JP6058067B2 - サイトカイン産生調節遺伝子及びその利用 - Google Patents

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Description

本発明は、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのサイトカインの産生調節に関与する遺伝子、及びその利用法に関する。
ＴＮＦ、インターロイキン類、インターフェロン類等のサイトカインは、免疫系、血液系、あるいは炎症反応等の生体防御システムにおいて重要な役割を演じている細胞情報伝達物質である。
免疫反応は、サイトカインの産生を刺激する物質が、宿主免疫細胞、特にマクロファージ、樹状細胞等に発現が見られるトルライクレセプター（ＴＬＲ）等のパターンリコグニションレセプター（ＰＲＲ）に認識されて開始され、マクロファージ、樹状細胞、リンパ球等の免疫担当細胞間の直接的あるいは間接的な相互作用により調節されている。
通常、生体は、細菌やウイルス等の感染、腫瘍、細胞障害等に対して、免疫応答を活性化することによって対応している。また、過剰な免疫応答が惹起されると、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー等のアレルギー性疾患や全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患が起こることも明らかにされている。従って、生体内でのサイトカインの産生をより好ましい状態に調節することが重要である。
近年、微生物や微生物由来成分を、サイトカイン産生調節物質、いわゆるBRM（生体応答修飾物質）として活用する試みがなされ、これまでに、グラム陽性菌由来の多糖−グリカン複合体のサイトカイン産生促進作用（特許文献１）、ラクトバチルス属細菌又はその菌体由来多糖画分のインターロイキン（IL）−6産生抑制作用（特許文献２）、乳酸菌菌体のIL−15産生促進作用（特許文献３）、ラクトバチルス・カゼイ等の菌体のIL−12産生促進作用（特許文献４）、ラクトバチルス属細菌由来の多糖−ペプチドグリカン複合体のマクロファージ活性化作用（特許文献５）、ラクトバチルス属細菌由来の多糖−ペプチドグリカン複合体の腫瘍細胞障害性因子誘起作用（特許文献６）等が報告されている。
このうち、ラクトバチルス・カゼイYIT 9018（FERM BP−665）やラクトバチルス・カゼイYIT 9029（FERM BP−1366）のサイトカイン産生調節作用については、その活性本体は、細胞壁成分である多糖−ペプチドグリカン複合体（PS−PG）であることが明らかにされている（特許文献２）。しかしながら、遺伝子レベルでの解明はなされていない。
一方、微生物のサイトカイン産生調節能を遺伝子レベルで改変する試みとして、リステリア溶血素であるリステリオリジンO遺伝子をラクトバチルス・カゼイATCC 393に導入すること（特許文献７）が報告されているが、安全性や有効性の面で問題があり、実用化には至っていない。さらに、乳酸菌が菌体外に産生するエキソポリサッカライドの生合成に関与する遺伝子についても報告されているが（特許文献８）、このエキソポリサッカライドは食品の増粘やクリーム化の目的のために使用することを目的としており、上記のPS−PGに含まれる多糖とは構造が異なるものである。
特開平８−９２１１２号公報 特開２００３−７３２８６号公報 特開２００２−２４１２９２号公報 特開平１０−１３９６７４号公報 特公平６−９９３１４号公報 特開昭６３−１９６５２１号公報 特開２００３−６３９９１号公報 特開平９−２６９号公報
本発明は、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのサイトカインの産生調節に関与する遺伝子及びその利用法を提供することに関する。
本発明者らは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029のゲノム情報を検討した結果、多糖−ペプチドグリカン複合体（PS−PG）の多糖成分の合成に関与する遺伝子群の中に、種々のサイトカインの産生調節に関与する遺伝子があり、該遺伝子を利用することにより、微生物における種々のサイトカインの産生を調節できることを見出した。
すなわち、本発明は以下の発明に係るものである。
１）以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６及び１０８に示すいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つサイトカイン産生調節能を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つサイトカイン産生調節能を有するタンパク質
２）以下の（ｄ）〜（ｆ）から選ばれるポリヌクレオチドからなる遺伝子
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７に示すいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つサイトカイン産生調節能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）（ｄ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つサイトカイン産生調節能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
３）上記遺伝子を微生物に導入するか又は微生物が有する当該遺伝子を改変することを特徴とする微生物のサイトカイン産生調節方法
４）上記遺伝子が導入又は改変されてなる微生物
５）上記微生物を含有する飲食品
６）上記微生物を含有する医薬品
７）上記遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することを特徴とするサイトカイン産生調節能を有する微生物のスクリーニング方法
８）上記ポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター
９）上記組換えベクターを含む宿主微生物
１０）上記ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする核酸断片
１１）上記ポリヌクレオチド又はその一部を含むDNAアレイ又はDNAチップ
本発明の遺伝子又はポリヌクレオチド若しくはその断片を利用することにより、微生物によるマクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのサイトカイン産生調節能を自在に変化させたり、所望のサイトカイン産生調節能を有する微生物をスクリーニングすることができる。
また、本発明の遺伝子が導入又は改変された微生物を用いることにより、所望のサイトカイン産生調節能を有する飲食品、医薬品の製造が可能となる。
pYSSE3、pYAP300の図である。 BALB/cマウス脾臓細胞におけるラクトバチルス・カゼイYIT 9029遺伝子破壊株のTNF-α誘導能を示す図である（菌体添加量は３μg／mL）。 BALB/cマウス脾臓細胞におけるラクトバチルス・カゼイYIT 9029遺伝子破壊株のIL-12p70誘導能を示す図である（菌体添加量は３μg／mL）。 BALB/cマウス脾臓細胞におけるラクトバチルス・カゼイYIT 9029遺伝子破壊株のIL-10誘導能を示す図である（菌体添加量は30μg／mL）。 BALB/cマウス脾臓細胞におけるラクトバチルス・カゼイYIT 9029遺伝子破壊株のIL-６誘導能を示す図である（菌体添加量は３μg／mL）。 マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-α誘導能を示す図である（菌体添加量は25μg／mL）。 マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるIL-10誘導能を示す図である（菌体添加量は25μg／mL）。 LPSで刺激したマウスマクロファージRAW264.7細胞におけるIL-6産生誘導抑制活性を示す図である（菌体添加量は５μg／mL）。 マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-α誘導能を示す図である（菌体添加量は１μg／mL）。 マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるIL-10誘導能を示す図である（菌体添加量は１μg／mL）。 マウスマクロファージJ774.1細胞におけるIL-12p40誘導能を示す図である（菌体添加量は１μg／mL）。 マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-αとIL-10誘導能、及びJ774.1細胞におけるIL-12p40誘導能を示す図である（菌体添加量は25μg／mL）。 ラクトバチルス・カゼイの各菌株におけるcps1D遺伝子の検出を示す図である。各レーンの菌株名は、1, YIT 9029;2, YIT 0180;3, YIT 0005;4, YIT 0006;5, YIT 0009;6, YIT 0123;7, YIT 0128;8, YIT 0003;9, YIT 0007;10, YIT 0010;11, YIT 0015;12, YIT 0038;13, YIT 0047;14, YIT 0171;15, YIT 0209;16, YIT 0226;17, YIT 0262;18, YIT 0289;19, YIT 0290;20, YIT 0295;21, YIT 0322;22, YIT 0393;23, YIT 10029である。
本明細書において、アミノ酸配列および塩基配列の相同性（同一性）は、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX（ゼネティックス社製）を用いたLipman-Person法(Lipman, D. J. and Pearson,W. R. 1985. Rapid and sensitive protein similarity searches. Science227:1435-1441)によるホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いることが出来る。具体的には、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029のPS−PG合成に関与する遺伝子を既知の多糖合成遺伝子と相同性比較して解析することにより算出したものであり、パラメーターとしては、Unit Size to compare＝2, Pick up Location＝5とし、結果を％表示させて行う。
また、遺伝子とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。また、ポリヌクレオチドとしては、ＲＮＡ、ＤＮＡを例示でき、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを包含する。
本発明の遺伝子は、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029から見出され、cps1A、cps1B、cps1C、cps1D、cps1E、cps1F、cps1G、cps1J、cps２A、cps2C、cps2D、cps2E、cps2F、cps2G、cps2H、cps3A、cps3B及びcps3Cと命名された遺伝子、及び遺伝子番号LCS0838、LCS1111、LCS1128及びLCS1890の遺伝子、並びに当該遺伝子から演繹される遺伝子であり、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのサイトカイン産生を促進又は抑制する機能を有するタンパク質をコードするものである。これら遺伝子と既存のデータベース上に登録されている遺伝子とのホモロジー検索を行った結果、９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドは見出されず、これらはいずれも新規な遺伝子である。
本発明の遺伝子は、具体的には、以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６及び１０８に示すいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つサイトカイン産生調節能を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つサイトカイン産生調節能を有するタンパク質
ここで、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６及び１０８に示すいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
アミノ酸の欠失、置換、付加は、例えば、配列番号２等に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が１塩基置換等の天然に生じる変異や、部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって遺伝子に人為的に導入される変異等により生じ得るものが包含される。斯かるアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号２等で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このポリヌクレオチドを常法により発現させる手法が挙げられる。
また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換を挙げることができる。
また、（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６及び１０８に示すそれぞれのアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、当該アミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。
「サイトカイン産生調節能」とは、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からの個々のサイトカインの産生を促進又は抑制することを意味し、一つの遺伝子が異なるサイトカインの産生の促進又は抑制作用を有する場合も包含される。
ここで、サイトカインとしては、特に限定されるものではなく、IFN-α、IFN‐β、IFN-γ等のインターフェロン類や、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29等のインターロイキン類や、TNF-α、TNF-β等の腫瘍壊死因子類や、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CL1、CL2、CX3CL、MCP、MIP、RANTES、Eotaxin等のケモカインや、GM-CSF、G-CSF、M-CSF等のコロニー刺激因子類や、EGF、PDGF、FGF、NGF、VEGF、TGF、KGF、IGF、SCF、BDNF、CNTF、OSM、IIGF等の増殖因子類や、トロンボポエチン（TPO）、ステムセルファクター（SCF）、白血病阻害因子（LIF）、プロラクチンホルモン、BMP、アクチビン、レプチン、アディポネクチン、プロスタグランジン（PG）類、一酸化窒素（NO）等を例示することができる。
また、免疫担当細胞とは、免疫応答に関与する細胞を意味し、特に制限はないが、例えばマクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、単球、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーT細胞等の細胞が挙げられる。
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６及び１０８に示すいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質と既知のタンパク質との相同性（同一性）を以下に示す。尚、同一性検索は、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYXを使用し、該塩基配列によって規定されるタンパク質のアミノ酸配列と、公開されている主に乳酸菌のゲノムやDNA断片の塩基配列により規定されるタンパク質のアミノ酸配列との比較を行なうことにより、同一性を有する遺伝子を検索した。同一性の指標としては、該アミノ酸配列全体あるいは一部でもより長い領域での同一性が２０％以上を目安に行なった。
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps1A）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・デルブルッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスLfi5株由来の菌体外多糖合成に関与するepsB遺伝子にコードされるタンパク質と３７．５％の同一性、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスHO2株由来の菌体外多糖合成に関与するepsA遺伝子にコードされるタンパク質と３０．９％の同一性を持ち、また、ラクトバチルス・ラムノーサスRW−9595M由来の菌体外多糖合成に関与するwzd遺伝子にコードされるタンパク質とは７０．２％の、ラクトバチルス・ガッセリATCC 33323のドラフト配列（JGI）から予想されるタンパク質とは４０．６％の同一性を有する。
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps1B）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・デルブルッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスLfi5株由来の菌体外多糖合成に関与するepsC遺伝子にコードされるタンパク質と４６．４％の同一性、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスHO2株由来の菌体外多糖合成に関与するepsB遺伝子にコードされるタンパク質と４１．７％の同一性を持ち、また、ラクトバチルス・ラムノーサスRW−9595M由来の菌体外多糖合成に関与するwze遺伝子にコードされるタンパク質とは８５．８％の同一性、ラクトバチルス・アシドフィルスNCFM由来の菌体外多糖合成に関与するepsC遺伝子にコードされるタンパク質とは４０．６％の同一性を有する。
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps1C）は、そのアミノ酸配列において、ストレプトコッカス・サーモフィラスCNRZ1066由来の多糖合成に関与するrgpA遺伝子にコードされるタンパク質と４６．３％の同一性、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスIL1403由来の多糖合成に関与するrgpA遺伝子にコードされるタンパク質と４３．４％の同一性を有する。
配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps1D）は、そのアミノ酸配列において、ストレプトコッカス・サリバリウスNCFB2393由来の多糖合成に関与するcpsG遺伝子にコードされるタンパク質と４３．５％の同一性を有する。
配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps1E）は、そのアミノ酸配列において、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスHO2株由来の菌体外多糖合成に関与するepsN遺伝子にコードされるタンパク質と２４．８％の同一性、ストレプトコッカス・サリバリウスNCFB2393由来の多糖合成に関与するcpsI遺伝子にコードされるタンパク質と２２．０％の同一性、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスIL1403由来の多糖合成に関与するycbH遺伝子にコードされるタンパク質と２３．０％の同一性を有する。
配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps1F）は、そのアミノ酸配列において、２０％以上の同一性を示すタンパク質は見出されなかった。
配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps1G）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・プランタルムWCFS1由来のthgA2遺伝子にコードされるタンパク質と３０．６％の同一性を有し、また、部分的にはストレプトコッカス・サーモフィラスCNRZ1066由来の菌体外多糖合成に関与するepsH遺伝子にコードされるタンパク質と84アミノ酸残基中３９．３％の同一性、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスIL1403由来のアセチル基転移に関与するyncA遺伝子にコードされるタンパク質と116アミノ酸残基中３４．５％の同一性を有する。
配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps1J）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・デルブルッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスLfi5由来の菌体外多糖合成に関与するepsE遺伝子にコードされるタンパク質と５８．３％の同一性、ラクトバチルス・ジョンソニNCC533由来の菌体外多糖合成に関与するepsE遺伝子にコードされるタンパク質と４４．１％の同一性、ラクトバチルス・ラムノーサスRW-9595M由来の菌体外多糖合成に関与するwelE遺伝子にコードされるタンパク質と７９．３％の同一性、ラクトバチルス・アシドフィルスNCFM由来の菌体外多糖合成に関与するepsE遺伝子にコードされるタンパク質と６５．７％の、ストレプトコッカス・サーモフィラスFI9186由来の菌体外多糖合成に関与するepsE遺伝子にコードされるタンパク質と４７．５％の同一性を有する。また、該アミノ酸配列の約３７％に相当する箇所は、部分配列のみが知られているラクトバチルス・パラカゼイType-V由来の多糖合成に関与する遺伝子の一部（遺伝子番号11596438）から得られるアミノ酸配列と９６．７％の同一性を有するが、その他の箇所については明らかではない。
配列番号８２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps2A）は、そのアミノ酸配列において、他の微生物等の遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列との同一性はなかった。
配列番号８４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps2C）は、そのアミノ酸配列において、エンテロコッカス・フェカリスV583株の遺伝子番号EF2195の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と３８．３％の同一性を持ち、また、ストレプトコッカス・ミュータンスUA159株の菌体外多糖合成に関与するrgpB遺伝子にコードされるタンパク質と３４．７％の同一性を有する。
配列番号８６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps2D）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・プランタルムWCFS1株の遺伝子番号lp_1763の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と４２．４％の同一性を持ち、また、エンテロコッカス・フェカリスV583株の遺伝子番号EF2181の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質のアミノ末端側100アミノ酸残基において３８．３％の同一性を有する。
配列番号８８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps2E）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・アシドフィルスNCFM株の遺伝子番号LBA0526の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と３５．９％の同一性を持ち、また、ラクトバチルス・デルブルッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスATCC11842株の遺伝子番号Ldb0454の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と３５％の同一性を有する。
配列番号９０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps2F）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・プランタルムWCFS1株の遺伝子番号lp_3093の遺伝子にコードされるムラミダーゼとされるタンパク質と208アミノ酸残基の部分で５１．０％の同一性を持ち、また、エンテロコッカス・フェカリスV583株の遺伝子番号EF2174の遺伝子にコードされるタンパク質と326アミノ酸残基の部分で３０．７％の同一性を有する。
配列番号９２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps2G）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・プランタルムWCFS1株の遺伝子番号lp_1231の遺伝子にコードされる繰り返しユニット移送酵素（リピートユニットトランスポーター）とされるタンパク質と４５．９％の同一性を持ち、また、ラクトバチルス・アシドフィルスNCFM株の遺伝子番号LBA1724の遺伝子にコードされる繰り返しユニット移送酵素とされるタンパク質と４２．６％の同一性を有する。
配列番号９４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps2H）は、そのアミノ酸配列において、他の微生物等の遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列との同一性はなかった。
配列番号９６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps3A）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・プランタルムWCFS1株の遺伝子番号lp_1275の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と６６．４％の同一性を持ち、また、ラクトバチルス・デルブルッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスATCC11842株の遺伝子番号Ldb1838の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と５５．７％の同一性を有する。
配列番号９８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps3B）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・プランタルムWCFS1株の遺伝子番号lp_1276の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と５９．７％の同一性を持ち、また、ラクトバチルス・デルブルッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスATCC11842株の遺伝子番号Ldb1837の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と５４．１％の同一性を有する。
配列番号１００に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Cps3C）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・プランタルムWCFS1株の遺伝子番号lp_1277の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と４９．７％の同一性を持ち、また、ラクトバチルス・デルブルッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスATCC11842株の遺伝子番号Ldb1836の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と３９．５％の同一性を有する。
配列番号１０２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（LCS0838P）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・デルブルッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスATCC11842株の遺伝子番号Ldb1569の遺伝子にコードされる多糖輸送タンパク質（ポリサッカライドトランスポートタンパク質）とされるタンパク質と４９．９％の同一性を持ち、また、ラクトバチルス・アシドフィルスNCFM株の遺伝子番号LBA1616の遺伝子にコードされる多糖輸送タンパク質とされるタンパク質と４８．９％の同一性を有する。
配列番号１０４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（LCS1111P）は、そのアミノ酸配列において、エンテロコッカス・フェカリスV583株の遺伝子番号EF2176の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と220アミノ酸残基の部分で３０．４％の同一性を持ち、また、ラクトバチルス・デルブルッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスATCC11842株の遺伝子番号Ldb0178の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と224アミノ酸残基の部分で２９．９％の同一性を有する。
配列番号１０６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（LCS1128P）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・アシドフィルスNCFMの遺伝子番号LBA1283の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と５３．２％の同一性を持ち、また、ラクトコッカス・ラクティスIL1403株のybaI遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と５３．１％の同一性を有する。
配列番号１０８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（LCS1890P）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・ジョンソニイNCC533株の菌体外多糖合成に関与するepsG遺伝子にコードされるタンパク質と295アミノ酸残基の部分で１８．３％の同一性を持ち、また、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスHO2株の菌体外多糖合成に関与するepsT遺伝子にコードされるタンパク質と344アミノ酸残基の部分で１８．３％の同一性を有する。
本発明の遺伝子は、好適には、以下の（ｄ）〜（ｆ）から選ばれるポリヌクレオチドからなる遺伝子が挙げられる。
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７に示すいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つサイトカイン産生調節能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）（ｄ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つサイトカイン産生調節能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps1A遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α、IL-6、IL-10及びIL-12の産生において、抑制作用を有する。
配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps1B遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α、IL-6、IL-10及びIL-12の産生において、抑制作用を有する。
配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps1C遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α、IL-6、IL-10及びIL-12の産生において、抑制作用を有する。
配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps1D遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α、IL-6、IL-10及びIL-12の産生において、抑制作用を有する。
配列番号９に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps1E遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α、IL-6、IL-12の産生において抑制作用を有する。
配列番号１１に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps1F遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α、IL-6、及びIL-12の産生において、抑制作用を有する。
配列番号１３に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps1G遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α、IL-6、及びIL-12の産生において、抑制作用を有する。
配列番号１５に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps1J遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α、IL-6、IL-10及びIL-12の産生において、抑制作用を有する。
配列番号８１に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps2A遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α産生を変化させず、IL-10産生を抑制する作用を有する。
配列番号８３に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps2C遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α産生を亢進させ、IL-10産生を抑制する作用を有する。
配列番号８５に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps2D遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α及びIL-10産生を抑制する作用を有する。
配列番号８７に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps2E遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α産生を亢進させ、IL-10産生を抑制する作用を有する。
配列番号８９に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps2F遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α産生を亢進させ、IL-10産生を抑制する作用を有する。
配列番号９１に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps2G遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α及びIL-10産生を抑制する作用を有する。
配列番号９３に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps2H遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α及びIL-10産生を抑制する作用を有する。
配列番号９５に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps3A遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α及びIL-10産生を抑制する作用を有する。
配列番号９７に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps3B遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α及びIL-10産生を抑制する作用を有する。
配列番号９９に示す塩基配列からなるＤＮＡ（cps3C遺伝子と命名）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α及びIL-10産生を抑制する作用を有する。
配列番号１０１に示す塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子番号LCS0838の遺伝子）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α及びIL-10産生を抑制する作用を有する。
配列番号１０３に示す塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子番号LCS1111の遺伝子）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α産生を変化させず、IL-10産生を抑制する作用を有する。
配列番号１０５に示す塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子番号LCS1128の遺伝子）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α産生を変化させず、IL-10産生を抑制する作用を有する。
配列番号１０７に示す塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子番号LCS1890の遺伝子）は、それがラクトバチルス・カゼイYIT 9029に存在する場合にあっては、マクロファージ及び／又は免疫担当細胞からのTNF-α及びIL-10産生を抑制する作用を有する。
本発明において、「ストリンジエントな条件下」とは、例えばMolecular cloning − a Laboratory manual 2nd edition(Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成：０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液に当該塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
また、（ｄ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列としては、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７に示すそれぞれの塩基配列において相当する配列を適切にアライメントした時、当該塩基配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を意味する。
本発明の遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７の配列を参考にプライマーを作製し、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029のDNAをテンプレートとする常法のPCR法で容易に得ることができる。
すなわち、例えば、いずれかの遺伝子のN末端開始コドンを含む配列からなるオリゴヌクレオチドA、及び該遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドBを化学合成し、これらのオリゴヌクレオチドAとBを１セットにし、ラクトバチラス・カゼイYIT 9029のDNAをテンプレートとしてPCR反応を行なうことにより得ることができる。また、こうして得られる遺伝子断片を効率よくプラスミドベクター等にクローニングを行なうために、オリゴヌクレオチドプライマーの5'末端側に制限酵素切断のための配列を付加して用いることもできる。ここで、プライマーとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、既に取得された本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。当該ヌクレオチドとしては、配列番号１等に対応する部分ヌクレオチド配列であって、１０〜５０個の連続した塩基、好ましくは１５〜３５個の連続した塩基等が挙げられる。
また、ＰＣＲの条件は、例えば2000塩基対の長さのDNA断片を得る場合には、９４℃ ２分、（９５℃ １０秒、５２℃ １０秒、７２℃ ２分）ｘ３０サイクル、７２℃ ７分が挙げられる。
また、その当該塩基配列に従い、DNA合成機により人工的に合成して得ることもできる。
本発明の遺伝子は、種々のサイトカインの産生調節に関与する遺伝子であることから、これを微生物に導入する、或いは微生物が有する当該遺伝子を改変することにより、当該微生物において、サイトカインの産生を調節することができる。
本発明の遺伝子の導入は、当該遺伝子を、元来有しない微生物に、単独或いは組み合わせて導入することにより行うことができる。遺伝子を導入する方法としてはDNAの取り込み能を利用したコンピテンス法、プロトプラストを利用したプロトプラストPEG法及び高電圧パルスを利用したエレクトロポレーション法等を利用すればよく、特にエレクトロポレーション法が好ましい。また、遺伝子を微生物染色体に組み込む場合には、相同組換えを利用した方法、部位特異的に組み込む方法を用いることができる。
本発明の遺伝子の改変には、当該遺伝子の発現阻害若しくは発現抑制、又は発現増強が挙げられる。
遺伝子の発現を阻害するには、本発明の遺伝子を破壊、欠損すればよく、この方法としては、全く別のDNA断片を遺伝子の内部に挿入する挿入失活法や段階的な相同組換えによって標的遺伝子の一部又は全部を欠失する段階的二重交叉法を用いればよく、特に段階的二重交叉法が好ましい。
具体的には、標的遺伝子の一部又は全部を欠失する場合には、欠失領域をはさむ両側の領域を染色体DNAから分離するか、あるいはPCR法によって増幅して分離し、例えばpYSSE3のような大腸菌では増殖するが対象とする微生物中では複製が出来ないプラスミドベクターにそれら両DNA断片を本来の向きと同じ向きに並んだ状態でクローニングする。次に、得られる組換えプラスミドDNAを、欠失を起こさせようとする微生物にエレクトロポレーション法等を用いて導入し、生じる抗生物質耐性のクローンから、PCR法等によって目的の欠失領域の上流又は下流のクローニングした領域との相同領域で組換えを起こしてプラスミドが染色体上に挿入したクローンを選択する。こうして得たクローンを、抗生物質を含まない培地で継代培養を繰り返すことによって、プラスミドが再び近接して存在する相同領域間の組換えによって染色体から離脱し、菌の増殖に伴って消失することによって、抗生物質耐性をなくしたクローンを選択する。こうして得たクローンからPCR法等によって標的遺伝子領域を欠失したクローンを分離することができる。
遺伝子の発現を抑制するには、本発明の遺伝子のmRNAの５’末端領域と相補的な短いRNAを合成することによる、いわゆるRNA干渉による方法や、該遺伝子の発現を制御する領域又は制御遺伝子を破壊若しくは欠損等して改変する方法を用いることができ、特に該遺伝子の発現を制御する領域の改変が好ましい。具体的には、遺伝子の転写を制御するプロモーターの配列を改変することによって、該遺伝子のmRNAへの転写量を多くしたり、少なくしたりすることができる。
遺伝子の発現を増強するには、本発明の遺伝子を運ぶ組換えプラスミドを対象とする微生物に導入すること、該遺伝子を染色体の別の場所に部位特異的組換えによって組み込むことによって微生物内での該遺伝子のコピー数を増加させること、該遺伝子の発現を制御する制御領域を改変したり、制御遺伝子を改変することによって発現を増加させる方法等によって行えばよいが、特に該遺伝子のコピー数を増加させる方法が好ましい。具体的には、１個の微生物細胞あたり複数個のコピー数を持つプラスミドに、対象とする遺伝子をその遺伝子の本来のプロモーター配列とリボソーム結合部位を含めてクローニングするか、別の遺伝子から分離した、あるいは化学合成によって作成したプロモーターとリボソーム結合部位の下流に該遺伝子のポリペプチドをコードする領域だけをつなげてクローニングした組換えプラスミドを作成し、微生物細胞内にエレクトロポレーション法などによって導入することによって、微生物細胞内での該遺伝子のコピー数を上げることができる。
ここで、遺伝子導入又は改変の対象となる微生物は、特に限定されるものではなく、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母等を用いることができるが、グラム陽性細菌を好適に利用することができ、特に生体への安全性が確認されているラクトバチルス属細菌等の利用が好ましい。ラクトバチルス属細菌の中でも、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ゼアエ、ラクトバチルス・ラムノーサス等のラクトバチルス・カゼイグループに属する細菌の利用が好ましく、特にラクトバチルス・カゼイを好適に利用することができる。また、サイトカイン産生調節遺伝子を元来有する微生物としては、ラクトバチルス・カゼイYIT 9018やラクトバチルス・カゼイYIT 9029が挙げられる。
例えば、ラクトバチルス・カゼイATCC 334に、該遺伝子のオペロン構造やプロモーターの位置を考慮して、好ましくはcps1A、cps1B、cps1C、cps1D、cps1E、cps1F、cps1G及びcps1J遺伝子をコードするDNA断片をプロモーターの下流に導入した場合、マクロファージからのTNF-α、IL-10、IL-12の産生が効率的に抑制された改変体を得ることができ（実施例６）、また、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029において、cps1A遺伝子等を欠損させるとTNF-α、IL-12、IL-10及びIL-6の産生を促進し、且つリポポリサッカライドの刺激によるマクロファージからのIL-6産生抑制活性が消失した改変体を得ることができる（実施例４、５）。さらに、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029において、cps2A遺伝子、cps2C遺伝子等を欠損させるとマクロファージからのTNF-α、IL-10産生が変化した改変体を得ることができる（実施例４）。
斯くして得られる遺伝子導入又は改変された微生物は、各々が有するサイトカイン産生調節能に応じ、種々の薬理作用を発揮する飲食品や医薬品として利用することができる。例えば、Th1型の免疫応答を促進するサイトカイン（IL-2、IL-12及びIFN-γ等）の産生を促進する微生物を含有する飲食品や医薬品は、Ｉ型アレルギー、アトピー性皮膚炎、花粉症の抑制等の効果や、細菌及びウイルス感染、がん細胞増殖等を抑制する効果が期待でき、逆にTh2型の免疫応答を促進するサイトカイン（IL-4、IL-5及びIL-10等）の産生を促進する微生物を含有する飲食品や医薬品は、炎症性腸疾患や粥状動脈硬化の要因としての炎症等の抑制、I型糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、シェーグレン症候群、移植拒絶反応、膠原病、多発性硬化症、自己免疫性萎縮性胃炎等の自己免疫疾患を抑制する等の応用効果が期待できる。
また、自然免疫系の抗原提示細胞の一つであるマクロファージが産生するTNF-αは、炎症を通した生体防御機構に広く関わるサイトカインであり、その受容体の偏在性や複数のシグナル伝達経路を活性化でき、様々な遺伝子の発現を誘導、抑制できることから、生体防御、生体恒常性、発生、分化などへの非常に多面的な生理効果が期待できる。
また、マクロファージや単球、血管内皮細胞、繊維芽細胞及びケラチノサイトから産生されるIL-6は、Ｂ細胞や形質細胞（プラズマ細胞）を増殖させ、IgG、IgM及びIgA抗体の産生を増強させる作用、Ｔ細胞の分化や活性化、肝細胞に作用しC-reactive protein（CRP）やハプトグロビンなどの急性期蛋白を誘導する作用、関節リウマチ患者の関節液中に著明に増加するなど、宿主防御、急性相反応、免疫反応、造血において重要な役割が期待できる。
また、抗原提示細胞（マクロファージや樹状細胞）やＢ細胞によって産生されるIL-12は、強力なIFN-γの誘導因子であり、Ｔ細胞からは産生されない。IL-12はナイーブヘルパーＴ細胞(Th0細胞)をTh1細胞に分化させる作用、ＮＫ細胞やＮＫＴ細胞を活性化させる作用など複数の作用を及ぼすことから、自然免疫系と獲得免疫系の橋渡し役として生理効果が期待できる。
遺伝子導入又は改変された本発明の微生物を飲食品や医薬品とする場合、菌体は、生菌又は加熱菌体（死菌体）のいずれでもよく、又凍結乾燥したものであってもよく、あるいはこれら微生物を含む培養物として利用することもできる。また、所望のサイトカイン産生調節能が保存されている限りは、菌体処理物を利用することも可能である。
医薬品として使用する場合は、本発明の微生物を固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
また、遺伝子導入又は改変された本発明の微生物は、上記のような製剤とするだけでなく、飲食品に配合して使用することもできる。飲食品に配合する場合は、そのまま、または種々の栄養成分と共に含有せしめればよい。この飲食品は、各々の微生物が有するサイトカイン産生調節能に応じ、種々の薬理作用を発揮する保健用食品又は食品素材として利用できる。具体的に本発明の方法により得られた微生物を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、すなわち、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には、動物の飼料も含まれる。
さらに飲食品としては、本発明の微生物を利用した発酵乳、乳酸菌飲料、発酵豆乳、発酵果汁、発酵植物液等の発酵飲食品の例が挙げられる。これら発酵飲食品の製造は常法に従えばよい。例えば発酵乳を製造する場合は、まず、殺菌した乳培地に本発明の微生物を単独又は他の微生物と同時に接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。次いで、別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、更にフレーバーを添加して最終製品に仕上げればよい。このようにして得られる発酵乳は、プレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。
本発明の遺伝子は、サイトカイン産生調節能を有する微生物のスクリーニングのために使用することもできる。
すなわち、本発明の遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することにより、サイトカイン産生調節能を有する微生物をスクリーニングすることができる。
ここで、遺伝子の有無及び／又はその発現量の測定は、本発明の遺伝子や遺伝子由来のmRNAを検出し得るプローブやプライマーを用いて、微生物における標的とする遺伝子の有無、コピー数や発現量をサザーンハイブリダイゼーション法やDNAマイクロアレイやRT-PCR法により行うことができる。そして、標的遺伝子やその発現の有無により、目的の微生物を選択すればよい。
なお、本発明の遺伝子は、PS−PGの合成や糖転移酵素の機能を有しているため、PS−PGの合成やPS−PGを有する微生物のスクリーニングといった目的にも利用できる。また、細菌が免疫機能等を発現する為に必要な糖鎖構造を有するか否かのスクリーニングといった目的や、細菌に本来持たない糖鎖を発現させて機能改善する目的にも利用できる。
（ｄ）〜（ｆ）で示されるポリヌクレオチド又はその一部（断片）を含む本発明の組換えベクターは、大腸菌及び対象とする微生物において該ベクターの導入を選択できるような遺伝子マーカーを有している任意のベクター（例えば、pHY400、pSA3、pYSSE3等）を用いてインビトロライゲーション法等の公知の方法により得ることができる。
また、上記の組換えベクターを含む宿主微生物は、公知の方法、すなわち、当該組換えベクターを宿主微生物に導入する場合はエレクトロポレーション法等の方法により、微生物染色体に組み込む場合は該微生物と相同なDNA領域を持つ組換えベクターをエレクトロポレーション法等により導入した後に相同組換えにより染色体に組み込まれたものをPCR法等によって確認する等の方法を用いることにより得ることができる。
また、（ｄ）〜（ｆ）で示されるポリヌクレオチド又はその一部（断片）を含む本発明のDNAアレイ又はDNAチップは、フォトリソグラフィー法等の公知の方法により作製することができる。このDNAアレイ又はDNAチップを用いることにより、本発明の遺伝子を発現する微生物をスクリーニングすることができる。
尚、上述した微生物の遺伝子導入又は改変や微生物のスクリーニングを効率よく行うためには、本発明のポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター、本発明のポリヌクレオチドの一部断片からなるPCR及びRT-PCR用プライマー、ポリヌクレオチド又はその一部を増幅することができるPCR及びRT-PCR用プライマー、ポリヌクレオチド又はその一部からなるハイブリダイゼーション用の核酸断片を用いることが好ましい。
ここで、使用されるプライマー等の核酸断片としては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、当該ヌクレオチドとしては、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７に示すそれぞれの塩基配列に対応する部分ヌクレオチド配列であって、１０〜５０個の連続した塩基、好ましくは１５〜３５個の連続した塩基が好ましい。
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明する。
実施例１ ラクトバチルス・カゼイYIT 9029の遺伝子解析（遺伝子の抽出）：
ラクトバチルス・カゼイYIT 9029のPS-PG合成及び糖転移酵素に関連する遺伝子を、既知の微生物由来多糖合成遺伝子との相同性等をもとに染色体上から検索した。すなわち、ゼネティックス社製 遺伝情報処理ソフトウェアGENETYXを用いたLipman-Person法(Lipman, D. J. and Pearson, W. R. 1985. Rapid and sensitive protein similarity searches. Science 227:1435-1441)により、個々の上記遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を相手として、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029のゲノム配列から予想されるタンパク質をコードすると思われるオープンリーディングフレーム（ORF）の全てに対してホモロジー解析した。その結果、数十に上る多糖合成及び糖転移に関与する可能性がある遺伝子を規定すると考えられるORFを抽出した。これらのうち配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７に記載の遺伝子はデータベース上にある既存遺伝子とのホモロジー検索により新規遺伝子であることを確認した。
実施例２ ラクトバチルス・カゼイYIT 9029の遺伝子破壊株の分離−1：
配列番号３記載の遺伝子（cps1B）を欠損する変異株の作成は次のように行った。
配列番号３内部の配列から選択した配列の５’末端側に制限酵素BamH I切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-cgggatccgagccaaaacatgttgttgct-3'（配列番号１７）、及び配列番号３と相補的な配列から選択した配列の５’末端側に制限酵素Pst I切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-aactgcagtgttacgacaacaaccccgt-3'（配列番号１８）をプライマーとし、KOD Plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO社製、製品番号KOD-201）を用いて本酵素に添付の方法に従って、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029のDNAをテンプレートとしてPCR反応を行った。こうして増幅されるDNA断片はcps1B遺伝子のアミノ末端とカルボキシル末端の両側を欠いた部分配列である。生成物を等量のトリス−イーディーティーエー（10mM Tris(pH 8.0)−1mM EDTA, TEと呼ぶ）飽和フェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコール（25：24：1）と混合し、よく攪拌した後、15,000xg 5分の遠心を行って、2層に分離した。上層の水層を回収し、その10分の1量の3M炭酸ナトリウム溶液（pH7）と3倍量の９９．５％エタノールを加え、-20℃に30分間以上置いた後に、4℃で15,000xg 15分間の遠心を行った。上清を捨て、沈殿物に７０％エタノールを加えて洗浄し、15,000xg 5分間の遠心をした後エタノールを捨て、沈殿物を真空乾燥した。
この沈殿物を100μLのHバッファー（タカラバイオ社製）反応液中で制限酵素BamH IとPst I（タカラバイオ社製）で切断（37℃で20時間）した後、前述のTE飽和フェノール-クロロフォルム-イソアミルアルコール処理（溶媒混合から水層回収まで）を２回繰り返し、回収した水層に10分の1量の3M炭酸ナトリウム溶液（pH7）と3倍量の９９．５％エタノールを加え、-20℃に30分間以上置いた後に、4℃で15,000xg 15分間の遠心を行った。上清を捨て、沈殿物に70%エタノールを加えて洗浄し、15,000xg 5分間の遠心をした後エタノールを捨て、沈殿物を真空乾燥した。
プラスミドベクターとして、プラスミドpUC19に由来する大腸菌用複製領域と、大腸菌とラクトバチルスの両方で機能するプラスミドpAMβ1に由来するエリスロマイシン耐性遺伝子を持つpYSSE3（図１）を用いた。pYSSE3 DNAを100μLのHバッファー（タカラバイオ社製）反応液中で制限酵素BamH IとPst I（タカラバイオ社製）で切断（37℃で20時間）した後、10倍濃度のCIPバッファー（TOYOBO社製）20μLと水を加えて容量を200μLとし、カーフインテスティンフォスファターゼ（TOYOBO社製）3μLを加えて37℃で2時間インキュベートした。その後、前述のTE飽和フェノール-クロロフォルム-イソアミルアルコール処理とエタノール沈澱処理を行い、沈殿物を真空乾燥した。
上記cps1B遺伝子内部配列からなるDNA断片と制限酵素切断したプラスミドベクターをそれぞれおよそ0.01〜0.1μgずつ混合し、これに等容量のDNAライゲーションキットVer.2.1（タカラバイオ社製）I液を加えて16℃で30分間インキュベートした後、氷中に置いた。
次に、溶解後氷中に置いたJM109コンピテントセル（TOYOBO社製）100μLに上記反応液5μLを加え、軽く混合して氷中で30分間インキュベートした後、42℃に30秒間さらして反応をとめ、再び氷中に戻した。この菌液にSOC培地（TOYOBO社製）を1mL加え37℃で1時間培養した後にエリスロマイシン（注射用エリスロマイシン、ダイナボット社製）を500μg／mLの濃度で加えたLB寒天培地（１L中に10gバクトトリプトン、5gバクトイーストエキストラクト、5g塩化ナトリウム、15g寒天を含む）に塗布して、37℃でインキュベートした。
生成したエリスロマイシン耐性のコロニーを500μg／mLのエリスロマイシンを添加したＬＢ培地で生育し、ウィザードプラスSVミニプレップDNAピューリフィケーションシステム（プロメガ社製）を用いて組換えプラスミドDNAを抽出した。
ラクトバチルス・カゼイYIT 9029へのDNA導入には、該微生物をMRS培地（ディフコ社製）に生育し、対数増殖期にある培養液を5,000xg 4℃で5分間遠心して集菌し、菌体を氷冷した20mM HEPES(pH7.0)と１０％グリセロールでそれぞれ1回ずつ洗浄し、洗浄菌体を（初めの培養液のクレット値）x2μLの１０％グリセロールに懸濁した。菌懸濁液50μLと組換えプラスミドDNA溶液3μLを混合し、2mm幅のエレクトロポレーション用キュベットに入れ、ジーンパルサーII（バイオラッド社製）を用いて、1.5kV, 200Ω、キャパシタンス25μFでエレクトロポレーションを行った。この液にMRS培地1mLを加え、37℃で2時間培養後、エリスロマイシンを20μg／mLの濃度で加えたMRS寒天培地に塗布し、37℃で2日又は3日間インキュベートした。
生育したエリスロマイシン耐性コロニーの一部をとり、50μLのTEに懸濁後、94℃で2.5分間処理し、その一部をテンプレートとして用い、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029染色体のcps1B遺伝子内にあって、しかもプラスミドにクローニングしたcps1B遺伝子内部の配列にはない配列から選ばれたプライマーと、プラスミドベクターにあって、クローニングしたcps1B遺伝子内部断片の近傍にある配列から選ばれたプライマーを用いて、PCR解析を行うことにより、導入したプラスミドがラクトバチルス・カゼイYIT 9029染色体のcps1B遺伝子内部の組換えプラスミド上のcps1B遺伝子断片と相同な領域に組み込まれて、cps1B遺伝子が分断（破壊）されていることを確認した。こうして得たクローンをΩcps1Bとした。
上記Ωcps1Bの分離に用いた方法と同様の方法により、cps1A、cps1D、cps1E、cps1F、cps1G、cps1Jの各遺伝子の破壊株を分離し、それぞれΩcps1A、Ωcps1D、Ωcps1E、Ωcps1F、Ωcps1G、Ωcps1Jとした。また、プラスミドベクターpYSSE3の導入の影響を確認するため、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029のゲノム配列において有効な遺伝子を含まないと考えられる領域の一部（#231と略記）を同様に破壊した破壊株を分離し、YIT 9029/pYSSE3とした。このときに用いた各遺伝子の内部配列増幅用のPCR用プライマーの配列を表１に示した。
上記Ωcps1Bの分離に用いた方法と同様の方法により、cps2A、cps2C、cps2D、cps2E、cps2F、cps2G、cps2H、cps3A、cps3B及びcps3Cの各遺伝子、並びに遺伝子番号LCS0838、LCS1111、LCS1128及びLCS1890の各遺伝子の破壊株を分離し、それぞれΩcps2A、Ωcps2C、Ωcps2D、Ωcps2E、Ωcps2F、Ωcps2G、Ωcps2H、Ωcps3A、Ωcps3B、Ωcps3C、ΩLCS0838、ΩLCS1111、ΩLCS1128及びΩLCS1890とした。このときに用いた各遺伝子の内部配列増幅用のPCRプライマー配列を表２に示した。
実施例３ ラクトバチルス・カゼイYIT 9029の遺伝子破壊株の分離−２：
配列番号１記載の遺伝子（cps1A）を欠損する変異株の作成は次のように行った。cps1A遺伝子の上流約1kbp近傍の領域から選択した配列とその５’末端側にPst I切断部位を持つ配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-atactgcagattggcatgggttttc-3'（配列番号３３）とcps1A遺伝子内部の５’末端に近い領域から選択した配列の相補鎖からの配列とその５’末端側にEcoR I切断部位を持つ配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-taagaattcagcttcgtattttggtaca-3'（配列番号３４）を一つのセットとし、cps1A遺伝子内部の３’末端に近い領域から選択した配列とその５’末端側にEcoR I切断部位を持つ配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-gaagaattcaatatgcaggattta-3'（配列番号３５）とcps1A遺伝子の下流約1kbp近傍の領域から選択した配列の相補鎖からの配列とその５’末端側にXba I切断部位を持つ配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-atatctagattcccccaaccatact-3'（配列番号３６）をもう一つのセットとして、それぞれKOD Plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO社製、製品番号KOD-201）を用いて酵素に添付の方法に従って、ラクトバチラス・カゼイYIT 9029のDNAをテンプレートとしてPCR反応を行った。それぞれの生成物は実施例２と同様にしてTE飽和フェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコール処理とエタノール沈澱処理を行い、沈殿物を真空乾燥した。
この沈殿物を、前者は100μLのHバッファー（タカラバイオ社製）反応液中で制限酵素Pst IとEcoR I（タカラバイオ社製）で、後者は100μLのMバッファー（タカラバイオ社製）反応液中で制限酵素EcoR IとXba Iで切断（37℃で20時間）した後、実施例２と同様にして得た沈殿物を真空乾燥した。
また、実施例２と同様の方法により、制限酵素Pst IとXba Iで切断したプラスミドベクターpYSSE3を調製した。
ライゲーション反応は、上記の２種類のDNA断片と制限酵素Pst IとXba Iで切断したプラスミドベクターをそれぞれおよそ0.01〜0.1μgずつ混合し、これに等量のDNAライゲーションキットVer.2.1（タカラバイオ社製）I液を加えて16℃で30分間インキュベートした後、氷中に置いた。
次に、実施例２と同様の方法により、エリスロマイシン耐性のコロニーから、目的の断片を有する組換えプラスミドDNAを分離した。
こうして生成したプラスミドは、ベクターの制限酵素Pst I切断部位とXba I切断部位の間に、２つのDNA断片がEcoR I切断部位をはさんで並んで挿入されていた。
ラクトバチルス・カゼイYIT 9029へのDNA導入とエリスロマイシン耐性を獲得したクローンの分離は実施例２と同様の方法により行った。
エリスロマイシン耐性のコロニーの一部をとり、50μLのTEに懸濁後、94℃で2.5分間処理し、その一部をテンプレートとして用い、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029染色体上にある、クローン化した２つの塩基配列領域のすぐ外側にある領域から選ばれた配列を有するプライマーとプラスミドベクター上の領域から選ばれた配列を有するプライマーを用いて、PCR解析を行って、導入したプラスミドが第一段階の相同組換えにより、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029染色体のcps1A遺伝子の上流域又は下流域の、組換えプラスミド上の断片と相同な領域に組み込まれていることを確認した。
次にこうして得たクローンをエリスロマイシンを含まないMRS培地に植えて37℃で一夜培養して増殖し、その0.1%を新鮮なMRS培地に植え継いで再び37℃で一夜培養する操作を5回繰り返した。こうして得た培養液をMRS寒天培地にコロニーが100〜300個程度が生育するように適宜希釈して塗布し、37℃で2日間培養した。生育したコロニーをレプリカ法により、20μg／mLのエリスロマイシン入りMRS寒天培地と通常のMRS寒天培地に移し、37℃で1日間培養した後、エリスロマイシン入り寒天培地には生育せず、通常の寒天培地にのみ生育するコロニーを選択した。
選択したコロニーの一部をとり、50μLのTEに懸濁後、94℃で2.5分間処理し、その一部をテンプレートとして用い、プラスミドにクローニングした２つの領域内の配列を有するプライマーとこれら２つの領域の間にある領域から選択された配列を有するプライマーを用いてPCRを行った場合には、増幅されるDNAがなく、また同時にこれら２つの領域からそれぞれ選択された配列を有する２つのプライマーを用いてPCRを行ったときには、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029の元の配列から予想される大きさのDNAよりも欠失した領域分だけ短いDNAが増幅されることを確認することによって、染色体に挿入していたプラスミドが、挿入の時に利用した相同配列間の相同的組換え部位とは異なるもう一方の相同配列間で第二段階の相同的組換えを起こすことにより、染色体からプラスミドが脱落したものを選択した。このクローンにおいては、プラスミドに由来する配列が消失すると同時に、cps1A遺伝子の中央の部分が欠失している。こうして得たクローンをΔcps1Aとした。
上記の方法と同様の方法により、cps1C、cps1E、cps1Jの各遺伝子の欠失による破壊株を分離し、それぞれΔcps1C、Δcps1E、Δcps1Jとした。このときに用いたPCR用プライマーの配列を表３に示した。また、同様の方法により、遺伝子ごとにその上流域と下流域の最適の領域を増幅し、プラスミドベクターへのクローニング、該組換えプラスミドのラクトバチルス・カゼイYIT 9029への導入、段階的二重交叉法による遺伝子の欠失を起こさせることにより、その他の遺伝子（cps1B、cps1D、cps1F、cps1G）の内部が欠失した変異株を分離することが可能である。ただし、cps1C遺伝子の欠失のためには大腸菌及び乳酸菌で複製が可能なシャトルベクタープラスミドであるpH4611（Mayumi Kiwaki et al., Bioscience Microflora Vol.20(4), 121-129, 2002）をプラスミドベクターとして用いた。pH4611は乳酸菌において複製が可能であるが、エリスロマイシンを加えないで培養すると、プラスミド脱落頻度が高いために、継代培養を繰り返した後にはエリスロマイシン耐性を有するクローンが著しく減少し、エリスロマイシン耐性を有するクローンはプラスミドが染色体に組み込まれたクローンであることが確認される。当該クローンを更に継代培養を行なうことにより、プラスミドが染色体から相同組換えによって切り出され、脱落したものを容易に選択することができ、基本的な操作はpYSSE3のような非複製型ベクターを使う場合と同じである。
実施例４ サイトカイン産生調節遺伝子による微生物のサイトカイン産生調節能の改変：
ラクトバチルス・カゼイYIT 9029由来遺伝子欠損変異株の挿入失活変異株７株（実施例２のΩcps1A、Ωcps1B、Ωcps1D、Ωcps1E、Ωcps1F、Ωcps1G、Ωcps1J）については、その対照株としてYIT 9029/pYSSE3を、完全欠失変異株４株（実施例３）については、その対照株としてYIT 9029を用いた。これら13株をMRS培地（ディフコ社製）で、37℃で一晩培養し、蒸留水で洗浄集菌した後、100℃で30分間処理し加熱死菌体を調製し凍結乾燥した。凍結乾燥菌体を終濃度１mg／mLとなるようにPBSで懸濁し、121℃ 20分オートクレーブで処理した後、10％牛胎児血清加RPMI-1640培地（SIGMA社製）（以下培養液と略）で希釈して使用した。
マクロファージ及び／又は免疫担当細胞は、８〜15週齢のメスのBALB/cマウス４匹（日本SLC）から脾臓を摘出して使用した。すなわち、10mM HEPESを含むハンクス緩衝液（HBSS）中で脂肪繊維等を除去したBALB/cマウス脾臓を注射筒押部位でつぶし、30mL HBSSに全細胞を回収した。この細胞浮遊液を70μｍフィルターでろ過した後、遠心洗浄（1,500rpm, ５分、４℃）を行った。遠心上清を除去した後、ボルテックス等で細胞を良く分散させ、赤血球溶血液８mL（２mL／脾臓１個）を添加して室温で５分反応させた。反応後、直ちにHBSSを加えて30mLとし遠心洗浄した。同様に、遠心上清を除去した後、ボルテックス等で細胞を良く分散させ、再度HBSS 30mLを加えて遠心洗浄した。再度、遠心上清を除去した後、培養液20mLに分散させた。細胞数を測定した後、BALB/cマウス脾臓細胞数が5x106／mLになるように培養液で希釈し、96ウエル細胞培養プレートに100μL／wellずつ分注した（5x105cells／well／200μL）。
次に、上述の培養液で希釈した乳酸菌加熱死菌体を100μL／wellずつ、終濃度３あるいは30μg／mLとなるように分注した（各群のｎ＝３）。
菌体添加後、直ちに37℃の５％CO2インキュベーターに移し24時間培養した。培養後上清を回収し、上清中のTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６濃度をELISA法で測定し、平均値と標準偏差を求めた。
その結果、次のことが判明した（図２〜図５）。
（１）Ωcps1Aは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、BALB/cマウス脾臓細胞におけるTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６産生を亢進させた。同様に、Δcps1Aは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029と比して、BALB/cマウス脾臓細胞におけるTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６産生を亢進させた。このことは、cps1A遺伝子はTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（２）Ωcps1Bは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、BALB/cマウス脾臓細胞におけるTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６産生を亢進させた。このことは、cps1B遺伝子はTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（３）Δcps1Cは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029と比して、BALB/cマウス脾臓細胞におけるTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６産生を亢進させた。このことは、cps1C遺伝子はTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（４）Ωcps1Dは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、BALB/cマウス脾臓細胞におけるTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６産生を亢進させた。このことは、cps1D遺伝子はTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（５）Ωcps1Eは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、BALB/cマウス脾臓細胞におけるTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６産生を亢進させた。同様に、Δcps1Eは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029と比して、BALB/cマウス脾臓細胞におけるTNF-α、IL-12p70及びIL-６産生を亢進させた。このことは、cps1E遺伝子はTNF-α、IL-12p70及びIL-６産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（６）Ωcps1Fは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、BALB/cマウス脾臓細胞におけるTNF-α、IL-12p70及びIL-６産生を亢進させた。このことは、cps1F遺伝子はTNF-α、IL-12p70及びIL-６産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（７）Ωcps1Gは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、BALB/cマウス脾臓細胞におけるTNF-α、IL-12p70及びIL-６産生を亢進させた。このことは、cps1G遺伝子はTNF-α、IL-12p70及びIL-６産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（８）Ωcps1Jは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、BALB/cマウス脾臓細胞におけるTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６産生を亢進させた。同様に、Δcps1Jは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029と比して、BALB/cマウス脾臓細胞におけるTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６産生を亢進させた。このことは、cps1J遺伝子はTNF-α、IL-12p70、IL-10及びIL-６産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
サイトカイン産生調節遺伝子による微生物のサイトカイン産生調節能の改変（２）：
ラクトバチルス・カゼイYIT 9029由来遺伝子欠損変異株の挿入失活変異株１４株（実施例２のΩcps2A、Ωcps2C、Ωcps2D、Ωcps2E、Ωcps2F、Ωcps2G、Ωcps2H、Ωcps3A、Ωcps3B、Ωcps3C、ΩLCS0838、ΩLCS1111、ΩLCS1128、ΩLCS1890）について、その対照株としてYIT 9029/pYSSE3を用いた。これら１４株をMRS培地（ディフコ社製）で、37℃で一晩培養し、蒸留水で洗浄集菌した後、100℃で30分間処理し加熱死菌体を調製し凍結乾燥した。凍結乾燥菌体を終濃度１mg／mLとなるようにPBSで懸濁し、121℃、20分オートクレーブで処理した後、10％牛胎児血清加RPMI-1640培地（SIGMA社製）（以下培養液と略）で希釈して使用した。次に、上述の培養液で希釈した乳酸菌加熱死菌体を100μL／wellずつ、終濃度２５μg／mLとなるように分注した（各群のｎ＝３）。
マウスマクロファージRAW264.7細胞（ATCCから購入）は、常法通り37℃、５％CO2インキュベーター中で培養して使用した。遠心分離（1,500rpm、５分、４℃）により細胞を回収した後、培養液で106／mLに懸濁し、96ウェル細胞培養用プレートに100μL／wellずつ分注した。
マウスマクロファージRAW264.7細胞添加後、直ちに37℃の５％CO2インキュベーターに移し24時間培養した。培養後上清を回収し、上清中のTNF-α及びIL-10濃度をELISA法で測定し、平均値と標準偏差を求めた。
その結果、次のことが判明した（図６〜図７）。
（１）Ωcps2Aは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-αを変化させず、IL-10産生を亢進させた。このことは、cps2A遺伝子はTNF-αを変化させず、IL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（２）Ωcps2Cは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-αを抑制し、IL-10産生を亢進させた。このことは、cps2C遺伝子はTNF-αを亢進させ、IL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（３）Ωcps2Dは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-α及びIL-10産生を亢進させた。このことは、cps2D遺伝子はTNF-α及びIL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（４）Ωcps2Eは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-αを抑制し、IL-10産生を亢進させた。このことは、cps2E遺伝子はTNF-αを亢進させ、IL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（５）Ωcps2Fは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-αを抑制し、IL-10産生を亢進させた。このことは、cps2F遺伝子はTNF-αを亢進させ、IL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（６）Ωcps2Gは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-α及びIL-10産生を亢進させた。このことは、cps2G遺伝子はTNF-α及びIL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（７）Ωcps2Hは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-α及びIL-10産生を亢進させた。このことは、cps2H遺伝子はTNF-α及びIL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（８）Ωcps3Aは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-α及びIL-10産生を亢進させた。このことは、cps3A遺伝子はTNF-α及びIL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（９）Ωcps3Bは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-α及びIL-10産生を亢進させた。このことは、cps3B遺伝子はTNF-α及びIL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（１０）Ωcps3Cは、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-α及びIL-10産生を亢進させた。このことは、cps3C遺伝子はTNF-α及びIL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（１１）ΩLCS0838は、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-α及びIL-10産生を亢進させた。このことは、遺伝子番号LCS0838の遺伝子はTNF-α及びIL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（１２）ΩLCS1111は、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-αを変化させず、IL-10産生を亢進させた。このことは、遺伝子番号LCS1111の遺伝子はTNF-αを変化させず、IL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（１３）ΩLCS1128は、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-αを変化させず、IL-10産生を亢進させた。このことは、遺伝子番号LCS1128の遺伝子はTNF-αを変化させず、IL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
（１４）ΩLCS1890は、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029/pYSSE3と比して、マウスマクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-α及びIL-10産生を亢進させた。このことは、遺伝子番号LCS1890の遺伝子はTNF-α及びIL-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
実施例５ LPSで刺激したRAW264.7細胞におけるIL-6産生能のサイトカイン産生調節遺伝子破壊株による改変：
マウスマクロファージRAW264.7細胞（ATCCから購入）は、常法通り37℃、５％CO2インキュベーター中で培養して使用した。遠心分離（1,500rpm、５分、４℃）により細胞を回収した後、実施例４記載の培養液で106／mLに懸濁し、96ウェル細胞培養用プレートに100μL／wellずつ分注した。次に、大腸菌由来リポポリサッカライド(LPS;10μg／mL)を単独で、又は実施例４と同様に調製したラクトバチルス・カゼイATCC 334（基準株）、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029に由来する遺伝子破壊株Ωcps1A、Ωcps1B、Δcps1C、Ωcps1D、Ωcps1E、Ωcps1F、Ωcps1G及びΩcps1Jの加熱死菌体５μg／mLをLPSと共に添加して37℃、５％CO2インキュベーター中24時間培養した。培養終了後上清を回収し、培養上清中のIL-6量をELISA法で測定した。LPSを単独で添加した場合のIL-6産生量を基準値とし、菌体添加後のIL-6産生抑制率(%)を算出し、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029株のIL-6産生抑制を100％として他の株のIL-6産生抑制効果を百分率（％）で評価した（図８）。
ラクトバチルス・カゼイYIT 9029加熱死菌体をLPSとともに添加したときは、LPS単独で刺激した場合と比してIL-6産生は著しく抑制された。これに対して、上記遺伝子破壊株や本発明の遺伝子を持たないラクトバチルス・カゼイATCC 334をLPSと共に添加したときには、IL-6の産生は亢進された。このことは、cps1A、cps1B、cps1C、cps1D、cps1E、cps1F、cps1G及びcps1J遺伝子は、LPS刺激によるマクロファージのIL-6の産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
実施例６ ラクトバチルス・カゼイATCC 334に本発明の遺伝子を導入した変異株のサイトカイン産生調節能の改変：
cps1A（配列番号１）、cps1B（配列番号３）、cps1C（配列番号５）、cps1D（配列番号７）、cps1E（配列番号９）、cps1F（配列番号１１）、cps1G（配列番号１３）及びcps1J（配列番号１５）の８個の遺伝子を含む領域を取得する為に、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029株のDNAを鋳型にcps1A遺伝子上流のリボソーム結合部位配列を含む領域の配列とその５’末端側にSmaI切断部位を含む配列をもつオリゴヌクレオチド 5'-taacccgggtggacttgattacacaagc-3'（配列番号４９）、及びcps1J遺伝子下流の領域の相補鎖の配列とその５’末端側にPst I切断部位を含む配列を持つオリゴヌクレオチド 5'-taactgcagacactctttttacactgcg-3'（配列番号５０）のプライマーセットを用い、KOD Plus DNAポリメラーゼを用いて、添付の方法に従いPCRを行い、cps1A、cps1B、cps1C、cps1D、cps1E、cps1F、cps1G及びcps1J遺伝子を含むDNA断片を増幅した。増幅したDNAは実施例２と同様に精製、濃縮、制限酵素切断等の処理を行った。また、プラスミドベクターpYAP300（ファージFSWのattPサイトとint遺伝子を運び、ラクトバチルス・カゼイのattBサイトに部位特異的に挿入することができるプラスミド、図１）も実施例２と同様に制限酵素切断とカーフインテスティンフォスファターゼ処理、精製、濃縮を施した。両者を混合してベクター中の転写プロモーターの下流にcps1Aからcps1Jまでの遺伝子が挿入されるように結合し、大腸菌JM109コンピテントセルに導入し、500μg／mLエリスロマイシンを含むLB寒天培地に塗布して、37℃で2日間培養した。得られたコロニーからプラスミドを抽出し、その大きさと制限酵素切断による断片の大きさから目的の組換えプラスミドを得た。
次に、ラクトバチルス・カゼイATCC 334をMRS培地に増殖させ、対数増殖期にある培養液を5,000xg、4℃で5分間遠心して集菌し、実施例２の方法に従ってエレクトロポレーションを行った。この液にMRS培地1mLを加え、37℃で2時間培養後、エリスロマイシンを20μg／mLの濃度で加えたMRS寒天培地に塗布し、37℃で2日又は3日間インキュベートして、エリスロマイシン耐性のコロニーを得た。得られたコロニーの一部をとり、目的のプラスミドが目的の位置に挿入していることを、ラクトバチルス・カゼイATCC 334染色体上のattBサイト近傍の領域から選択された配列を有するプライマーと、クローニングされたcps1Aからcps1Jまでの領域の末端に比較的近い領域から選択された配列を有するプライマーとを用いてPCR法によって確認した。
こうして得られたラクトバチルス・カゼイYIT 9029に由来するcps1A、cps1B、cps1C、cps1D、cps1E、cps1F、cps1G及びcps1J遺伝子を持つラクトバチルス・カゼイATCC 334をATCC334 cps1A-Jとした。この遺伝子導入株の菌体を実施例４と同様に調製した。
RAW264.7細胞（ATCCから購入）及びJ774.1細胞（現RIKEN Bio Resource Center（旧RIKEN Gene Bank）から購入）は、実施例５と同様に使用した。実施例４記載の培養液で希釈した乳酸菌加熱死菌体を100μL加え（終濃度１μg／mL）、37℃、５％CO2インキュベーター中で24時間培養した。培養後、直ちに培養上清を回収して上清中のTNF-α、IL-10及びIL-12p40濃度をELISA法で測定した（図９〜１１）。
ラクトバチルス・カゼイYIT 9029株の遺伝子を導入したATCC 334 cps1A-J加熱死菌体を１μg／mL添加した場合のTNF-αの産生量は、親株のATCC 334よりも低かった。このことは、導入した遺伝子が、親株であるATCC 334の免疫調節作用に関し、TNF-αの産生を抑制するように変化させたことを意味する。またATCC 334 cps1A-J株のIL-10及びIL-12p40産生に対する効果についても、ATCC 334の示す産生誘導能に対して顕著に誘導活性が低下した。このことは、cps1Aからcps1Jまでの遺伝子の導入が親株ATCC 334のマクロファージ細胞株に対するIL-10及びIL-12p40の産生誘導活性を抑制したことを意味する。
実施例７ ラクトバチルス・カゼイYIT 9029Δcps1C変異株への野生型cps1C遺伝子導入によるサイトカイン産生調節能の改変：
cps1C遺伝子上流のリボソーム結合部位配列を含む配列とその５’末端側にSmaI切断部位を含む配列を持つオリゴヌクレオチド 5'-tcccccgggttgggggaatctatcg-3'（配列番号５１）とcps1C遺伝子下流の領域の相補鎖の配列とその５’末端側にPstI切断部位を含む配列を持つオリゴヌクレオチド 5'-aaactgcagttatattttccatcgataaa-3'（配列番号５２）をプライマーとし、ラクトバチラス・カゼイYIT 9029のDNAをテンプレートとしてKOD Plus DNAポリメラーゼによってcps1C遺伝子を増幅した。増幅したDNAは実施例２と同様に精製、濃縮、制限酵素切断等の処理を行い、同じく制限酵素切断とカーフインテスティンフォスファターゼ処理、精製、濃縮を施したプラスミドベクターpYAP300とを混合して、ベクター中の転写プロモーターの下流にcps1C遺伝子が挿入されるように結合し、大腸菌JM109コンピテントセルに導入し、500μg/mLエリスロマイシンを含むLB寒天培地に塗布して、37℃で１日間培養した。得られたコロニーからプラスミドを抽出し、その大きさと制限酵素切断による断片の大きさから目的の組換えプラスミドを得た。
次に、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029Δcps1C変異株をMRS培地に増殖し、対数増殖期にある培養液を5,000xg、4℃で5分間遠心して集菌し、実施例２の方法に従ってエレクトロポレーションを行った。この液にMRS培地1mLを加え、37℃で2時間培養後、エリスロマイシンを20μg／mLの濃度で加えたMRS寒天培地に塗布し、37℃で2日又は3日間インキュベートして、エリスロマイシン耐性のコロニーを得た。得られたコロニーの一部をとり、目的のプラスミドがattBサイトに挿入していることを、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029染色体上のattBサイト近傍の領域から選択された配列を有するプライマーと、クローニングされたcps1Cの領域から選択された配列を有するプライマーとを用いてPCR法によって確認した。こうして得られた株をΔcps1C／cps1C株とした。この遺伝子導入株の菌体を実施例４と同様に調製した。
実施例６と同様にRAW264.7及びJ774.1細胞を用いて、これにΔcps1C／cps1C株菌体を添加して、サイトカインの産生を調べたところ、TNF-α、IL-12p40及びIL-10のいずれのサイトカインの産生もΔcps1Cに比して著しく低下し、元のラクトバチルス・カゼイYIT 9029の持つサイトカイン産生誘導能と同等、又はそれよりも更に低下することが観察された（図１２）。このことは、Δcps1Cへのcps1C遺伝子の再導入が細胞壁多糖の合成を復帰させるが、異なる位置に導入されたことによって、その発現量が異なるために、更に強くサイトカイン産生を抑制するようになったと結論された。
実施例８
図１３に記載のラクトバチルス・カゼイの各菌株をMRS平板培地で培養し、生育したコロニーをTEに懸濁し、94℃で３分間熱処理したものをDNA抽出液とした。これを鋳型として、表１に記載のcps1D遺伝子内部の配列を増幅するためのプライマーを用いてTaKaRa ExTaq（タカラバイオ社製）を用いて、94℃ 2分、（94℃ 10秒、53℃ 10秒、72℃ 1.5分）x30、72℃ 5分の条件でPCRを行ない、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動によって調べた。その結果、図１３に示すようにYIT 9029で検出されるDNA断片と同じ大きさのDNA断片が、ごく限られた数の菌株からも検出され、これらの菌株が少なくともcps1D遺伝子を持つことが示された。

Claims (5)

  1. 配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号６に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号８に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号１０に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号１４に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号１６に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子からなる、サイトカイン産生抑制遺伝子であって、
    当該遺伝子をプロモーターの下流に導入してラクトバチルス・カゼイ(ATCC334)で発現させた場合、当該ラクトバチルス・カゼイ(ATCC334)によるマクロファージからのTNF-α、IL-6、IL-10及びIL-12から選択されるサイトカインの産生を抑制する、遺伝子。
  2. 配列番号１に示す塩基配列又はこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３に示す塩基配列又はこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示す塩基配列又はこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号７に示す塩基配列又はこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号９に示す塩基配列又はこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１１に示す塩基配列又はこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１３に示す塩基配列又はこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１５に示す塩基配列又はこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる、サイトカイン産生抑制遺伝子であって、
    当該遺伝子をプロモーターの下流に導入してラクトバチルス・カゼイ(ATCC334)で発現させた場合、当該ラクトバチルス・カゼイ(ATCC334)によるマクロファージからのTNF-α、IL-6、IL-10及びIL-12から選択されるサイトカインの産生を抑制する、遺伝子。
  3. 請求項１又は２記載の遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することを特徴とするマクロファージからのTNF-α、IL-6、IL-10及びIL-12から選択されるサイトカインの産生抑制能を有する微生物のスクリーニング方法。
  4. 請求項２記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  5. 請求項４記載の組換えベクターを含む宿主微生物。
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