CN114617103A - 一种eb病毒感染棉耳绒猴模型的构建方法 - Google Patents
一种eb病毒感染棉耳绒猴模型的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种EB病毒感染棉耳绒猴模型的构建方法，包括对棉耳绒猴进行EB病毒感染；所述EB病毒感染剂量为1～2×1010copies/kg。本发明首次构建了EB病毒感染棉耳绒猴模型，通过对病毒滴度、剂量、麻醉方式等条件的优化，可以使棉耳绒猴长期携带EB病毒，第18周淋巴结中仍然检测到了EB病毒存在；为EB病毒的预防性疫苗及感染EB病毒后清除及控制提供了灵长类动物模型；可用于EB病毒疫苗保护效果尤其是长期保护效果的评价；而且建立了系统的分子，影像及病理检测体系，能够全方位，动态的检测并提供不同滴度EB病毒感染棉耳绒猴的全方面资料。
Description
技术领域
本发明属于动物模型构建领域，具体涉及一种EB病毒感染棉耳绒猴模型的构建方法。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus)属γ-孢疹病毒，是一种普遍存在的人类病毒，可感染全球90％以上的人口。它具有潜在感染正常上皮细胞、B淋巴细胞和NK/T细胞的特性，当人体免疫系统失调时可发展成多种疾病甚至恶性肿瘤，如传染性单核细胞增多症(IM)，免疫缺陷个体B细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤(BL)，霍奇金病(HG)，NK/T细胞淋巴瘤，胃癌和鼻咽癌等。
因为其具有潜在致癌性，所以研发预防性疫苗来阻断其感染显得尤为重要。EB病毒具有寄主嗜好性，在自然界的正常寄主为人。虽然人们已建立了EB病毒感染人源化小鼠的动物模型，但是人源化小鼠不能产生体液免疫。体液免疫尤其中和抗体的产生对EB病毒的预防至关重要，因此构建一种EB病毒能够感染且免疫系统正常的动物模型对其疫苗研发显得格外重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种EB病毒感染棉耳绒猴模型的构建方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种EB病毒感染棉耳绒猴模型的构建方法，包括对棉耳绒猴进行EB病毒感染；所述EB病毒感染剂量为1-2×1010copies/kg。
在本发明的一些实施方式中，所述EB病毒感染剂量为500～800GRU/kg；其中关于GRU与病毒拷贝数的转换方式是：把相应GRU量的EB病毒提取DNA，用定量PCR计算出这些GRU里面EB病毒DNA的拷贝数。
在本发明的一些实施方式中，所述EB病毒感染的方式为接触传播、口服、静脉注射、皮下注射、腹腔注射或粘膜给药。
在本发明的一些实施方式中，所述EB病毒感染的方式为静脉注射和/或腹腔注射；所述静脉注射进一步为大腿静脉注射。
在本发明的一些实施方式中，还包括感染前进行麻醉，麻醉时使用的麻醉剂为舒泰、氯胺酮、戊巴比妥中的至少一种。优选为舒泰，因为舒泰能获得最好的麻醉效果，即5分钟内即入睡且麻醉时间长达1小时。其中本发明对舒泰的具体规格不做限定，常用的有舒泰20、舒泰50、舒泰100等规格均可。
在本发明的一些优选实施方式中，所述麻醉剂的使用剂量为12～16mg/kg，例如12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg或16mg/kg。
在本发明的一些优选实施方式中，所述麻醉剂的使用剂量为14mg/kg。
在本发明的一些实施方式中，所述舒泰的主要成分为替来他明和唑拉西半；其中替来他明6-8mg/kg，唑拉西半6-8mg/kg。
在本发明的一些实施方式中，所述麻醉剂的注射方式为肌肉注射、皮下注射或静脉注射；优选为肌肉注射。
在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括对模型进行评估；所述评估内容包括：体重，体温，身体状况、EB病毒抗体滴度、EB病毒拷贝数、棉耳绒猴淋巴结状况或EBER鉴定。
在本发明的一些实施方式中，所述棉耳绒猴淋巴结状况为棉耳绒猴腋窝淋巴结状况、腹股沟淋巴结状况。
在本发明的一些实施方式中，所述EB病毒拷贝数检测是选择EB病毒的BALF5基因作为检测其拷贝数的基因。
在本发明的一些实施方式中，通过PCR检测BALF5基因。
在本发明的一些实施方式中，所述PCR中扩增BALF5基因的引物序列为：
BALF5-1F：5’-GGTCACAATCTCCACGCTGA-3’；
BALF5-1R：5’-CAACGAGGCTGACCTGATCC-3’。
在本发明的一些实施方式中，所述棉耳绒猴腋窝及腹股沟淋巴结状况的检测是通过PET、MR、CT、PET-MR、PET-CT、超声检测中的一种或多种进行检测。
在本案发明的一些优选实施方式中，所述棉耳绒猴腋窝及腹股沟淋巴结状况的检测是通过PET、PET-MR或PET-CT进行检测。
在本发明的一些实施方式中，在进行检测时，所用的显像剂为F18-FDG、F18-FLT、氨基酸、胆碱、受体显像剂、核苷酸或11C乙酸酯；优选为F18-FDG。
在本发明的一些实施方式中，所述显像剂的剂量1～3m ci/kg，例如1.1m ci/kg、1.2m ci/kg、1.3m ci/kg、1.4m ci/kg、1.5m ci/kg、1.6m ci/kg、1.7m ci/kg、1.8m ci/kg、1.9m ci/kg、2.0m ci/kg、2.1m ci/kg、2.1m ci/kg、2.2m ci/kg、2.3m ci/kg、2.4m ci/kg、2.5m ci/kg、2.6m ci/kg、2.7m ci/kg、2.8m ci/kg、2.9m ci/kg或3.0m ci/kg。
在本发明的一些实施方式中，所述显像剂的剂量2m ci/kg。
在本发明中，对棉耳绒猴的年龄及性别对EB病毒的感染并无相关研究，不对棉耳绒猴的年龄与性别进行特殊限定。
本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述的构建方法制备得到的EB病毒感染棉耳绒猴模型的用途：
(I)用于筛选或评价能够预防、缓解或者治疗EB病毒感染的药物；或
(II)用于筛选或评价能够预防EB病毒感染的疫苗；或
(III)在研究所述EB感染过程或发病机理。
本发明的第三方面，提供一种棉耳绒猴身体病变情况的检测方法：通过PET和/或MR对棉耳绒猴进行检测，其中PET的检测参数见下表：
| 采集时间 | 矩阵 | FOV视野 | 层厚 | 重建算法 | 其他 |
| 30分钟 | 192*192 | 300mm | 1.6mm | OSEM | TOF |
MR的检测参数见下表：
PET-MR检查大幅度减低了放射的损伤，与其他手段相比，它的灵敏度高、准确性好。但是在本专利之前，PET-MR主要是用于人类的疾病检测，并没有使用PET-MR技术进行猴类特别是棉耳绒猴的相关研究；但人类和猴的身体状况相差较多，适用于人类检测的PET-MR参数并不能很好的对棉耳绒猴进行检测。发明人通过大量工作研究出适合棉耳绒猴的PET-MR检测参数，不仅能对棉耳绒猴腋窝淋巴结状况、腹股沟淋巴结状况进行检测，还可以对身体的其他高摄取和病变部位进行准确检测，也可以用于其他猴类检测，填补了这方面的空白。
本发明的有益效果是：
本发明首次构建了EB病毒感染棉耳绒猴模型，通过对病毒剂量、麻醉方式等条件的优化，可以使棉耳绒猴长期携带EB病毒，长达8周，此外，在优化的EB病毒剂量范围下，还具有安全性，感染后的模型可长期存活，且体重不减，综合状态良好；为EB病毒的预防性疫苗提供了灵长类动物模型；可用于EB疫苗保护效果尤其是长期保护效果的评价。
本发明还建立了系统的分子，影像及病理检测体系，能够全方位，动态的检测并提供不同滴度EB病毒感染棉耳绒猴的全方面资料。特别是建立了一种检测棉耳绒猴的PET-MR检查方法，可以更准确的检测棉耳绒猴的身体病变状况。
本发明的模型构建时间短且操作简单、易于观察、节约成本、稳定性好，重复性强，建模成功性高。
附图说明
图1为体温检测图。
图2为体重检测图。
图3为注射EB病毒后不同时间点检测棉耳绒猴血液里EB病毒拷贝数。
图4为EB病毒感染后不同时间点检测血液里EB病毒特异性抗体。图4A为检测EB病毒糖蛋白gB的IgM的滴度；图4B为检测EB病毒糖蛋白gHgL的IgM的滴度；图4C为检测EB病毒糖蛋白gp350的IgM的滴度。
图5为EB病毒感染后不同时间点检测淋巴结大小的变化的成像效果图。
图6为EB病毒感染后不同时间点检测淋巴结大小的变化的统计图。
图7为EB病毒感染后不同时间点检测淋巴结代谢情况的成像效果图。
图8为EB病毒感染后不同时间点检测淋巴结代谢情况的统计图。
图9为EB病毒感染后不同时间点检测的整体代谢显示图。
图10为EB病毒感染后检测腋窝淋巴结细胞液EBER。图10A为阳性对照；图10B为高剂量EB病毒组；图10C为PBS对照组。
图11为EB病毒感染后检测腋窝淋巴结组织EBER。图11A为PBS对照组组；图11B为注射高剂量EB病毒组；图11C为注射低剂量EB病毒组。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
EB病毒：又称人类4型疱疹病毒，属于γ疱疹病毒亚科，是一种人类致癌性病毒。
RPMI-1640培养基：一种细胞培养基，主要用来培养肿瘤细胞系。
FBS：又名胎牛血清，用来给培养的细胞提供营养因子。
CNE2-EBV-GFP细胞：一种鼻咽癌上皮细胞系，里面携带EBV基因组，用来诱导产生带有绿色荧光的EB病毒。
TPA：(2S)-(1-四氢嘧啶-2-酮)-3-甲基丁酸。
丁酸钠：英文名称Sodium butyrate。
G418：Geneticin，遗传霉素，是一种氨基糖苷类抗生素。
Akata-细胞：一种人的淋巴母细胞样，不带EB病毒基因组。
HNE1-细胞：人的鼻咽癌上皮细胞系。
GRU(Green Raji Unit)：EB病毒滴度单位，计算公式如下GRU＝总的Raji细胞数目×GFP Raji％/EB病毒体积。
TD50：B细胞的转化单位(Transforming dose)。
PET：正电子发射型计算机断层显像(Positron Emission ComputedTomography)，是核医学领域比较先进的临床检查影像技术。
MR：磁共振检查(Magnetic Resonance)是医学检查的一种方法。
超声检查：一种基于超声波(超声)的医学影像学诊断技术，使肌肉和内脏器官(包括其大小、结构和病理学病灶)可视化。
舒泰50：又名盐酸替他来明盐酸唑拉西泮，用来麻醉动物绒猴。
盐酸氯胺酮：全名为2-邻氯苯基-2-甲氨基环己酮。
PCR：PCR一般指聚合酶链式反应。其是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。
qPCR：实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
EBER检测：EBER是EB病毒编码的一种小RNA，在EB病毒感染的细胞核里以高拷贝存在。
PET-MR：正电子发射计算机断层显像仪PET和核磁共振成像术MR两强结合一体化组合成的大型功能代谢与分子影像诊断设备，同时具有PET和MR的检查功能，可以进行全身解剖水平+代谢水平的检查，缩短检查时间，辐射低且无电离辐射。
F18-FDG：又称2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖，PET显影剂。
仪器为联影uPMR 790。
实验材料：FBS购于Invitrogen公司、RPMI 1640购于Invitrogen公司、EBER检测试剂盒购于中山金桥、qPCR试剂购于Takara、舒泰50购于维科贸易有限公司、盐酸氯胺酮购于中牧倍康公司。
实施例1 PET MR参数
PET MR主要用于人体影像检测；其在人体检测时参数见表1和表2：
表1人PET参数
| 采集时间 | 矩阵 | FOV视野 | 层厚 | 重建算法 | 其他 |
| 30分钟 | 150*150 | 500mm | 2.8mm | OSEM | TOF |
表2人MR参数
但是用于人类的参数并不适用于猴类，特别是棉耳绒猴，现有技术中也没有棉耳绒猴的PET-MR检测的相关研究。申请人用人的参数对棉耳绒猴进行检测，结果表明用人的参数扫描绒猴图不清晰，不能获得清晰呈现。
申请人根据棉耳绒猴的特性进一步优化调整参数，主要通过TE回波时间，TE重复时间，矩阵等参数进行摸索,确保最优的参数组合，因为参数钟只要有一个不合适就导致得不到最优的呈像结果，最终得到了一种可以用于棉耳绒猴以及其他猴类的PET-MR检测参数，可以准确的评估棉耳绒猴的病变状况，具体见表3和表4：
表3棉耳狨猴PET参数
| 采集时间 | 矩阵 | FOV视野 | 层厚 | 重建算法 | 其他 |
| 30分钟 | 192*192 | 300mm | 1.6mm | OSEM | TOF |
表4棉耳狨猴MR参数
实施例2EB病毒的产生与定量
1)培养CNE2-EBV+细胞，培养基为维持培养基(RPMI-1640培养基+10％FBS+1％链霉素/青霉素+G418)，37℃，5％CO2细胞培养箱培养。
2)当CNE2-EBV+细胞密度达到100％时，往里加入丁酸钠和TPA，共培养12小时后，撤去含有丁酸钠和TPA的培养基，加入不含G418的维持培养基。
3)培养3天后，收集上清，2000rpm，10分钟，25℃，将上清用0.8μm的细胞过滤器过滤。将滤液转入超速离心管，50000rpm,3小时，4℃。
4)弃上清，将病毒颗粒用RPMI-1640培养基溶解并分装冻存-80℃。
5)取-80℃冻存的EB病毒，插入冰里解冻。
6)取细胞活性良好的Akata-细胞，按照1万/每孔转移到96孔板里，每孔体积为100μl(培养基成分为RPMI-1640+10％FBS+1％链霉素/青霉素)。
7)分别加入20μl，10μl，5μl，2.5μl和1.25μl的浓缩病毒至96孔板里，每个病毒量3个重复。
8)将体积补至200μl，培养2天。
9)流式细胞仪器检测Akata-细胞里GFP阳性细胞比例，并将其按照公式算出EB病毒GRU滴度。计算公式如下GRU＝总的Raji细胞数目×GFP Raji％/EB病毒体积。
实施例3 EB病毒感染棉耳绒猴
1)取3只健康的雌性，2-3岁的棉耳绒猴，将其隔离饲养，一只/一笼。
2)取PBS溶解的舒泰50，按照14mg/kg的剂量计算并肌肉注射棉耳绒猴，等其麻醉后进行后续处理，将之前冻存的EB病毒从-80℃取出放入冰中解冻。
3)用1ml的注射器吸取0.5ml血液，将其转移入肝素钠的血液收集管中，取50μl全血-80冻存。其余1500rpm，10min，4℃，血清-80℃冻存，血细胞分离PBMC。
4)采血后，取1只棉耳绒猴(300g)设为高剂量组(High dose EBV)，高剂量绒猴300g，感染剂量为：EBV 200万GRU，EB病毒DNA拷贝数为4.2×109；用1ml的注射器吸取CNE2-EBV-GFP细胞产的1ml 200万GRU单位的EB病毒，大腿静脉注射0.5ml，同时腹腔注射0.5ml。取1只棉耳绒猴(250g)设为低剂量组(Low dose EBV)，低剂量绒猴250g，感染剂量为：EBV 2万GRU，EB病毒DNA拷贝数为4.2×107：用1ml的注射器吸取CNE2-EBV-GFP细胞产的1ml 2万GRU单位的EB病毒，大腿静脉注射0.5ml，腹腔注射0.5ml。取1只棉耳绒猴(300g)设为对照组(No EBV)：用1ml的注射器吸取1m的PBS，大腿静脉注射0.5ml，腹腔注射0.5ml。
5)EB病毒感染完棉耳朵绒猴前后，每天测量其体温及体重，同时每周做PET-MR，采血及采集唾液。
其中体温检测结果见图1；结果表明注射EB病毒(200万GRU单位)不会引起棉耳绒猴体温剧烈波动。体重检测图见图2；结果表明除了第0周到第一周，因为绒猴转入到新的环境，会体重降低外，第2周体重开始回升。同时在注射高剂量的EB病毒后，也不会对绒猴体重有影响，综合体温，体重表明，200万GRU的EB病毒不会影响棉耳绒猴的体温，体重，猴身体状况良好。
关于麻醉剂，申请人用盐酸氯胺酮25mg/kg，静脉注射进行麻醉，发现猴子入睡需要20分钟，且麻醉程度低，很容易翻动，会影响PET-MR扫描。申请人还尝试了氯胺酮，戊巴比妥麻醉剂，但是均不能达到深度麻醉效果。因此选用舒泰50进行麻醉，能获得最好的麻醉效果，即5分钟内即入睡且麻醉时间长达1小时。
实施例4 EB病毒感染棉耳绒猴后检测血液里EB病毒的拷贝数
1)注射EB病毒前和注射病毒后，每周将棉耳绒猴用舒泰麻醉后，用1ml的注射器吸取大腿静脉0.5ml血，转移到肝素钠抗凝管中。
2)取50μl全血提取DNA，具体步骤如下：
a)选用omega公司的E.Z.N.A.Tissue DNA Kit，将各试剂按照说明书配置好。
b)将全血转移入1.5ml灭菌管中，加入200μl试剂盒里提供的elution buffer。
c)加入25μl OB protease solution。
d)加入250μl BL buffer。涡旋震荡。
e)放入70℃金属加热器加热10分钟。
f)加入250μl无水乙醇，混合均匀，将其转移入2ml DNA收集管中。
g)离心机12000g，25℃，1分钟。
h)加入500μl HBC，12000g，30秒。
i)加入洗脱液700μl，12000g，1分钟，弃废液。
j)重复上述1次。
k)空管12000g，2分钟。
l)室温放置2分钟。
m)将收集柱放入新的灭菌管中，加入提前70℃加热的灭菌水，静止2分钟，12000g，2分钟。
3)选择EB病毒的BALF5基因作为检测其拷贝数的基因，引物序列如下：
BALF5-1F：5’-GGTCACAATCTCCACGCTGA(SEQ ID NO.1)-3’；
BALF5-1R：5’-CAACGAGGCTGACCTGATCC(SEQ ID NO.2)-3’。
配置体系见表5。
表5 qPCR反应体系
| 成分 | 体积 |
| SYBR染料(2X) | 10μl |
| BALF5-1F 5’(10μM) | 0.3μl |
| BALF5-1R 5’(10μM) | 0.3μl |
| 无菌超纯水 | 补足至20μl |
qPCR反应程序见表6。
表6 qPCR反应程序
4)根据网站http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html计算血液中DNA。
结果见图3，第0周采血后，麻醉并注射EB病毒，和上述体温，体重实验是同时做的。提取血液里的DNA，qPCR检测EB病毒拷贝数，结果表明注射EB病毒前血液中检测不到EB病毒基因组，注射EB病毒后，高剂量组血液中EB病毒先升高后降低，但是在注射后第8周仍然保持一个可检测到的水平。同时低剂量组在第5周后就降低到了低水平，即基线处。此结果表明只有注射200万GRU的高剂量EB病毒才可以使棉耳绒猴长期携带EB病毒。
实施例5 EB病毒感染后检测血清中EB病毒膜蛋白gLgH，gB和gp350特异性IgM抗体的滴度
1)用ELISA包被液(30mM碳酸氢钠，10mM碳酸钠，PH 9.6)稀释抗原蛋白，至浓度为100ng/100μl。
2)取Elisa板取抗原蛋白加入，每孔100ng，放入37℃恒温箱2小时。
3)用PBST洗板2次。
4)将PBS溶解的3％牛血清蛋白加入Elisa板里，每孔200μl。
5)将Elisa板转入4℃冰箱，放置过夜。
6)第2天早上将板取出，用PBST洗3遍。
7)将血清按照100倍比例，用PBS按照2倍稀释至12800倍。
8)放入37℃恒温箱，静止2小时，用PBST洗5遍。
9)将耦联HRP的抗人IgM的抗体用3％BSA稀释5000倍，室温放置1小时。
10)用PBST洗5遍，加入Elisa反应液。
11)15分钟后用终止液中止反应。
12)用酶连免疫检测仪检测OD450，计算滴度。
结果见图4，取注射EB病毒前和注射EB病毒后的不同时间点的血清做Elisa，检测EB病毒糖蛋白gp350，gHgL和gB的IgM的滴度，结果表明gB的特异性IgM抗体滴度最高，其次gHgL的特异性IgM抗体滴度，gp350的特异性IgM抗体滴度最低。
实施例6 EB病毒感染棉耳绒猴PET-MR观察腋窝、腹股沟等淋巴结变化
1)取高剂量EB病毒感染绒猴，低剂量EB病毒感染绒猴和PBS对照组。
2)将实验棉耳绒猴不喂水和食物12小时。
3)称体重，用舒泰50，按照14mg/kg的量肌肉注射。
4)棉耳绒猴麻醉后，按照2m ci/kg吸取一定量的FDG-18F，选用胰岛素针在腿末端静脉注射，测定注射前和注射后的放射量。
5)将棉耳绒猴放入PET-MR仪器里，此时猴子用医用纱布包裹，防止猴子在实验过程中体温过低和活动，从而影响最终图像的质量。
6)PET-MR检查结束后，将棉耳绒猴用保暖围布盖好，放入笼子中，等其有意识了用无针头注射器葡萄糖注射液，恢复能量。
EB病毒感染后不同时间点检测淋巴结大小的变化见图5和图6。
本实施例中所用的PET-MR参数见表7和表8。
表7 PET参数
| 采集时间 | 矩阵 | FOV视野 | 层厚 | 重建算法 | 其他 |
| 30分钟 | 192*192 | 300mm | 1.6mm | OSEM | TOF |
表8 MR参数
PET-MR结果表明，高剂量EB病毒注射后棉耳绒猴腋窝淋巴结体积明显增大。同比低剂量EB病毒组和PBS对照组，体积明显更大。图5为成像效果图，图6为淋巴结体积统计图。综合表明只有200万GRU高剂量EB病毒感染会引起棉耳绒猴淋巴结肿大。
EB病毒感染后不同时间点检测淋巴结代谢情况见图7-图9。
PET-MR结果表明，高剂量EB病毒注射后棉耳绒猴腋窝淋巴结代谢明显增强。同比低剂量EB病毒组和PBS对照组，代谢最强。图7为成像效果图，图8为淋巴结代谢统计图。下面组图为整体代谢显示图，图9为腋窝黑色表示组织代谢旺盛。综合表明只有200万GRU高剂量EB病毒感染会引起棉耳绒猴淋巴结代谢增强，该代谢增强有可能是炎症或病变引起。
实施例7棉耳绒猴腋窝淋巴液获得及EBER鉴定
1)将棉耳绒猴秤体重后，按照14mg/kg的剂量麻醉绒猴，等其沉睡后，用耦合剂涂腋窝，然后用探头检查，当其检测到相应淋巴结时，用1ml注射器插入并吸取淋巴液，将吸取淋巴液转入无菌1.5ml离心管里。
2)将装有淋巴液EP管用甩片机，甩片成功后，用组化笔画圈，空气干燥20min。
3)用4％多聚甲醛处理20分钟后PBS冲洗，70％，80％，90％，95％，100％酒精梯度脱水。
4)空气干燥，用胃蛋白酶消化30分钟，37℃。
5)弃去胃蛋白酶，70％，80％，90％，95％，100％酒精梯度脱水，空气干燥。
6)添加EBER探针，硅胶水泥封片，湿盒，37℃，避光，过夜。
7)去除硅胶水泥，PBST洗3遍，每次2分钟。
8)加入HRP标记抗地高辛抗体，37℃，30分钟，PBS洗3次，每次2分钟。
9)DAB显色15分钟。
10)复染，脱水，透明及封片。
EB病毒感染后检测腋窝淋巴结细胞液EBER见图10。
EB病毒注射棉耳绒猴后第18周检测腋窝淋巴结淋巴液，做EBER检测，图10A阳性对照(EB病毒阳性细胞)，图10B注射高剂量EB病毒呈现阳性，细胞核原位杂交实验显示存在EBER，颜色棕色，图10C注射PBS对照组EB病毒为阴性，细胞核原位杂交实验显示无EBER。
实施例8棉耳绒猴腋窝淋巴组织获得及EBER鉴定
1)将棉耳绒猴秤体重后，按照14mg/kg的剂量麻醉绒猴，等其沉睡后，取其右侧淋巴结组织。
2)4％多聚甲醛固定及石蜡包埋。
3)切片，烤片及脱蜡。
4)后面程序与步骤与淋巴液的EBER鉴定一样。
EB病毒感染后检测腋窝淋巴结组织EBER见图11。
EB病毒注射棉耳绒猴后第20周检测腋窝淋巴结，做EBER检测。图11A为注射PBS对照组右侧腋窝淋巴结组织EBER鉴定为阴性(无褐色)，图11B为注射高剂量EB病毒组右侧腋窝淋巴结组织EBER鉴定为阳性(褐色沉淀)，图11C为注射低剂量EB病毒右侧腋窝淋巴结EBER鉴定为阴性。该图表明注射200万GRU的高剂量EB病毒会使棉耳绒猴长期携带EB病毒，2万GRU的低剂量EB病毒不会使棉耳绒猴长期携带EB病毒。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究
所)
<120> 一种EB病毒感染棉耳绒猴模型的构建方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtcacaatc tccacgctga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caacgaggct gacctgatcc 20
Claims (10)
1.一种EB病毒感染棉耳绒猴模型的构建方法，其特征在于，包括对棉耳绒猴进行EB病毒感染；所述EB病毒感染剂量1～2×1010copies/kg。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述EB病毒感染的方式为接触传播、口服、静脉注射、皮下注射、腹腔注射或粘膜给药；优选为静脉注射和/或腹腔注射。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括感染前进行麻醉的实验步骤；优选地，麻醉时使用的麻醉剂为舒泰、氯胺酮和戊巴比妥中的一种或多种；更优选地，所述麻醉剂为舒泰。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述麻醉剂的使用剂量为12～16mg/kg。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述方法还包括对模型进行评估；所述评估内容包括：体重、体温、身体状况、EB病毒抗体滴度、EB病毒拷贝数、棉耳绒猴淋巴结状况或EBER鉴定。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述EB病毒拷贝数检测是选择EB病毒的BALF5基因作为检测其拷贝数的基因；优选为通过PCR检测BALF5基因；优选地，所述PCR中扩增BALF5基因的引物序列为：
BALF5-1F：5’-GGTCACAATCTCCACGCTGA-3’；
BALF5-1R：5’-CAACGAGGCTGACCTGATCC-3’。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述棉耳绒猴腋窝及腹股沟淋巴结状况的检测是通过PET、MR、CT、PET-MR、PET-CT、超声检测中的一种或多种进行检测；优选地，通过PET、PET-MR、PET-CT中的一种或多种进行检测。
8.根据权利要求8所述的构建方法，在进行检测时，所用的显像剂为F18-FDG、18F-FLT、氨基酸、胆碱、受体显像剂、核苷酸或11C乙酸酯；优选地，所述显像剂的剂量1～3m ci/kg。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述的构建方法制备得到的EB病毒感染棉耳绒猴模型的用途：
(I)用于筛选或评价能够预防、缓解或者治疗EB病毒感染的药物；或
(II)用于筛选或评价能够预防或清除EB病毒感染的疫苗；或
(III)在研究所述EB病毒感染过程或发病机理。
10.一种棉耳绒猴身体病变情况的验证方法：通过PET和/或MR对棉耳绒猴进行检测，其中PET的检测参数为：
；
MR的检测参数为：
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2022
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| 谭志强: "基于 PET/MR 影像猴脑模板的食蟹猴脑结构和葡萄糖代谢的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》, 15 March 2021 (2021-03-15), pages 6 - 8 * |
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