CN116970529A - 一种屎肠球菌wk2及其细菌素基因和应用 - Google Patents

一种屎肠球菌wk2及其细菌素基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116970529A
CN116970529A CN202310976500.8A CN202310976500A CN116970529A CN 116970529 A CN116970529 A CN 116970529A CN 202310976500 A CN202310976500 A CN 202310976500A CN 116970529 A CN116970529 A CN 116970529A
Authority
CN
China
Prior art keywords
egfp
pet28a
enterococcus faecium
enterococcus
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310976500.8A
Other languages
English (en)
Inventor
吴敬
苏少锋
海旭冉
李丽杰
顾悦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inner Mongolia Agricultural University
Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences
Original Assignee
Inner Mongolia Agricultural University
Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inner Mongolia Agricultural University, Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences filed Critical Inner Mongolia Agricultural University
Priority to CN202310976500.8A priority Critical patent/CN116970529A/zh
Publication of CN116970529A publication Critical patent/CN116970529A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3526—Organic compounds containing nitrogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3571—Microorganisms; Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种屎肠球菌WK2及其细菌素基因和应用，属于微生物应用技术领域，所述屎肠球菌WK2的保藏编号为CGMCC No.25370。本发明从屎肠球菌WK2获得的两个细菌素基因entB和entX2，优化后与表达质粒pET28a‑EGFP通过分子生物学成功构建了重组载体，并导入到感受态细胞中获得重组菌株；所述重组菌株能够表达细菌素，对单增李斯特菌具有抑制效果。屎肠球菌WK2对单增李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌均表现出良好的抑菌效果。以屎肠球菌WK2发酵液为原料提取获得的细菌素粗提物在不同温度下对牛奶中的单增李斯特菌均有非常显著的抑制效果。

Description

一种屎肠球菌WK2及其细菌素基因和应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种屎肠球菌WK2及其细菌素基因和应用。
背景技术
乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是将碳水化合物发酵成主要终产物为乳酸的革兰氏阳性细菌的总称，包括乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)和乳杆菌属(Lactpnacillus)等18个属，共200多种。乳酸菌的分布十分广泛，在人、动植物的表面或体内，土壤或者发酵食品中都有存在。乳酸菌的益生特性显著，可调节肠道菌群平衡、提高机体免疫功能、降低胆固醇以及抑制致病菌。乳酸菌被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)公认为安全级食品(generally recognized as safe，GRAS)(Bourdichon F,Laulund S,Tenning P.Inventory of microbial species with a rationale:a comparison of theIDF/EFFCA inventory of microbial food cultures with the EFSA Biohazard Panelqualified presumption of safety[J].FEMS microbiology letters,2019,366(5):fnz048.)，这也使其成为商业开发的理想选择产品。
随着人们健康意识的增强，生物类防腐剂因具有良好的物理稳定性和无毒性而引起广泛关注。自从乳酸链球菌生产的乳酸链球菌素(Nisin)成为第一个商业化应用的细菌素以来，科研人员利用微生物学、分子生物学和合成生物学的研究方法，成功筛选出一系列具有高效抑菌功能的细菌素。多数细菌素能够抑制类似或密切相关的菌株的生长。研究表明，多数细菌素能明显抑制，如单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等革兰氏阳性病原菌的生长，但却很难抑制大肠杆菌(Escherichia coli)等革兰氏阴性病原菌的繁殖，较窄的抑菌谱已经严重影响了细菌素的应用效果(SerbinaNV,ShiC,Pamer EG.Monocyte-Mediated Immune Defense againstMurine Listeria Monocytogenes Infection[J].Advancesin immunology,2012,56(03):113-119.)。
乳酸菌细菌素在乳与乳制品行业中，有着悠久的安全使用历史。由于它们不构成健康风险问题，无论是由细菌素产生菌株排出的细菌素，还是菌株本身都是乳制品中化学防腐剂的一个很好的替代品。可以将纯化或半纯化的细菌素投入食品中进行抑菌，或者添加产生细菌素的乳酸菌菌株中进行应用。但在大多数情况下，细菌素被吸附到食物基质中很容易降解，从而导致抑菌活性丧失。因此，将细菌素参入食品装膜/涂层中，以提高细菌素在复杂食品系统中的活性和稳定性的方式也被逐渐认可(Salgado,P.R.,Ortiz,C.M.,Musso,Y.S.,Di Giorgio,L.,and Mauri,A.N.(2015).Edible fifilms and coatingscontaining bioactives.Curr.Opin.Food Sci.5,86–92.doi:10.1016/j.cofs.2015.09.004)。
因此，研究开发出广谱、高效、特性稳定的新型细菌素，依然可以为天然食品防腐的深度开发提供了更多的渠道和选择。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种屎肠球菌WK2及其细菌素基因和应用。
本发明提供了一种屎肠球菌(enterococcus faecium)WK2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25370。
本发明提供了所述的屎肠球菌WK2在抑制单增李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种的应用。
本发明提供了来源于所述的屎肠球菌WK2的肠球菌素基因，其特征在于，所述肠求菌素基因的序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
本发明提供了所述的肠球菌素基因的优化序列，所述肠球菌素基因的优化序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
本发明提供了一种表达所述肠球菌素基因的重组载体，包括初始载体和所述的肠球菌素基因。
优选的，所述初始载体包括表达质粒pET28a-EGFP。
本发明提供了表达所述肠球菌素基因的重组菌株，所述重组菌株中转化有所述的重组载体。
本发明提供了所述的肠球菌素基因或所述的优化序列编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示。
本发明提供了所述的蛋白质在抑制细菌中的应用。
本发明提供了所述的蛋白质作为食品抑菌剂的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的屎肠球菌WK2对单增李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌四种病原菌均表现出良好的抑菌效果；所述屎肠球菌WK2在哥伦比亚血平皿上无溶血环，表明其具有较好的安全性。
本发明通过对屎肠球菌WK2全基因组分析及细菌素的预测，获得了两个细菌素基因entB和entX2；对细菌素基因entB和entX2进行密码子优化后与表达质粒pET28a-EGFP通过分子生物学成功构建了重组载体，并导入到感受态细胞中获得重组菌株；所述重组菌株能够表达细菌素：肠球菌素B和肠球菌素X2。
纯化后的肠球菌素B和肠球菌素X2，对单增李斯特菌具有一定的抑制效果。以屎肠球菌WK2发酵液为原料提取获得的细菌素粗提物在4℃、18℃、25℃、37℃的情况下对奶中的单增李斯特菌均有非常显著的抑制效果；并且对单增李斯特菌的作用效果不止是抑制生长，还会杀灭单增李斯特菌。
生物保藏说明
本发明提供的一种屎肠球菌enterococcusfaecium WK2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25370，保藏日期为2022年7月22日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为屎肠球菌WK2(左)和金黄色葡萄球菌(右)溶血试验效果图；
图2为菌株WK2抑菌试验效果图；
图3为pUC57-Simple-B216和pUC57-Simple-X2-177菌落PCR筛选；其中M：2000bpDNA Marker；1-5：pUC57-Simple-B216质粒转入DH5α的菌落PCR结果；7-11：pUC57-Simple-X2-177质粒转入DH5α的菌落PCR结果；6、12：阴性对照；
图4为目的基因片段的双酶切；其中，M：2000bp DNAMarker；1：pUC57-Simple-B216质粒的双酶切结果；2：pUC57-Simple-X2-177质粒的双酶切结果；
图5为表达质粒的双酶切；其中M：2000bp DNA Marker；1、3：双酶切后的pET28a-EGFP的质粒；2、4：pET28a-EGFP质粒；
图6为pET28a-EGFP-B质粒酶切鉴定，其中M:1Kb DNAMarker；1:pET28a-EGFP-B质粒经双酶切；2:pET28a-EGFP-B质粒；
图7为pET28a-EGFP-X2质粒酶切鉴定，其中M:1Kb DNA Marker；1:pET28a-EGFP-X2质粒经XbaI+XhoI酶切；2:pET28a-EGFP-X2质粒；
图8为pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21菌落PCR筛选，其中M：2000bpDNAMarker；1-5：pET28a-EGFP-B216质粒转入BL21的菌落PCR结果；7-12：pET28a-EGFP-X2-177质粒转入BL21的菌落PCR结果；6、13阴性对照；
图9为时间对pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21的影响，其中M：5-245KDa Marker；1-3：pET28a-EGFP-B-BL21在OD600 nm值到0.4、0.6、0.8的表达效果，4-6：pET28a-EGFP-X2-BL21在OD600 nm值到0.4、0.6、0.8的表达效果；
图10为诱导温度对pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21的影响，其中M：5-245KDa Marker；1-3：pET28a-EGFP-B-BL21在温度为18℃、25℃、30℃的表达效果；4-6：pET28a-EGFP-X2-BL21在温度为18、25、30℃的表达效果；
图11为IPTG浓度对pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21的影响，其中，M：5-245KDa Marker；1-3：pET28a-EGFP-B-BL21在IPTG的浓度为0.5mM、1mM、1.5mM时的表达效果，4-6：pET28a-EGFP-X2-BL21在IPTG的浓度为0.5mM、1mM、1.5mM时的表达效果；
图12为重组蛋白的存在形式，其中M：5-245KDa Marker；1-4:pET28a-EGFP-B-BL21诱导前上清、诱导后上清、诱导前沉淀、诱导后沉淀；5-8：pET28a-EGFP-X2-BL21诱导前上清、诱导后上清、诱导前沉淀、诱导后沉淀；
图13为纯化后的目的蛋白，M：5-245KDa蛋白Marker；B：His-enterocin B蛋白；X2：His-enterocin X2蛋白；
图14为蛋白标准曲线；
图15为WK2细菌素在4℃牛奶中的抑菌效果图；
图16为WK2细菌素在18℃牛奶中的抑菌效果图；
图17为WK2细菌素在25℃牛奶中的抑菌效果图；
图18为WK2细菌素在37℃牛奶中的抑菌效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
屎肠球菌WK2的特性分析
乳酸菌菌株WK2筛自酸马奶。指示菌有单增李斯特菌CMCC 54002、伤寒沙门菌CMCC50071、大肠埃希菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌CMCC 26003，均购自广东环凯生物科技有限公司。
溶血性的检测
选取纯化菌株，活化两代后用接种环于哥伦比亚血平皿中划线，37℃恒温培养箱培养24h，观察是否有溶血现象。
抑菌能力测定
菌株的抑菌性能采用牛津杯琼脂扩散法进行测定。取复苏后的菌株WK237℃恒温培养24h，以10000r/min离心5min，分离上清液调节pH至6.0，以微孔滤膜(0.45μm)过滤后置于4℃冰箱备用。取单增李斯特菌、沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活化后调节活菌数为1×106CFU/mL，混菌于LB固体培养基中。待平板完全晾干后，在每个平板上放置1个四连式牛津杯，在每个孔中加入200μL的菌株上清液，在37℃培养箱中培养24h，观察是否形成抑菌圈并测量直径大小。
实验结果
溶血性
屎肠球菌WK2的溶血实验结果如图1所示，该菌并未产生溶血环，对照组金黄色葡萄球菌溶血环明显，说明屎肠球菌WK2是安全菌株，具有成为益生菌的潜力。
抑菌能力
对菌株WK2进行抑菌能力的测定，发现该菌株对大肠杆菌、单增李斯特菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌效果，其中对单增李斯特菌与沙门菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别达到21.19mm和18.85mm，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌也有一定作用效果，抑菌圈直径分别为9.04mm和8.36mm(图2)。
表1抑菌实验结果统计表
注：抑菌圈直径为平均值，牛津杯外径8mm。
实施例2
屎肠球菌WK2的细菌素基因的重组表达
试验菌株及质粒
表达质粒：pET28a-EGFP，pUC57-Simple载体，购自HonorGene(奥诺基因)亚克隆感受态细胞：DH5α
表达菌株：BL21(DE3)，购自北京全式金生物技术有限公司。
指示菌：单增李斯特菌CMCC54002。
试验方法
细菌素基因entB和entX2的核苷酸序列以及针对大肠杆菌种属做密码子优化后的B216、X2-177的序列如下：
entB：
ATGCAAAATGTAAAAGAATTAAGTACGAAAGAGATGAAACAAATTATCGGTGGAGAAAATGATCACAGAATGCCTAATGAGTTAAATAGACCTAACAACTTATCTAAAGGTGGAGCAAAATGTGGTGCTGCAATTGCTGGGGGATTATTTGGAATCCCAAAAGGACCACTAGCATGGGCTGCTGGGTTAGCAAATGTATACTCTAAATGCAACTAA(SEQIDNo.1)
entX2：
ATGCAAAATGTAAAAGAAGTTTCTGTAAAAGAGATGAAACAAATTATCGGTGGTTCTAATGATAGTCTTTGGTATGGTGTAGGACAATTTATGGGTAAACAAGCAAACTGTATAACAAACCATCCTGTTAAACACATGATAATTCCTGGATATTGTTTATCGAAAATTTTAGGGTAA(SEQ ID No.2)
B216：
ATGCAGAATGTGAAAGAACTGAGTACCAAAGAAATGAAACAGATTATTGGCGGCGAAAATGATCATCGTATGCCGAATGAACTGAATCGTCCGAATAATCTGAGCAAAGGCGGCGCAAAATGCGGTGCCGCCATTGCCGGCGGCCTGTTTGGTATTCCGAAAGGCCCGCTGGCATGGGCAGCCGGTCTGGCAAATGTTTATAGTAAATGCAATTAA(SEQIDNo.3)
X2-177：
ATGCAGAATGTGAAAGAAGTGAGCGTTAAAGAAATGAAACAGATTATTGGCGGTAGTAATGATAGTCTGTGGTATGGCGTGGGTCAGTTTATGGGCAAACAGGCAAATTGTATTACCAATCATCCGGTGAAACACATGATTATTCCGGGTTATTGCCTGAGTAAAATTCTGGGTTAA(SEQ ID No.4)
蛋白质序列：
MQNVKELSTKEMKQIIGGENDHRMPNELNRPNNLSKGGAKCGAAIAGGLFGIPKGPLAWAAGLANVYSKCN(SEQ ID No.5)
MQNVKEVSVKEMKQIIGGSNDSLWYGVGQFMAKQANCITNHPVKHMIIPGYCLS KILG(SEQ IDNo.6)
将优化后的序列B216、X2-177，插入到pUC57-Simple载体，获得pUC57-Simple-B216质粒和pUC57-Simple-X2-177质粒。
转化实验步骤
1.取100μL的DH5α感受态细胞在冰上融化，加入10μLpUC57-Simple-B216质粒和pUC57-Simple-X2-177质粒，轻柔的旋转摇匀内容物，在冰中放置30min。
2.将管放入预加温至42℃的循环水浴中，放置90s，不摇动管。
3.快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2min。
4.向每个管中加入500μL的液体LB培养基混匀，放置37℃恒温培养箱，50rpm震荡培养1h，将其复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
5.将已经转化的感受态细胞吸取100μL加入到含有AMP、IPTG、X-gal的LB抗性培养基中，用涂布棒抹匀，倒置平板37℃恒温过夜培养。
阳性克隆筛选
将抗性平板取出并放置于4℃冰箱，20min后取出，挑选白色的克隆于1mL的液体LB中，并加入10μL的AMP，挑选完成后的菌液放置于37℃恒温培养箱过夜振荡培养。
将过夜培养的菌液按表2配置PCR体系扩增，PCR条件见表3。PCR产物由1.2％(W/V)琼脂糖凝胶电泳进行检测，如果亚克隆载体连接成功，片段大小为213bp、177bp。
B基因引物序列：
R：ATGCAGAATGTGAAAGAACTGAG(SEQ ID No.7)
F：TTAATTGCATTTACTATAAACATTTGCC(SEQ ID No.8)
X2基因引物序列：
R：ATGCAGAATGTGAAAGAAGTGAG(SEQ ID No.9)
F：TTAACCCAGAATTTTACTCAGGC(SEQ ID No.10)
表2菌液PCR反应体系
表3PCR反应条件
重组质粒的提取
分别活化扩增携带目的基因和pET28a-EGFP的感受态细胞DH5α，对过夜培养的菌液提取质粒，参考天根质粒小提中量试剂盒。
双酶切并纯化
用Nanodrop测定质粒含量，使用限制酶BamHI和XhoI于37℃双酶切4h获得目的基因的片段，跑胶、回收该片段。同时用相同条件双酶切pET28a-EGFP载体，跑胶、回收载体片段。双酶切体系见表4。
表4PCR产物及pET28a-EGFP的双酶切体系
参考TaKaRa MiniBESTAgarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0胶回收试剂盒进行操作。
T4连接
使用T4连接酶将双酶切过的目的基因与空质粒在金属浴中16℃过夜连接，体系如表5所示。
表5目的基因及空质粒的连接体系
双酶切鉴定
用Nanodrop测定DNA含量，使用限制酶XbaI和XhoI按表6体系双酶切对连接的重组质粒进行酶切鉴定。
表6重组质粒的双酶切体系
重组质粒的转化与验证
1.取50μLBL21(DE3)感受态细胞在冰上融化，加入5μL连接体系，轻轻摇匀，冰浴放置30min。
2.冰浴结束后，42℃水浴锅中热激45s，热激完成后迅速将离心管转移到冰盒中冰浴2min
3.向每个离心管中加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，放置37℃恒温培养箱震荡培养1h使细菌复苏。
4.将震荡复苏的感受态细胞加到相应的抗性LB琼脂培养基上，用涂布棒涂匀，待液体被吸收后，37℃恒温培养箱倒置培养过夜。
利用菌落PCR的方式，验证重组子。用枪头挑取平板上的菌落，于1.5mL含卡纳抗性的液体Lb培养基中过夜培养。T7/T7ter作为引物(序列如下)进行菌落PCR，用1.2％(W/V)琼脂糖凝胶电泳进行验证，并将菌种用Kana抗性培养基进行保藏。PCR体系与程序如表7、表8所示。
T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID No.11)
T7ter：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’(SEQ ID No.12)
表7通用引物T7/T7ter PCR反应体系
表8通用引物T7/T7ter PCR反应条件
将目的条带正确的菌液送到华大基因测序，测得完整的目的基因序列信息，以此确认是否构建成功，随后对测序正确的菌液，进行扩繁及保菌。
重组蛋白的表达与优化
按1％的接菌量将pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21在Kana抗性LB培养基中活化三代，第三代于250mL锥形瓶中培养60mL菌液，37℃，200rpm，培养至OD600在0.6到0.8之间，加入100μL的IPTG后降低培养温度至25℃，150rpm振荡过夜诱导表达。随后，6000rpm，15min离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤三次并重悬，加入蛋白上样液后，高温煮沸7min，随后冷却到室温，12000rpm离心10min，取上清做SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，选择10％的分离胶，蛋白上样量为15μL。第一步电压为60V，电泳到浓缩胶与分离胶的交界处时将电压变换到120V，待电泳到达玻璃板底部时停止电泳。
使用考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液进行染色。将2mL的溶液A加入到100mL的溶液B中，混匀，此为工作液。将电泳完成的PAGE胶取下放入装有去离子水的容器中，加热至沸腾后停止，倒掉水溶液。加入30mL工作液，加热至沸腾，保持30s，放置到摇床上摇动10min，回收染色液。向容器中加入50mL的水，加热到沸腾状态保持30s，在摇床上继续摇动10min，换水完成脱色，观察染色情况。
重组蛋白的诱导条件优化
培养时间的优化
按1％的接种量将pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21在Kana抗性LB培养基中活化两代，使第二代的OD600分别在0.4、0.6、0.8时向对应的培养基中加入100μL的IPTG，25℃过夜诱导培养，之后按照4.2.2中的方法做SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳根据目的蛋白的表达量确定优化效果。
培养温度的优化
按1％的接种量将pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21在Kana抗性LB培养基中活化两代，当第二代的OD值达到了最佳值时，加入100μL的IPTG，分别于18℃、25℃、30℃的培养箱中150rpm过夜诱导表达后，做SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳根据目的蛋白的表达量确定优化效果。
IPTG浓度的优化
按1％的接种量将pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21在Kana抗性LB培养基中活化两代，当第二代的OD值达到了最佳值时，分别加入终浓度分别为0.1mmol/L的IPTG、0.5mmol/L的IPTG、1mmol/L的IPTG，于最佳温度下150rpm过夜诱导表达，随后按照4.2.2中的方法做SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳根据目的蛋白的表达量确定优化效果。
重组蛋白存在形式的检测
按1％的接菌量将pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21在Kana抗性LB培养基中活化三代，第三代于250mL锥形瓶中培养60mL菌液，最佳诱导条件诱导表达。随后，6000rpm，15min离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤三次并重悬，于-80℃冰箱中反复冻融3次，加入终浓度为1mmol/L的苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)与DNA酶(deoxyribonuclease,DNase I)放置30min,随后将样品放在冰水混合物中，用细胞破碎仪超声波破碎10min，仪器参数为工作5s，间歇5s，保护温度50℃，功率280W，变幅杆为Φ2。吸取一定量的破碎液，12000rpm,离心5min，分别收集上清与沉淀，沉淀用PBS重悬，分别做SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白的存在形式。
重组蛋白的变性与过滤
将经过最佳诱导条件培养的菌液转移到离心杯中，7000g离心20min，弃掉上清，收集菌体。按照菌体和Lysis buffer体积比为1：10的比例将包涵体悬浮，混匀后在冰浴条件下超声波破碎十分钟。将破碎液转移至离心管中，10000rpm，4℃离心30min，倒掉上清后重复包涵体重悬与超声波破碎的步骤。之后按照菌体与Lysis buffer(含8M尿素)的比例为1：10将包涵体悬浮并用0.45μm滤膜将不溶性物质去除，在变性条件下进行HIS标签纯化。
重组蛋白的柱上纯化与复性
1.将泵中注满去离子水，去掉上塞子，将层析柱与色谱系统连接，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中旋紧。
2.用3～5倍柱体积的去离子水将储存缓冲液冲出。
3.使用至少5倍柱床体积的Lysis buffer平衡色谱柱。
4.利用泵或者注射器上样
5.用Wash Buffer冲洗柱子，直到紫外吸收达到了一个稳定的基线。
6.用Elution Buffer采用线性梯度稀释的方法洗脱，收集蛋白洗脱液。
重组蛋白的除盐与浓缩
按照蛋白洗脱液的体积，截取适当长度的透析袋，去离子水清洗后将收集的蛋白洗脱液装入透析袋，并用透析袋夹进行封闭。4℃环境下PBS透析24h，每隔6h更换一次PBS缓冲液。
使用Millipore 30KDa的超滤管对目的蛋白于4℃，7000rpm离心收集上层液体。浓缩后的蛋白用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的蛋白纯度。浓缩后的蛋白采用0.45μm水系滤膜过滤除菌并于4℃保藏。经过上述处理过的蛋白命名为His-enterocin B和His-enterocin X2。
蛋白浓度的测定
使用BCA蛋白定量试剂盒测定经过优化表达的两种细菌素蛋白浓度。
稀释BSA标准品，用与待测蛋白样品相一致的稀释液按说明书中表格进行稀释。计算BCA工作液需要总量，将BCA-A和BCA-B按照50：1体积比配制。使用微孔测量法将稀释好的A-G BSA标准品与待测蛋白样品各25μL分别加到做好标记的96孔板中，每孔加入200μL的工作液，混匀后37摄氏度孵育30min，冷却至室温后用酶标仪进行检测，562nm范围内测定吸光值。绘制标准曲线，计算蛋白浓度。
实验结果
将携带目的基因的质粒转化到感受态细胞DH5α中大量扩增，可以提高下一步对质粒双酶切的成功性。用菌落PCR验证质粒是否成功导入感受态细胞DH5α，菌落PCR结果见图3：其中，M：2000bp DNAMarker；1-5：pUC57-Simple-B216质粒转入DH5α的菌落PCR结果；7-11：pUC57-Simple-X2-177质粒转入DH5α的菌落PCR结果；6、12：阴性对照；图3显示，目的条带的大小与预期相符，证明质粒成功的导入感受态细胞DH5α。
为了构建重组质粒，需要分别对携带目的基因的质粒和表达载体的质粒进行双酶切，用琼脂糖凝胶电泳验证质粒的酶切效果，并对目的条带进行胶回收。结果如图4所示，其中M：2000bp DNA Marker；1：pUC57-Simple-B216质粒的双酶切结果；2：pUC57-Simple-X2-177质粒的双酶切结果；由图4可以看出，酶切后的条带大小在200bp左右，与预期相符，双酶切成功。
图5中M：2000bp DNAMarker；1、3：双酶切后的pET28a-EGFP的质粒；2、4：pET28a-EGFP质粒；如图5所示，未酶切的pET28a-EGFP质粒远大于2000bp，双酶切后的条带小于未酶切的质粒，与预期标准相符。
用T4连接酶将酶切后B216基因和X2-177基因与酶切后的pET28a-EGFP连接构建pET28a-EGFP-B和pET28a-EGFP-X2重组质粒，并用双酶切验证重组质粒是否正确。酶切鉴定结果如图6所示：其中，M:1Kb DNAMarker；1:pET28a-EGFP-B质粒经双酶切；2:pET28a-EGFP-B质粒，结果显示，pET28a-EGFP-B重组质粒构建成功。
图7为pET28a-EGFP-X2质粒酶切鉴定：其中M:1Kb DNA Marker；1:pET28a-EGFP-X2质粒经XbaI+XhoI酶切；2:pET28a-EGFP-X2质粒，结果显示，pET28a-EGFP-x2重组质粒构建成功。
菌株pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21的构建
将重组质粒转化到感受态细胞BL21(DE3)后，成功的菌株分别命名为pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21，两者的菌落PCR结果见图8：其中，M：2000bpDNAMarker；1-5：pET28a-EGFP-B216质粒转入BL21的菌落PCR结果；7-12：pET28a-EGFP-X2-177质粒转入BL21的菌落PCR结果；6、13阴性对照。测序结果经过序列比对，表明两个重组质粒成功转化到感受态细胞BL21(DE3)中。
诱导条件的优化
诱导时间的确定
大肠杆菌表达系统通常用OD600来确定菌体的生长情况，因为时间对于重组蛋白诱导表达的影响主要来源于菌体的生长情况，所以以菌体的OD值作为诱导时间的参考标准。一般取对数期的菌株进行诱导表达，本实验选取菌株培养到OD600＝0.4、OD600＝0.6、OD600＝0.8的时期进行诱导表达，结果表明菌株pET28a-EGFP-B-BL21的最佳诱导时间为OD600培养至0.6，菌株pET28a-EGFP-X2-BL21培养至OD600为0.8。图9时间对pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21的影响：其中M：5-245KDa Marker；1-3：pET28a-EGFP-B-BL21在OD600到0.4、0.6、0.8的表达效果，4-6：pET28a-EGFP-X2-BL21在OD600到0.4、0.6、0.8的表达效果。
诱导温度的确定
温度会直接影响细菌生长的速度，如果温度过高过低都会对目的蛋白的表达产生抑制。因此将菌株pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21分别放到18℃、25℃、30℃进行诱导表达，结果发现两个菌株在三个温度中均能成功表达，且均在30℃下重组蛋白的诱导表达效果最好，因此选择30℃作为最佳的诱导温度，图10诱导温度对pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21的影响：其中M：5-245KDa Marker；1-3：pET28a-EGFP-B-BL21在温度为18℃、25℃、30℃的表达效果；4-6：pET28a-EGFP-X2-BL21在温度为18℃、25℃、30℃的表达效果。
IPTG的浓度确定
IPTG的添加量过少会导致阻遏蛋白的结合饱和度不够，从而影响表达。但是如果IPTG的添加量过高，会促使包涵体蛋白的生长。所以通常采用低量诱导剂表达。本实验采用的IPTG浓度分别为0.5mM、1mM、1.5mM进行，结果表明菌株pET28a-EGFP-B-BL21和菌株pET28a-EGFP-X2-BL21的最佳IPTG浓度均为1mM。图11为IPTG浓度对pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21的影响：其中，M：5-245KDa Marker；1-3：pET28a-EGFP-B-BL21在IPTG的浓度为0.5mM、1mM、1.5mM时的表达效果，4-6：pET28a-EGFP-X2-BL21在IPTG的浓度为0.5mM、1mM、1.5mM时的表达效果。
综上，pET28a-EGFP-B-BL21的最佳诱导条件为在OD600达到0.6时，加入浓度为1mM的IPTG，30℃低温诱导过夜。pET28a-EGFP-X2-BL21的最佳诱导条件为在OD600达到0.8时，加入浓度为1mM的IPTG，30℃低温诱导过夜。
重组蛋白形式的检测
对pET28a-EGFP-B-BL21和pET28a-EGFP-X2-BL21工程菌进行诱导表达，对诱导后的上清和沉淀做SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果如图12所示(其中M：5-245KDaMarker；1-4:pET28a-EGFP-B-BL21诱导前上清、诱导后上清、诱导前沉淀、诱导后沉淀；5-8：pET28a-EGFP-X2-BL21诱导前上清、诱导后上清、诱导前沉淀、诱导后沉淀)，经过最佳条件诱导并超声波破碎处理后，在上清中，观察到了一定的可溶解性目的蛋白，但是纯度太低。而菌体的沉淀物中出现大量目的蛋白，说明重组蛋白主要是以不可溶的包涵体形式存在。
重组蛋白的纯化与验证
重组蛋白的纯化
利用原核表达系统表达B、X2蛋白，根据His标签性质纯化目的蛋白，获取一定纯度和浓度目的蛋白。因为Ni-NTA6FF更容易的获得比Ni-IDA纯度更高的蛋白，所以采用Ni-NTA6FF进行填料纯化目的蛋白。纯化后的目的蛋白命名为His-enterocin B和His-enterocinX2，用SDS-PAGE电泳进行检测，如图13所示，：其中M：5-245KDa蛋白Marker；1：His-enterocin B蛋白；2：His-enterocin X2蛋白；结果表明His-enterocin B和His-enterocinX2均为单一条带，说明纯化的效果良好，可用于后续实验。
His-enterocinB和His-enterocinX2蛋白的定量
在低温条件下用超滤管对纯化后的蛋白进行浓缩，浓缩后用BCAProteinAssayKit进行蛋白定量。BSA的蛋白标准曲线如图14所示，蛋白线性较好R2＝0.9967，将目的蛋白的OD值代入曲线，得His-enterocinB蛋白得浓度为9.71mg/mL，His-enterocin X2得浓度为8.43mg/mL。
实施例3
硫酸铵沉淀粗提细菌素在牛乳中的应用
三代活化屎肠球菌WK2，将培养液4℃、12000r/min离心并收集上清，用0.45μm口径的滤菌器过滤除菌。向上清中缓慢加入提前配置好的饱和硫酸铵溶液，使上清与硫酸铵溶液的体积比例为1:4。磁力搅拌8h后将混有饱和硫酸铵的溶液离心并保留沉淀。用1×PBS将沉淀重悬，置于3500Da的透析袋中透析48h，每6h换一次液，最后收集得到的溶液，即为硫酸铵沉淀得到的粗提物。
细菌素的粗提物对牛奶的保鲜作用
牛奶中菌落数的测定
将牛乳121℃、15min高温灭菌，接入单增李斯特菌并使终浓度达到1×103CFU/mL。实验组加入粗提的屎肠球菌WK2细菌素，并使终浓度达到32μg/mL。对照组添加等量的无菌水。分别放置在温度为4、18、25、37℃的环境下进行培养。从第0天开始，每隔一天，用生理盐水将牛奶稀释到合适的梯度后，进行菌落计数。
数据处理与分析
每组试验重复三次，结果用平均值±标准差表示。
结果与分析
屎肠球菌WK2细菌素对牛奶的抑菌结果
如图15所示，对照组单增李斯特菌在低温环境中的生长受到了一定的抑制，但是总体呈现缓慢上升趋势，从第6d开始，生长速度明显加快，到第9d时平均lg值达到了4.64，并且上涨趋势依然明显。实验组显示，1d就以产生明显的抑菌效果，2d已经将单增李斯特菌彻底杀灭，平均lg值为0，之后牛奶里再无单增李斯特菌生长。
如图16所示，18℃空白组牛奶中的李斯特在0～24h之间生长速度较为缓慢，从第24h开始，24h～48h之间，单增李斯特菌在牛奶中快速生长，平均lg值从3.45上涨到了6.48，之后牛奶中的李斯特菌处于相对平稳的状态。实验组中，单增李斯特菌在第12h就已经受到了明显的抑制，第24h，实验组的lg值为0，单增李斯特菌抑制效果十分显著。
如图17所示，对照组的李斯特菌0～10h生长较为缓慢，10～20h生长速度有所增加，20-25h李斯特菌增长速度十分迅速，平均lg值从4.9直接到达了7.45，从30h开始，李斯特菌生长速度趋于平缓。实验组中，李斯特菌明显受到了细菌素的抑制，第10h单增李斯特菌的平均lg值已经下降到0.48，第15h单增李斯特菌已经被完全杀灭。
如图18所示，对照组李斯特菌0～5h生长较为缓慢，5h-15h李斯特菌的生长十分迅速，20h过后李斯特菌的生长速度逐渐趋于平缓。实验组中，细菌素对单增李斯特菌的抑制效果明显，第5h的平均lg值为2.34，第15h李斯特菌已经被完全抑制。
可见，屎肠球菌WK2的细菌素在4℃、18℃、25℃、37℃的情况下对牛奶中的单增李斯特菌均有显著的抑制效果，该细菌素对单增李斯特菌的作用效果不只是抑制生长，还会杀灭单增李斯特菌。
由上述实施例可知，本发明提供的屎肠球菌WK2具有较好的安全性，对单增李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌四种病原菌均表现出良好的抑菌效果。本发明获得的两个细菌素基因entB和entX2，优化后与表达质粒pET28a-EGFP通过分子生物学成功构建了重组载体，并导入到感受态细胞中获得重组菌株；所述重组菌株能够表达细菌素；以屎肠球菌WK2发酵液为原料提取获得的细菌素粗提物在4℃、18℃、25℃、37℃的情况下对奶中的单增李斯特菌均有非常显著的抑制效果；并且对单增李斯特菌的作用效果不止是抑制生长，还会杀灭单增李斯特菌。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种屎肠球菌(enterococcusfaecium)WK2，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25370。
2.权利要求1所述的屎肠球菌WK2在抑制单增李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌中的一种或几种的应用。
3.来源于权利要求1所述的屎肠球菌WK2的肠球菌素基因，其特征在于，所述肠求菌素基因的序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
4.权利要求3所述的肠球菌素基因的优化序列，其特征在于，所述肠球菌素基因的优化序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
5.一种表达权利要求3或4所述肠球菌素基因的重组载体，其特征在于，包括初始载体和权利要求3或4中所述的肠球菌素基因。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述初始载体包括表达质粒pET28a-EGFP。
7.表达权利要求3或4所述肠球菌素基因的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株中转化有权利要求5或6所述的重组载体。
8.权利要求3所述的肠球菌素基因或权利要求4所述的优化序列编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.5或SEQ IDNo.6所示。
9.权利要求8所述的蛋白质在抑制细菌中的应用。
10.权利要求1所述的屎肠球菌WK2或权利要求8所述的蛋白质作为食品抑菌剂的应用。
CN202310976500.8A 2023-08-03 2023-08-03 一种屎肠球菌wk2及其细菌素基因和应用 Pending CN116970529A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310976500.8A CN116970529A (zh) 2023-08-03 2023-08-03 一种屎肠球菌wk2及其细菌素基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310976500.8A CN116970529A (zh) 2023-08-03 2023-08-03 一种屎肠球菌wk2及其细菌素基因和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116970529A true CN116970529A (zh) 2023-10-31

Family

ID=88471225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310976500.8A Pending CN116970529A (zh) 2023-08-03 2023-08-03 一种屎肠球菌wk2及其细菌素基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116970529A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102056489B (zh) 新型发酵乳及其应用
Mc Grath et al. Bacteriophages in dairy products: pros and cons
CN114480438B (zh) 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用
CN108048373B (zh) 一株枯草芽孢杆菌ah1005及其应用
CN105176874A (zh) 凝结芽孢杆菌fm603及其应用
US8741622B2 (en) Stress tolerant Bifidobacteria
CN110484467B (zh) 一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗菌肽和应用
CN105238809A (zh) 抗菌肽cc31在枯草芽孢杆菌中的表达方法
CN114015698B (zh) 一种表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用
CN104962566A (zh) 一种重组细菌素及其制备方法和应用
CN105255935A (zh) 抗菌肽cc34在枯草芽孢杆菌中的表达方法
CN108342340B (zh) 一种产细菌素的凝结芽孢杆菌及其制备方法和应用
CN117946953A (zh) 重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及应用
CN107828703B (zh) 空间罗伊氏乳杆菌Fullarton-9-35及应用
CN112111438A (zh) 一种印第安纳沙门氏菌菌蜕的制备方法
EP0474464A2 (en) Bacteriophage resistant recombinant bacteria
CN105104712B (zh) 一种微生物饲料添加剂及其制备方法
CN110257314B (zh) 一种产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用
CN107475222A (zh) 基因工程改造的耐热人溶菌酶
KR102683982B1 (ko) 장류용 종균 바실러스 벨레젠시스 및 그의 용도
CN116970529A (zh) 一种屎肠球菌wk2及其细菌素基因和应用
CN114752519B (zh) 一种利用发酵热带芽孢杆菌改善海水鱼发酵品质的方法
Mirhadi Zadi et al. Molecular isolation, probiotic property, and bacteriocin production of Enterococcus faecium (TM81) and Lactobacillus curvatus (TM51) with anti-listerial activity in native dairy products of Iran
CN114703117A (zh) 一种重组枯草芽孢杆菌、其构建方法及一种重组胶原酶
CN110760467B (zh) 一株发酵乳杆菌及其在功能性黄酒中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination