KR20100119339A - 플라스미드 셔틀 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 유산균용 벡터에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드 및 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드와 대장균 유래 벡터를 연결하여 제조된 셔틀벡터에 관한 것이다. 본 발명의 플라스미드는 미생물에 대한 항균활성과 장내부착성이 우수한 유산균인 락토바실러스 펜토서스로부터 분리한 RCR형(rolling-circle replication type, RCR type) 벡터로 락토바실러스 펜토서스에 안정적으로 도입되고 복제가능하며, 유산균에서 목적하는 외부 유전자 및 유용 유전자 발현에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 유전자 도입 후에도 해당 유산균의 장내부착성이 유지될 수 있어, 생균활성제로 이용가능한 유산균에 유용한 외부 유전자를 발현시킬 수 있는 백본(backbone)벡터로 이용될 수 있으므로 다양한 산업분야에 응용이 기대된다.
유산균, 플라스미드, RCR형 벡터, 셔틀벡터

Description

플라스미드 셔틀 벡터{A PLASMID SHUTTLE VECTOR}
본 발명은 유산균, 구체적으로 락토바실러스 펜토서스로부터 분리된 플라스미드와 상기 플라스미드 및 대장균 유래 벡터를 연결하여 제조된 대장균-유산균 셔틀벡터 플라스미드에 관한 것이다.
유산균은 당류를 발효해서 50% 이상 젖산을 생성하는 세균으로, 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물이다. 음식물뿐만 아니라 포유동물의 구강과 소화관, 토양 등 자연계에 널리 분포하고 있으며, 식품의 보존과 관능적 특성과 관련된 중요한 역할 등을 수행하는 인간생활에 유익한 균주이다. 전 세계적으로 오랜 기간에 걸쳐 유산균 함유 발효 식품으로 널리 식품으로 사용된 유산균은 최근에 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물로 안정성을 인정받고 있다.
이러한 유산균의 안정성 및 유산균이 건강에 좋다는 인식을 기초로 하여 유산균 함유 식품을 통하여 건강을 유지하고, 질병을 예방하려는 노력이 증대되었으며, 이와 함께 유산균을 기능성 식품에 사용하기 위하여 잠재력을 평가하기 위한 프로바이오틱 유산균에 대한 연구가 전 세계적으로 광범위하게 진행되고 있다.
프로바이오틱 유산균은 유래 및 이용에 대한 안정성이 인정될 뿐만 아니라 위장관 상부의 산성 조건 및 담즙 존재 하에서도 존재하여야 하고, 대장에서 부착이 가능해야 하며, 균주 안정성이나 생존력이 뛰어나야 한다. 현재 상기 요구 조건을 만족하는 프로바이오틱 유산균은 락토바실러스 속 균주(Lactobacillus sp.)와 비피도박테리움 균주(Bifidobacterium strain)가 대부분이다.
한편, 김치는 특별한 지식 없이도 가정에서 누구나 전래의 보편적인 방법으로 제조 가능한 식품으로, 보다 구체적으로는 삼국시대부터 발달한 한국의 대표적 전통발효식품으로 소금물에 절인 배추나 무 등의 채소류에 고춧가루, 파, 마늘 등의 양념류를 혼합하여 생활환경 주변에 존재하는 미생들에 의한 발효과정을 거쳐 숙성되는 대표적인 한국의 발효식품 중 하나이다.
최근에는 김치의 유용성에 관한 연구가 다수 발표되었으며, 일 예로 면역활성 증진 및 항암효과 등의 생리활성 기능이 밝혀지면서 영양공급 외에도 건강유지에 꼭 필요한 식품으로 인식되고 있고, 신선한 야채를 열처리하지 않고 담그기 때문에 야채의 모든 영양소가 유지되어 유산균에게 좋은 서식환경을 제공할 수 있으므로 유산균의 함유량이 발효유제품에 비하여 놓은 것으로 보고되어 있다.
상기 유산균에 대한 연구는 주로 유제품에 대해서 진행되어 왔으며, 오랜 역사에 비해 김치발효과정에 관여하는 유산균에 대해서는 최근에서야 체계적이고 과학적인 연구가 진행되고 있다.
상기와 같은 연구 동향에 따라, 최근에는 김치로부터 분리된 미생물로서 프로바이오틱 유산균의 조건을 만족하는 유산균에 대한 연구와 함께, 상기 유산균을 이용한 유전자 발현시스템에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
이러한 연구 중, 최근에 관심이 집중되는 연구분야는 인체에 유익한 고부가가치성의 물질을 미생물 특히, GRAS 미생물인 유산균을 이용하여 대량 생산하기 위한 연구로, 구체적으로 유산균에 특정 유전자를 발현시키는 새로운 유전자 발현시스템에 관한 것이다.
상기 유산균을 이용한 유전자 발현시스템은 유산균 원래의 특성 이외에 새로운 기능을 가진 유산균을 개발하기 위한 것으로, 외래 유전자를 유산균에 안전하게 도입하고 발현시키는 것, 즉 형질전환을 위한 연구가 주를 이루고 있다.
유산균의 형질전환과 관련하여 초기에 사용되었던 방법인 컨쥬게이션 법(conjugation method)이나 원형질법(protoplast method)은 낮은 형질전환 효율을 나타낼 뿐만 아니라 시간 소모적이고 재현성이 떨어지는 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 플라스미드를 이용한 전기천공법(electropoartion)이 제시되었다. 상기 전기천공법을 이용한 형질전환을 수행하기 위해서는 필수적인 요소가 바로 외래 유전자를 전달할 수 있는 운반체, 즉 벡터이다.
따라서, 유산균에 특정 유전자를 발현시키는 새로운 유전자 발현시스템과 관련하여, 유산균에 이용가능한 벡터에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 복제안정성과 관련된 문제를 해결하기 위하여, 대장균에서 안정적인 복제를 수행하기 위하여, 대장균에서도 복제가 가능한 셔틀벡터의 제조가 가능한 유산균 벡터 및 이를 이용한 셔틀벡터와 셔틀벡터를 이용한 벡터시스템의 개발에 관한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
본 발명은 유산균에 이용가능한 플라스미드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 유산균에 이용가능한 플라스미드와 대장균 유래 벡터를 연결하여 제조된 셔틀벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점(Ori) 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질(replication initiation protein, Rep protein) 유전자를 포함하는 플라스미를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점(Ori) 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미와 대장균 유래 벡터를 연결하여 제조된 셔틀벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 셔틀벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 발명자는 발효음식 특히, 우리나라의 전통음식인 김치로부터 분리된 유산균에 외래 유전자를 안전하게 도입하고 발현시킬 수 있는 유전자 발현시스템을 연구하던 중, 김치로부터 분리되고, 장내부착성이 우수하여 생균활성제로 사용될 수 있으며, 유해 미생물에 대한 항균활성이 뛰어나고, 사이토카인의 분비를 유도하여 면역력 증강 효과가 있는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)에 속하는 균주로부터 셔틀벡터로 이용가능한 크기의 RCR형 플라스미 드(rolling-circle replication type plasmid, RCR type plasmid)인 p1-4를 분리하고, 상기 플라스미드인 p1-4의 복제형태를 분석한 후, 대장균 유래 벡터와 재조합한 셔틀벡터(shuttle vector)를 제조하였으며, 상기 셔틀벡터를 이용한 형질전환에 적합한 유산균 숙주세포인 락토바실러스 펜토서스 균주에 상기 셔틀벡터를 도입시켜, 안정적으로 형질전환이 가능하며, 특히 상기 플라스미드를 분리한 균주에 형질전환을 수행하는 경우, 안정적으로 형질전환을 수행할 수 있어 host/vector system의 개발이 가능하다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 있어서, “플라스미드(plasmid)"란 본 발명이 속하는 기술부야에서 통상적으로 공지된 바와 같은 의미를 가지며, 즉 세균에 존재하는 환상의 비-염색체성 요소를 의미한다. 플라스미드의 제조, 플라스미드 DNA의 전달 및 결합, 형질전환 등을 위해 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 공지의 방법들을 사용할 수 있으며, 상기 공지의 방법은 문헌[예를 들면, Sambrook, J. et al., 'Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition', Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]등에 기술되어 있다.
본 발명은 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)로부터 분리한 플라스미드를 제공한다.
상기 플라스미드는 이제까지 보고되지 않은 락토바실러스 펜토서스에서 분리된 신규한 플라스미드로, p1-4로 명명하였다. 상기 플라스미드 p1-4는 2,424bp이고, G+C함량이 38.2%이며, 발현되는 아미노산의 크기에 따라 발현이 예상되는 ORF(Open Reading Frame)가 ORF1, ORF2 및 ORF3으로 세 종류를 포함하고 있다. 상 기 플라스미드 p1-4는 전체 2,424 서열을 기준으로 기존에 보고된 플라스미드와 비교하였을 때, Pediococcus damnosus의 pF8801과 51%의 유사성이 있는 것으로 확인되었고, 상기 51% 유사성 중 96% 일치성이 있는 것으로 확인되었다.
본 발명의 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드일 수 있다. 상기 플라스미드는 락토바실러스 펜토서스, 바람직하게는 기탁번호 KFCC 11417P를 갖는 락토바실러스 펜토서스 F121-1(Lactobacillus pentosus F121-1 KFCC 11417P)로부터 유래된 것일 수 있다. 또한, 상기 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점(Ori), 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드이거나 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점(Ori), 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자 및 서열번호 7의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드일 수 있다. 또한, 상기 플라스미드는 바람직하게는 서열번호 9의 염기서열을 갖는 플라스미드일 수 있다.
또한, 상기 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점(Ori), 서열번호 2의 염기서열을 갖는 복제기점(Ori) 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미일 수 있다. 또한, 상기 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점(Ori), 서열번호 2의 염기서열을 갖는 복제기점(Ori), 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드이거나 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점(Ori), 서열번호 2의 염기서열을 갖는 복제기점(Ori), 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자 및 서열번호 7의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드일 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점(Ori)은 5'-TATCAAGATAAGA-3'의 서열을 갖는 13개의 뉴클레오타이드로 이루어지며, reverse-complement 염기서열 중, Guanine-Adenine 결합에 nick이 형성되면서 염기서열 내 plus-DNA strand의 복제가 시작되는 지점일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 2의 염기서열을 갖는 복제기점(Ori)은 5'-TAGATAGTCT-3'의 서열을 갖는 10개의 뉴클레오타이드로 이루어지며, 염기서열 내 minus-DNA strand의 복제가 시작되는 지점일 수 있다.
또한, 상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자는 p1-4의 ORF1이라고 명명하며, 상기 p1-4의 ORF1는 855bp의 염기서열을 갖고, 285개의 아미노산(amino acid)산으로 이루어진 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화(coding)하며, 기존에 보고된 복제개시단백질과 유전적 연관성이 있으므로, 복제개시단백질의 기능을 하는 단백질을 암호화하는 유전자인 것으로 확인되었다.
상기 서열번호 5의 염기서열을 갖는 단백질 유전자는 상기 p1-4의 ORF2라고 명명하며, 상기 p1-4의 ORF2는 270bp의 염기서열을 갖고, 90개의 아미노산으로 이루어진 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하며, 지금까지 보고된 복제개시단백질 중 전사조절인자(transcriptional regulator)와 유전적 연관성이 있으므로, 전사조절인자의 기능을 하는 단백질을 암호화하는 유전자일 것으로 예상되었다.
상기 서열번호 7의 염기서열을 갖는 단백질 유전자는 상기 p1-4의 ORF3이라고 명명하며, 상기 p1-4의 ORF3은 225bp의 염기서열을 갖고, 75개의 아미노산으로 이루어진 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화한다.
또한, 본 발명은 상기 플라스미드에 추가로, multiple cloning site(MCS) 및 선별 마커가 포함된 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 클로닝 벡터일 수 있다. 또한, 상기 클로닝 벡터는 상기 플라스미드, MCS 및 선별 마커에 추가로 대장균의 복제원점 및 프로모터를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 플라스미드는 본 발명의 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드일 수 있고, 추가로 서열번호 2의 염기서열을 갖는 복제기점, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 단백질 유전자 및 서열번호 7의 염기서열을 갖는 단백질 유전자로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 각각의 결합은 서열번호 1의 복제기점으로부터 5 ’에서 3’ 방향으로 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시 단백질 유전자, 서열번호 7의 염기서열을 갖는 단백질 유전자, 서열번호 2의 복제기점 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 단백질 유전자 순으로 결합될 수 있다.
상기 클로닝 벡터는 유산균 특히, 김치로부터 분리된 락토바실러스 펜토서스에서 안정적으로 외래 유전자의 복제 및 발현이 가능하여, 유산균 특히, 김치 등의 발효식품에 기능성을 부가하기 위한 형질전환체 또는 김치 등의 발효식품에 기능성 을 부가하기 위한 유산균을 이용한 유전자 발현시스템을 제조할 수 있어서 매우 유용하며, 산업적으로 생균활성물질(probiotics)의 개량 등에도 유용하게 사용될 수 있다.
상기 MCS는 다양한 제한효소에 의해 인식되고 절단되는 부위 즉, 제한부위(restriction site)를 갖는 DNA 단편을 의미하고, 상기 MCS는 특정 제한효소(restriction enzyme)에 의해 인지되어 절단되므로 절단된 MCS의 부위에 목적 유전자의 삽입을 가능하게 한다. 상기 MCS는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 공지된 MCS라면 제한없이 사용할 수 있으며, 이는 MCS를 가지고 있는 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 다양한 벡터 바람직하게는 대장균용 벡터, 일 예로 pUC18이나 pUC19에서 유래된 것일 있다.
또한, 상기 선별 마커(selection marker)는 유전자의 클로닝 여부 즉, 숙주세포 내에 벡터가 삽입되었는지 또는 형질전환되었는지 여부를 선별할 수 있는 유전자를 의미하며, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제 등에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택 가능 표현형을 부여하는 유전자일 수 있다. 상기 선별 마커는 일 예로, 아밀레이즈(amylase)와 같은 당분해효소, 포피라네이즈(porphyranase), 항생제 저항성 유전자, 발색 효소 유전자 또는 발광/형광 유전자일 수 있으나, 이 외에도 본 발명이 속하는 기술분야에서 선별 마커로 공지된 다양한 유전자가 사용될 수 있다. 상기 선별 마커는 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 다양한 벡터, 바람직하게는 대장균용 벡터, 일 예로 pUC18이나 pUC19에서 유래된 것일 있다.
상기 아밀레이즈는 알파-아밀레이즈일 수 있으며, 일 예로 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 알파-아밀레이즈일 수 있고, 상기 포피라네이즈는 서열번호 11의 유전자 서열에 의해 암호화되는 포피라네이즈일 수 있다. 또한, 상기 선별 마커는 서열번호 10의 유전자 서열에 특정 프로모터나 특정 프로모터 및 신호 펩타이드의 프로모터 구조체, 일 예로 서열번호 29의 서열을 갖는 구조체를 추가로 포함하는 유전자 구조체일 수 있다.
상기 항생제 저항성 유전자는 에리스로마이신 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자, 암피실린 저항성 유전자, 가나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자 등일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니라 바람직하게는 에리스로마이신 저항성 유전자일 수 있다.
상기 발색 효소 유전자는 β-갈락토시다제 유전자 또는 β-글루쿠로니다제(GUS) 유전자 등일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 발광 유전자는 루시퍼라제 유전자 등일 수 있고, 상기 형광 유전자는 BFP 유전자, CFP 유전자, GFP 유전자, YFP 유전자 또는 RFP 유전자 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점(Ori) 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질(replication initiation protein, Rep protein) 유전자를 포함하는 플라스미드와 대장균 유래 벡터를 연결하여 제조된 셔틀벡터에 관한 것이다.
상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드는 추가로 서열번호 2의 염기서열을 갖는 복제기점, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 단백질 유전자 및 서열번호 7의 염기서열을 갖는 단백질 유전자로 이루어진 군중에서 선택된 1 이상을 더욱 포함하는 것일 수 있다.
상기 셔틀벡터는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점; 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자; MCS; 및 선별 마커와 대장균의 복제 원점 및 프로모터를 포함하는 대장균 유래 벡터를 포함하고 있는 것이므로, 상기 셔틀벡터에는 유산균의 복제 원점 및 대장균의 복제 원점을 모두 가지고 있어서 유산균 및 대장균에서 상호 복제가 가능하다. 상기 대장균의 복제 원점 및 프로모터는 대장균 유래 복제 원점 및 대장균 유래 프로모터일 수 있다. 또한, 상기 셔틀벡터는 대장균 유래 복제개시단백질을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 상기 셔틀 벡터는 목적 유전자를 유산균과 대장균에서 대량 복제 및 발현시킬 수 있다.
본 발명의 셔틀벡터는 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드에 대장균의 복제 원점 및 프로모터의 염기서열을 직접 삽입하여 제조하거나, 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드와 대장균 유래 벡터를 연결하여 제조할 수 있다. 상기 셔틀벡터는 대장균과 유산균에서 모두 복제가 가능한 셔틀벡터일 수 있다.
상기 대장균용 벡터는 대장균 유래 벡터 또는 대장균에서 복제가능한 벡터를 의미하며, 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 대장균 유래 형질전환용 벡터, 일 예로 pUC18 및 pUC19일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 대장균의 복제 원점은 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 대장균 유래 형질전환용 벡터에 포함된 복제 원점일 수 있다. 상기 대장균의 복제 원점의 염기서열은 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있으므로, 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 공지된 대장균의 복제 원점을 본 발명의 셔틀 벡터에 용이하게 삽입할 수 있다.
상기 대장균의 복제 원점 및 프로모터의 삽입 또는 대장균 유래 벡터와의 결합을 위해서, 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드를 제한효소로 절단하여 선형 플라스미드 DNA로 제조한 후, 이를 동일한 제한효소로 절단한 대장균 유래 형질전환용 벡터 또는 상기 제한효소로 절단하여 수득한 대장균의 복제 원점 및 프로모터를 포함하는 부위와 유전공학적 방법(예: ligation)으로 연결하여 제조할 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드에 대장균의 복제 원점 및 프로모터의 염기서열을 직접 삽입하거나, 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플 라스미드와 대장균 유래 벡터를 연결하여 재조합 셔틀벡터를 제조하는 것 또는 상기 재조합 셔틀벡터를 이용하여 형질전환체를 제조하는 방법은 유산균 유래 셔틀벡터에 관하여 기재되어 있는 미국특허 제5,688,683호 등에 기재된 방법을 포함한 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
상기 셔틀벡터, 상세하게는 유산균 및 대장균에서의 발현을 위한 셔틀벡터, 더욱 상세하게는 락토바실러스 펜토서스 및 대장균에서의 발현을 위한 셔틀벡터는 목적 유전자를 유산균 및 대장균에서 복제 및/또는 발현시기 위한 것이다. 상기 락토바실러스 펜토서스는 기탁번호 KFCC 11417P를 갖는 락토바실러스 펜토서스 F121-1(Lactobacillus pentosus F121-1 KFCC 11417P)일 수 있다. 상기 락토바실러스 펜토서스 F121-1에 상기 셔틀벡터를 삽입하는 경우, RCR 형 벡터 유래 복제기점과 복제개시단백질을 포함함에도 불구하고, 현저히 안정하게 형질전환이 유지되므로, 호스트/벡터(host/vector) 시스템으로 이용이 가능하다는 장점이 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드와 대장균 유래 벡터를 연결하여 제조한 셔틀벡터에는 목적 유전자가 삽입될 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 플라스미드 또는 셔틀벡터에 목적 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 목적 유전자(target gene)라 함은 유산균에서 클로닝 하고자 하 는 유전자 또는 특정 숙주세포에서 발현시키고자 하는 유전자를 의미한다.
상기 목적 유전자는 본 발명의 플라스미드 또는 셔틀벡터 내에 존재하는 MCS 내에 삽입될 수 있다. 예컨대, 목적 유전자는 각 벡터의 MCS 내에 삽입될 수 있도록 제한효소 서열을 포함하는 프라이머로 PCR 증폭한 후, 제한효소로 절단하여 동일한 제한효소로 절단된 클로닝 벡터 또는 셔틀 벡터의 MCS 내에 삽입될 수 있다.
상기 목적 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 "작동가능하게 연결된다(operably linked)"는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다. 즉, 상기 목적 유전자는 벡터 내에 있는 프로모터에 의해 그 발현이 조절될 수 있도록 연결될 수 있다.
상기 목적 유전자는 유산균에 형질전환시킬 수 있는 모든 유전자를 의미하며, 보다 구체적으로는 형질전환의 숙주세포에 해당하는 유산균의 프로바이오틱스로서의 활성, 기능 및/또는 유용성을 높일 수 있는 유전자일 수 있다.
특히 본 발명의 플라스미드가 김치로부터 분리된 유산균에서 분리된 것이므로, 본 발명의 플라스미드 및 이를 이용하여 제조된 벡터들은 김치와 같은 발효식품을 포함하는 식품, 바람직하게는 인간의 면역 증강, 성장 촉진, 질병 예방 등을 수행할 수 있는 식품을 포함한 기능성 식품에 포함되어, 이러한 기능성을 부여하거나 향상시킬 수 있는 목적 유전자를 본 발명의 목적 유전자로 사용할 수 있다.
본 발명의 플라스미드 또는 셔틀벡터에 삽입, 구체적으로 플라스미드 또는 셔틀벡터의 MCS 부위로 삽입 가능한 의학, 산업적으로 유용한 목적 유전자의 예로 는 호르몬, 사이토카인, 효소, 응고인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사 인자, 항원, 항체 등을 암호화하는 유전자가 있다.
또한, 본 발명의 플라스미드 또는 셔틀벡터에는 목적 유전자의 발현을 조절하기 위하여 프로모터 이외에 발현 조절 서열이 추가로 포함될 수 있다. ‘발현 조절 서열(expression control sequence)’이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 또한, 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터(promoter) 이외에 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터(operator) 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함한다.
상기 셔틀벡터는 구체적으로 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드와 pUC18을 연결하여 제조된 셔틀벡터일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 12를 가진 셔틀벡터일 수 있다.
상기 셔틀벡터는 대장균 및 락토바실러스 펜토서스에서 상호 복제가 가능한 것일 수 있으며, 도 9 및 도 10에 기재된 개열지도를 갖는 것일 수 있고, 보다 상세하게는 상기 셔틀벡터는 서열번호 12 내지 서열번호 17로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 셔틀벡터일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 셔틀벡터 내에 상기 목적 유전자가 삽입된 재조합벡터일 수 있다. 상기 목적유전자는 바람직하게는 셔틀벡터의 MCS 부위 내에 삽입될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 벡터, 셔틀벡터 또는 상기 셔틀벡터에 목적 유전자가 삽입된 재조합 셔틀벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.
상기 형질전환체의 숙주세포는 박테리아일 수 있고, 상기 박테리아는 대장균 또는 유산균일 수 있다. 상기 대장균은 형질전환체의 제조에 사용되는 통상의 대장균일 수 있으며, 상기 유산균은 바람직하게는 락토바실러스 펜토서스 균주일 수 있고, 일 예로 상기 락토바실러스 펜토서스는 기탁번호 KFCC 11417P를 갖는 락토바실러스 펜토서스 F121-1(Lactobacillus pentosus F121-1 KFCC 11417P)일 수 있다.
이와 같이 형질전환된 박테리아는 목적 유전자로부터 발현되는 단백질의 대량 생산에 유용하게 이용될 수 있다. 따라서 형질전환된 박테리아를 배양하여 배양물로부터 대량 생산된 목적 단백질을 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 박테리아에 도입하는 단계를 포함하는 형질전환체 제조방법에 관한 것이다.
상기 박테리아는 대장균 또는 유산균인 것이 바람직하다.
상기 재조합 벡터를 박테리아에 도입하는 단계는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 열 충격 방법(heat shock method), 칼슘 포스페이트 침전법, 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 호스트/벡터 시스템(host/vector) 시스템일 수 있다. 본 발명에서 호스트/벡터 시스템이란 호스트로 사용되는 균주의 활성 및 특성을 유지 하면서 삽입되는 벡터에 의해 특정 형질이 전환될 수 있는 시스템을 의미한다. 상기 호스트/벡터 시스템은 형질전환되는 균주와 균주에 도입되는 벡터로 구성된다.
상기 벡터는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점; 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질; multiple cloning site 및 선별 마커를 포함하는 벡터 또는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점; 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자; multiple cloning site; 선별 마커; 대장균 유래 복제 원점; 및 대장균 유래 프로모터를 포함하고, 유산균 및 대장균에서 상호복제가 가능한 셔틀벡터인 벡터일 수 있다. 상기 셔틀벡터는 일 예로 서열번호 12 내지 서열번호 17로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 것인 셔틀벡터인 벡터일 수 있다.
상기 호스트 또는 균주는 유산균, 바람직하게는 락토바실러스 펜토서스 균주, 더욱 바람직하게는 기탁번호 KFCC 11417P를 갖는 락토바실러스 펜토서스 F121-1일 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 플라스미드는 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물로 안정성을 인정받은 유산균, 구체적으로 락토바실러스 펜토서스에서 안정하게 복제되고 발현될 수 있으며, 본 발명에 따른 셔틀벡터는 대장균과 유산균에서 모두 안정적으로 발현이 가능하여, 유산균을 이용한 유전자 발현시스템 및 이를 이용한 프로바이오틱스 등의 개발에 응용될 수 있으므로, 우리 고유음식인 김치를 비롯한 발효식품을 포함한 다양한 식품 및 의약품 등에 사용될 수 있어 산업적 이용가치가 매우 크다할 것이다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 균주의 선별 및 동정
김치에서 분리한 341 여종의 미생물 중, 장내 부착성이 우수하여 생균활성제로 이용가능한 것으로 확인된 미생물들을 분리하였다. 상기 분리된 미생물들을 각각 5ml의 MRS(Difco aboratories, Detroit, Mich., U.S.A.) 액체배지에 접종하여 30℃에서 18시간 동안 배양한 후 plasmid DNA를 분리하고, 상기 분리한 plasmid DNA를 1.0% agarose(Cambrex BioScience Rockland, Inc., ME, U.S.A.) gel에서 전기영동하여 plasmid DNA의 존재 유무 및 크기를 확인하였다.
그 결과, 장내 부착성도 우수하면서, 작은 크기(약 2.3kb 이하)의 plasmid를 보유한 균주로 락토바실러스 펜토서스 F121-1(Lactobacillus pentosus F121-1)을 선정하였고, 상기 락토바실러스 펜토서스 F121-1의 plasmid DNA를 분석한 결과를 도 2에 나타내었다. 상기 도 2에는 Lactobacillus pentosus F121-1이 보유한 플라스미드와 상기 플라스미드를 다양한 제한효소로 처리한 결과를 나타내고 있으며, 이 중 약 2.0kb 이하의 플라스미드를 p1-4로 명명하였다.
<실시예 2> Lb. pentosus F121-1로부터 분리된 plasmid p1-4의 분석
실시예 2-1. Lb. peptosus F121-1로부터 p1-4의 분리
상기 실시예 1에서 분리한 Lb . peptosus F121-1를 MRS 액체배지를 이용하여 30℃에서 OD600값이 약 0.8이 되도록 18시간 동안 정치배양하였다. 상기 유산균 배양액 5ml을 원심분리(11,900×g, 3min)하여 배양상징액을 제거하고 남은 pellet을 PBS(pH7.4)로 2번 세척하였다. 상기 세척한 pellet을 lysozyme(30mg/ml)이 첨가된 resuspension 용액(Quiagen Co., 독일) 250μl에 현탁하고 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 이 후, 분리 단계는 QIAprepSpin miniprep kit(QIAGEN Inc., 독일)을 이용하여 kit manual에 준하여 수행하였다.
실시예 2-2. p1-4의 분석
도 2에서 나타낸 바와 같이, 분리한 plasmid p1-4를 여러 가지 제한효소로 처리한 결과 NcoⅠ(1462bp), HpaⅠ(1676bp), Hind Ⅲ(1316bp 및 2180bp), HincⅡ(410, 1676 및 1730bp), EcoRⅠ(241bp 및 1248bp) 및 DraⅠ(763bp, 1065bp, 1164bp 및 1316bp)에 의해 절단되었다. 단일 절단을 형성하는 제한효소 HpaⅠ로 처리된 p1-4를 SmaⅠ로 처리된 대장균 vector인 pUC18에 T4 DNA ligase(TaKaRa)를 사용하여 삽입하여 pUC1-4를 제조하였고, 상기 재조합 벡터에 대해 솔젠트사(대한민국)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였으며, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. DNA와 단백질 상동성 분석, ORF분석 및 제한효소 위치는 NCBI BLAST(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)의 program, pDRAW32 프로그램, DNASIS(HITACHI software Engineering Co. Janpan) program 및 Bioinformatics(http://www.bioinformatics.org/sms2/index.html)을 이용하여 분석하였고, alignment와 phylogenetic 분석은 CLUSTAL W2 프로그램을 이용하여 수행하였으며, 그 결과를 도 3, 도 5 내지 도 8 및 표 1에 나타내었다. 또한, 염기서열의 반복구조를 확인하기 위해 mfold프로그램(http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/MobylePortal/portal.py?form=mfold)을 이용하였고, 플라스미드 지도 구성은 PlasMapper(http://wishart.biology.ualberta.ca/PlasMapper/index.html)을 이용하였다.
상기 NCBI의 program과 DNASIS program을 이용하여 p1-4의 염기서열 분석 결과, 전체염기서열은 2,424bp이고, G+C함량은 38.2%이었으며, 발현이 예상되는 ORFs(open reading frames)가 3개 확인되었고, 복제기점(origin, Ori)이 2개인 RCR형(rolling-circle replication type, RCR type) 플라스미드인 것으로 확인되었다. 상기 ORF는 발현되는 아미노산의 크기에 따라 ORF1, ORF2 및 ORF3라 명명하였다.
상기 도 5에서 확인된 바와 같이, 상기 플라스미드 p1-4는 전체 2,424 서열을 기준으로 기존에 보고된 플라스미드와 비교하였을 때, 가장 유사성이 높은 것으로 확인된 Pediococcus damnosus의 pF8801과 51%의 유사성이 있는 것으로 확인되었고, 상기 51% 유사성 중 96% 일치성이 있는 것으로 확인되어, 기존에 보고된 다른 미생물의 플라스미드와 전혀 상이한 플라스미드인 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 3 및 도 4에서 확인된 바와 같이, 플러스 복제기점(Ori(+)) 즉, 이중나선 복제개시부위(double stranded origin)는 5'-TATCAAGATAAGA-3'의 서 열(서열번호 1의 염기서열)을 갖는 13개의 뉴클레오타이드로 이루어지며, reverse-complement 염기서열 중, Guanine-Adenine 결합에 nick이 형성되면서 염기서열 내 plus-DNA strand의 복제가 시작되는 지점인 것으로 예측되었다.
또한, 상기 도 3 및 도 4에서 확인된 바와 같이, 마이너스 오리진(minus origin, Ori(-)) 즉, 단일나선 복제개시부위(single stranded origin)는 5'-TAGATAGTCT-3'의 서열(서열번호 2의 염기서열)을 갖는 10개의 뉴클레오타이드로 이루어지며, 염기서열 내 minus-DNA strand의 복제가 시작되는 지점으로 예측되었다.
또한, 상기 도 3 및 도 4에서 확인된 바와 같이, 복제개시단백질 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지며, p1-4의 ORF1이라고 명명하였고, 상기 p1-4의 ORF1는 855bp의 염기서열을 갖고, 285개의 아미노산(amino acid)산으로 이루어진 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화(coding)하며, 복제개시단백질의 기능을 하는 단백질을 암호화하는 유전자인 것으로 확인되었다.
또한, 두 번째 복제개시단백질 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 것으로 확인되었으며, p1-4의 ORF2라고 명명하였고, 상기 p1-4의 ORF2는 270bp의 염기서열을 갖고, 90개의 아미노산으로 이루어진 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하며, 지금까지 보고된 복제개시단백질 중 전사조절인자(transcriptional regulator)와 유전적 연관성이 있으므로, 전사조절인자의 기능을 하는 단백질을 암호화하는 유전자인 것으로 확인되었다.
상기 두 번째 복제개시단백질 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 것으로 확인되었고, p1-4의 ORF3이라고 명명하였으며, 상기 p1-4의 ORF3은 225bp의 염 기서열을 갖고, 75개의 아미노산으로 이루어진 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하며, 상기 단백질은 지금까지 보고된 복제개시단백질 또는 지금까지 기능이 보고된 단백질과 염기서열상 연관성이 없는 것으로 확인되었다.
Figure 112009026538186-PAT00001
상기한 결과로부터, Lactobacillus pentosus F121-1 유래 plasmid p1-4는 지금까지 알려지지 있은 않은 새로운 락토바실러스 펜토서스 유래의 RCR 형 plasmid로 확인되었다.
<실시예 3> LAB- E. coli 셔틀벡터의 구성
LAB-E. coli 셔틀벡터 구축에 삽입될 유산균 벡터 유전자로 상기 실시예 2-2의 Lactobacillus pentosus F121-1의 3 kb 이하의 plasmid인 p1-4를 사용하여 도 9 및 도 10의 방법으로 수행하였다. 보다 상세하게는, 상기 p1-4를 1.0% agarose gel 전기영동 후 gel elution kit(Quiagen, Germany. & GenecleanⅡ, MP Biomedicals, France)을 사용하여 p1-4를 분리하고 HpaⅠ으로 절단하였다. 대장균 발현 벡터인 pUC18을 SmaⅠ으로 절단한 뒤, p1-4를 rapid ligation kit(Roche, German)을 이용하거나 T4 DNA ligase(3 unit/μL)를 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안 조합하였고, 대장균에 형질전환시켜 E. coli TG1(pUC1-4)를 LB(ampicillin 50 μg/mL) 고체배지에서 X-gal(Promega, USA)에 의한 하얀색 콜로니 중 선별하였다. Em R 유전자는 pIL2530α를 주형(template)으로 하기 표 2의 primer Emr-F(서열번호 18)와 Emr-R(서열번호 19)을 사용하고 Taq polymerase(Takara co.)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR은 MJ mini personal thermal cycler(BioRad, USA)를 사용하여 수행하였으며, 상기 PCR은 pre-denaturation(95℃/5분)후에, denaturation(95℃/1분), annealing(55℃/1분 30초), elongation (72℃/1분)을 5회 반복하고 denaturation(95℃/30초), annealing (55℃/30초) 및 elongation(72℃/1분)을 30회 반복한 다음 최종 elongation을 위해 72℃에서 5분을 거치고 4℃로 냉각하는 방법으로 수행하였다. 상기 PCR 산물은 PCR quick spin(Intron, 대한민국)을 이용하여 정제하고, pGem-T easy vector(Promega, USA)에 ligation 후, 형질전환하여 E. coli TG1(pGemem)을 제조하였다. 상기 형질전환으로 제조된 E. coli TG1(pGemem)으로부터 pGemem을 분리하여, EcoRⅠ으로 절단하고, gel elution하여 Em R 유전자를 수득하였다. 상기 수득한 Em R 유전자를 pUC1-4에 삽입하고, 상기 방법으로 대장균 형질전환을 거쳐 p1-4를 포함하는 pEm인 pEm1-4를 회수하였다. 또한, PCR 수행을 위한 주형(template) 즉, 전달 유전자로 pTA322의 α-amylase와 pPOR3의 porphyranase를 사용하였고, 상기 두 종류의 유전자의 증폭은 Pfu-polymerase(Solgent Co., 대한민국)을 이용하여 수행하였으며, 각각 표 2의 primer 322F(서열번호 20)와 322R(서열번호 21), primer POR-F(서열번호 22)와 POR-R(서열번호 23)을 사용하였다. 상기 PCR은 pre-denaturation(95℃/5분)후에, denaturation(95℃/1분), annealing(55℃/1분 30초) 및 elongation (72℃/2분)을 5회 반복하고, denaturation(95℃/30초), annealing (55℃/1분) 및 elongation(72℃/2분)을 30회 반복한 다음, 최종 elongation을 위해 72℃에서 5분을 거치고 4℃로 냉각하는 방법으로 수행하였다. 상기 PCR 산물은 T4 DNA polynucleotide kinase(Koschemco., 대한민국)와 10 mM ATP(Sigma, USA)로 5′-말단에 인산화처리를 하여, HincⅡ로 절단된 pEm1-4에 직접 접합(ligation)하여, α-amylase를 포함하는 pEm1-4인 약 7.8kb의 pEm1-4α와 porphyranase를 포함하는 pEm1-4인 약 7.9kb의 pEm1-4por를 제조하였다. 상기 α-amylase가 삽입된 pEm1-4α를 이용하여 상기와 같은 방법으로 대장균을 형질전환하여 LB(ampicillin 50μg/mL, erythromycin 200μg/mL) 고체배지에서 배양하고, 요오드 반응에 의한 콜로니 주변의 투명환을 형성한 균주를 선별하였으며, 상기 porphyranase를 포함하는 pEm1-4인 pEm1-4por를 이용하여 상기와 같은 방법으로 형질전환시킨 대장균은 agar를 분해하여 주변이 움푹 패이는지 여부를 확인하여, 주변이 움푹 패인 콜로니가 형질전환된 것으로 선택하였다.
pEm1-4αp는 Lactobacillus delbrueckii의 PrtB(proteinase B)의 promoter와 signal peptide(0.3kb)와 α-amylase 유전자의 ORF 시작점부터 PstⅠ site까지의 염기서열(서열번호 29)를 Integrated DNA Technologies사(USA)에서 합성하였다.
상기 pEm1-4α 중 α-amylase gene의 promoter에 해당되는 부분과 ORF 시작점부터 PstⅠ site를 제외한 나머지를 하기 표 2의 pEm1-4α w/o p F(서열번호 24)와 R(서열번호 25)을 이용하여 PCR을 한 다음, 합성한 유전자와 접합(blunt ligation)시켰다. 상기 pEm1-4epα는 pEm에 삽입되어 있는 Em 내성 유전자의 ORF만을 제외하도록, 하기 표 2의 Em w/o ORF F(서열번호 26)와 R(서열번호 27)을 이용하여 PCR을 수행하였고, α-amylase의 ORF를 pTA322를 template로 하여, 하기 표 2의 α-ORF F(서열번호 28)와 322-R(서열번호 21)을 이용해 PCR을 수행하였다. 상기 증폭된 두 유전자를 접합(blunt ligation)시키고, LB(erythromycin 200μg/mL) 배지에서 α-amylase 활성을 나타낸 콜로니를 선별하여, pUCepα로 명명하였다. 상기 제조된 pUCepα를 주형(template)으로 Emr F(서열번호 18)와 322-R(서열번호 21)을 이용해 PCR을 수행하여 epα-amylase를 증폭시키고, HincⅡ로 절단된 pEm1-4에 접합(blunt-ligation)시켜, pEm1-4epα를 제조하였다.
Primer name Primer sequence (5′→3′) 서열번호
Emr-F CGGTTCGTGTTCGTGCTGACTTGCA 18
Emr-R GGGACCTCTTTAGCTCCTTGGAAGC 19
322-F TTGAAGAAGTGAAGAAGCAGAGA 20
322-R TAAAATGTAATCAAAGAAATTTATAA 21
POR-F CCATATGAGAGCTCACCTCG 22
POR-R GAAGAGAAGGAGCCGATG 23
pEm1-4α w/o p F TGCAGCAGCGGCGGCAAATC 24
pEm1-4α w/o p R GATTCTCCTCCCCTTTCAATG 25
Em w/o ORF F TTCTATGAGTCGCTTTTGTAAATTTG 26
Em w/o ORF R GTAATCACTCCTTCTTAATTACAAATT 27
α-ORF F ATGAAACAACAAAAACGGC 28
<실시예 4> LAB - E. coli 셔틀벡터(shuttle vector)를 이용한 형질전환
상기 Lactobacillus pentosus F121-1을 MRS 배지에 전배양과 본배양을 한 뒤, 0.24 M glycine과 0.1 M sucrose가 들어있는 MRS 배지 12 mL에 1% 접종하고 4.5시간 동안 배양하여 OD600값이 약 0.5가 되도록 배양하였다. 상기 배양액을 1,400×g의 조건에서 10분 동안 원심분리하여 균체를 회수하고, 상기 회수된 균체를 미리 냉각한 3차 증류수 1 mL로 2번 세척하였다. 상기 세척한 균체에 50 mM EDTA(pH 8.0) 1 mL을 넣고 현탁하여, 4℃에 5분 동안 방치(incubation)시켰다. 상기 EDTA를 이용하여 현탁과정을 수행한 균체를, 다시 미리 냉각한 3차 증류수 1 mL로 2번 세척한 뒤, 0.3 M sucrose로 3번 세척하고, 이를 500 μL의 0.3 M sucrose에 현탁한 뒤, 이 중 100μL(electro-competent LAB)와 상기 제조된 plasmid DNA(pEm1-4α, pEm1-4por, pEm1-4αp, 및 pEm1-4epα) 각 1 μg을 혼합하고 1.5 kV, 4 ms, 200Ω, 0.2 cm cuvette의 조건으로 single pulse하였다. 상기 형질전환을 수행한 혼합액에 MRS 배지 900 μL를 첨가하고, 30℃에서 3시간 동안 배양한 후, MRS(erythromycin 5 μg/mL, 0.1% soluble starch) 고체배지에 분주하고 30℃에서 3일 배양하여 형질전환체를 선별하였고, amylase 활성은 M17(0.25% glucose, erythromycin 5 μg/mL, 0.1% soluble starch, 0.5% CaCO3) 고체배지에서 확인하였다. 대조구로는 Lactococcus 속 및 Lactobacillus 속에 대한 host range가 넓은 pIL2530α를 사용하였고, 추가적으로 상기 플라스미드(shuttle vector)의 host spectrum을 확보하기 위하여, 본 발명자가 김치로부터 분리된 plasmid free strain인 Lactobacillus plantarum SKK와 Lactobacillus plantarum F125-H를 사용하였다.
상기 Lactobacillus plantarum SKK와 Lactobacillus pentosus F121-1에 대조군인 pIL2530α를 형질전환한 후, 상기 본 발명의 벡터의 형질전환 결과와 비교하여 도 12와 표 3에 나타내었다.
Figure 112009026538186-PAT00002
상기 도 11 및 표 3에 나타낸 바와 같이, p1-4의 재조합 벡터(pEm1-4α와 pEm1-4por)는 Lb . pentosus F121-1에 대해 4.2×102 CFU/μg of DNA 또는 7.7×102 CFU/μg of DNA의 수율로 형질전환되어, pIL2530α 보다 우수한 형질전환 수율을 나타내, host/vector 시스템으로 이용될 수 있을 것으로 예상되었다.
상기 도 11에서 pIL2530α와 달리 pEm1-4α와 pEm1-4por가 삽입된 형질전환체에서 재조합 vector는 확인이 되지만, p1-4 original band의 형태는 사라져 관찰되지 않은 것은, 본 발명의 shuttle vector의 기본 frame으로 사용한 p1-4 부분과 Lb. pentosus F121-1가 가지는 plasmid인 p1-4 간의 homologous recombination에 의한 결과로 해석되었다. 상기한 결과는 도 11b 및 11c에 나타난 바와 같이, pEm1-4αp 및 pEm1-4epα에서도 유사하게 확인되었다.
또한, 기존에 보고된 균주의 경우, 복제에 관여하는 origin 및 Rep initiator 단백질의 이동과 접합은 넓은 숙주 범위를 갖기 위한 경우가 대부분이나, 본 발명의 p1-4의 재조합 벡터는 Lb. pentosus F121-1에만 형질전환고, Lactobacillus plantarum 계열의 SKK와 F125-H에 형질전환이 되지 않아, 균주 특이적인 vector임이 확인되었고, host/vector 시스템으로 이용될 수 있을 것으로 예상되었다.
상기 형질전환시킨 형질전환체의 각 1개의 콜로니로부터 형질전환체를 분리한 후, MRS(erythromycin 5 μg/mL) 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 20 μL의 물에 현탁하고, 각각 0.1% soluble starch가 들어있는 LB(erythromycin 200 μg/mL, ampicillin 50 μg/mL) 고체배지를 이용하여 30℃에서 7일간 배양하면서, 형질전환체를 요오드 반응에 따른 투명환을 형성하는 콜로니를 관찰하여, 도 12 및 하기 표 4와 표 5에 나타내었다.
1.5일 배양한 결과 분해환(Clear zone)의 크기(mm)
F121-1(1-4 epa) 5.00
F121-1(1-4 a) 2.53
F121-1(2530a) 0.47
F121-1(1-4 SDM, 1-4ap) 4.76
F121-1(1-4 por) -
1.5일 배양한 결과 분해환(Clear zone)의 크기(mm)
F121-1(1-4 epa) 11.37
F121-1(1-4 a) 7.23
F121-1(2530a) 3.55
F121-1(1-4 SDM, 1-4ap) 9.58
F121-1(1-4 por) -
상기 도 12와 표 4 및 표5에 나타낸 바와 같이, 아밀레이즈 유전자가 포함된 본 발명의 벡터에서는 아밀레이즈 활성만을 측정하여 형질전환여부를 확인할 수 있으므로, 용이하게 형질전환여부를 측정할 수 있는 효과가 있음이 확인되었다. 또한, 대조군인 pIL2530에 비하여, 본 발명의 셔틀벡터를 이용한 형질전환체가 우수한 아밀레이즈 활성을 나타내었고, 특히, pEm1-4epα와 pEm1-4αp가 우수한 아밀레이즈 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
또한, Agarose 전기영동을 통하여 본 발명의 셔틀벡터인 pEm1-4α를 형질전환시킨 형질전환체인 Lb. pentosus F121-1(pEm1-4α)와 pIL2530α를 형질전환시킨 대조군에 대해, Em R probe를 이용하여 southern blot을 수행하여 본 발명의 셔틀벡터가 락토바실러스 펜토서스 F121-1 내에서 안정하게 유지됨을 확인하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다. 상기 southern blot은 보다 상세하게는 상기 플라스미드 및 형질전환체의 플라스미드(plasmid cocktail)를 1.0% agarose gel에 전기영동한 후, EtBr(Ethidium bromide)로 염색하였다. 상기 염색한 젤을 실온에서 denaturation buffer(0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl)을 gel 부피의 10배를 넣고 45분 동안 침수시킨 후, 멸균수로 한 번 세척하고 동일한 부피의 neutralization buffer(1 M TrisCl, 1.5 M NaCl, pH 7.4)를 넣고 30분 동안 중화시키고 난 다음, 한 번 더 15분 동안 중화과정을 거쳤다. 상기 중화된 젤의 DNA band를 Hybond N membrane(Amersham co. UK)에 10×SSC(1.5 M NaCl, 0.1 M sodium citrate)를 통해 이동시키고 UV로 10초 동안 고정화시켰다. 상기 전이된 membrane을 prehybridization solution(6×SSC, 5×Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% deionized formamide)에 42℃에서 4시간 동안 반응 후, blocking시키고, prehybridization solution 40 mL에 0.4 μg의 probe를 넣고 42℃에서 하룻밤 동안 현탁하였다. 이 후, size-marker인 λ HindⅢ digested DNA probe를 동일한 방법으로 잡종화시키고 난 후 2×SSC(0.1% SDS)에 실온에서 10분 동안 2번 세척하고, 0.1×SSC(0.1% SDS)로 65℃에서 20분 동안 2번에 걸쳐 세척하였다. Membrane에 묻은 세척액을 제거하고 biotin detection을 하였다. Biotin detection은 Fermentas사(USA)의 chromogenic detection kit을 사용하여 시행하였다. Streptavidin-AP conjugate 반응 후 BCIP/NBT 기질을 넣어 암실에서 30분 이상 반응시킨 다음 자색의 band를 나타나게 하였다. 발색이 완료되면 멸균수로 세척하고 건조시켰다. 상기 Biotin-labeled probe는 Em R 유전자를 probe로 사용하기 위하여 pGemTem을 EcoRⅠ으로 절단한 뒤, gel elution하여 Em R fragment를 회수하였다. Klenow fragment를 사용하여 염기를 biotin-labeled dUTP로 치환하기 위해 DNA 1μg과 random primer(Fermentas, USA)를 넣고 5분 동안 100℃에서 가열한 후, 얼음에 바로 냉각시켰다. Biotin-labeled dNTP와 Klenow fragment 5 unit을 넣고 37℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 0.5 M EDTA(pH 8.0) 1μL를 넣어 반응을 종결시키고 -20℃에서 보관하였다. Probe 제조에 대한 대조구로 λ HindⅢ digested DNA(Fermentas, USA)를 사용하였다.
상기 도 13에 나타낸 바와 같이, southern blot을 수행한 결과, Em R probe로 확인된 밴드의 크기와 pEm1-4α의 크기가 일치하여, 본 발명의 셔틀벡터(pEm1-4α)가 락토바실러스 펜토서스 F121-1 내에서 안정하게 유지됨을 확인할 수 있었다.
<실시예 5> 형질전환체내에서의 셔틀벡터의 안정성 확인
RCR(Rolling circle replication) type의 plasmid 특징을 고려하여, 본 발명의 셔틀벡터의 안정성을 확인하기 위해, 재조합 균주에서의 plasmid의 실활 가능성을 확인하였다. 보다 상세하게는, 락토바실러스 펜토서스 F121-1에 삽입된 벡터(pEm1-4α 및 pEm1-4por와 pIL2530α)들의 plasmid 안정성을 측정하기 위해, 1 콜로니를 MRS(erythromycin 5μg/mL) 액체 배지에 접종하여 전배양과 본배양을 거치고 난 뒤, 균체를 멸균수에 세척하고 항생제(erythromycin)가 없는 MRS 액체배지에 0.1% 접종하였다. 24시간마다 계대 배양하였고 3일마다 erythromycin이 들어있는 것과 들어있지 않는 MRS 평판배지에 분주하여 생균수를 30일 동안 측정하였고, 이를 도 14에 나타내었다.
상기 도 14에 나타낸 바와 같이, 30일째까지 Lb . pentosus F121-1(pEm1-4α)와 Lb . pentosus F121-1(pEm1-4por) 형질전환체는 모두 전기영동 상에서 클로닝된 벡터 band를 확인할 수 있었다. 한편, 락토바실러스 펜토서스 F121-1은 generation time이 약 100.5분인 반면, pEm1-4α와 pEm1-4por, pIL2530α는 각각 154.6분, 165분, 226.8분으로 나타났고, 이들의 100 generation에 해당되는 시간은 순서대로 7일, 10.7일, 11.6일, 15.8일인 것으로 확인되었다.
RCR type의 플라스미드는 insert DNA의 크기도 매우 중요하므로, theta type에 비하여 안정성에 대한 문제가 있는 RCR type의 단점은 재조합 벡터의 크기를 줄이는 방법으로 향상시킬 수 있을 것으로 기대되었다.
<실시예 6> 셔틀벡터가 도입된 형질전환체의 장내부착성, 소수성 및 응집성 확인
ATCC(American Type Culture Collection, USA)로부터 분양받은 Caco-2(ATCC HTB37)는 DMEM-high glucose(suppled with 10% fetal bovine serum, 1% non-essential amino acid, 1% streptomycin/penicillin(10,000 IU/mL), 10 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate, 1 mM L-glutamine, Hyclone, USA) 배지를 사용하여, 배양하였고, 이틀에 한 번씩 배지를 바꿔주며 15일 동안 배양하여 분화시켰다. 장내부착능에 사용한 passage는 25~45까지였다.
상기 Caco-2 세포주에 대한 부착능을 측정하기 위해 유산균을 30℃에서 24시간 동안 배양한 뒤, 균체를 회수하여 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)으로 3번 세척하였다. 또한, 15일 배양된 Caco-2 세포를 PBS로 2번 세척한 후, 여기에 유산균은 108 CFU/mL이 되도록 넣고 항생제와 fetal bovine serum이 들어있지 않은 배지를 각 well마다 1 mL씩 첨가하였다. 이를 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 1시간동안 배양한 후, 부착되지 못한 유산균을 제거하기 위해 PBS로 세 번 세척하였다.
각 well에 메탄올 1 mL씩 넣고 5분 동안 세포가 cover slip에 고정되도록 하고 Gram 염색 후, 광학 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다(×4,000).
또한, plate counting을 위해, 각 well 마다 0.05% triton X-100 1 mL을 넣고 10분 동안 흔들어 주었다. 이를 102-104배 희석하여 MRS 배지에 도말하고, 30℃에서 1~2일 동안 배양하였다. positive control로 Lactobacillus rhamnosus GG(ATCC 53103)을 사용하였고, negative control로는 Lactobacillus acidophilus ATCC4356를 사용하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
상기 도 15a 및 15b에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 펜토서스 F121-1을 비롯한 그의 형질전환체들은 모두 부착율이 Lb . rhamnosus GG에 비해 3~4 log CFU/mL 더 높은 수치를 나타냈고, 특히 락토바실러스 펜토서스 F121-1(pEm1-4α)는 원 균주보다 더 부착율이 좋은 것으로 확인되었다.
또한, 락토바실러스 펜토서스 F121-1의 Caco-2 세포주에 대한 부착율에 대하여, 대부분의 형질전환체들이 0.9 내지 1.0배 정도의 수치를 나타내어, 본 발명의 셔틀벡턱의 형질전환이 숙주인 락토바실러스 펜토서스 F121-1이 갖는 우수한 장내부착활성에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 또한, Gram 염색 후 현미경 관찰 결과, 락토바실러스 펜토서스 F121-1(pEM1-4α)는 락토바실러스 펜토서스 F121-1 원 균주와 거의 동일한 부착 양상을 나타내는 등, 우수한 부착능을 나타내어, 산발적으로 퍼진 양상을 보인 대조군(Lb. pentosus F121-1(pIL2530α))에 비해 우수한 부착능을 갖는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명의 셔틀벡터을 이용한 형질전환이 세포의 기능에 미치는 영향, 구체적으로 소수성과 응집성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실험을 수행하였다.
구체적으로 소수성의 경우 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 우선, 5 mL MRS 액체배지에 배양된 유산균을 11,600×g에서 5분 동안 원심분리하여 균체를 회수한 뒤 0.05 M phosphate buffer(pH 6.8) 10 mL로 2번 세척하였다. 균체를 OD600이 0.5가 되도록 희석한 유산균 3 mL에 10 mL hexadecane(Merck, 독일)을 넣고 1분 동안 볼텍싱(vortex)한 후, 15분 동안 실온에서 방치한 뒤, OD600에서 수용액 층의 소수성을 측정하였으며, 그 결과를 도 15c에 나타내었다.
또한, 배양된 유산균을 5,000×g에서 15분 동안 원심분리하여 균체를 회수한 뒤, 이를 PBS(pH 7.2)로 2번 세척하고, OD600이 0.5로 조절하여 PBS에 재현탁하였다. 상기 재현탁한 균체를 5시간 동안 실온에서 방치하면서 매 시간마다 상등액 1 mL을 취하여 OD600에서 측정하였다. 응집율(%)은 “100×(초기 OD600에서 측정 값 - n시간 OD600에서 측정 값)÷초기 OD600에서 측정 값“으로 계산하였으며, 그 결과를 도 15d에 나타내었다.
상기 도 15c 및 도 15d에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 셔틀벡터를 이용한 형질전환 여부에 영향을 받지 않고, 소수성과 응집성이 유사하게 나타나, 본 발명의 셔틀벡터는 숙주(host)의 소수성 및 응집성에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
백신 운반체로서 유산균을 이용하기 위한 시도는 1995년 이후로 꾸준하게 개발되고 있으나, 최근 까지 면역활성에 대한 연구를 위주로 진행되었고, 생균 또는 생균활성제로 응용하기 위하여 필수적으로 요구되는 장내부착성에 대한 연구는 제한적이다.
이러한 종래기술이 갖는 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 장내부착성이 매우 우수한 균주인 락토바실러스 펜토서스 F121-1을 발견하였고, 상기 균주에 대하여 백신 등을 운반하기 위해 사용되는 벡터 또는 셔틀벡터를 연구하던 중, 상기 균주에 대해 형질전환을 수행하는 경우에도 생균 활성제로 응용되는 경우 검토하여야 하는 소수성이나 응집성 및 상기 균주의 장내부착성에 영향을 미치지 아니하는 셔틀벡터를 제조하였다.
따라서, 이러한 벡터와 균체를 이용하여 개발된 host/vector system은 백신 운반체를 비롯한 다양한 생균제재로의 이용가능성이 매우 높을 것으로 평가된다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 펜토서스 F121-1과 다른 유연관계 미생물과의 계통발생학적 관계를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 김치로부터 분리한 유산균인 락토바실러스 펜토서스 F121-1이 보유한 플라스미드와 상기 플라스미드를 다양한 제한효소로 처리한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 펜토서스 F121-1로부터 분리한 플라스미드 p1-4의 개열지도를 나타낸 그림으로, 도 3a 및 도 3b는 플라스미드 p1-4의 제한부위를 나타낸 개열지도이고, 도 3c는 플라스미드 p1-4의 제한부위와 함께 유전적 조직(genetic organization)을 나타낸 것으로, 화살표는 ORF(Open Reading Frame)을 나타낸 것으로 화살표의 방향이 전사(transcription) 방향을 나타내는 것이고, 막대의 위치는 복제기점(replication origin, plus origin)을 나타내는 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 플라스미드 p1-4의 염기서열을 나타낸 그림이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 플라스미드 p1-4의 염기서열과 다른 유연관계 미생물 유래 벡터와의 유사성을 토대로 계통발생학적 관계를 나타낸 그림이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 플라스미드 p1-4의 이중나선 복제개시부위(double stranded origin)를 다른 플라스미드와 비교한 그림으로, 도 6a는 플라 스미드 p1-4의 이중나선 복제개시부위의 서열을 다른 플라스미드의 이중나선 복제개시부위의 서열과 비교한 것으로, *는 같은 컬럼 내의 모든 염기서열이 같은 위치를 의미하고, 도 6b는 각 서열의 상동성을 기초로 플라스미드 p1-4의 이중나선 복제개시부위의 염기서열과 다른 유연관계 미생물 유래 벡터의 이중나선 복제개시부위의 염기서열을 토대로 계통발생학적 관계를 나타낸 그림이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 플라스미드 p1-4의 구조체를 나타낸 그림으로, 도 7의 붉은색으로 표시된 염기서열 부위는 마이너스 오리진(minus origin) 즉, 단일나선 복제개시부위(single stranded origin)로 예상되는 부위를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 플라스미드 ORF1 부위 즉, 복제개시단백질의 아미노산 서열을 다른 플라스미드의 복제개시 단백질과 비교한 그림으로, 도 8의 *는 같은 컬럼 내의 모든 염기서열이 같은 위치, :는 conserved substitution 부위, ;는 semi-conserved substitution 부위를 의미한다.
도 9 및 도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 셔틀벡터인 pEm1-4α, pEm1-4por, pEm1-4αp 및 pEm1-4 epα의 제조과정 및 개열지도를 나타낸 것으로, 도 9는 pEm1-4α 및 pEm1-4por의 제조과정을 나타낸 것이고, 10a는 pEm1-4αp 및 pEm1-4 epα의 제조과정을 나타낸 것이며, 도 10b는 pUC1-4의 개열지도이고, 도 10c는 pEm1-4α의 개열지도이며, 도 10d는 pEm1-4의 개열지도이고, 도 10e는 pEm1-4por의 개열지도이며, 도 10f는 pEm1-4αp의 개열지도이고, 도 10g는 pEm1-4 epα의 개열지도이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 재조합벡터를 형질전환시킨 결과를 나타낸 사진으로, 도 11a는 락토바실러스 펜토서스 F121-1 및 락토바실러스 플란타룸 SKK에 본 발명의 재조합벡터와 pIL2530α를 형질전환시킨 형질전환체의 플라스미드를 전기영동한 사진으로, H는 락토바실러스 펜토서스 F121-1의 original plasmid를 전기영동한 것이고, V1은 pEm1-4α이며, T1은 락토바실러스 펜토서스 F121-1에 pEm1-4α를 형질전환시킨 것이고, V2는 Em1-4por이며, T2는 락토바실러스 펜토서스 F121-1에 Em1-4por를 형질전환시킨 것이고, V3는 pIL2530α이며, T3는 락토바실러스 펜토서스 F121-1에 pIL2530α를 형질전환시킨 것이고, HS는 락토바실러스 플란트리운 SKK(plasmid-free)이며, T4는 락토바실러스 플란트리운 SKK에 pIL2530α를 형질전환시킨 것이고, 도 11b는 락토바실러스 펜토서스 F121-1에 pEmαp1-4를 형질전환시킨 것이고, 도 11c는 락토바실러스 펜토서스 F121-1에 pEm1-4epα를 형질전환시킨 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 재조합벡터를 락토바실러스 펜토서스 F121-1에 형질전환시킨 M17-G배지에 배양시킨 후, 요오드로 염색하여, 아밀레이즈 활성을 관찰한 사진이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 재조합벡터인 pEm1-4α와 대조군인 pIL2530α를 형질전환시킨 후에, EmR probe를 이용하여 서던블럿팅(Southern blot)한 사진을 나타낸 것으로, 1은 락토바실러스 펜토서스 F121-1에 pEm1-4α을 형질전환시킨 결과이고, 2는 락토바실러스 펜토서스 F121-1에 pIL2530α를 형질전환시킨 결과이며, 3은 형질전환시키지 않은 락토바실러스 펜토서스이고, 4는 상기 1의 서던블럿 결과이고, 5는 상기 2의 서던블럿 결과이며, 6은 상기 3의 서던 블럿 결과이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 재조합벡터의 안정성을 확인하기 위하여, 락토바실러스 펜토서스 F121-1에 본 발명의 셔틀벡터인 pEm1-4α와 pEm1-4por 및 대조군인 pIL2530α를 형질전환시킨 형질전환체를 배양하며, 플라스미드의 안정성을 확인한 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 재조합벡터와 대조군인 pIL2530α를 형질전환시킨 형질전환체와 원균주인 락토바실러스 펜토서스 F121-1이 갖는 부착능, 소수성 및 응집성을 확인한 것으로, 도 15a는 부착된 세포의 수를 측정하여 부착능을 확인한 결과이고, 도 15b는 Caco-2 cell에 형질전환체가 부착된 세포를 염색한 후, 촬영한 사진이며, 도 15c는 형질전환체의 소수성을 나타낸 결과이고, 도 15d는 형질전환체의 응집성을 나타낸 결과이다.
<110> MOKPO NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A PLASMID SHUTTLE VECTOR <130> KP200090052 <160> 29 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1429R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 858 <212> DNA <213> p1-4_ORF1 <220> <221> CDS <222> (1)..(855) <400> 3 atg ttg cac tac aag aaa gcc cat cga gtt aaa gag tgt ggt gaa gta 48 Met Leu His Tyr Lys Lys Ala His Arg Val Lys Glu Cys Gly Glu Val 1 5 10 15 tta cgt ttt gta gaa gat aaa aat ggt cac aaa aaa ttg gct cag act 96 Leu Arg Phe Val Glu Asp Lys Asn Gly His Lys Lys Leu Ala Gln Thr 20 25 30 tgg ttt tgt cat tcc cgt ttg tgt ccg tta tgt aat tgg cgg cgg tca 144 Trp Phe Cys His Ser Arg Leu Cys Pro Leu Cys Asn Trp Arg Arg Ser 35 40 45 atg aaa caa tct aac cag tta act caa att ttg aca gaa aca gtt aaa 192 Met Lys Gln Ser Asn Gln Leu Thr Gln Ile Leu Thr Glu Thr Val Lys 50 55 60 cag cga aaa acg ggg cgg ttc ttg ttt tta acg ttg acg gta aag aat 240 Gln Arg Lys Thr Gly Arg Phe Leu Phe Leu Thr Leu Thr Val Lys Asn 65 70 75 80 act aca ggg gat ttg ttg aag agt gaa tta cgg cag atg gga cga gcc 288 Thr Thr Gly Asp Leu Leu Lys Ser Glu Leu Arg Gln Met Gly Arg Ala 85 90 95 gtt gca aag atc ttt cag tat aaa aaa gtg gct aaa aat ttg ttg ggt 336 Val Ala Lys Ile Phe Gln Tyr Lys Lys Val Ala Lys Asn Leu Leu Gly 100 105 110 tat gta cgt tca act gag gtt acc att aat cac gaa gca gat cag ccg 384 Tyr Val Arg Ser Thr Glu Val Thr Ile Asn His Glu Ala Asp Gln Pro 115 120 125 atg tat cac cac cat atg cat gtt ttg ctt ttt atg aaa tcg agt tat 432 Met Tyr His His His Met His Val Leu Leu Phe Met Lys Ser Ser Tyr 130 135 140 ttt aca gga act gat aat tat att tca caa gca gaa tgg act aga tat 480 Phe Thr Gly Thr Asp Asn Tyr Ile Ser Gln Ala Glu Trp Thr Arg Tyr 145 150 155 160 tgg caa cga gcg atg aaa tta gct tat gcg cca gtt gtg aat gtt gaa 528 Trp Gln Arg Ala Met Lys Leu Ala Tyr Ala Pro Val Val Asn Val Glu 165 170 175 gcg gtt aaa ccg aat gtg aaa cgc cag aaa aat tcc tta ctg gct agt 576 Ala Val Lys Pro Asn Val Lys Arg Gln Lys Asn Ser Leu Leu Ala Ser 180 185 190 gcc caa gaa acg gct aaa tat cag gtg aag tcc aaa gat att tta act 624 Ala Gln Glu Thr Ala Lys Tyr Gln Val Lys Ser Lys Asp Ile Leu Thr 195 200 205 aac aat caa gaa caa gat cta caa gta att gat gat ttg gag caa gct 672 Asn Asn Gln Glu Gln Asp Leu Gln Val Ile Asp Asp Leu Glu Gln Ala 210 215 220 ttg gct ggg tcc cgg caa att agc tat ggg ggc ttg ctg aaa gaa att 720 Leu Ala Gly Ser Arg Gln Ile Ser Tyr Gly Gly Leu Leu Lys Glu Ile 225 230 235 240 cgc aag cag ttg caa tta gaa gac gtt gaa aat ggg gat ttg att aat 768 Arg Lys Gln Leu Gln Leu Glu Asp Val Glu Asn Gly Asp Leu Ile Asn 245 250 255 acg gat agt gat gat caa aaa act ggt cag gta gtg cgt gaa att gtt 816 Thr Asp Ser Asp Asp Gln Lys Thr Gly Gln Val Val Arg Glu Ile Val 260 265 270 gca aaa tgg gat tat cag cgt aaa aat tat ttt gtt tgg taa 858 Ala Lys Trp Asp Tyr Gln Arg Lys Asn Tyr Phe Val Trp 275 280 285 <210> 4 <211> 285 <212> PRT <213> p1-4_ORF1 <400> 4 Met Leu His Tyr Lys Lys Ala His Arg Val Lys Glu Cys Gly Glu Val 1 5 10 15 Leu Arg Phe Val Glu Asp Lys Asn Gly His Lys Lys Leu Ala Gln Thr 20 25 30 Trp Phe Cys His Ser Arg Leu Cys Pro Leu Cys Asn Trp Arg Arg Ser 35 40 45 Met Lys Gln Ser Asn Gln Leu Thr Gln Ile Leu Thr Glu Thr Val Lys 50 55 60 Gln Arg Lys Thr Gly Arg Phe Leu Phe Leu Thr Leu Thr Val Lys Asn 65 70 75 80 Thr Thr Gly Asp Leu Leu Lys Ser Glu Leu Arg Gln Met Gly Arg Ala 85 90 95 Val Ala Lys Ile Phe Gln Tyr Lys Lys Val Ala Lys Asn Leu Leu Gly 100 105 110 Tyr Val Arg Ser Thr Glu Val Thr Ile Asn His Glu Ala Asp Gln Pro 115 120 125 Met Tyr His His His Met His Val Leu Leu Phe Met Lys Ser Ser Tyr 130 135 140 Phe Thr Gly Thr Asp Asn Tyr Ile Ser Gln Ala Glu Trp Thr Arg Tyr 145 150 155 160 Trp Gln Arg Ala Met Lys Leu Ala Tyr Ala Pro Val Val Asn Val Glu 165 170 175 Ala Val Lys Pro Asn Val Lys Arg Gln Lys Asn Ser Leu Leu Ala Ser 180 185 190 Ala Gln Glu Thr Ala Lys Tyr Gln Val Lys Ser Lys Asp Ile Leu Thr 195 200 205 Asn Asn Gln Glu Gln Asp Leu Gln Val Ile Asp Asp Leu Glu Gln Ala 210 215 220 Leu Ala Gly Ser Arg Gln Ile Ser Tyr Gly Gly Leu Leu Lys Glu Ile 225 230 235 240 Arg Lys Gln Leu Gln Leu Glu Asp Val Glu Asn Gly Asp Leu Ile Asn 245 250 255 Thr Asp Ser Asp Asp Gln Lys Thr Gly Gln Val Val Arg Glu Ile Val 260 265 270 Ala Lys Trp Asp Tyr Gln Arg Lys Asn Tyr Phe Val Trp 275 280 285 <210> 5 <211> 225 <212> DNA <213> p1-4_ORF2 <220> <221> CDS <222> (1)..(222) <400> 5 atg acg tcg tgc gtt ctg act gaa aaa cgt cag aag ggc gca ctt ata 48 Met Thr Ser Cys Val Leu Thr Glu Lys Arg Gln Lys Gly Ala Leu Ile 1 5 10 15 ctc cac gaa aat aaa tgg ggt gta agt tgc tta aaa cct gta tca gaa 96 Leu His Glu Asn Lys Trp Gly Val Ser Cys Leu Lys Pro Val Ser Glu 20 25 30 ttc gct ccg ctc aaa cta aaa ctg acg ggg gtc agt ttg aaa ccc aaa 144 Phe Ala Pro Leu Lys Leu Lys Leu Thr Gly Val Ser Leu Lys Pro Lys 35 40 45 aag cag ata agt tca gtc gta aac tcc ttc gaa ctt ttc tcc ttt ttg 192 Lys Gln Ile Ser Ser Val Val Asn Ser Phe Glu Leu Phe Ser Phe Leu 50 55 60 ggt tgc tct caa aag ccc aaa att gcc ttc taa 225 Gly Cys Ser Gln Lys Pro Lys Ile Ala Phe 65 70 <210> 6 <211> 74 <212> PRT <213> p1-4_ORF2 <400> 6 Met Thr Ser Cys Val Leu Thr Glu Lys Arg Gln Lys Gly Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu His Glu Asn Lys Trp Gly Val Ser Cys Leu Lys Pro Val Ser Glu 20 25 30 Phe Ala Pro Leu Lys Leu Lys Leu Thr Gly Val Ser Leu Lys Pro Lys 35 40 45 Lys Gln Ile Ser Ser Val Val Asn Ser Phe Glu Leu Phe Ser Phe Leu 50 55 60 Gly Cys Ser Gln Lys Pro Lys Ile Ala Phe 65 70 <210> 7 <211> 270 <212> DNA <213> p1-4_ORF3 <220> <221> CDS <222> (1)..(270) <400> 7 atg ccg agg att gac gaa cgt agt tgg aaa aag att ttt gaa ttg ggt 48 Met Pro Arg Ile Asp Glu Arg Ser Trp Lys Lys Ile Phe Glu Leu Gly 1 5 10 15 aat aac ggt aaa tac gat gat gaa gcg tat gct gag att ctt gct aca 96 Asn Asn Gly Lys Tyr Asp Asp Glu Ala Tyr Ala Glu Ile Leu Ala Thr 20 25 30 gta ttg aat ttg cgt gtt gaa aaa ggc tta act caa agt gac gtt gcg 144 Val Leu Asn Leu Arg Val Glu Lys Gly Leu Thr Gln Ser Asp Val Ala 35 40 45 aga ata tct ggt tta tct acg agt atg atc tct aaa att gaa agt caa 192 Arg Ile Ser Gly Leu Ser Thr Ser Met Ile Ser Lys Ile Glu Ser Gln 50 55 60 tat aca gta ccg agt gta aaa aat ttc tta cga tat att ttc gcc tta 240 Tyr Thr Val Pro Ser Val Lys Asn Phe Leu Arg Tyr Ile Phe Ala Leu 65 70 75 80 gat ttg gat tgg gaa ctc gtt cat aaa cgt 270 Asp Leu Asp Trp Glu Leu Val His Lys Arg 85 90 <210> 8 <211> 90 <212> PRT <213> p1-4_ORF3 <400> 8 Met Pro Arg Ile Asp Glu Arg Ser Trp Lys Lys Ile Phe Glu Leu Gly 1 5 10 15 Asn Asn Gly Lys Tyr Asp Asp Glu Ala Tyr Ala Glu Ile Leu Ala Thr 20 25 30 Val Leu Asn Leu Arg Val Glu Lys Gly Leu Thr Gln Ser Asp Val Ala 35 40 45 Arg Ile Ser Gly Leu Ser Thr Ser Met Ile Ser Lys Ile Glu Ser Gln 50 55 60 Tyr Thr Val Pro Ser Val Lys Asn Phe Leu Arg Tyr Ile Phe Ala Leu 65 70 75 80 Asp Leu Asp Trp Glu Leu Val His Lys Arg 85 90 <210> 9 <211> 2424 <212> DNA <213> p1-4 <400> 9 gttgtcgcca ttggcgactt ctgatacaga 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ttaaaaattc ggaatattta 120 tacaatatca tatgtttcac attgaaaggg gaggagaatc atgaaacaac aaaaacggct 180 ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc ttgctgcctc attctgcagc 240 agcggcggca aatcttaatg ggacgctgat gcagtatttt gaatggtaca tgcccaatga 300 cggccaacat tggaagcgct tgcaaaacga ctcggcatat ttggctgaac acggtattac 360 tgccgtctgg attcccccgg catataaggg aacgagccaa gcggatgtgg gctacggtgc 420 ttacgacctt tatgatttag gggagtttca tcaaaaaggg acggttcgga caaagtacgg 480 cacaaaagga gagctgcaat ctgcgatcaa aagtcttcat tcccgcgaca ttaacgttta 540 cggggatgtg gtcatcaacc acaaaggcgg cgctgatgcg accgaagatg taaccgcggt 600 tgaagtcgat cccgctgacc gcaaccgcgt 630 <210> 11 <211> 1776 <212> DNA <213> porphyranase <400> 11 ccatatgaga gctcacctcg ttgatgagct ctcatatcaa ttttattagt ttgcttcacc 60 tctcacctcc gaacaaatcc tctcataacc gtttcaacaa aataagccaa ccaacgaaaa 120 acgacttcca gaaaattacc tgaaacatat aaagaagttt aatattacaa gcgccatgca 180 tcacttttat aacaaacatc aatcgatagc aacatattta ccaaattcac taaaacagca 240 atgaataata agattggttg aactatatta 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tcgtggcgtt cagaggctgg 1140 tatcgttgct tctgatgcgg atctagccga tagctcgaaa aataaaatgt acgttgactg 1200 gattcgtgtt tataaaccag ttcgagacaa cgataataac ggcattgtcc ctccgagtga 1260 tgcaactagt ttacagttta ttcatagtaa tagatgtctc gatgtaaaag atggagcaac 1320 gtggaatggt agtacctatc aacaatggag ttgcaacaca tcaaatagca atcaacgttt 1380 cactttcact ccagtatcaa acagtgaata tttaattcaa tcagataaaa gtcaactctg 1440 cgttgagtta aaaccagacg catctcaatg gaaagatggt gctactatcc agcagtatat 1500 ttgtaattca gcagaagaaa atcagttgtg gacgttattc gacaaaggca gtaacacttt 1560 tgagttaaga aataagaaga cgggtaagtg tcttgaggtt gctaataacc aagcaactaa 1620 cggtggtagc attattcaag cgtcttgtga tggaggaaac aaccaacgaa ttaagttcaa 1680 gtaaatcgct tgcaacctaa tctaattagt acattcattt aatgactttc tattaaatga 1740 atgtgcattt ttattgttca tcggctcctt ctcttc 1776 <210> 12 <211> 5110 <212> DNA <213> pUC1-4 <400> 12 gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60 cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120 tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180 aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240 ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300 ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360 tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420 tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480 actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540 gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600 acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660 gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720 acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780 gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840 ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900 gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960 cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 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ttgaagaagt gaagaagcag aga 23 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> 322-R <400> 21 taaaatgtaa tcaaagaaat ttataa 26 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> POR-F <400> 22 ccatatgaga gctcacctcg 20 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> POR-R <400> 23 gaagagaagg agccgatg 18 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> pEm1-4aw/op-F <400> 24 tgcagcagcg gcggcaaatc 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> pEm1-4aw/op-R <400> 25 gattctcctc ccctttcaat g 21 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> pEmw/oORF-F <400> 26 ttctatgagt cgcttttgta aatttg 26 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> pEmw/oORF-R <400> 27 gtaatcactc cttcttaatt acaaatt 27 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> a-ORFinitiation-F <400> 28 atgaaacaac aaaaacggc 19 <210> 29 <211> 683 <212> DNA <213> PrtB promoter structure <400> 29 ctgcagtgaa ataatgtgct ttttgttttt tggcgttcag aaattacttt tccactgttt 60 gatttaaaat tctgctaaaa aacatttaac tttaatttaa actatggtat gattatgaaa 120 tgttagtgag ccgaagctgc gtgatgaaag gcttgctaat aaaaatattt atttgtctaa 180 aggagttaag gaaacagatg cagaagaaaa aatccgcacg ccatttgaac aaagtggctg 240 aattagccgc agcactgctc ctatcagcga gtccactggc gggaactttc cagtcagccg 300 ctatgaaaca acaaaaacgg ctttacgccc gattgctgac gctgttattt gcgctcatct 360 tcttgctgcc tcattctgca gctgcagtga aataatgtgc tttttgtttt ttggcgttca 420 gaaattactt ttccactgtt tgatttaaaa ttctgctaaa aaacatttaa ctttaattta 480 aactatggta tgattatgaa atgttagtga gccgaagctg cgtgatgaaa ggcttgctaa 540 taaaaatatt tatttgtcta aaggagttaa ggaaacagat gcagaagaaa aaatccgcac 600 gccatttgaa caaagtggct gaattagccg cagcactgct cctatcagcg agtccactgg 660 cgggaacttt ccagtcagcc gct 683

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자를 포함하는 플라스미드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 플라스미드는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 복제기점, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 단백질 유전자 및 서열번호 7의 염기서열을 갖는 단백질 유전자로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 더욱 포함하는 플라스미드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 플라스미드는 서열번호 9의 염기서열을 갖는 플라스미드.
  4. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점; 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질; multiple cloning site 및 선별 마커를 포함하는 벡터.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 벡터는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 복제기점, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 단백질 유전자 및 서열번호 7의 염기서열을 갖는 단백질 유전자로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 더욱 포함하는 벡터.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 multiple cloning site 및 선별 마커는 대장균용 벡터에서 유래된 것인 벡터.
  7. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 복제기점; 서열번호 3의 염기서열을 갖는 복제개시단백질 유전자; multiple cloning site; 선별 마커; 대장균 유래 복제 원점; 및 대장균 유래 프로모터를 포함하고, 유산균 및 대장균에서 상호복제가 가능한 셔틀벡터인 벡터.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 셔틀벡터는 서열번호 12 내지 서열번호 17로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 것인 셔틀벡터인 벡터.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 벡터 내에 목적 유전자가 삽입된 재조합 벡터.
  10. 제9항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 숙주세포는 대장균 또는 유산균인 형질전환체.
  12. 제4항의 벡터 또는 제7항의 셔틀벡터와 락토바실러스 펜토서스 균주로 구성된 호스트/벡터 시스템(host/vector) 시스템.
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