CN117551679A - 一种食品级诱导表达载体、系统及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，本发明提供了一种新的食品级诱导表达系统，不仅可以响应低浓度锌离子，弥补现有技术中乳酸菌NICE系统诱导剂成本高限制应用的缺陷；还具有严谨的调控体系，避免转录泄露，蛋白表达量高；同时，本发明提供的表达系统还可以在其他可食用的菌株中使用，促进微生物，尤其乳酸乳球菌或嗜热链球菌作为底盘生物食品和医学领域的应用。

Description

一种食品级诱导表达载体、系统及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，尤其涉及微生物基因工程，具体涉及一种食品级诱导表达载体、系统及其构建方法和应用。
背景技术
本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。
乳酸菌是一类利用碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌的统称，由于其长期应用于食品发酵，是公认的安全微生物。同时，乳酸菌也是肠道菌群的正常组分，具有维持肠内菌群平衡、参与食物转化、粘膜免疫等多种功能，与机体健康息息相关，是益生菌的主要代表性类群。近年来，消费者对于益生产品的健康甚至治疗功效的需求日益增加，乳酸乳球菌和嗜热链球菌等常用食品发酵菌株成为理想的底盘携带新的功能基因(簇)，通过食品级诱导表达系统控制功能基因表达，可以提高菌体细胞的抗逆性、产生高附加值的代谢产物或者治疗疾病的医药分子，这类工程益生菌在食品、医药领域具有诱人的市场前景。
乳酸菌中广泛使用的诱导表达系统为乳酸链球菌素控制的表达系统(nisin-controlled expression,NICE)，包含启动子PnisA和转录调控元件nisRK。在使用NICE系统控制目的基因表达时，需要向培养基中添加乳酸链球菌素(nisin)用来启动PnisA下游基因的转录。由于NICE系统的遗传元件来自于乳酸乳球菌并且诱导剂nisin可以食用，因此NICE系统是一种食品级诱导表达系统。除此以外NICE系统适用的宿主范围广、控制基因表达强度高，是目前唯一商品化的乳酸菌诱导表达系统。但是NICE系统存在诱导剂成本高、转录存在渗漏情况等，这都限制了NICE系统应用场景。
发明内容
为克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种新的食品级诱导表达系统，不仅可以响应低浓度锌离子，弥补现有技术中乳酸菌NICE系统诱导剂成本高限制应用的缺陷；还具有严谨的调控体系，避免转录泄露，蛋白表达量高；同时，本发明提供的表达系统还可以在其他可食用的菌株中使用，扩充了食品级菌株的储量，促进微生物，尤其乳酸乳球菌或嗜热链球菌作为底盘生物食品和医学领域的应用。
为实现上述目的，本发明的一个或多个实施例提供了如下技术方案：
第一方面，提供一种食品级诱导表达载体pNZST，所述载体包括启动子Pzst、转录调控元件Rzst；
所述启动子Pzst选自嗜热链球菌ST1、CNRZ1066、LMG 18311、JIM8232、ND03、MN-ZLW-002、ASCC1275或S9；
所述转录调控元件Rzst选自嗜热链球菌ST1、CNRZ1066、LMG 18311、JIM8232、ND03、MN-ZLW-002、ASCC1275或S9。
本发明的具体实施方式中，所述启动子Pzst的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述转录调控元件Rzst的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1：
ATGGACACTATGAACAAACTGTTCAGTAACGTACACAGCGAACGGTTTGCCCCTATCCTTTCTGTTGGTAGTATTGGATAATAGATATTGAATATGATGTTCGTGAATCTATTATACCAAAGGAAGGTAAAAA
SEQ ID NO.2：
ATGACTGCACAAGATCGTCGCATTACCAAGACTAGAAAAGCCATCTATCAAGCTTTCTTGTACTTACTTAACCAAAAAGATTATGAGGCCATCACCGTTCAGGAGATTATTGACTTGGCTGATGTGGGGCGTTCGACCTTTTACAGCCATTATGAGAGCAAAGAGTTACTACTGGATGAGCTCTGCCAAAAGCTCTTTCACCATTTGTTTGAGCGTACTCAATACCTCTCTCCACAAGACTACCTGGCCCATATCTTTCAACATTTCAAGAAAAATCAAGACCATGTAACCAGTCTCTTGCTTTCAAAAAACGATTATTTTATCCGGCAGCTGCGAAAAGAACTGGAACATGACGTCTATCCAATGGTAGCTGATGAACTGATTCAATCACACCCCAACATTCCTCACTCATATCTCAAGCACCTGGTTATAACCAACTTCATTGAAACCCTGACCTGGTGGTTGAAAAAAGGCAAGTCCTACAGCGAGCAGGAAGTAGTCCAGTTTTATTTGGAGATTTTAAACGTCGCTTCTAACTAA
本发明的具体实施方式中，所述食品级诱导表达载体还包括抗性基因及质粒复制起始蛋白的核酸；
优选地，所述抗性基因包括氯霉素抗性基因cmr或红霉素抗性基因Ermr；
本发明的具体实施方式中，所述表达载体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的具体实施方式中，所述表达载体还包括产物合成基因的核酸序列；优选地，所述产物合成基因包括GFP、IL-10。
本发明的第二方面，提供一种食品级诱导表达系统，所述系统包括第一方面所述的食品级诱导表达载体；
所述系统还包括宿主菌株；
所述宿主菌株包括乳酸乳球菌、嗜热链球菌；
优选地，所述乳酸乳球菌包括MG1363；所述嗜热链球菌包括ST1。
本发明的具体实施方式中，所述系统还包括诱导物；
优选地，所述诱导物为锌离子。
本发明的第三方面，一种生产白细胞介素IL-10的方法，将基因IL-10扩增后采用酶切连接的方式连接到第一方面所述的诱导表达载体中得到质粒pNZST-IL-10；
将质粒pNZST-IL-10转化到宿主菌株中，获得重组菌株；
将重组菌株培养至OD600＝0.4添加终浓度为0.05mM～1.2mM的锌离子，继续培养4～6小时，即可获得；
所述宿主菌株包括乳酸乳球菌、嗜热链球菌；
优选地，所述乳酸乳球菌包括MG1363；所述嗜热链球菌包括ST1；
优选地，所述锌离子的最终浓度为1mM。
本发明的第四方面，提供第一方面所述的食品级诱导表达载体或第二方面食品级诱导表达系统及其产物在制备食品、食品添加剂、化妆品、生物药及保健品上的应用。
本发明的第五方面，提供一种锌响应的启动子组合物，所述启动子组合物包括启动子和转录调控元件；所述启动子和转录调控元件的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
以上一个或多个技术方案存在以下有益效果：
本发明公开了一种食品级诱导表达载体、系统及其在蛋白表达中的应用。所述食品级诱导表达系统包含启动子Pzst和专一性转录调控元件Rzst，二者来自于嗜热链球菌ST1且诱导剂是低浓度的锌离子，均属于食品级。利用本发明公开的食品级诱导表达系统，在嗜热链球菌培养过程中添加浓度为0.08～0.24mM锌离子、在乳酸乳球菌培养过程中添加0.2mM～1.0mM锌离子作为诱导剂即可使目的基因大量表达；该系统表现出严谨性强、蛋白表达量高、诱导剂成本低的特点，为乳酸乳球菌或嗜热链球菌作为底盘生物在食品和医学领域的应用提供了一种安全、严谨的诱导表达系统。
本发明附加方面的优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：本发明实施例一中质粒pNZST图谱
图2：本发明实施例4或5重组乳酸乳球菌MG/pNZST-gfp(A)和重组嗜热链球菌ST/pNZST-gfp(B)的相对荧光强度
图3：本发明实施例7或8重组乳酸乳球菌MG/pNZST-IL和重组嗜热链球菌ST/pNZST-IL表达IL-10后蛋白质杂交结果
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
需要注意的是，本发明未详尽之处是本领域技术人员公知。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件，未详细记载的实验步骤参照《分子克隆实验指南》((美)M.R.格林(Michael R.Green),(美)J.萨姆布鲁克(Joseph.Sambrook)主编，第四版)、病理生理学实验、在线数据库等。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均从商业途径得到。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：锌离子控制的食品级表达系统的遗传元件的获得
以嗜热链球菌ST1的基因组为模板，使用引物zstF和zstR经过PCR扩增获得DNA片段Rzst-Pzst，在该片段中包含启动子Pzst和专一性转录调控元件Rzst的编码序列。序列比对显示启动子Pzst序列与嗜热链球菌CNRZ1066、LMG 18311、JIM8232、ND03、MN-ZLW-002、ASCC1275和S9中的同源序列的一致性为100％，与肺炎链球菌D39中同源序列的一致性为70.59％；专一性转录调控元件Rzst与嗜热链球菌CNRZ1066、LMG 18311、JIM8232、ND03、MN-ZLW-002、ASCC1275和S9中的同源序列的一致性为99.96％，与肺炎链球菌D39中同源序列的一致性为66.67％。
其中，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST1已于2014年8月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,其保藏编号为CGMCC No.9781。
嗜热链球菌的启动子Pzst和专一性转录调控元件的序列通过引物zstF和zstR从菌株ST1的基因组中PCR扩增获得DNA片段Rzst-Pzst。
引物zstF的序列为：5’-TTAGTTAGAAGCGACGTTTAAAATC-3’(SEQ ID NO.4)，
引物zstR的序列为：5’-TTTTTACCTTCCTTTGGTATAATAGATTC-3’(SEQ ID NO.5)。
PCR反应体系为：2×PrimeSTAR Max DNAPolymerase，25μL；zstF，1.5μL；zstR，1.5μL；菌株ST1的基因组DNA，0.5μL；ddH2O，20.5μL。
PCR反应条件为：98℃预变性1分钟，30个循环的变性、退火和延伸，其中变性条件为98℃，10s，退火条件为54℃，15s，延伸条件为72℃，4s；再延伸条件为72℃，10分钟；16℃保温。
序列比对方法：使用DNAMAN软件进行多个序列的一致性比对。
实施例2：锌离子控制的食品级表达载体的建立
使用实施例1中包含启动子Pzst和专一性转录调控元件Rzst的DNA片段Rzst-Pzst(核酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.1所示)，替换载体pNZ8148中BglII和NcoI之间的DNA序列，具体是将pNZ8148使用BglII和NcoI进行酶切获得的产物与Rzst-Pzst的DNA片段通过HiFi DNAAssembly Master Mix进行无缝组装，组装体系转化大肠杆菌DH5α后经过筛选测序后得到重组载体pNZST(如图1)。
载体pNZ8148购自MoBiTec GmbH,货号:VS-ELV00200-01。
无缝克隆组装体系如下：
混匀后，50℃反应1小时。
无缝组装体系转化大肠杆菌DH5α的方法：所述无缝组装体系加入到大肠杆菌DH5α的化学感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30分钟后42℃水浴热激90秒，迅速置于冰上3分钟，加入500μL LB液体培养基，37℃、200rpm摇动培养2小时。取100μL涂布于含终浓度10μg/mL氯霉素LB筛选平板上，37℃培养48小时。
LB液体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，115℃灭菌20分钟，备用。
LB固体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，1.5％琼脂粉，115℃灭菌20分钟，备用。
实施例3：绿色荧光蛋白表达载体的构建
使用引物gfpF和gfpR扩增获得绿色荧光蛋白基因gfp，将含有gfp基因的DNA片段和质粒pNZST经过限制性内切酶NcoI和KpnI酶切，两种酶切产物经过T4 DNA连接酶连接并转化大肠杆菌DH5α，筛选测序正确的重组质粒pNZST-gfp即为绿色荧光蛋白的表达载体。
引物gfpF的序列为：5’-TATCCATGGATGAGCAAAGGAGAAGAACT-3’(SEQ ID NO.6)，
引物gfpR的序列为：5’-TATGGTACCTTAGTAGAGCTCATCCATGC-3’(SEQ ID NO.7)。
所述绿色荧光蛋白基因为人工合成序列(SEQ ID NO.8)，绿色荧光蛋白序列号GenBank:AGT98535.1
限制性内切酶酶切体系如下：
混匀后，37℃反应1小时。
T4 DNA连接酶反应体系如下：
混匀后，16℃连接12小时
转化大肠杆菌DH5α的方法：所述连接液加入到大肠杆菌DH5α的化学感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30分钟后42℃水浴热激90秒，迅速置于冰上3分钟，加入500μL LB液体培养基，37℃、200rpm摇动培养2小时。取100μL涂布于含终浓度10μg/mL氯霉素LB筛选平板上，37℃培养48小时。
LB液体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，115℃灭菌20分钟，备用。
LB固体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，1.5％琼脂粉，115℃灭菌20分钟，备用。
实施例4：绿色荧光蛋白在乳酸乳球菌中的诱导表达
将质粒pNZST-gfp电转化进入宿主乳酸乳球菌MG1363获得重组菌MG/pNZST-gfp，按照2％将重组菌接种于含有终浓度为2.5μg/mL氯霉素的GM17培养基中，30℃静置培养至OD600＝0.4，加入锌离子至终浓度为0.2mM～1.0mM之间，继续培养4～6小时诱导绿色荧光蛋白表达后检测。
所述乳酸乳球菌MG1363购自MoBiTec GmbH,货号:VS-ELS01363。
其中，乳酸乳球菌的电转化方法：乳酸乳球菌MG1363按2％转接至SolI中，30℃静置培养至OD600＝0.4，冰浴30分钟后6000g离心10分钟收集菌体细胞，加入适量冰浴的SolII洗涤菌体。6000g离心10分钟收集菌体细胞，加入1/20体积Sol II悬起菌体沉淀获得感受态细胞。将1μg质粒pNZST-gfp加入感受态细胞混匀后转移到电转化杯，冰浴10分钟，电击，其中电转化参数为2200V/200Ω/20μF。电击结束加入1mL SGM17，混匀后转移至离心管，30℃静置复苏2小时后涂布含有终浓度为2.5μg/mL氯霉素的GM17平板，30℃静置培养48小时。
转化使用的试剂及培养基配方如下：
GM17液体培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母提取物5.0g/L，聚蛋白胨5.0g/L，抗坏血酸0.5g/L，牛肉浸膏2.5g/L，β-甘油磷酸二钠19g/L，0.02g/L MgSO4·7H2O，蒸馏水1000mL，115℃灭菌20分钟，备用。
GM17固体培养基：GM17液体培养基添加1.5％的琼脂粉，115℃灭菌20分钟，备用。
Sol I：GM17液体培养基中添加170g/L蔗糖，10g/L甘氨酸，115℃灭菌20分钟，备用。
Sol II：68g/L蔗糖，10％(v/v)甘油，115℃灭菌20分钟，备用。
SGM17：GM17液体培养基中添加76.3g/L蔗糖山梨醇，4g/L六水氯化镁，2％(v/v)0.1M氯化钙，115℃灭菌20分钟，备用。
绿色荧光蛋白的诱导表达与检测方法：重组菌MG/pNZST-gfp按照2％接种在含有2.5μg/mL氯霉素的GM17培养基，30℃下静置培养至OD600＝0.4，加入锌离子至终浓度为0.2～1.0mM，继续培养4～6小时。培养液6000g离心5分钟收集菌体细胞，菌体细胞用PBS缓冲液洗涤并重悬至原体积。检测菌悬液的OD600以及荧光强度RFU(激发波长485nm，发射波长535nm)，结果(图2)单位相对荧光强度(RFU/OD600)在3103.12±150.35到8467.47±107.02之间。在不添加锌离子时重组菌MG/pNZST-gfp的相对荧光强度(RFU/OD600)在1167.15±54.77至1319.57±31.40之间，而不添加锌离子时宿主菌MG1363的相对荧光强度(RFU/OD600)在1115.15±40.86至1341.41±30.35之间。以上结果中不添加诱导剂锌离子时，重组菌MG/pNZST-gfp和宿主菌MG1363的相对荧光强度相当，但是添加了锌离子的重组菌MG/pNZST-gfp相对荧光强度明显升高，证明该系统的严谨性。
当锌离子终浓度为0.8mM、诱导4小时相对荧光单位(RFU/OD600)是8467.47±107.07。
实施例5：绿色荧光蛋白在嗜热链球菌中的诱导表达
将质粒pNZST-gfp电转化进入宿主嗜热链球菌ST1获得重组菌ST/pNZST-gfp，按照2％将重组菌接种于含有终浓度为2.5μg/mL氯霉素的LM17培养基中，42℃静置培养至OD600＝0.4，加入终浓度为0.08mM～0.24mM的锌离子，继续培养4～6小时诱导绿色蛋白表达后检测。
其中，嗜热链球菌的电转化方法：嗜热链球菌ST1按2％转接至LM17中，42℃静置培养至OD600＝0.5，加入等体积SGLM17，42℃静置培养1小时后冰浴30分钟。6000g离心10分钟收集培养液中的菌体细胞，用冰浴的SG Buffer洗涤菌体细胞。6000g离心5分钟收集菌悬液中的菌体细胞，加入1/20体积SG Buffer悬起菌体沉淀获得感受态细胞。将1μg质粒pNZST-gfp加入感受态细胞混匀后转移到电转化杯，冰浴10分钟，电击，其中电转化仪参数为2500V/200Ω/20μF。电击结束加入1mL SLM17，混匀后转移至离心管，42℃静置复苏2小时后涂布含有终浓度为2.5μg/mL氯霉素的LM17平板，42℃静置培养48小时。
转化使用的试剂及培养基配方如下：
LM17液体培养基：乳糖10g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母提取物5.0g/L，聚蛋白胨5.0g/L，抗坏血酸0.5g/L，牛肉浸膏2.5g/L，β-甘油磷酸二钠19g/L，0.02g/L MgSO4·7H2O，蒸馏水1000mL，115℃灭菌20分钟，备用。
LM17固体培养基：LM17液体培养基添加1.5％的琼脂粉，115℃灭菌20分钟，备用。
SGLM17：LM17液体培养基中添加145.7g/L山梨醇，200g/L甘氨酸，115℃灭菌20分钟，备用。
SG buffer：72.8g/L山梨醇，0.78g/L磷酸二氢钾，10％(v/v)甘油，115℃灭菌20分钟，备用。
SLM17：LM17液体培养基中添加72.8g/L山梨醇，4.1g/L六水氯化镁，2％(v/v)0.1M氯化钙，115℃灭菌20分钟，备用。
绿色荧光蛋白的诱导表达与检测方法：重组菌ST/pNZST-gfp按照2％接种在含有2.5μg/mL氯霉素的LM17培养基，42℃下静置培养至OD600＝0.4，加入锌离子至终浓度为0.08mM～0.24mM，继续培养4～6小时。培养液6000g离心5分钟收集菌体细胞，菌体细胞用PBS缓冲液洗涤并重悬至原体积。检测菌悬液的OD600以及荧光强度RFU(激发波长485nm，发射波长535nm)，结果(图2)单位相对荧光强度(RFU/OD600)在2220.05±35.25到15351.19±139.56之间。在不添加锌离子时重组菌ST/pNZST-gfp的相对荧光强度(RFU/OD600)在1008.83±27.54至1224.84±54.12之间，而不添加锌离子时宿主菌ST1的相对荧光强度(RFU/OD600)在1124.79±17.50至1241.07±33.45之间。
当锌离子终浓度为0.2mM、诱导4小时相对荧光单位(RFU/OD600)是15351.19±139.56。
以上结果说明，本发明提供的食品级诱导表达载体在宿主是热链球菌ST1中依旧可以严谨调控下游基因表达，并未发生转录泄露。
实施例6：白介素-10(IL-10)表达载体的构建
使用引物ILF和ILR扩增获得含有IL-10基因的DNA片段，并将其与pNZST经过限制性内切酶NcoI和KpnI酶切，将两种酶切产物经过T4 DNA连接酶连接并转化大肠杆菌DH5α后，筛选正确的重组质粒pNZST-IL即为白介素-10的表达载体。
引物ILF的序列为：5’-TATCCATGGATGAAAAAAAAGATTATCTC-3’(SEQ ID NO.9)，
引物ILR的序列为：5’-TATGGTACCTCAGTTACGGATTTTCATAG-3’(SEQ ID NO.10)
IL-10基因为人工合成序列(SEQ ID NO.11)，参考的IL-10蛋白质序列号GenBank:CAG46825.1
限制性内切酶酶切体系如下：
混匀后，37℃反应1小时。
T4 DNA连接酶反应体系如下：
混匀后，16℃连接12小时
转化大肠杆菌DH5α的方法：将IL-10与pNZST的连接液加入到大肠杆菌DH5α的化学感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30分钟后42℃水浴热激90秒，迅速置于冰上3分钟，加入500μLLB液体培养基，37℃、200rpm摇动培养2小时。取100μL培养液涂布于含终浓度10μg/mL氯霉素LB筛选平板上，37℃培养48小时。
LB液体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，115℃灭菌20分钟，备用。
LB固体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，1.5％琼脂粉，115℃灭菌20分钟，备用。
实施例7：IL-10在乳酸乳球菌中的诱导表达
将质粒pNZST-IL电转化进入乳酸乳球菌MG1363获得重组菌MG/pNZST-IL，按照2％将重组菌接种于含有终浓度为2.5μg/mL氯霉素的GM17培养基中，30℃静置培养至OD600＝0.4，加入锌离子至终浓度为0.8mM，继续培养4小时诱导IL-10表达后检测。
乳酸乳球菌的电转化方法：乳酸乳球菌MG1363按2％转接至SolI中，30℃静置培养至OD600＝0.4，冰浴30分钟后6000g离心10分钟收集菌体细胞，加入适量冰浴的Sol II洗涤菌体。6000g离心10分钟收集菌体细胞，加入1/20体积Sol II悬起菌体沉淀获得感受态细胞。将1μg质粒pNZST-IL加入感受态细胞混匀后转移到电转化杯，冰浴10分钟，电击，其中电转化参数为2200V/200Ω/20μF。电击结束加入1mL SGM17，混匀后转移至离心管，30℃静置复苏2小时后涂布含有终浓度为2.5μg/mL氯霉素的GM17平板，30℃静置培养48小时。
GM17液体培养基、GM17固体培养基、Sol I、Sol II、SGM17的支配方法与实施例4相同。
IL-10的诱导表达与检测方法：重组菌MG/pNZST-IL按照2％接种在含有2.5μg/mL氯霉素的GM17培养基，30℃下静置培养至OD600＝0.4，加入锌离子至终浓度为0.8mM，继续培养4小时。培养液6000g离心5分钟收集菌体细胞，菌体细胞用PBS缓冲液洗涤并重悬至原体积的1/10。向菌悬液中加入玻璃珠破碎菌体细胞后12000g离心10分钟收集上清液即为重组菌的胞内蛋白。胞内蛋白样品经过12％的SDS-PAGE电泳分离后进行Western Blot，其中一抗使用IL-10单克隆抗体。结果显示(图3)，杂交获得分子量在15kDa至20kDa之间的条带，符合IL-10分子量大小。
实施例8：IL-10在嗜热链球菌中的诱导表达
将质粒pNZST-IL电转化进入嗜热链球菌ST1获得重组菌ST/pNZST-IL，按照2％将重组菌接种于含有终浓度为2.5μg/mL氯霉素的LM17培养基中，42℃静置培养至OD600＝0.4，加入锌离子至终浓度为0.2mM，继续培养4小时诱导IL-10表达后进行检测。
嗜热链球菌的电转化方法：嗜热链球菌ST1按2％转接至LM17中，42℃静置培养至OD600＝0.5，加入等体积SGLM17，42℃静置培养1小时后冰浴30分钟。6000g离心10分钟收集培养液中的菌体细胞，用冰浴的SG Buffer洗涤菌体细胞。6000g离心5分钟收集菌悬液中的菌体细胞，加入1/20体积SG Buffer悬起菌体沉淀获得感受态细胞。将1μg质粒pNZST-IL加入感受态细胞混匀后转移到电转化杯，冰浴10分钟，电击，其中电转化仪参数为2500V/200Ω/20μF。电击结束加入1mL SLM17，混匀后转移至离心管，42℃静置复苏2小时后涂布含有终浓度为2.5μg/mL氯霉素的LM17平板，42℃静置培养48小时。
LM17液体培养基配制方法同实施例5。
LM17固体培养基配制方法同实施例5。
SGLM17配制方法同实施例5。
SG buffer配制方法同实施例5。
SLM17配制方法同实施例5。
IL-10的诱导表达与检测方法：重组菌ST/pNZST-IL按照2％接种在含有2.5μg/mL氯霉素的LM17培养基，42℃静置培养至OD600＝0.4，加入锌离子至终浓度为0.2mM，继续培养4小时。培养液6000g离心5分钟收集菌体细胞，菌体细胞用PBS缓冲液洗涤并重悬至原体积的1/10。向菌悬液中加入玻璃珠破碎菌体细胞后12000g离心10分钟收集上清液即为重组菌的胞内蛋白。胞内蛋白样品经过12％的SDS-PAGE电泳分离后进行Western Blot，其中一抗使用IL-10单克隆抗体。结果显示(图3)，杂交获得分子量在15kDa至20kDa之间的条带，符合IL-10分子量大小。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种食品级诱导表达载体pNZST，其特征在于，所述载体包括启动子Pzst、转录调控元件Rzst；
所述启动子Pzst选自嗜热链球菌ST1、CNRZ1066、LMG 18311、JIM8232、ND03、MN-ZLW-002、ASCC1275或S9；
所述转录调控元件Rzst选自嗜热链球菌ST1、CNRZ1066、LMG 18311、JIM8232、ND03、MN-ZLW-002、ASCC1275或S9。
2.如权利要求1所述的食品级诱导表达载体，其特征在于，所述启动子Pzst的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述转录调控元件Rzst的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的食品级诱导表达载体，其特征在于，所述食品级诱导表达载体还包括抗性基因及质粒复制起始蛋白的核酸；
优选地，所述抗性基因包括氯霉素抗性基因cmr或红霉素抗性基因Ermr。
4.如权利要求1所述的食品级诱导表达载体，其特征在于，所述表达载体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.如权利要求1所述的食品级诱导表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括产物合成基因的核酸序列；
优选地，所述产物合成基因包括GFP、IL-10。
6.一种食品级诱导表达系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1-5任一项所述的食品级诱导表达载体；
所述系统还包括宿主菌株；
所述宿主菌株包括乳酸乳球菌、嗜热链球菌；
优选地，所述乳酸乳球菌包括MG1363；所述嗜热链球菌包括ST1。
7.如权利要求6所述的一种食品级诱导表达系统，其特征在于，所述系统还包括诱导物；
优选地，所述诱导物为锌离子。
8.一种生产白细胞介素IL-10的方法，其特征在于，将基因IL-10扩增后采用酶切连接的方式连接到权利要求1-4任一项所述的诱导表达载体中得到质粒pNZST-IL-10；
将质粒pNZST-IL-10转化到宿主菌株中，获得重组菌株；
将重组菌株培养至OD600＝0.4添加终浓度为0.05mM～1.2mM的锌离子，继续培养4～6小时，即可获得；
所述宿主菌株包括乳酸乳球菌、嗜热链球菌；
优选地，所述乳酸乳球菌包括MG1363；所述嗜热链球菌包括ST1；
优选地，所述锌离子的最终浓度为1mM。
9.权利要求1-5任一项所述的食品级诱导表达载体或权利要求6-7任一项食品级诱导表达系统及其产物在制备食品、食品添加剂、化妆品、生物药及保健品上的应用。
10.一种锌响应的启动子组合物，其特征在于，所述启动子组合物包括启动子和转录调控元件；所述启动子和转录调控元件的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
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