 횡자표로서 표준의 상이한 농도의 대수를 사용하고, 세로좌표로서 상응하는 OD 값을 사용하여 플롯팅하였다. 상기 플롯팅된 표준 곡선의 선형 회귀 방정식을 기준으로, 샘플의 농도를 그의 시험된 OD 값을 통해 계산할 수 있다. 상기 식은 하기와 같다:
logOD=Blog[농도]+A
2 개월 된 마우스들에 대한 비교 결과를 도 9에 나타내었다.
4) 세포소멸의 탐지
온코 코포레이션(Oncor Corp.)으로부터 ApoTaq(동일 반응계 세포소멸 탐지 키트)를 사용하여 세포소멸을 탐지하고, 그 과정은 하기와 같다:
1. 파라핀 섹션을 왁스 제거하여 물로 만들고, PBS에 매번 5 분간 2 회 침지시켰다.
2. 조직의 전 처리
조직을 실온에서 15 분간 PBS-희석된 프로테아제 K(20 ㎍/㎖)로 처리하고(60 ㎕/5 ㎠), 이어서 탈이온수로 매번 2 분간 2 회 세척하였다.
3. 내생 페록시다제의 불활성화
조직을 실온에서 PBS-희석된 3% H2O2로 5 분간 처리하고, 이어서 탈이온수로 매번 5 분간 2 회 세척하였다.
4. 샘플 평형화
원치 않는 액체를 조심스럽게 버렸다. 평형 완충액 75 ㎕를 샘플 상에 직접 가하고, 이어서 실온에서 10 초 이상 배양시켰다.
5. TdTase의 결합
원치 않는 액체를 조심스럽게 버렸다. TdTase 작용액(77 ㎕의 반응 완충액 + TdTase 33 ㎕)을 직접 가하고, 이어서 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다.
6. 반응의 종료
샘플을 종결 완충액에 가하고, 15 초간 교반하고, 이어서 실온에서 10 분간 배양을 계속하였다.
7. 항디곡신-공액물의 첨가
샘플을 PBS로 매번 1 분간 3 회 세척하였다. 원치 않는 액체를 조심스럽게 버린 후에, 샘플을 실온-가온된 항디곡신-페록시다제 공액물로 덮고, 이어서 실온에서 30 분간 배양시켰다.
8. 색의 전개
샘플을 PBS로 매번 2 분간 4 회 세척하였다. DAB를 발색을 위해 사용하였다.
9. 물을 사용한 반응의 종료
샘플을 탈이온수로 매번 1 분간 3 회 세척하고, 이어서 탈이온수로 5 분간 계속 세척하였다.
10. 반대 염색
0.5% 메틸 그린(메틸 그린 0.5 g을 0.1M 아세트산 나트륨(pH 4.0) 100 ㎖에 용해시킴)을 사용하여 실온에서 10 분간 반대 염색하였다. 이어서 샘플을 처음 두 번은 탈이온수로 3 회 세척하고, 세 번째는 물에 각각 10 회 침지시키고, 교반 없이 30 초간 물에 침지시켰다. 마지막으로, 샘플을 상기 언급한 방법을 사용하여 100% n-부탄올로 3 회 세척하였다.
11. 슬라이드의 밀봉
샘플을 크실렌에 매번 2 분간 3 회 침지시키고, 이어서 중성 검으로 밀봉시켰다.
결과는 명백한 세포소멸이 트랜스제닉 마우스에서도 15 개월 된 야생형 마우스에서도 탐지되지 않았음을 입증하였다.
실시예 9
HBsAg 유전자의 표적화된 통합을 함유하는 마우스의 혈청 단백질체학에 대한 연구
1) 간 조직으로부터의 단백질의 제조
1. 간 조직을 샘플로서 취하였다;
2. 상기 샘플을 약절구를 사용하여 액체 질소 하에서 분말화시켰다. 용해 완충액(5M 우레아, 2M 티오우레아, 2% SB-30, 2% CHAPS, 1% DTT, 프로테아제 억제제의 혼합물) 5 ㎖을 샘플 g 당 가한 후에, 상기 샘플을 조직 균질화기로 30 초간 균질화시켰다;
3. 조직 현탁액을 15 ℃에서 10 분간 10,000 g에서 원심분리시켰다;
4. 그의 상등액을 4 ℃에서 45 분간 150,000 g에서 초 원심분리시켰다;
5. 이어서 생성된 상등액을 액체 층이 위에 부유하는 것을 조심스럽게 피하면서 꺼내고, 다시 6 ℃에서 50 분간 40,000 g에서 원심분리시켰다;
6. 생성된 상등액을 꺼내었다. 그의 단백질 농도를 브래드포드 방법에 따라 측정한 후에, 상기 상등액을 나누어 -75 ℃에서 보관하였다.
2) 마우스 혈청의 제조
3 개월된 야생형 마우스와 트랜스제닉 동종접합 마우스 각각의 혈액을 실온에서 30 분간 두고, 이어서 3500 g에서 30 분간 원심분리시켰다. 상부 혈청을 취하고 그의 단백질 농도를 PIERCE 코포레이션으로부터 BCATM-단백질 분석 키트(제품 번호 23226)를 사용하여 측정한 후에, 각각의 혈청을 -75 ℃에서 나누어 보관하였다.
3) 혈청 및 간 조직에 대한 단백질체학 분석
1. 등 전압 초점 맞추기
통합된 재 수화 방법을 사용하여, 단백질 250 ㎍을 함유하는 혈청 또는 조직 추출물을 샘플 재 수화 용액(8 몰/ℓ 우레아, 2% CHAPS, 미량의 브로모페놀 블루)에 최종 부피 350 ㎕로 가하고, 여기에 환원체 DTT를 20 밀리몰/ℓ의 최종 농도로 가하고, IPG 완충액을 0.5% 최종 농도로 가하였다. IPG 건조 겔(pH3-10L, 18 ㎝, Amersham Pharmacia Biotech)을 상기 용액에 넣어 하기의 변수들 하에서 등 전압 초점 맞추기를 수행하였다:
단계 전압(V) 시간(h) 전압-시간(Vh)
재 수화 0 12 0
1 500 1 500
2 1000 1 1000
3 8000 4 32000
2. 평형화
등 전압 초점 맞추기 후에, 상기 IPG 겔을 SDS 평형 완충액(50 밀리몰/ℓ의 트리스-Cl(pH 8.8), 6 몰/ℓ의 우레아, 30% 글리세롤(V/V), 2% SDS(V/V), 미량의 브로모페놀 블루)에 넣고, 이어서 진탕기 상에서 매번 10 분간 2 회 진탕시키며, 처음에 상기 평형 완충액은 100 ㎎ DTT를 함유하였고, 두 번째는 250 ㎎의 요오도아세트아미드를 함유하였다.
3. 2 차원 SDS-PAGE 수직 전기영동
IPG 겔의 크기에 따라, 200 x 200 x 1 ㎣의 크기를 갖는 12.5% 균질 겔 조각을 제조하였다. 평형화된 IPG 겔을 SDS-PAGE 상으로 옮긴 다음 미량의 브로모페놀 블루[전기영동 완충액(25 밀리몰/ℓ의 트리스, 250 밀리몰/ℓ의 글리신(pH 8.3), 0.1% SDS에 의해 제조됨]를 함유하는 0.5% 아가로스로 차단시켰다. 14 내지 15 ℃에서, 먼저 겔 당 20 mA의 일정한 전류를 40 분간 통하게 하고, 이어서 브로모페놀 블루가 유리 플레이트의 하부 경계로부터 1 ㎜ 떨어져 이동할 때까지 30 mA로 증가시켰다. 상기 전기영동 겔을 메탄올:아세트산:물(3:3:4)에서 고정시키고, 화려한 쿠마씨 블루 염색액(메탄올:물:아세트산-4.5:4.5:1에 의해 제조된, 0.25% 화려한 쿠마씨 블루 R250)으로 4 시간에 걸쳐 염색하였다. 이어서 7% 아세트산-10% 에탄올을 사용하여 변색시켰다.
4. 2D 겔 전기영동 결과에 대한 분석
전기영동 결과를 에머샴 파마시아 바이오테크 코포레이션(Amersham Pharmacia Biotech Corp.)의 상 분석 소프트웨어 이미지마스터 2D 엘리트 3.01을 사용하여 분석하였다.
5. PAGE로부터의 상이한 단백질들의 효소 절단 및 추출
2D 겔로부터 명백한 차이가 있는 단백질 점들을 선택하고, 이어서 블레이드에 의해 염색 경계를 따라 절단하고, 튜브에 넣고, 50% 아세토니트릴(크로마토그래프 등급), 50 mM 암모늄 비카보네이트를 함유하는 용액으로 변색시키고, 원심분리시키고 진공 하에서 건조시켰다. 0.01 g/ℓ의 트립신 용액 8 내지 10 ㎕를 각 튜브에 가하고, 37 ℃에서 20 시간 동안 배양시켰으며, 이때 트립신은 베링거 코포레이션(변경된, 서열화 등급)으로부터 입수했으며, 그의 용액은 25 밀리몰/ℓ의 암모늄 비카보네이트 용액을 사용하여 제조하였다. 5% 트리플루오로아세트산(TFA, Fluka Corp.) 120 ㎕를 가하고, 40 ℃에서 1 시간 동안 원심분리시켰다. 상등액을 취하고, 이어서 120 ㎕의 2.5% TFA, 50% ACN 용액을 가하고, 30 ℃에서 1 시간 동안 배양시키고, 마지막으로 합하고 동결 건조시켰다.
6. 차별적인 단백질들에 대한 펩티드 질량 핑거프린팅(PMF) 분석
펩티드 혼합물을 0.5% 트리플루오로아세트산 10 ㎕에 용해시킨 다음 동결 건조시켰다. 1 ㎕의 용해된 펩티드 혼합물 또는 탈염된 추출물을 점으로 취하고, 0.1% 트리플루오로아세트산/50% 아세토니트릴에 용해된 1 ㎕의 포화된 1-시아노-4-하이드록시 신남산 용액을 기질로서 사용하고, 이어서 실온에서 건조시켰다. 브룩커 코포레이션(Bruker Corp.)으로부터의 플라이트 질량 분광측정의 REFLEX III 매트릭스 지원된 레이저 탈착/이온화 시간(MALDI-TOF-MS)을 사용하여 단백질들을 337 ㎚의 레이저 길이에서 검출하였다.
7. 데이터베이스의 탐색을 통한 단백질의 예비 식별
단백질 등전점, 분자량 범위 및 펩티드 핑거프린트 프로파일 및 일부 다른 변수들의 입력 데이터에 따라, 이들 변수들에 합치되는 단백질을 단백질 데이터베이스 중에서 데이터베이스 탐색 프로그램의 이점을 취하여 탐색할 수 있다. 웹 상의 단백질 데이터베이스 탐색 프로그램은 하기와 같다: ExPASy 분자 생물학 서버에 의해 제공된 PeptIdent(http://www.expasy.ch/tools/peptident.html) 및 UCSF질량 분광측정 설비에 의해 제공된 MS Fit(http://prospector.ucsf.edu/htmlucsf3.0msfit.htm).
본 발명에 의해 간세포 암종의 마우스 모델과 상기 동물 모델을 확립시키는 방법이 제공된다. 또한 본 발명에 의해 제공된 마우스 모델을 이용하여 간세포 암종 발병을 탐색하고, 이를 조기 진단 및 치료할 수 있으며, 항암약물을 선별할 수 있다.

Claims (17)

  1. a) 관심의 외래 유전자를 표적 부위와 상동인 서열을 갖는 적합한 벡터에 삽입하여 재조합 표적 벡터를 제작하고;
    b) 상기 단계 a)로부터의 표적 벡터를 사용하여 연구된 동물의 ES 세포를 형질감염시키고, 상기 외래 유전자가 특정 부위에 통합된 표적화된 ES 세포를 선별하고;
    c) 상기 단계 b)로부터 수득된 표적화된 ES 세포를 상기 동물의 포배에 주입하고 상기 포배를 생체 외에서 배양하여 표적화된 ES 세포를 갖는 배아를 생성시키고;
    d) 상기 단계 c)로부터 생성된 배아를 상기 동물의 자궁에 이식하여 상기 외래 유전자를 안정하게 발현하는 자손을 발육시킴
    을 포함하는 동물 모델의 확립 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 관심의 외래 유전자가 HBV, HCV, HIV 등으로부터 선택된 바이러스 유전자, 또는 다른 병인 미생물들의 유전자를 포함하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 관심의 외래 유전자가 HBV 유전자인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 관심의 외래 유전자가 HBsAg 유전자 또는 HBV X 유전자인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 표적 벡터가 관심의 외래 유전자, 표적 부위의 상동 서열, 양성 및 음성 선별 마커를 포함하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 동물이 마우스인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 관심의 외래 유전자를 마우스의 p21 유전자 좌에 삽입하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 관심의 외래 유전자를 마우스 p21 유전자 좌의 제 2 엑손에 삽입하는 방법.
  9. 세포 게놈상의 p21 유전자 좌가 관심의 외래 유전자에 의해 삽입되는 것을 특징으로 하는 마우스 세포.
  10. 제 9 항에 있어서, 동일한 유전자형을 갖는 배아 줄기 세포 또는 체 세포인 세포.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 관심의 외래 유전자가 HBV, HCV, HIV 등으로부터 선택된 바이러스 유전자, 또는 다른 병인 미생물들의 유전자를 포함하는 세포.
  12. 제 1 항의 방법에 의해 수득된 트랜스제닉 동물.
  13. 염색체에 관심의 외래 유전자가 유전자 노크-인(knock-in) 방법에 의해 부위 특이적으로 통합됨을 특징으로 하는 트랜스제닉 마우스.
  14. 제 13 항에 있어서, 관심의 외래 유전자가 HBV, HCV, HIV 등으로부터 선택되는 바이러스 유전자, 바람직하게는 HBsAg 유전자 또는 HBV X 유전자인 트랜스제닉 마우스.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 관심의 외래 유전자가 마우스의 p21 유전자 좌에 부위 특이적으로 삽입됨을 특징으로 하는 트랜스제닉 마우스.
  16. HbsAg 유전자가 마우스의 p21 유전자 좌에 부위 특이적으로 삽입되고, 관심의 외래 유전자가 안정하게 유전되고 발현되며, 정상적으로 발달하고, 일정 시간 후에 간세포 암종이 나타남을 특징으로 하는 트랜스제닉 마우스.
  17. 간세포 암종 발병의 탐색, 그의 조기 진단 및 치료, 및 항암약물의 선별에서 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 하나의 항에 따른 트랜스제닉 마우스의 용도.
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