KR20150092921A

KR20150092921A - 담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터를 포함하는 셔틀벡터 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20150092921A
Application number: KR1020140013555A
Authority: KR
Inventors: 강대경; 채종표
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2014-02-06
Filing date: 2014-02-06
Publication date: 2015-08-17
Also published as: KR101613897B1

Abstract

본 발명은 담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터를 포함하는 셔틀벡터 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01 균주의 유전체로부터 담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salvarius) CPM-7로PM 부터 분리된 유산균 플라스미드를 대장균 유래 벡터와 연결하여 제조된 셔틀벡터(shuttle vector)에 관한 것이다.
본 발명에 따른 담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터를 포함하는 셔틀벡터 및 이를 포함하는 조성물은, 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 특이적으로 반응하여 발현되는 특성을 가지고 있어, 사람이나 동물이 장내에서 특이적으로 유용 유전자를 발현시킬 수 있으며, 이를 경구용 백신 운반체로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 새로운 기능을 부가한 프로바이오틱스 개발을 위한 백본(backbone) 벡터로 이용될 수 있다.

Description

담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터를 포함하는 셔틀벡터 및 이를 포함하는 조성물{SHUTTLE VECTOR COMPRISING A PROMOTER INDUCIBLY EXPRESSED UNDER BILE ACID AND COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터를 포함하는 셔틀벡터 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01 균주의 유전체로부터 담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salvarius) CPM-7로 부터 분리된 유산균 플라스미드를 대장균 유래 벡터와 연결하여 제조된 셔틀벡터(shuttle vector)에 관한 것이다.

사람의 장에는 약 1kg의 균이 서식하고 있으며 음식물의 양과 균의 양이 거의 동일하게 존재하고, 매일 배설하는 분변 내용물도 수분을 제외하면 약 40%를 균이 차지한다. 사람의 분변을 현미경으로 관찰하면 거의 균 덩어리로 이루어져 있음을 알 수 있으며 이들 균의 99% 정도가 혐기성 균이다. 모유를 먹는 건강한 아기의 경우, 분변 균 중 90% 이상이 Bifidobacterium으로 이루어져 있으나 나이가 들면서 점차 Bifidobacterium은 감소하고 장내 유해균이 증가하게 된다. 이러한 정상적인 노화 과정에서 장내 균총의 분포를 건강한 상태로 유지하도록 도와주는 것이 프로바이오틱스(Probiotics)의 기능이다. 프로바이오틱스는 섭취되어 장에 도달하였을 때에 장내 환경에 유익한 환경을 하는 균주를 말한다. 즉, 장에 도달하여 장 점막에서 생육할 수 있게 된 프로바이오틱스는 젖산을 생성하여 장내 환성을 산성으로 만든다. 산성 환경에서 견디지 못하는 유산균들은 그 수가 감소하게 되고 산성에서 생육이 잘 되는 유익균을은 더 증식하게 되어 장내 환경을 건강하게 만들어주게 된다.

현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균들이며 이들 유산균은 GRAS(Generally Accepted As Safe) 균주로서 그 안정성이 오랜 기간 인정되어 식품이나 의약품, 동물용 사료첨가제 등에 사용되어 왔다. 특히 락토바실러스 속 유산균은 내산성 및 내답증성, 장관 점막 부착성 및 접착성 그리고 프로바이오틱스로서의 건강증진 효과 등으로 인해 경구 운반체의 후보물질로 각광을 받고 있다. 현재 유산균을 이용한 유전자 발현시스템이 최근 유럽과 미국을 중심으로 연구가 진행 중이며, 현재까지 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 등에서 유래된 플라스미드를 이용한 다양한 벡터 시스템이 개발되고 있다. 하지만, 인체나 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 특이적으로 반응하여 발현될 수 있는 벡터 시스템은 아직까지 개발된 적이 없다.

이에 본 발명에서는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01 균주로부터 담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터 및 유산균 플라스미드를 포함하는 셔틀벡터를 제공함으로 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 특이적으로 반응하여 발현될 수 있는 새로운 기능의 프로바이오틱스 개발에 기반을 마련하고자 한다.

출원번호 10-2007-0000797 유산균 내에서 복제가 가능한 대장균-락토바실러스 셔틀벡터 및 그 응용

본 발명의 목적은 담즙산에 의해 특이적으로 반응하여 발현되는 특성을 통하여 사람이나 동물의 장내에서 특이적으로 유용 유전자를 발현시키고 경구용 백신 운반체로 사용하기 위한 것으로, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01 균주의 유전체로부터 분리된 담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salvarius) CPM-7로부터 분리된 유산균 플라스미드를 대장균 유래 벡터와 연결하여 셔틀벡터를 제조함으로써 완성된다.

본 발명의 위와 같은 목적은, 사람이나 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 의해 특이적으로 발현이 증가하는 특성을 갖는 셔틀벡서 pBCEG29를 제공함으로 달성된다.

또한, 상기 셔틀벡터는 셔틀벡터 pBCEG29는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01 유전체로부터 분리된 DADA(D-alanyl-D-alanine ligase) 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터로써 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DADA_P(D-alanyl-D-alanine ligase_Promoter)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 셔틀벡터 pBCEG29는 경구 운반체로 사용 가능한 유산균인 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM-7 유래의 플라스미드 DNA로써 서열번호 4의 염기서열을 갖는 pCPM72를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 위와 같은 목적은, a) 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01 균주의 유전체로부터 DADA_P 프로모터 부위를 PCR 방법으로 증폭하여 벡터에 클로닝하는 단계, b) 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM-7 균주로부터 pCPM72 플라스미드 DNA를 분리하여 pUC19 벡터에 클로닝하는 단계, c) 벡터의 크기를 최적화하기 위하여, 상기 b) 단계에서 제작된 pCPM72를 주형으로 하여 대장균 복제원점 부위, 엠피실린(ampicillin) 항생제 저항성 유전자 및 다중클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 PCR 방법으로 각각 증폭하는 단계, d) 상기 c) 단계에서 생성된 각각의 증폭산물을 제한효소 처리 후, 연결시켜 셔틀벡터 pC19를 제작하는 단계, e) 상기 d) 단계에서 제작된 셔틀벡터 pC19에 유산균에서 복제가 가능한 복제인자 영역을 클로닝하기 위해 상기 b) 단계에서 분리된 pCPM72를 주형으로 하여 유산균 복제원점 부위를 PCR 방법으로 증폭하는 단계, f) 상기 e) 단계에서 생성된 증폭산물을 제한효소 처리 후, 상기 d) 단계에서 제작된 pC19에 연결시켜 pC29를 제작하는 단계, g) 락토바실러스 속 유산균의 선택마커(selection marker)로 사용되는 에리트로마이신(Erythromycin) 저항성 유전자를 클로닝하기 위해 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01 지놈(genome)을 주형으로 하여 에리트로마이신(Erythromycin) 저항성 유전자를 PCR 방법으로 증폭하는 단계, h) 상기 g) 단계에서 생성된 증폭산물을 제한효소 처리 후, 상기 f) 단계에서 제작된 pC29에 연결시켜 pCE29를 제작하는 단계, i) 상기 a) 단계에서 클로닝된 DADA_P 프로모터를 제한효소 처리 후, 상기 h) 단계에서 제작된 pCE29에 연결시켜 pBCE29를 제작하는 단계, j) 유산균의 선택마커로 사용되는 β-글루쿠로니다아제(Beta-glucuronidase) 유전자를 클로닝하기 위해 pNZ8008 플라스미드 벡터를 주형으로 하여 β-글루쿠로니다아제(Beta-glucuronidase) 유전자를 PCR 방법으로 증폭하는 단계 및 k) 상기 j) 단계에서 생성된 증폭산물을 제한효소 처리 후, 상기 i) 단계에서 제작된 pBCE29에 연결시켜 pBCEG29를 제작하는 단계를 포함하여 구성되는 셔틀벡터 pBCEG29의 제조방법을 제공함으로 달성된다.

또한, 상기 a) 단계의 DADA_P 프로모터 부위는 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 c) 단계의 대장균 복제원점 부위 및 엠피실린(ampicillin) 항생제 저항성 유전자는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 c) 단계의 다중클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 e) 단계의 유산균 복제원점 부위는 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 g) 단계의 에리트로마이신(Erythromycin) 저항성 유전자는 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 j) 단계의 β-글루쿠로니다아제(Beta-glucuronidase) 유전자는 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 위와 같은 목적은 셔틀벡터 pBCEG29로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체를 제공함으로 달성된다.

상술한 바와 같이, 담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터를 포함하는 셔틀벡터 및 이를 포함하는 조성물은, 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 특이적으로 반응하여 발현되는 특성을 가지고 있어, 사람이나 동물이 장내에서 특이적으로 유용 유전자를 발현시킬 수 있으며, 이를 경구용 백신 운반체로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 새로운 기능을 부가한 프로바이오틱스 개발을 위한 백본(backbone) 벡터로 이용될 수 있다.

도 1. 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM-7 균주에서 유래된 pCPM72 플라스미드의 개열지도
도 2. 대장균 복제원점 영역 및 엠피실린 항생제 저항성 유전자를 포함하는 부분과 multi-cloning site(MCS) 부분을 연결하여 제작된 pC19 셔틀벡터 개열지도
도 3. 플라스미드 pCPM72의 복제인자 영역과 pC19 셔틀벡터를 연결하여 제작된 pC29 셔틀벡터 개열지도
도 4. 플라스미드 pC29와 에리트로마이신(Erythromycin) 저항성 유전자를 연결하여 제조된 pCE29 셔틀벡터 개열지도
도 5. 플라스미드 pCE29와 DADA 유전자의 프로모터 부위인 DADA_P를 연결하여 제조된 pBCE29 셔틀벡터 개열지도
도 6. 플라스미드 pBCE29와 β-글루쿠로니다아제 유전자를 연결하여 제조된 pBCEG29 셔틀벡터 개열지도
도 7. 대장균과 락토바실러스 속 유산균 내에서 상호 복제가 가능한 셔틀벡터 pBCEG29의 제조과정
도 8. 건강한 돼지 분변으로부터 분리된 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) C1-10 유산균의 플라스미드 DNA의 존재 유무를 확인한 실험 결과
도 9. 형질전환된 유산균에 도입된 β-글루쿠로니다아제 유전자의 발현정도를 조사 결과

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다.

하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.

실시 예 1. 담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터 DAD_P의 클로닝 및 이의 염기서열 분석

본 발명의 담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01 균주의 유전체로부터 분리된 DADA(D-alanyl-D-alanine ligase) 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터로서, 이의 클로닝 과정은 다음과 같다.

락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01 균주의 유전체로부터 담즙산 첨가에 의해 발현이 증가하는 DADA(D-alanyl-D-alanine ligase) 유전자의 업스트림(upstream) 부분을 클로닝 하였으며, 이를 DADA_P로 명명하였다. 보다 자세하게는, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01의 genomic DNA로 부터, 서열번호 1과 같은 담즙산에 의해 발현이 유도되는 프로모터인 DADA_P를 표 1과 같은 프라이머를 이용하여 증폭한 후 pGEMT(R)-T easy 벡터(Promega, USA)에 클로닝을 하였다.

프라이머	프라이머 서열	인식되는 제한효소
DADA_P-F	5'-AACGGGCCCGAGCGTTATCATTATCGGTT-3’	GGGCCC: ApaⅠ
DADA_P-R	5'-AACGCCGGCATTTTTATCTCCTTTTTGTCC-3'	GCCGGC: NaeⅠ

실시 예 2. 플라스미드 분리를 위한 락토바실러스 속 균주로부터 플라스미드 pCPM72의 분리

돼지의 장관 내에서 집락형성(colonization)이 잘 일어나며, 경구 운반체로 사용 가능한 유산균을 확보하기 위하여 천안지역의 돈사에서 수거한 돼지 분변을 생리식염수로 희석한 후 Na-azide가 함유된 MRS 평판배지에 도말하였다. 37℃에서 48시간 동안 혐기 상태로 배양한 후, 전형적인 락토바실러스 속 콜로니 50개를 임의로 택하여 플라스미드 DNA(Plasmid DNA)를 추출하였으며, 셔틀벡터(shuttle vector)로 개발 가능한 2~10kb 크기의 플라스미드 DNA를 가지고 있는 균주를 선발하였다.

플라스미드 분석으로 선발된 락토바실러스 속을 동정하기 위하여 16s rRNA 유전자 분석과 API CH50L 키트를 이용한 표현형 분석을 실시하였다. 동정실험을 통해 해당 균주를 "락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM-7로 명명하였으며, 이를 한국농업미생물자원센터(KACC)에 2007년 11월 16일자로 기탁하였다(기탁번호 : KACC 91332P).

락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM-7로부터 플라스미드 DNA를 분리하기 위해, 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM-7 균주를 MRS 액체배지에 배양한 후에 원심분리하여 균체를 회수하였다. 인산완충용액으로 세척한 후에, 라이소자임(lysozyme)과 뮤타노라이신(mutanolysin) 효소를 첨가하여 30 내지 60분 동안 반응시켰다. 이 후, 이를 원심분리하여 상층액을 제거한 후에 100㎕의 Solution Ⅰ(50 mM glucose, 25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, pH 8.0)로 현탁하였으며, 200㎕의 0.2M NaOH, 1% SDS를 첨가하여 잘 섞어주었다. 여기에 150㎕의 5M 포타슘 아세테이트(potassium acetate) 용액(pH 4.8)을 첨가하여 혼합하였다. 이 후, 이를 12,000xg에서 20분간 원심분리하여 상층액 회수하였으며, 이와 동일한 부피의 phenol:chloroform:isoamyalcohol(25:24:1)을 첨가하여 교반하였다. 이를 12,000xg에서 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하고, 이의 1/10 부피의 3M NaOAc 및 2배의 에탄올을 첨가한 후 -20℃에서 30 내지 60분간 보관한 후 이를 다시 12,000xg에서 20분간 원심분리하여 플라스미드 DNA의 침전을 유도하였다. 이를 70% 에탄올로 가볍게 세척하여 건조한 후, 적정량의 증류수를 첨가하여 플라스미드 DNA를 용해하였다. 이를 0.7 내지 1.0% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 전기영동을 수행하여 에티디움 브로마이드(ethidium bromide : EtBr)로 염색하여 플라스미드 DNA의 존재 여부 및 크기를 확인하였다.

이와 같이 생성된 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM-7 유래의 플라스미드 DNA(이하, pCPM72)에 제한효소를 처리한 결과, Sau3AⅠ 제한효소 인식 사이트가 한군데 존재하는 것으로 추정되었기에, Sau3AⅠ 제한효소로 처리한 pCPM72를 BamHⅠ으로 처리한 pUC19에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다(서열번호 4, 도 1). 염기서열 분석 결과, pCPM72는 2579bp의 뉴클레오티드(nucleotide)로 구성되어 있고, G+C 함량은 30.77%이었다. 또한 두 개의 ORF(Open Reading Frame)이 존재하며, 22bp가 반복되는 ori(origin of replication)가 존재함을 확인하였다

두 개의 ORF 중, ORF 1은 314개의 아미노산(amino acid)로 구성되어 있으며, 다른 유산균의 복제 단백질(replication protein)과 50 내지 95%의 높은 상동성을 나타내었다. ORF 2는 144개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 다른 미생물의ribbon helix-turn-helix protein과 30% 전후의 상동성을 나타내었다.

실시 예 3. 셔틀벡터의 제조

실시 예 2에서 분석한 결과를 바탕으로 대장균(E. coli)-락토바실러스(Lactobacillus) 셔틀벡터(shuttle vector)를 제조하였다.

3-1. pUC19 벡터의 최소화

최종적으로 완성될 벡터의 사이즈를 최적화하기 위해, 대장균 벡터 pUC19을 주형으로 하여 대장균 복제원점 영역 및 엠피실린(ampicillin) 항생제 저항성 유전자를 포함한 부분과 multi-cloning site 부분을 각각 표 2의 프라이머를 사용하여 PCR 방법으로 증폭하였다. 이 후, 증폭된 PCR 산물은 각각 NcoⅠ제한효소로 절단한 후에 T4 DNA ligase로 연결시켜, 도 2와 같은 맵(map)을 갖는 1.85kb 크기의 pC19을 완성하였다.

프라이머	프라이머 서열	인식되는 제한효소
MCS(multi cloning site)-F	5'-CAACACCATGGGGGCCCGCCGGCCATATGGCATGCCTGCAGGTC-3'	CCATGG: Nco I
MCS(multi cloning site)-R	5'-ACACACCATGGGCTAGCTTAGAATTCGAGCTCGGTACC-3'	CCATGG: Nco I
Ap-Ori-F	5'-ACACACCATGGCAGCTGCTCGAGCCCCTATTTGTTTAT-3'	CCATGG: Nco I
Ap-Ori-R	5'-ACACACCATGGCTCGAGGTAAAAAGGCCGC-3'	CCATGG: Nco I

3-2. 유산균의 복제원점(replication origin)의 클로닝

락토바실러스 속 유산균에서 복제가 가능한 복제인자 영역을 클로닝하기 위해 pCPM72를 주형으로 하여 표 3과 같은 pCPM-ori-F와 pCPM-ori-R을 이용한 PCR 반응을 실시하였으며, PCR 생성물을 NheⅠ 제한효소로 처리하였다. 이 후, 실시 예 3-1을 통해 제작된 pC19을 NheⅠ 제한효소로 절단한 후, 상기의 PCR 반응물과 T4 DNA ligase효소로 연결함으로써, 도 3과 같은 맵(map)을 갖는 2.92kb 크기의 pC29를 제조하였다.

프라이머	프라이머 서열	인식되는 제한효소
pCPM-ori-F	5'- ACACGGCTAGCAGTGTAATAATTACTC -3'	GCTAGC: Nhe I
pCPM-ori-R	5'- CAACGGCTAGCATTATTCTATCCAGT -3'	GCTAGC: Nhe I

3-3. 에리트로마이신(Erythromycin) 저항성 유전자의 클로닝

락토바실러스 속 유산균의 selection marker(선택마커)로 사용되는 에리트로마이신 저항성 유전자를 클로닝하기 위하여, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01 genome을 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. 이때 사용된 프라이머는 표 4와 같다.

프라이머	프라이머 서열	인식되는 제한효소
pCPM-erm-F	5'- AAACAGCTGTTTCGCAGTAACTCTATTATCAAC -3'	CAGCTG: Pvu II
pCPM-erm-R	5'- AAACAGCTGGCACCCCTTAACTTTATCTATTAA -3'	CAGCTG: Pvu II

증폭된 821bp 크기의 PCR 산물과 실시 예 3-2를 통해 제작된 pC29를 Pvu Ⅱ 제한효소로 각각 절단한 후에 T4 DNA ligase로 연결함으로써, 도 4와 같은 맵을 갖는 3.74kb 크기의 pCE29를 제작하였다.

3-4. 담즙산 유도성 프로모터의 클로닝

실시 예 1을 통해 클로닝된 DADA_P와 실시예 3-3에서 제작된 pCE29를 ApaⅠ 및 Nae Ⅰ 제한효소로 각각 절단한 후에 T4 DNA ligase로 연결함으로써 도 5와 같은 맵을 가진 4.24kb 크기의 pBCE29를 제작하였다.

3-5. β-글루쿠로니다아제(Beta-glucuronidase) 유전자의 클로닝

β-글루쿠로니다아제 효소는 X-gluc 기질을 분해하여 색깔을 푸르게 변하게 하고, 락토바실러스 속 유산균은 이 유전자를 가지고 있지 않기 때문에, β-글루쿠로니다아제 유전자는 유산균용 selection marker로 자주 사용되고 있다. 상업적으로 사용되고 있는 pNZ8008 플라스미드 벡터(plamid vector)를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. 이때 사용된 프라이머는 표 5와 같다. 증폭된 1809bp 크기의 PCR 산물과 pBCE29를 NdeⅠ 및 EcoRⅠ 제한효소로 각각 절단한 후에 T4 DNA ligase로 연결함으로써 도 6과 같은 맵을 가진 6.05kb 크기의 pBCEG29를 최종적으로 제작하였으며, 이상과 같은 pBCEG29 셔틀벡터의 제조과정은 도 7과 같다.

프라이머	프라이머 서열	인식되는 제한효소
pCPM-glu-F	5'-AGCGGTCATATGTTACGTCCTGTAGAAACCCC-3'	CATATG: Nde I
pCPM-glu-R	5'-AGCGGTGAATTCTCATTGTTTGCCTCCCTGCT-3'	GAATTC: EcoR I

실시 예 4. 대장균-락토바실러스 셔틀벡터(pBCEG29)에 의한 락토바실러스 속 균주의 형질전환

실시예 3을 통해 최종적으로 제작한 pBCEG29를 유산균 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) C1-10에 도입하였다.

락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) C1-10은 천안지역의 돈사에서 수거한 돼지 분변을 생리식염수로 희석한 후에 Na-azide가 함유된 MRS 평판배지에 도말함으로써 분리되었으며, 16s rRNA 유전자 분석과 API CH50L 키트를 이용한 표현형 분석을 통한 동정실험을 통해 상기 균주는 "락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) C1-10"으로 명명되었다. C1-10 균주는 도 7에서 보는 바와 같이 Plasmid - free 균주이기 때문에 형질전환용 숙주로 적합한 것으로 확인되었다.

락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) C1-10 균주를 1% 글리신(glycine)이 함유된 MRS 액체배지에 접종하여 OD660 = 0.3 내지 0.5에 도달할 때까지 배양한 후에 얼음에 10분간 방치하였다. 이 후, 5,000xg 에서 20분간 원심분리하여 유산균을 회수한 후, 인산완충용액(5mM sodium phosphate, 1mM MgCl2, pH7.4)으로 2회 세척하였다. 1mM 수크로오스(sucrose), 1mM MgCl2(pH7.4) 용액 100㎕에 현탁한 후에 pBCEG29와 혼합하였다. 얼음에 잠시 방치한 후 1~5KV, 10~50uF의 조건으로 전기천공(electroporation)을 실시하였다. MRS 배지 500㎕를 첨가한 후 37℃에서 2 내지 3시간 배양한 후, 세포를 침전시켜 5 내지 10㎍/㎖ 농도의 에리트로마이신이 함유된 MRS 고체배지에 도말하였다. 37℃에서 48 내지 72시간 동안 배양한 후에 생성된 콜로니를 취하여 형질전환주로 선발하였다.

실시 예 5. DADA_P 프로모터에 의한 β-글루쿠로니다아제(Beta-glucuronidase) 유전자의 담즙산 의존적 발현 확인

상기 실시 예 4를 통해 선별된 형질전환 유산균을 에리트로마이신(5~10㎍/㎕)이 함유된 MRS 액체배지에 접종하고 37℃에서 48시간 내지 72시간 동안 배양하였다. 배양액 0.1%(v/v)을 다시 에리트로마이신이 함유된 MRS 액체배지에 접종하고 OD660=0.5에 도달할 때까지 배양한 후에 담즙산(Sigma, USA)을 0, 0.1, 0.3%씩 각각 첨가하여 5시간 동안 추가배양 하였다. 배양이 종료된 후에 각 배양액을 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 초음파분쇄기로 세포를 파쇄하였다. 이 후, 세포파쇄액을 원심분리하여 상등액을 회수한 다음 DADA_P 프로모터 하류(downstream)에 연결된 리포터 유전자(reporter gene)인 β-글루쿠로니다아제의 발현정도를 조사함으로써, DADA_P 프로모터의 담즙산 의존성 여부를 조사하였다. β-글루쿠로니다아제 활성 강도는 X-gluc 기질의 분해 정도에 따라 시료의 색깔이 달라짐을 이용하여 분광 광도계(spectrophotometer)를 사용하여 405nm 흡광도(optical density)를 측정하였다. 도 9에서 보는 바와 같이, 담즙산이 첨가되지 않은 시료에서는 흡광도가 0.11에 불과하였으나, 담즙산이 0.1% 첨가된 시료에서는 흡광도가 1.07, 담즙산이 0.3% 첨가된 시료에서는 흡광도가 1.43으로서 담즙산의 농도가 증가함에 따라 흡광도도 같이 증가하였다. 이는 담즙산이 첨가됨에 따라 유전자 발현이 유도되며, 나아가 담즙산 농도가 증가함에 따라 유전자 발현도 함께 증가한다는 것을 의미한다. 즉, 본 발명에 의한 DADA_P 프로모터는 담즙산에 의존적으로 그 하류에 연결된 유전자의 발현을 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<110> DANKOOK University Industry Academic Cooperation Foundation <120> SHUTTLE VECTOR COMPRISING A PROMOTER INDUCIBLY EXPRESSED UNDER BILE ACID AND COMPOSITION COMPRISING THE SAME <130> P14 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 500 <212> DNA <213> DADA(D-alanyl-D-alanine ligase) <400> 1 gtgatttgag cgttatcatt atcggtttta tttgttgaaa tacttggtaa gtcaaataaa 60 gctcggtaaa aattaatata atctaattga gaattgatat aagaatttgt aacagaaccg 120 ggtgaaaagg gagccgtgag atgaggagtg ctggcataaa gattatctgc attaaaattt 180 tctttaggta aatttttata ttgattttga atttgatgaa cttcttgaat ttcatcttta 240 gtaaaggttg cagcctgtgc gttagtaact ataacggtag aagtagttgt acttaacaca 300 atagttgcta aaaaagtggc tgcttttttg gtaaaagtca taattactcc ttttagcgaa 360 tcatatagta gcatgatagt aatatatata acgtaattat aaaaaaattg cattcttttt 420 agactttttt tcgaaattga tgcattatag cgtcacgatt gtttataata aggtttcgag 480 gacaaaaagg agataaaaat 500 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DADA_P-F <400> 2 aacgggcccg agcgttatca ttatcggtt 29 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DADA_P-R <400> 3 aacgccggca tttttatctc ctttttgtcc 30 <210> 4 <211> 2579 <212> DNA <213> plasmid pCPM72 <400> 4 ggatctgtta ggatacgtac gttcaacaga aatcacagtt aatcgaaaag agaaaagttt 60 tcatcagcat atacatattc ttttagcagt atcgccaaca tattttaaaa agggtcatta 120 tttatctcaa gataattggt ctaaattgtg gcagaaagca cggaaattag attataaacc 180 agtggtaaat attaagactg tttcagacag taagaaagat aaaagccttg ttgcgagtgc 240 aaaagaagtt gcgaagtatc aagttaagag ttctgattac atcactgaag atgttgaaag 300 cgacttggaa tttttaaagg agttagaaaa agctttattt cataaacgtc aactttcatt 360 tggtggagag tttaaagtaa tcagaaaaga attaaaactt gaagatcatg aagatgattt 420 agtacacgtt gatggagaaa atacttctgc tgccgaaaca gaaaaaatta tttttctttg 480 gaataacgaa gtaaaaaatt atgtgaactg gatagaataa tttaagaact ggaatttttt 540 tcagttcttt tttttatttt ttgtttctgg aattgaagta gcagagaaaa tttttcttcc 600 agttattttt cgcaagaaaa aaaggaaact ggaagaaaaa ttattgttta acaaatgttt 660 tacgtaaaat aagcgtaaaa caaagtgtaa attaggtgta aaacaagtgt taaatagctg 720 tgtaacaagc gagaaaatta agtccctaag aaaacgccga tactatcggc tcccacgcac 780 ctgtgggacc attttctctt atgctcttta actctgtact ccagtttaga agatgccaaa 840 attttattct caaaattcgt taagtgggtt tgaagatttt tttctttgtt taattttttt 900 gaaaaagaaa aattgaattt aagaaatttt tttggctcaa aattaaattt aaaaatcgaa 960 aatcaaagaa ttaaatcttc aaaagtttca aagcaaacat acaagttatt acaagcctta 1020 aaaatcgttt ctgagacgtt ttaaataaag ctgaatataa ataatagtca aggggcaaaa 1080 aagcgacgta ggagcttttg agacgccgta gggcaaccct tgactatttt aagcataaag 1140 acgctgagaa aaaagaaagc aagcttgctt tctcgagaca cgtgtcggcg aacggttccc 1200 caatgcaatg gggcggaggg gttaagataa tattatttta ttagtagctt taatttgtag 1260 ctacaaaatg ttataataat tttgaggtgg taaagatgtt taaacgtgaa aatagagatg 1320 aagttgtaag acttagagta acgacagaag aaaaagaaat tttaaaaaag tttgctcaag 1380 aaaaagattt gactatgtca gcagtaatag ctcaagcctt agataactat ttggatgcaa 1440 caactccaaa agattttgag caaatggaag tttattataa tggcaaaaag gataaagcat 1500 tgacacgtaa agctcaaaat gccttagctt tttctaaacg ctatgatgaa atcatgggca 1560 ataagacttc tttgtttgat atggaaaaag aatatcaaga acattatttt gagagattga 1620 aaaaattggt tgctgaagat gaagaattga aaaagttgag aaaattgcag tcaaagaaag 1680 caaaaattga gcagtaaaaa agttggcttt agccaacttt taaactcgcg aagcgagttt 1740 cttcttatct tgatactata tagaaataac gccatttttt ttttgagtca aaaaaagtgc 1800 gataaacgtt gatataataa cgtttataag gggtcaaaaa ggtcgaaaat gggttgaatg 1860 gattgtttat aatattttaa ctttttatga ctttttggct tgtatagatt tttttgaaaa 1920 ttgagggtat actcgttttt agaataaaaa aattaatgca aaaaaaaact catgctgaaa 1980 gttttggacg acctaagcaa gagttttaaa gcaaaatatt attgtgttta ttacggtttt 2040 agtgtaataa ttactcacta cattatagag atgttaggtg gaatagtcaa taattgttgt 2100 tataatgctt taggactctg acagcatgag taaagaaagg aagttcttct catgtttgga 2160 gatgaaattt tagtagataa ggcaaaaaat ggcaaggtta gaccctggaa agaaaagaaa 2220 ttagctaatt taacctatgc tgaatattta cagattctgg aaataaaaaa agcttttaga 2280 gtaaaaaagt gtggtaatct tctaactttt acaaaaagtg aaaatggctt aaagctttat 2340 caaacatggt tttgtaagag tcgcctatgt ccattgtgtg cttggcgtta cgctatgaaa 2400 aatagctatg aattgagttc gattttagat gtcttttata aacgatatcc aaaatcaaga 2460 tttttatttt taactctaac tgaagaaaac gcaaaacagg gagaattaaa agaaaaatta 2520 gctgagatga acagggcttt atataagctt tttcagtata aaaaagttca aaaggatcc 2579 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ap-Ori-F <400> 5 acacaccatg gcagctgctc gagcccctat ttgtttat 38 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ap-Ori-R <400> 6 acacaccatg gctcgaggta aaaaggccgc 30 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCS(multi cloning site)-F <400> 7 caacaccatg ggggcccgcc ggccatatgg catgcctgca ggtc 44 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCS(multi cloning site)-R <400> 8 acacaccatg ggctagctta gaattcgagc tcggtacc 38 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCPM-ori-F <400> 9 acacggctag cagtgtaata attactc 27 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCPM-ori-R <400> 10 caacggctag cattattcta tccagt 26 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCPM-erm-F <400> 11 aaacagctgt ttcgcagtaa ctctattatc aac 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCPM-erm-R <400> 12 aaacagctgg caccccttaa ctttatctat taa 33 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCPM-glu-F <400> 13 agcggtcata tgttacgtcc tgtagaaacc cc 32 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCPM-glu-R <400> 14 agcggtgaat tctcattgtt tgcctccctg ct 32

Claims

사람이나 동물의 장내에 존재하는 담즙산에 의해 특이적으로 발현이 증가하는 특성을 갖는 셔틀벡터 pBCEG29.
제1항에 있어서,
상기 셔틀벡터 pBCEG29는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01 유전체로부터 분리된 DADA(D-alanyl-D-alanine ligase) 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터로써 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DADA_P(D-alanyl-D-alanine ligase_Promoter)를 포함하는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터 pBCEG29.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 셔틀벡터 pBCEG29는 경구 운반체로 사용 가능한 유산균인 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM-7 유래의 플라스미드 DNA로써 서열번호 4의 염기서열을 갖는 pCPM72를 포함하는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터 pBCEG29.
a) 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01 균주의 유전체로부터 DADA_P 프로모터 부위를 PCR 방법으로 증폭하여 벡터에 클로닝하는 단계;
b) 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CPM-7 균주로부터 pCPM72 플라스미드 DNA를 분리하여 pUC19 벡터에 클로닝하는 단계;
c) 벡터의 크기를 최적화하기 위하여, 상기 b) 단계에서 제작된 pCPM72를 주형으로 하여 대장균 복제원점 부위, 엠피실린(ampicillin) 항생제 저항성 유전자 및 다중클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 PCR 방법으로 각각 증폭하는 단계;
d) 상기 c) 단계에서 생성된 각각의 증폭산물을 제한효소 처리 후, 연결시켜 셔틀벡터 pC19를 제작하는 단계;
e) 상기 d) 단계에서 제작된 셔틀벡터 pC19에 유산균에서 복제가 가능한 복제인자 영역을 클로닝하기 위해 상기 b) 단계에서 분리된 pCPM72를 주형으로 하여 유산균 복제원점 부위를 PCR 방법으로 증폭하는 단계;
f) 상기 e) 단계에서 생성된 증폭산물을 제한효소 처리 후, 상기 d) 단계에서 제작된 pC19에 연결시켜 pC29를 제작하는 단계;
g) 락토바실러스 속 유산균의 선택마커(selection marker)로 사용되는 에리트로마이신(Erythromycin) 저항성 유전자를 클로닝하기 위해 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) PF01 지놈(genome)을 주형으로 하여 에리트로마이신(Erythromycin) 저항성 유전자를 PCR 방법으로 증폭하는 단계;
h) 상기 g) 단계에서 생성된 증폭산물을 제한효소 처리 후, 상기 f) 단계에서 제작된 pC29에 연결시켜 pCE29를 제작하는 단계;
i) 상기 a) 단계에서 클로닝된 DADA_P 프로모터를 제한효소 처리 후, 상기 h) 단계에서 제작된 pCE29에 연결시켜 pBCE29를 제작하는 단계;
j) 유산균의 선택마커로 사용되는 β-글루쿠로니다아제(Beta-glucuronidase) 유전자를 클로닝하기 위해 pNZ8008 플라스미드 벡터를 주형으로 하여 β-글루쿠로니다아제(Beta-glucuronidase) 유전자를 PCR 방법으로 증폭하는 단계; 및
k) 상기 j) 단계에서 생성된 증폭산물을 제한효소 처리 후, 상기 i) 단계에서 제작된 pBCE29에 연결시켜 pBCEG29를 제작하는 단계; 를 포함하여 구성되는 셔틀벡터 pBCEG29의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 a) 단계의 DADA_P 프로모터 부위는 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터 pBCEG29의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 c) 단계의 대장균 복제원점 부위 및 엠피실린(ampicillin) 항생제 저항성 유전자는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터 pBCEG29의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 c) 단계의 다중클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터 pBCEG29의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 e) 단계의 유산균 복제원점 부위는 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터 pBCEG29의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 g) 단계의 에리트로마이신(Erythromycin) 저항성 유전자는 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터 pBCEG29의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 j) 단계의 β-글루쿠로니다아제(Beta-glucuronidase) 유전자는 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 프라이머 세트로 증폭되는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터 pBCEG29의 제조방법.
제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 의해서 제조된 셔틀벡터 pBCEG29로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체.