WO2008053588A1 - Gène régulateur de la production de cytokines et utilisation de celui-ci - Google Patents

Gène régulateur de la production de cytokines et utilisation de celui-ci Download PDF

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WO2008053588A1
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Tomoyuki Sako
Emi Yasuda
Masaki Serata
Satoshi Matsumoto
Kan Shida
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Kabushiki Kaisha Yakult Honsha
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Definitions

  • the present invention relates to a gene involved in regulation of the production of site force-in from macrophages and / or immunocompetent cells, and a method for using the same.
  • Site power in is a cell signaling substance that plays an important role in the immune defense system, blood system, and biological defense systems such as inflammatory reactions. is there.
  • PRRs pattern recognition receptors
  • TLR toll-like receptor
  • cytokines production regulators so-called BRMs (biological response modifiers)
  • BRMs biological response modifiers
  • the cytokine-glycan complex of cytokines derived from gram-positive bacteria Production promoting action (Patent Document 1), Lactobacillus bacterium or polysaccharide derived from interleukin (ID 16 production inhibitory action (Patent Document 2), Lactic acid bacteria IL-15 production promoting action (patent Reference 3), Lactobacillus casei, etc.
  • Patent Document 5 Macrophage activating action of polysaccharide-peptidoglycan complex derived from Lactobacillus bacteria
  • Patent Document 5 Tumor cytotoxic factor-inducing action of polysaccharide monopeptide glycan complex derived from Lactobacillus bacteria
  • Patent Document 5 Reference 6) etc. have been reported.
  • Lactobacillus casei YIT 9018 (FERM BP-665) N.
  • lactobacillus casei YIT 9029 (FERM BP-1366) has a cell wall component that regulates its site activity. It has been revealed that it is a polysaccharide-peptidoglycan complex (PS-PG) (Patent Document 2). However, no elucidation has been made at the gene level.
  • PS-PG polysaccharide-peptidoglycan complex
  • Patent Document 1 JP-A-8_9 2 1 1 2
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 3 _ 7 3 2 8 6
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 2 _ 2 4 1 2 9 2
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 10-1 3 9 6 7 4
  • Patent Document 5 Japanese Patent Publication No. 6-9 9 3 1 4
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 6 3-1 9 6 5 2 1
  • Patent Document 7 Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 3 _ 6 3 9 9 1
  • Patent Document 8 Japanese Patent Application Laid-Open No. 9_26 9
  • the present invention relates to site force-in from macrophages and / or immunocompetent cells.
  • the present invention relates to providing genes involved in production regulation and methods of using the same.
  • the present invention relates to the following inventions.
  • (b) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a), and having the ability to regulate cytokine production
  • a gene comprising a polynucleotide selected from the following (d) to (f)
  • a screening method for microorganisms having the ability to regulate cytokine production characterized by measuring the presence and / or expression level of the above gene
  • the ability to regulate the production of cytokines from macrophages and / or immunocompetent cells by microorganisms can be freely changed, or the desired production of cytokines can be regulated. It is possible to screen for microorganisms having the ability.
  • FIG. 1 is a diagram of pYSSE3 and PYAP300.
  • FIG. 2 A graph showing the ability of Lactobacillus casei YIT 9029 gene-disrupted strain to induce TNF-spleen in spleen cells of BALB / c mice (addition amount of cells is 3 g / mL).
  • FIG. 3 is a graph showing the IL-12p70 inducibility of Lactobacillus casei YIT 9029 gene-disrupted strain in BALB / c mouse spleen cells.
  • FIG. 4 is a graph showing the IL-10-inducing ability of Lactobacillus casei YIT 9029 gene-disrupted strain in BALB / c mouse spleen cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing the IL-6 inducibility of Lactobacillus casei YIT 9029 gene-disrupted strain in BALB / c mouse spleen cells (addition amount of cells is 3 g / mL).
  • FIG. 6 is a graph showing the ability of TNF-spleen to be induced in mouse macrophage RAW264.7 cells (the addition amount of bacterial cells is 25 g / mL).
  • FIG. 7 is a graph showing IL-10-inducing ability in mouse macrophage RAW264.7 cells (amount of fungus added is 25 gZmL).
  • FIG. 8 is a graph showing IL-6 production induction inhibitory activity in mouse macrophage RAW264.7 cells stimulated with LPS.
  • FIG. 9 A graph showing the ability of TNF-splenic induction in mouse macrophage RAW264.7 cells (the addition amount of bacterial cells is 1 g / mL).
  • FIG. 10 is a view showing the ability to induce ⁇ 10 in mouse macrophage RAW264.7 cells (the amount of added bacterial cells is 1 g / mL).
  • FIG. 11 is a graph showing IL_12p40 inducibility in mouse macrophage J774.1 cells (bacterial cell addition amount is 1 g / mL).
  • FIG. 12 shows TNF-human IL-10-inducing ability in mouse macrophage RAW264.7 cells and IL-12p40-inducing ability in J774.1 cells (the amount of added cells is 25 mL).
  • FIG. 13 shows the detection of s ⁇ gene in each strain of Lactobacillus casei.
  • the strain names in each lane are: 1, YIT 9029; 2, YIT 0180; 3, YIT 0005; 4, YIT 0006; 5, YIT 0009; 6, YIT 0123; 7, YIT 0128; 8, YIT 000 3; 9, YIT 0007: 10, YIT 0010: 11, YIT 0015: 12, YIT 0038; 13, YIT
  • the term "gene” is intended to include not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA such as sense strand and antisense strand constituting the same, and is not limited to its length. It is not something.
  • the polynucleotide include RNA and DNA, and DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
  • the gene of the present invention was found from Lactobacillus casei YIT 9029, and CDS1 A CPS! BV CPSIC CDS1D, CDS1E, CDS1F, CDS1G, CDS1 J, CDS 2 A, CDS2G, CQ. S2D. CDS2E. CDS2 CDS2G. CDS2H.
  • a homology search between these genes and genes registered in an existing database no polynucleotides having 90% or more sequence identity were found, and these are all novel genes.
  • the gene of the present invention is a gene encoding a protein selected from the following (a) to (c).
  • (b) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a), and having the ability to regulate cytokine production
  • amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added is 1 or several, preferably 1
  • amino acid sequence in which ⁇ 10 amino acids have been deleted, substituted or added is included, and the addition includes the addition of one to several amino acids at both ends.
  • Deletion, substitution, and addition of amino acids include, for example, naturally occurring mutations such as single-base substitution in a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, etc., site-specific mutation introduction methods, and mutation treatments. And the like which can be caused by mutations artificially introduced into genes by the above.
  • a technique for artificially performing such amino acid deletion, substitution or addition for example, a conventional site-specific method for a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, etc.
  • An example is a method in which mutagenesis is performed and then this polynucleotide is expressed by a conventional method.
  • amino acid substitution examples include substitution with an amino acid having similar properties such as hydrophobicity, charge, pK, and steric structure.
  • amino acid sequences having 90% or more identity with the amino acid sequence (a) include SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 1 0, 1 2, 1 4, 1 6, 82, 84 , 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, and 108, when the corresponding sequences are properly aligned, the corresponding amino acid sequence And an amino acid sequence having an identity of 900/0 or more, more preferably 95% or more.
  • Site force-in production regulating ability means to promote or suppress the production of individual cytokines from macrophages and / or immunocompetent cells, and one gene has different cytokines. Even if it has an effect of promoting or suppressing production Included.
  • the site force in is not particularly limited, and interferons such as IFN-H, IFN-S, IFN-r, IL_1, IL_2, IL_3, IL_4, IL-5, IL_6, IL_7, IL_8, IL_9, IL_10, IL_11, IL_12, IL_13, IL_14, IL_15, IL_16, IL_17, IL_18, IL_19, IL_20, IL_21, IL_22, IL_23, IL_24, IL_25, IL_26, IL_27, IL_28 Interleukins such as I L_29, tumor necrosis factors such as TNF-H and TNF_S, GXGL1, GXGL2, GXGL3, GXGL4, GXGL5, GXGL6, GXGL7, GXGL8, GXGL9, GXGL10, GXGL11, CXCL12, GXGL GX
  • the immunocompetent cells mean cells involved in the immune response, and are not particularly limited. For example, macrophages, dendritic cells, Langerhans cells, monocytes, T cells, B cells, natural killer cells. And natural killer T cells.
  • the identity search uses genetic information processing software GENETYX, and the protein defined by the amino acid sequence of the protein defined by the base sequence and the publicly disclosed genome sequence of lactic acid bacteria or DNA fragments. By comparison with the amino acid sequence of —Searched for genes with sex. As an index of identity, the entire amino acid sequence or a part of the amino acid sequence was examined with an identity in a longer region of 20% or more as a guide.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (GpslA) is involved in the synthesis of extracellular polysaccharides derived from Lactobacillus delbrutsuki sub-spiisse ⁇ Bulgarix Lfi 5 ⁇ 37.5% identity with the protein encoded by the gene, Lactococcus lactis subspecies cremoris H02 strain derived from the ⁇ gene involved in extracellular polysaccharide synthesis 30.
  • the protein encoded by the ⁇ gene that has 9 ⁇ 1 ⁇ 2 identity and is involved in the synthesis of extracellular polysaccharides derived from Lactobacillus rhamnosus RW-9595M is 70.2% of Lactobacillus gasseri. It has 40.6% identity with the protein predicted from the draft sequence (JGI) of ATG C 33323.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (GpslB) is involved in the synthesis of extracellular polysaccharides derived from Lactobacillus delbrutsuki sub-spiisse ⁇ Bulgarix Lfi 5 in its amino acid sequence ⁇ 46.4 1 ⁇ 2 identity with the protein encoded by the gene, Lactococcus lacteis subspecies ⁇ Cremoris ⁇ The protein encoded by the gene involved in the synthesis of extracellular polysaccharides derived from the H02 strain And 4 1.
  • a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is a protein encoded by the I gene involved in the synthesis of polysaccharides derived from Streptococcus samophilus GNRZ1066 in its amino acid sequence. % Of identity, lactococcus lactis subspices lactis IL140 3-derived protein involved in the synthesis of polysaccharide % Identity.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is composed of 43.5% of the protein encoded by the ⁇ gene involved in the synthesis of polysaccharides derived from Streptococcus salivarius NGFB2393. Have the same identity.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 has a lactococcus lactis subspices in the amino acid sequence.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 has 30.6% identity with the protein encoded by the gene derived from Lactobacillus plantarum WGFS1 in its amino acid sequence.
  • it is partly Streptococcus salimorphus GNRZ1066-derived protein that is involved in the synthesis of extracellular polysaccharides ⁇ 39.3% of 84 amino acid residues and lactococcus lactis ⁇ Sub-sciences ⁇ Lactis 34.5% of 116 amino acid residues with the protein encoded by the gene involved in translocation of acetyl group derived from IL1403.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 (GpslJ) is involved in the synthesis of exopolysaccharide derived from Lactobacillus delbruecki subspices Bulgarix Lfi 5 in the amino acid sequence. 58. 3% identity with the protein encoded by the gene, Lactobacillus johnsonii NGG53 Involved in the synthesis of exopolysaccharides derived from 3 ⁇ 4 4.1% identity with the protein encoded by the gene, Lactobacillus rhamnosussus involved in exopolysaccharide synthesis from RW-9595M 79.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 82 had no identity in the amino acid sequence with the amino acid sequence of the protein encoded by another microorganism or other gene.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 84 is a protein that is a glycosyltransferase that is encoded by the gene of EF2195 in Enterococcus faecalis V583 strain in its amino acid sequence. And 38.3% identity with the protein encoded by the ⁇ gene involved in the exopolysaccharide synthesis of Streptococcus mutans UA159 strain.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 86 is a glycosyltransferase that is encoded by the gene of Lactobacillus plantarum WGFS1 gene number ⁇ _1763 in the amino acid sequence. It has 42.4% identity with the protein, and is the amino terminal 100 amino acid residue of the protein that is glycosyltransferase encoded by the gene number EF2181 of Enterococcus faecalis V583 strain. 38. 3% identity.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 88 has the following amino acid sequence: No. LBA0526 has 35.9% identity with the protein called glycosyltransferase encoded by the gene of LBA0526. Also, Lactobacillus delbruecki sub-spicious — Bulgarix ATGG1 1842 gene number It has 35% identity with a protein called glycosyltransferase encoded by the Ldb0454 gene.
  • a protein (Gps2F) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 90 is a muramidase that is encoded by the gene of the Lactobacillus plantarum WGFS1 gene number l p_3093 in the amino acid sequence. It has 51.0% identity in the 208 amino acid residues with the protein to be expressed, and also the protein encoded by the gene of EF21 74 gene of Enterococcus serivaris V583 strain. The amino acid residue has 30.7% identity.
  • the protein (Gps2G) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 92 is a repetitive unit transfer enzyme that is encoded by the gene of Lactobacillus plantarum WGFS1 strain gene number ⁇ ⁇ _1231 in the amino acid sequence.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 94 had no identity in the amino acid sequence with the amino acid sequence of the protein encoded by a gene of another microorganism or the like.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 96 is a glycosyltransferase encoded by the gene of Lactobacillus plantarum WGFS1 strain ⁇ _1275 in the amino acid sequence.
  • Lactobacillus del bruecki sub spi _s i s bulgarics ATGG1 1842 strain gene number Ldb1838 is a glycosyltransferase that is coded by the gene of Ldb1838. And 55.7 ⁇ 1 ⁇ 2 identity with the protein.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 98 has a gene number of Lactobacillus plantarum WGFS1 in the amino acid sequence. No. I It has 59.7% identity with the protein that is glycosyltransferase encoded by the gene of ⁇ _1276, and Lactobacillus delburtski subsp_s_Bulgarix ATGG11842 strain gene number Ldb1837 It has 54.1% identity with the protein that is glycosyltransferase that is encoded by the gene.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 100 is a glycosyltransferase encoded by the gene of Lactobacillus plantarum WGFS1 gene No. I p J 277 in its amino acid sequence. It has 49.7 ⁇ 1 ⁇ 2 identity with protein, and Lactobacillus delbrutski subspices ⁇ Bulgarix ATGG11842 strain gene No. Ldb1836 39. 5% identity.
  • a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 102 (LCS0838P) is encoded in the amino acid sequence by the gene of Ldb1569 in Lactobacillus delbrutsuki subspice bulgarix ATGG11842 strain.
  • Polysaccharide transport protein that has 49.9% identity with the protein that is said to be a polysaccharide transport protein (polysaccharide transport protein) and that is encoded by the gene of Lactobacillus-acidophilus NGFM strain gene number LBA1616 And 48.9% identity with the protein.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 104 is considered to be a glycosyltransferase that is encoded by the gene of gene No. EF2176 of Enterococcus faecalis V583 in its amino acid sequence. Saccharide having 30.4% identity with the 220 amino acid residues in the protein, and encoded by the gene of Lactobacillus-Derbrutski Subspis bulgaricus ATGG11842 gene number Ld b0178 It has 29.9% identity in the 224 amino acid residue portion with the transferase protein.
  • a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 106 is a protein that is a glycosyltransferase encoded by the gene of LBA1283 gene number LBA1283 in the amino acid sequence. 5 3. 2 ⁇ 1 ⁇ 2 identity, and Lactococcus lacteis IL1403 strain ⁇ ⁇ It has 53.1% identity with the protein that is glycosyltransferase encoded by the ⁇ gene.
  • a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 108 is a protein encoded by the ⁇ gene involved in the extracellular polysaccharide synthesis of Lactobacillus johnsonii NGG533 in the amino acid sequence.
  • the 295 amino acid residue has 18.3 ⁇ 1 ⁇ 2 identity, and is encoded by a gene involved in exopolysaccharide synthesis of Lactococcus lactis subspiris cremoris H02 strain 8.3 amino acid residues in the region of 344 amino acid residues.
  • the gene of the present invention preferably includes a gene comprising a polynucleotide selected from the following (d) to (f).
  • DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be obtained from macrophages and / or immunocompetent cells if it exists in Lactobacillus casei YIT 9029. It has an inhibitory effect on the production of TNF-, IL-6, 11_-10 and 11_-12.
  • the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (named as eI gene) is present from macrophages and / or immunocompetent cells when present in Lactobacillus casei YIT 9029. Inhibits the production of TNF-, IL-6, 11_-10 and 11_-12.
  • the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 (named as e ⁇ l gene) is macrophage and / or immunocompetent cell if it exists in Lactobacillus casei YIT 9029. It has an inhibitory effect on the production of TNF-, IL-6, IL-10 and IL-12.
  • the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 (named as e ⁇ gene) is present from macrophages and / or immunocompetent cells when present in Lactobacillus casei YIT 9029. It has an inhibitory effect on the production of TNF-, IL-6, IL-10 and IL-12.
  • the DNA gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 is designated as TNF-DNA from macrophages and / or immunocompetent cells. , IL-6, IL-12 production has an inhibitory effect.
  • the DNA sequence consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 (named s £ gene) is macrophage and / or immunocompetent cell if it exists in Lactobacillus casei YIT 9029. It has an inhibitory effect on the production of TNF-, IL-6, and IL-12.
  • the DNA NA (named as s ⁇ gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 is macrofuzzy and / or immune responsible if it is present in Lactobacillus casei YIT 9029 It has an inhibitory effect on the production of TNF-s, IL-6, and IL-12 by cellular force.
  • the DNA NA (named ee Li gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 is macrofuzzy and / or immunity responsible if it exists in Lactobacillus casei YIT 9029 It has an inhibitory effect on the production of TNF-s, IL-6, IL-10 and IL-12 by cellular force.
  • DNA NA (named 2 ⁇ 2 ⁇ gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 81 is macrofuzzy and / or immunity responsible if it exists in Lactobacillus casei YIT 9029 It has the effect of suppressing IL-10 production without altering TNF production from cellular force.
  • DNA NA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 83 (named as 2 ⁇ gene) is present from macrophages and / or immunocompetent cells when present in Lactobacillus casei YIT 9029. It enhances the production of TNF-s and suppresses IL-10 production.
  • DNA NA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 85 (named as 2 ⁇ gene) is present from macrophages and / or immunocompetent cells when present in Lactobacillus casei YIT 9029. Has the effect of suppressing the production of TNF- and IL-10.
  • the DNA gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 87 is named as follows. If it is present in Lactobacillus casei YIT 9029, TNF-DNA from macrophages and / or immunocompetent cells is used. Has the effect of enhancing production and suppressing IL-10 production.
  • DNA NA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 89 (named as £ ⁇ £ ⁇ gene) is macrophage and / or immunity if it exists in Lactobacillus casei YIT 9029. It has the effect of enhancing TNF- production from the responsible cells and suppressing IL-10 production.
  • DNA NA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 91 (named £ ⁇ ££ gene) is present in Lactobacillus casei YIT 9029, macrophage and / or It has the effect of suppressing TNF- and IL-10 production from immunocompetent cells.
  • DNA NA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 93 (named as 2 ⁇ 2 ⁇ gene) is macrophage and / or immunocompetent cell if it exists in Lactobacillus casei YIT 9029 Has the effect of inhibiting TNF- and IL-10 production from
  • DNA NA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 95 (named as 2 ⁇ gene), when present in Lactobacillus casei YIT 9029, from macrophages and / or immunocompetent cells. Has the effect of suppressing the production of TNF- and IL-10.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 97 (named as 2 ⁇ gene) is present from Lactobacillus casei YIT 9029 if it is present from macrophages and / or immunocompetent cells. Has the effect of inhibiting TNF- and IL-10 production.
  • DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 99 (named as 2 ⁇ gene) is present from Lactobacillus casei YIT 9029 if it is present from macrophages and / or immunocompetent cells. Has the effect of inhibiting TNF- and IL-10 production.
  • DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 101 (gene of LGS0838) is present in Lactobacillus casei YIT 9029 from macrophages and / or immunocompetent cells. It suppresses the production of TNF- and IL-10.
  • the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 103 (the gene having the gene number L £ mil) is a macrophage and / or immunocompetent cell if it exists in Lactobacillus casei 9029 It has the effect of suppressing IL-10 production without altering the production of TNF- from.
  • D ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (gene of gene number L £ m2S) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 105 is a macrophage and / or immunity if it exists in Lactobacillus casei YIT 9029 It has the effect of suppressing IL-10 production without altering the production of TNF-s from the responsible cells.
  • DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 107 (gene of gene No. LGS1890) is present in Lactobacillus casei YIT 9029 from macrophages and / or immunocompetent cells. It has the effect of suppressing TNF- and IL-10 production.
  • “under stringent conditions” includes, for example, the conditions described in Molecular cloning—a Laboratory manual 2nd edition (Sambrookb, 1989).
  • 6 XS SC composition of 1 XS SC: 0.15M sodium chloride, 0.01 5M sodium quenate, pH 7.0 ), 0.5% S DS, 5 X Denhart and 10 Omg / ml L-dicin sperm DNA in a solution containing a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence at 65 ° C, 8 to 1
  • the conditions include a constant temperature for 6 hours and hybridization.
  • the base sequence having an identity of 90 ⁇ 1 ⁇ 2 or more with the base sequence of (d) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 1 3, 1, 5, 81, 83 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, and 107, when the corresponding sequences are properly aligned, It means a base sequence having 90 ⁇ 1 ⁇ 2 or more, more preferably 95% or more identity.
  • the gene of the present invention has SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 1 3, 1 5, 8
  • Lactobacillus casei YIT 9029 It can be easily obtained by the conventional PGR method using DNA as a template.
  • an oligonucleotide A consisting of a sequence containing the N-terminal initiation codon of any gene and an oligonucleotide B consisting of a sequence complementary to the sequence containing the terminal codon of the gene are chemically synthesized
  • These oligonucleotides A and B can be obtained as a set, and PGR reaction can be performed using Lactobacillus casei YIT 9029 DNA as a template.
  • a sequence for cleaving a restriction enzyme can be added to the 5 ′ end of the oligonucleotide primer. .
  • nucleotides and the like chemically synthesized based on information on the base sequence of the gene of the present invention can be generally used, but the gene of the present invention already obtained and fragments thereof can also be used well. it can.
  • the nucleotide includes a partial nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 and the like, and includes 10 to 50 consecutive bases, preferably 15 to 35 consecutive bases.
  • the PCR conditions are, for example, 9 4 ° C for 2 minutes, (95 ° C for 10 seconds, 52 ° C for 10 seconds, 72 ° C for obtaining DNA fragments of 2000 base pairs in length) C 2 min) x 30 cycles, 7 2 ° C 7 min.
  • the gene of the present invention is a gene involved in the regulation of production of various cytokines, introduction of this gene into a microorganism or modification of the gene possessed by the microorganism allows the The production of force-in can be regulated.
  • the gene of the present invention can be introduced by introducing the gene into a microorganism that does not originally exist, alone or in combination.
  • a method for introducing a gene a combination method using DNA uptake ability, a protoplast PEG method using a protoplast, an electroporation method using a high voltage pulse, etc. may be used, and in particular, the electroporation method is used. preferable.
  • a method utilizing homologous recombination or a site-specific integration method can be used.
  • Modification of the gene of the present invention includes inhibition or suppression of expression of the gene, or enhancement of expression.
  • the gene of the present invention may be destroyed or deleted.
  • This method includes insertion inactivation method in which a completely different DNA fragment is inserted into the gene by stepwise homologous recombination.
  • a stepwise double crossover method in which part or all of the target gene is deleted may be used, and a stepwise double crossover method is particularly preferable.
  • the regions on both sides sandwiching the deletion region are separated from the chromosomal DNA or amplified by the PGR method and separated, for example, PYSSE3
  • PYSSE3 These DNA fragments are cloned in the same orientation as their original orientation in a plasmid vector that can grow in Escherichia coli but cannot replicate in the target microorganism.
  • the obtained recombinant plasmid DNA is subjected to an electroporation method or the like for microorganisms that are to cause deletions.
  • the resulting antibiotic-resistant clone is recombined in the region homologous to the target region upstream or downstream of the target deletion region by the PGR method, etc.
  • Clones lacking the target gene region can be isolated from the clones thus obtained by the PGR method or the like.
  • RNA interference method by synthesizing a short RNA complementary to the 5 'end region of the mRNA of the gene of the present invention, or the expression of the gene
  • a method can be used in which the region to be controlled or the control gene is altered by disruption or deletion, and the region that controls the expression of the gene is particularly preferred.
  • the region to be controlled or the control gene is altered by disruption or deletion, and the region that controls the expression of the gene is particularly preferred.
  • the sequence of a promoter that controls gene transcription the amount of transcription of the gene into mRNA can be increased or decreased.
  • the recombinant plasmid carrying the gene of the present invention is introduced into the target microorganism, and the gene is incorporated into another location of the chromosome by site-specific recombination.
  • the gene is incorporated into another location of the chromosome by site-specific recombination.
  • a method for increasing the copy number of the gene is preferred.
  • a target gene can be cloned into a plasmid having multiple copies per microbial cell, including the original promoter sequence of the gene and the liposome binding site, or another gene.
  • a recombinant plasmid cloned by linking only the region coding for the polypeptide of the gene downstream of the promoter and the ribosome binding site separated from the gene or by chemical synthesis is created, and is then introduced into the microbial cell. By introducing it by an electroporation method or the like, the copy number of the gene in the microorganism cell can be increased.
  • the target microorganism for gene transfer or modification is not particularly limited. Gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, yeast, etc. can be used. Gram-positive bacteria are preferably used. In particular, it is preferable to use Lactobacillus bacteria that have been confirmed to be safe for living organisms.
  • Lactobacillus casei Lactobacillus paracasei
  • Lactobacillus zae Lactobacillus rhamnosussus, etc.
  • Zey can be suitably used.
  • Lactobacillus casei YIT 9018 can be cited Lactobacillus casei YIT 9029.
  • Lactobacillus casei YIT 9029 when a CDS2A gene, e ⁇ gene, or the like is deleted, a variant with altered TNF- or IL-10 production from macrophages can be obtained (Example 4).
  • the thus-introduced or modified microorganisms thus obtained can be used as foods and beverages and pharmaceuticals that exhibit various pharmacological actions depending on the ability to regulate the production of cytokines.
  • foods and beverages and pharmaceuticals that contain microorganisms that promote the production of cytokines that promote Th1-type immune responses include type I allergies, atopic dermatitis, pollen It can be expected to be effective in suppressing infections, bacteria and virus infections, cancer cell proliferation, etc., and conversely, site-power-in (IL-4, IL-5 and IL-10 etc.)
  • Food and beverages and pharmaceuticals that contain microorganisms that suppress inflammation such as inflammatory bowel disease and atherosclerosis, type I diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, polymyositis, Siegren's syndrome
  • Application effects such as suppression of autoimmune diseases such as transplant rejection, collagen disease, multiple sclerosis, and
  • TNF-s produced by macrophages is a site force-in that is widely involved in biological defense mechanisms through inflammation. Since it can activate signal transduction pathways and induce and suppress the expression of various genes, it can be expected to have a multifaceted physiological effect on host defense, homeostasis, development and differentiation.
  • IL-6 produced from macrophages, monocytes, vascular endothelial cells, fibroblasts, and keratinocytes proliferates B cells and plasma cells (plasma cells), and lGG, IgM and IgA antibodies. Effects on T cell differentiation, T cell differentiation and activation, effects on hepatocytes and induction of acute phase proteins such as G-react i ve prote in (CRP) and haptoglobin, in the synovial fluid of rheumatoid arthritis patients It can be expected to play an important role in host defense, acute phase reaction, immune response, and hematopoiesis.
  • CRP G-react i ve prote in
  • haptoglobin haptoglobin
  • IL-12 produced by antigen-presenting cells (macrophages and dendritic cells) and B cells is a strong inducer of IFN-r and is not produced by T cells.
  • IL-12 acts as a bridge between the innate immune system and the acquired immune system, as it has multiple actions such as the ability to differentiate naive helper T cells (ThO cells) into Th1 cells and the action of activating NK and NKT cells. As such, physiological effects can be expected.
  • ThO cells naive helper T cells
  • the microbial cell When the microorganism of the present invention into which a gene is introduced or modified is used as a food or drink or a pharmaceutical product, the microbial cell may be either a live cell or a heated cell (dead cell), or lyophilized. Alternatively, it can be used as a culture containing these microorganisms. In addition, as long as the desired ability to control in-site production is preserved, it is also possible to use a processed bacterial cell product.
  • the microorganism of the present invention can be mixed with a solid or liquid nontoxic pharmaceutical carrier and administered in the form of a conventional pharmaceutical preparation.
  • a solid or liquid nontoxic pharmaceutical carrier such as solid preparations such as tablets, granules, powders and capsules, liquid preparations such as solutions, suspensions and emulsions, and freeze-dried preparations. These preparations can be prepared by conventional means on the preparation.
  • non-toxic pharmaceutical carrier examples include glucose, lactose, sucrose, starch, mannitol, dextrin, fatty acid glyceride, polyethylene glycol, hydroxyethyl starch, ethylene glycol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, amino acid, gelatin, Examples include albumin, water, and physiological saline.
  • conventional additives such as stabilizers, wetting agents, emulsifiers, binders, tonicity agents, excipients and the like can be appropriately added as necessary.
  • the microorganism of the present invention into which a gene has been introduced or modified can be used not only as a preparation as described above but also in a food or drink. When blended in foods and drinks, it may be contained as it is or together with various nutritional components. These foods and drinks can be used as health foods or food materials that exhibit various pharmacological actions according to the ability of each microorganism to regulate cytokine production.
  • additives that can be used as foods and drinks are used as appropriate, and forms suitable for foods using conventional means, that is, It may be formed into granules, granules, tablets, capsules, pastes, etc., and various foods such as processed foods such as ham and sausage, processed fishery products such as kamaboko and chikuwa, bread, confectionery, butter It may be used by adding to powdered milk, or by adding it to beverages such as water, fruit juice, milk, soft drinks and tea drinks.
  • the food and drink includes animal feed.
  • examples of the food and drink include fermented food and drink such as fermented milk, lactic acid bacteria beverage, fermented soy milk, fermented fruit juice, and fermented plant liquid using the microorganism of the present invention.
  • fermented food and drink such as fermented milk, lactic acid bacteria beverage, fermented soy milk, fermented fruit juice, and fermented plant liquid using the microorganism of the present invention.
  • Manufacture of these fermented foods and drinks should just follow a conventional method.
  • the microorganism of the present invention is inoculated and cultured in a sterilized milk medium alone or simultaneously with other microorganisms, and this is homogenized to obtain a fermented milk base.
  • a separately prepared syrup solution is added and mixed, homogenized with a homogenizer or the like, and flavor is added to finish the final product.
  • the product can be in any form such as lane type, soft type, fruit flavor type, solid type,
  • the gene of the present invention can also be used for screening microorganisms having the ability to regulate cytokine production.
  • a microorganism having the ability to regulate cytokine production can be screened.
  • the presence or absence of the gene and / or the expression level thereof is measured by using the probe or primer capable of detecting the gene of the present invention or the mRNA derived from the gene, the presence or absence of the target gene in the microorganism, and the copy number.
  • the expression level can be determined by Southern hybridization method, DNA microarray or RT-PGR method.
  • the target microorganism may be selected according to the presence or absence of the target gene and its expression.
  • the gene of the present invention has PS-PG synthesis and glycosyltransferase functions, it can also be used for purposes such as PS-PG synthesis and screening for microorganisms having PS-PG. It can also be used for the purpose of screening whether or not a bacterium has a sugar chain structure necessary for expressing an immune function or the like, or for the purpose of improving the function by expressing a sugar chain that the bacterium does not originally have.
  • the recombinant vector of the present invention containing the polynucleotide shown in (d) to (f) or a part (fragment) thereof can be selected for introduction of the vector in E. coli and the microorganism of interest. It can be obtained by a known method such as an in vitro ligation method using an arbitrary vector having a gene marker (for example, pHY400, pSA3, pYSSE3, etc.).
  • the host microorganism containing the above recombinant vector may be incorporated into a microorganism chromosome by a known method, that is, when the recombinant vector is introduced into the host microorganism by a method such as an electroporation method. Is obtained by introducing a recombinant vector having a DNA region homologous to the microorganism by the electroporation method or the like, and then confirming the one integrated into the chromosome by homologous recombination by the PGR method or the like. be able to.
  • the DNA array or DNA chip of the present invention containing the polynucleotides (d) to (f) or a part (fragment) thereof is prepared by a known method such as a photolithography method. Can do. By using this DNA array or DNA chip, microorganisms expressing the gene of the present invention can be screened.
  • a recombinant vector containing the polynucleotide of the present invention or a part thereof, or a part of the polynucleotide of the present invention containing the polynucleotide of the present invention or a part thereof, or a part of the polynucleotide of the present invention.
  • nucleic acid fragment such as a primer used
  • nucleotides chemically synthesized based on information on the base sequence of the gene of the present invention can be generally used. 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 1 3, 1 5, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 1 01, 1 03, 1 05 and 1 07
  • a partial nucleotide sequence corresponding to each of the nucleotide sequences shown in the above preferably 10 to 50 consecutive bases, preferably 15 to 35 consecutive bases.
  • Lactobacillus casei YIT 9029 PS-PG synthesis and genes related to glycosyltransferases were compared with known microorganism-derived polysaccharide synthesis genes. We searched from the chromosome based on homology. That is, the Lipman-Person method (Lipman, D.J. and Pearson, W.R.
  • Example 2 Isolation of Lactobacillus casei YIT 9029 Gene Disrupted Strain—1: A mutant strain lacking the gene (CDS1B) described in SEQ ID NO: 3 was prepared as follows.
  • Oligonucleotide 5′-cgggatccgagccaaacat gttgttgct-3 ′ (SEQ ID NO: 17), and a sequence containing restriction enzyme I cleavage site added to the 5 ′ end of the sequence selected from the sequence selected from SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 3 _Aactgcagtgttacgacaacaaccccgtgt_3 ( ⁇ ⁇ ij number 1 8) 3 ⁇ 4: Primer with a sequence containing a restriction enzyme E ⁇ i I cleavage site added to the 5 'end of the sequence selected from the complementary sequence Using the KOD Plus DNA polymerase (T0Y0B0, product number K0D-201), a PGR reaction was performed using the Lactobacillus casei YIT 9029 DNA as a template according to the method attached to this enzyme.
  • the DNA fragment thus amplified is a partial sequence lacking both sides of the amino terminal and the force lpoxyl terminal of the CDS1B gene.
  • Equal volume of tris-di-di-ty-e-one (referred to as 10 mM Tris (pH 8.0) -1 mM EDTA, TE) Saturated phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25: 24: 1)
  • the mixture was stirred well, and then centrifuged at 15,000 xg for 5 minutes to separate into two layers. Collect the upper aqueous layer, add 1/10 volume of 3M sodium carbonate solution (pH 7) and 3 volumes of 99.5% ethanol, and place at _20 ° C for 30 min. At 15,000 xg for 15 minutes.
  • plasmid vector As a plasmid vector, the replication region for Escherichia coli derived from plasmid pUG19 and PYSSE3 (Fig. 1) having the erythromycin resistance gene derived from plasmid pAM; S1 functioning in both E. coli and lactobacillus are used. It was. pYSSE3 DNA 100 1_ H buffer (Takara Bio Inc.) Restriction enzymes I and E ⁇ l in the reaction solution
  • DNA fragment consisting of the above s ⁇ gene internal sequence and the plasmid vector cleaved with the restriction enzyme were mixed in an amount of approximately 0 01 to 0 1 g , respectively, and an equal volume of the DNA ligation kit Ver.2.1 ( (TAKARA BIO INC.) The night was added and incubated at 16 ° C for 30 minutes, then placed on ice.
  • reaction solution 5 1_ was added to JM109 combi- ent cell (manufactured by T0Y0B0) 100 1_ placed in ice after dissolution, and the mixture was lightly mixed and incubated for 30 minutes in ice. The reaction was stopped by exposure to ° C for 30 seconds and returned to ice again. Add 1 mL of S0G medium (T 0Y0B0) to this bacterial solution, incubate at 37 ° C for 1 hour, and then add erythromycin (erythromycin for injection, Dynapot) at a concentration of 500 Ug / mL.
  • S0G medium T 0Y0B0
  • the resulting erythromycin-resistant koguchi 21 was grown in LB medium supplemented with 500 ug / mL erythromycin, and assembled using the Wizard Plus SV Miniprep DNA Purifier System (Promega). Replacement plasmid DNA was extracted.
  • the introduced plasmid is homologous to the eI gene fragment on the recombinant plasmid inside the eI gene of the Lactobacillus casei YIT 9029 chromosome by performing PGR analysis using a primer selected from It was confirmed that the eI gene had been disrupted (broken) by integration into the region.
  • the clone thus obtained was designated as QCDSIB.
  • Cps1A. CDS1D, CPS1 £, CDS1F, CDS1G, and eeLi disrupted strains were isolated by the same method as used for the isolation of ⁇ ⁇ ⁇ , and QCDS1A, ⁇ CDS1D, QCDS1E, QCDS1F, respectively. , QCDS1G, QeeLi. Also, to confirm the impact of the introduction of the Plasmid Vector PYSSE3, Lactobacillus casei YIT 9029 Part of the region that does not contain a valid gene (
  • QCDS2A QCDS2 QCDS3A, QCDS3B, QCDS3G, QLCS0838.
  • Table 2 shows the sequence of PGR primers used to amplify the internal sequence of each gene.
  • Example 3 Isolation of Lactobacillus casei YIT9029 Gene Disrupted Strain _2: A mutant lacking the gene (cps1A) described in SEQ ID NO: 1 was prepared as follows. ee! Oligonucleotide 5 '-atactgca gattggcatgggttttc-3' (SEQ ID NO: 3 3) with a sequence selected from the region around 1 kbp upstream of the A gene and its 5 'terminal fJlcPst I cleavage site !
  • a gene and a sequence having an EcoRI cleavage site at its 5 'end -Gaagaattcaatatgcaggattta-3 '(SEQ ID NO: 3 5) and the sequence from the complementary strand of the sequence selected from the region around 1 kbp downstream of the SE A gene and a sequence with an I-cleavage site at the 5' end are added.
  • This precipitate is 100 1_ H buffer (Takara Bio) in the reaction solution with restriction enzymes I and EI (Takara Bio), and the latter is 100 L M buffer (Takara Bio). (Manufactured by Bio Inc.) After digestion with restriction enzymes I and I (20 hours at 37 ° C) in the reaction solution, the precipitate obtained in the same manner as in Example 2 was vacuum-dried. In addition, a plasmid vector PYSSE3 cleaved with restriction enzymes I and I was prepared in the same manner as in Example 2.
  • the ehrssion reaction was performed by mixing approximately 0.01 to 0.1 ug of each of the above two types of DNA fragments and a plasmid vector cleaved with restriction enzymes I and I.
  • DNA Ligation Kit Ver. 2.1 (Takara Bio Inc.) Incubate for 30 minutes at 16 ° C with the addition of the night, and then place on ice.
  • recombinant plasmid DNA having the target fragment was isolated from colonies resistant to erythromycin by the same method as in Example 2.
  • a portion of the erythromycin-resistant colony is taken, suspended at the end of 50 1 _, treated at 94 ° C for 2.5 minutes, and a portion of this colony is used as a template.
  • PGR analysis was performed using a primer having a sequence selected from a region immediately outside two cloned base sequence regions and a primer having a sequence selected from the region above the plasmid vector.
  • the introduced plasmid is incorporated into the region homologous to the fragment on the recombinant plasmid in the upstream or downstream region of the SEA gene of the Lactobacillus casei YIT 9029 chromosome by the first step of homologous recombination. I confirmed.
  • the cells were grown overnight at 37 ° C and grown, and 0.1% of the cells were transferred to fresh MRS medium and again cultured overnight at 37 ° C for 5 times.
  • the culture broth thus obtained was applied to an MRS agar medium with appropriate dilution so that about 100 to 300 colonies would grow, and cultured at 37 ° C for 2 days.
  • the grown colonies were transferred to 20 g / mL erythromycin-containing MRS agar medium and normal MRS agar medium by a replica method and cultured at 37 ° C for 1 day, but they did not grow on erythromycin-containing agar medium. Colonies that grew only on the agar medium were selected.
  • a portion of the selected colony was taken, suspended in 50 1_ TE, treated at 94 ° C for 2.5 minutes, and a portion of the colony was used as a template and cloned into plasmid.
  • PGR is performed using a primer having a sequence within the region and a primer having a sequence selected from the region between these two regions, there is no DNA to be amplified, and at the same time these two Each selected sequence from the region
  • PGR is performed using two primers, the Lactobacillus force zy YIT 9029's original sequence is expected to be shorter than the size of the deleted DNA, and the DNA will be amplified.
  • the plasmid inserted into the chromosome can undergo a second stage of homologous recombination between the other homologous sequences different from the homologous recombination sites between the homologous sequences used at the time of insertion.
  • the sequence derived from the plasmid disappears, and at the same time, the central part of the ee! A gene is deleted.
  • the clone thus obtained was designated as Aee lA.
  • strains disrupted by deletion of each gene of CPS1C.cps1E.eeLi were isolated and designated ACDS1G and ACDS! E.As ⁇ i, respectively.
  • the sequence of the PGR primer used at this time is shown in Table 3.
  • the same method is used to amplify the optimal upstream and downstream regions of each gene, cloning them into a plasmid vector, introducing the recombinant plasmid into Lactobacillus casei YIT 90 29, By causing the gene deletion by the stepwise double crossover method, it is possible to isolate a mutant strain in which other genes (CDS1B. CDS1D. CDS1 CDS1G) are deleted.
  • pH4611 (Mayum i Kiwaki et a., Bioscience Microflora Vol. 20 (4), 121-129, 20 02) is a shuttle vector plasmid that can be replicated in E. coli and lactic acid bacteria for deletion of the ££ gene. ) was used as the plasmid vector.
  • PH4611 can replicate in lactic acid bacteria, but when cultured without adding erythromycin, the frequency of plasmid shedding is high, so the number of clones that are resistant to erythromycin is significantly reduced after repeated subculture.
  • the clone having erythromycin resistance is a clone in which plasmid is integrated into the chromosome.
  • the plasmid is excised from the chromosome by homologous recombination, and the missing one can be easily selected.
  • the basic operation is non-replication such as PYSSE3. The same as using a type vector.
  • Lactobacillus casei YIT 9029-derived gene deletion mutant 7 insertion-inactivated mutants ( ⁇ £ ⁇ 1 ⁇ , QCDS1B, QCDS1D, QCDS1E, QCDS1F, QCPS! G, QCPSU in Example 2)
  • YIT 9029 / pYSSE3 4 complete deletion mutant strains (Example 3)
  • YIT 9029 was used as a control strain. These 13 strains were cultured overnight in MRS medium (Difco) at 37 ° C, washed with distilled water, collected and treated at 100 ° C for 30 minutes to prepare heated dead cells and freeze-dried did.
  • Freeze-dried cells are suspended in PBS to a final concentration of 1 mg / mL, treated with an autoclave at 121 ° C for 20 minutes, and then RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (manufactured by SIGMA) (below) It was diluted with the culture medium).
  • Macrophages and / or immunocompetent cells were used after excising the spleen from 4 8-15 week old female 8 1_8 / 0 mice (Japan SLG). That is, BALB / c mouse spleen from which fatty fibers and the like were removed in Hank's buffer (HBSS) containing 10 mM HEPES was crushed at the syringe barrel pressing site, and whole cells were collected in 30 mL HBSS. The cell suspension was filtered through a 70-m filter, and then centrifuged (1,500 rpm, 5 minutes, 4 ° C).
  • HBSS Hank's buffer
  • the cells were well dispersed with PORTEX or the like, 8 mL of red blood lysate (2 mL / one spleen) was added, and the mixture was allowed to react at room temperature for 5 minutes. Immediately after the reaction, HBSS was added to make 30 mL and washed with centrifugation. Similarly, after removing the centrifugal supernatant, the cells were well dispersed with PORTEX or the like, and 30 mL of HBSS was added again, followed by centrifugal washing. After removing the centrifugal supernatant again, it was dispersed in 20 mL of the culture solution.
  • QCDSIA enhanced the production of TNF-, IL_12p70, IL-10 and IL-6 in BALB / G mouse spleen cells.
  • ACDSIA enhanced the production of TNF-s, IL-12p70, IL-10 and IL-6 in BAL B / c mouse spleen cells compared to Lactobacillus casei YIT 9029. This means that the ee! A gene is a gene that suppresses the production of TNF-, IL_12p70, IL-10, and IL-6.
  • ⁇ ⁇ enhances production of TNF-, IL-12p70, IL-10 and IL-6 in BALB / G mouse spleen cells compared with Lactobacillus casei YIT 9029 / pYSSE3 I let you go.
  • the s gene is a gene that suppresses TNF-, IL_12p70, IL-10 and IL_6 production.
  • ⁇ ⁇ ⁇ produces TNF-, IL-12p70, IL-10 and IL-6 in BALB / c mouse spleen cells compared to Lactobacillus casei YIT 9029 / pYSSE3 Increased.
  • the s ⁇ gene is a gene that suppresses production of TNF-, IL_12p70, IL-10 and IL-6.
  • ⁇ ⁇ enhanced the production of TNF-s, IL_12p70 and IL-6 in BALB / c mouse spleen cells compared with Lactobacillus casei YIT 9029 / pYSSE3. This means that the gene suppresses TNF-, IL_12p70, and IL-6 production.
  • Lactobacillus casei insertion-inactivated mutant of YIT 9029-derived gene deletion mutant 1 4 strain (Example 2 ⁇ £ ⁇ £ ⁇ , QCDS2 QCDS2D, QCDS2E, QCDS2 QCDS2 G QCDS2H, QCDS3A, QCDS3B, QCDS3 QLGS0838, QLCS111 YQ9029 / pYSSE3 was used as a control strain for KQLGS112 8, QLCS1890).
  • MRS medium Difco
  • mice macrophage RAW264 7 cells were used and cultured in a conventional manner 37 ° C, 5% G0 2 incubator scratch. The cells were collected by centrifugation (1,500 rpm, 5 minutes, 4 ° C.), suspended in a culture solution at 10 6 / mL, and dispensed 100; uL / wel I into a 96-well cell culture plate. After addition murine macrophage RAW264.7 cells were cultured for 24 hours immediately transferred to 37 ° 5% G0 2 incubator beta one C. After incubation, the supernatant was collected, and the TNF-s and IL-10 concentrations in the supernatant were measured by ELISA to determine the mean value and standard deviation.
  • CDS2D is a gene that suppresses TNF- and IL-10 production.
  • ee ⁇ 2E gene is a gene that enhances TNF- and suppresses IL-10 production.
  • QCDS2G enhanced the production of TNF-s and IL-10 in mouse macaque phage RAW264.7 cells. This means that the e ⁇ gene is a gene that suppresses TNF- and IL-10 production.
  • QCDS2H enhanced the production of TNF-s and IL-10 in mouse macaque phage RAW264.7 cells. This means that the gene suppresses TNF- and IL-10 production.
  • QCDS3A enhanced the production of TNF-s and IL-10 in mouse macaque phage RAW264.7 cells. This means that the CDS3A gene is a gene that suppresses TNF- and IL-10 production.
  • QLGS "" enhanced IL-10 production without altering TNF-s in mouse macrophage RAW264.7 cells compared to Lactobacillus casei YIT 9029 / pYSSE3. This means that the gene with gene number LOmil does not change TNF-s and suppresses IL-10 production.
  • QLGS1128 enhanced IL-10 production without altering TNF-s in mouse macrophage RAW264.7 cells, compared to Lactobacillus casei YIT 9029 / pYSSE3. This means that the gene of gene number L £ m2 ⁇ does not change TNF-s and suppresses IL-10 production.
  • QLGS1890 enhanced TNF- and IL-10 production in mouse macaque phage RAW264.7 cells compared to Lactobacillus casei YIT 9029 / pYSSE3. This means that the gene of gene number L ⁇ is a gene that suppresses TNF- and IL-10 production.
  • Example 5 Modification of IL-6 production ability in LPS-stimulated RAW264.7 cells by a cytokine-regulated gene disruption strain:
  • mice macrophage RAW264.7 cells were used and cultured in a conventional manner 37 ° C, 5% G0 2 incubator scratch. Cells were collected by centrifugation (1,500 rpm, 5 minutes, 4 ° C), then suspended at 10 6 / mL with the culture medium described in Example 4, and lOO ⁇ L / wel I each on a 96-well cell culture plate. Dispensed. Next, Lactobacillus casei ATGG 334 (reference strain), Lactobacillus force ZY YIT 9029 prepared in the same manner as in Example 4 alone or from E. coli-derived lipopolysaccharide (LPS; 10; Ug / mL).
  • LPS E. coli-derived lipopolysaccharide
  • QCDS1D, QCDS1E, QCDS1 QCDSIG and QCD added to 37 ° C heat killed cells 5 g / mL with LPS of, 5% G0 2 Incubator was cultured for 24 hours. After completion of the culture, the supernatant was collected, and the amount of IL-6 in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • Lactobacillus casei A modification in which the gene of the present invention was introduced into ATGG 334 Modification of the ability of different strains to regulate cytokine production:
  • a gene The sequence of the region containing the liposome binding site sequence and its 5′-terminal l-cleavage ⁇
  • KOD Plus Perform PGR using DNA polymerase according to the attached method, including CDS!
  • the amplified DNA was treated in the same manner as in Example 2, such as purification, concentration, and restriction enzyme cleavage.
  • the plasmid vector pYAP300 (plasmid that carries the phage FSW ai! E site and the M gene and can be inserted site-specifically into the Lactobacillus casei ail ⁇ site, Fig. 1) is also an example.
  • the digestion with restriction enzyme and the treatment with force-fintestine phosphatase were performed, purified and concentrated.
  • LB agar containing 500 g / mL erythrocyte mycin by mixing the two and binding them so that the genes from CDS1A to CDS1J are inserted downstream of the transcriptional promoter in the vector. It was applied to the medium and cultured at 37 ° C for 2 days. The plasmid was extracted from the obtained colonies, and the desired recombinant plasmid was obtained from its size and the size of the fragment obtained by digestion with restriction enzymes.
  • Lactobacillus casei ATGG 334 is grown in MRS medium, and the culture solution in the logarithmic growth phase is collected by centrifugation at 5,000 xg and 4 ° C for 5 minutes, and then electrophoretic culture is performed according to the method of Example 2.
  • the target Lactobacillus casei ATGG 334 is inserted at the position of the primer having a sequence selected from the region near the site and the end of the cloned CDS1A to CDS1J region is relatively It was confirmed by the PGR method using a primer having a sequence selected from a close region.
  • Lactobacillus casei ATGG 334 with ee! A, QQS IB, CDS1G, CDS1D, CDS1E, CDS1F, CDS1 G and CDS1 J genes derived from Lactobacillus casei YIT 9029 thus obtained is ATGG334 CDS1A- J.
  • the cells of this transgenic strain were prepared in the same manner as in Example 4.
  • RAW264.7 cells purchased from ATGG
  • J774.1 cells current RIKEN Bio Resource
  • EXAMPLE 4 Lactobacillus heat-killed bacteria diluted in culture medium according 100 1_ added (final concentration 1 ug / mL), for 24 hours at 37 ° C, 5% G0 2 incubator one inside. Immediately after the culture, the culture supernatant was collected, and the concentrations of TNF-, 11_-10 and 11_-1240 in the supernatant were measured by the 1_ method (FIGS. 9 to 11).
  • Example 7 Lactobacillus casei ⁇ ⁇ 9029 ⁇ £ Mutation of wild-type e ⁇ gene into mutants to modify cytokine production regulation ability:
  • Oligonucleotide 5 '-tcccccgggttgggggaa tctatcg-3' (SEQ ID NO: 5 1) with a sequence containing a Siral cleavage site and the sequence of the complementary strand in the downstream region of the gene and its 5 'Oligonucleotide 5'-aaac tgcagttatattttccatcgataaa-3' (SEQ ID NO: 52) with a sequence containing an I-cleavage site at the end is used as a primer, and Lactobacillus casei YIT 9029 DNA as a template.
  • the e ⁇ gene was amplified by melase.
  • the amplified DNA is purified, concentrated, and digested with restriction enzymes in the same manner as in Example 2.
  • the plasmid vector —PYAP300 which has been subjected to the same restriction enzyme digestion, treatment with calffintestin phosphatase, purification, and concentration, is mixed. Then, bind the e ⁇ l gene downstream of the transcription promoter in the vector, introduce it into E. coli JM109 competent cell, and apply it to LB agar medium containing 500 ug / mL erythromycin. The cells were cultured at 37 ° C for 1 day. The plasmid was extracted from the obtained colonies, and the desired recombinant plasmid was obtained from its size and the size of the fragment obtained by restriction enzyme digestion.
  • Lactobacillus casei YIT 9029 mutant was grown in MRS medium.
  • the culture solution in the logarithmic growth phase was collected by centrifugation at 5,000 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C., and electroporation was performed according to the method of Example 2.
  • the strain thus obtained was designated as ACDS1GZCDS1G strain.
  • the cells of this transgenic strain were prepared in the same manner as in Example 4.
  • Each strain of Lactobacillus casei shown in Fig. 13 was cultured in MRS plate medium, and the grown colonies were suspended in TE and heat-treated at 94 ° C for 3 minutes to obtain a DNA extract.
  • TaKaRa ExTaq manufactured by Takara Bio Inc.
  • PGR was performed under conditions of x30, 72 ° C for 5 minutes, and the presence or absence of amplification products was examined by agarose gel electrophoresis.
  • DNA fragments of the same size as the DNA fragments detected by YIT 9029 were detected from a very limited number of strains as shown in Fig. 13 and at least S ⁇ It was shown to have a gene.

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Description

明 細 書
サイトカイン産生調節遺伝子及びその利用
技術分野
[0001 ] 本発明は、 マクロファージ及び/又は免疫担当細胞からのサイ ト力インの 産生調節に関与する遺伝子、 及びその利用法に関する。
背景技術
[0002] T N F、 インタ一ロイキン類、 インタ一フエロン類等のサイ ト力インは、 免疫系、 血液系、 あるいは炎症反応等の生体防御システムにおいて重要な役 割を演じている細胞情報伝達物質である。
免疫反応は、 サイ トカインの産生を刺激する物質が、 宿主免疫細胞、 特に マクロファージ、 樹状細胞等に発現が見られるトルライクレセプター （T L R ) 等のパターンリコグニシヨンレセプタ一 （P R R ) に認識されて開始さ れ、 マクロファージ、 樹状細胞、 リンパ球等の免疫担当細胞間の直接的ある いは間接的な相互作用により調節されている。
[0003] 通常、 生体は、 細菌やウィルス等の感染、 腫瘍、 細胞障害等に対して、 免 疫応答を活性化することによって対応している。 また、 過剰な免疫応答が惹 起されると、 アトピー性皮膚炎、 気管支喘息、 アレルギー性鼻炎、 アレルギ 一性結膜炎、 食物アレルギー等のアレルギー性疾患や全身性エリテマトーデ ス （S L E ) 、 慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患が起こることも明らかに されている。 従って、 生体内でのサイ トカインの産生をより好ましい状態に 調節することが重要である。
[0004] 近年、 微生物や微生物由来成分を、 サイ トカイン産生調節物質、 いわゆる B RM (生体応答修飾物質） として活用する試みがなされ、 これまでに、 グラム 陽性菌由来の多糖ーグリカン複合体のサイ トカイン産生促進作用 （特許文献 1 ) 、 ラク トバチルス属細菌又はその菌体由来多糖画分のインタ一ロイキン ( I D 一 6産生抑制作用 （特許文献 2 ) 、 乳酸菌菌体の I L一 15産生促進作用 （ 特許文献 3 ) 、 ラク トバチルス■カゼィ等の菌体の I L— 12産生促進作用 （特 許文献 4 ) 、 ラク トバチルス属細菌由来の多糖一ペプチドグリカン複合体の マクロファージ活性化作用 （特許文献 5 ) 、 ラク トバチルス属細菌由来の多 糖一べプチドグリカン複合体の腫瘍細胞障害性因子誘起作用 （特許文献 6 ) 等が報告されている。
[0005] このうち、 ラク トバチルス■カゼィ Y I T 9018 (FERM BP- 665) ゃラク ト バチルス .カゼィ Y I T 9029 (FERM BP- 1366) のサイ ト力イン産生調節作用 については、 その活性本体は、 細胞壁成分である多糖—ペプチドグリカン複 合体 （PS— PG) であることが明らかにされている （特許文献 2 ) 。 しかしな がら、 遺伝子レベルでの解明はなされていない。
[0006] 一方、 微生物のサイ ト力イン産生調節能を遺伝子レベルで改変する試みと して、 リステリア溶血素であるリステリオリジン 0遺伝子をラク トバチルス■ カゼィ ATGG 393に導入すること （特許文献 7 ) が報告されているが、 安全性 や有効性の面で問題があり、 実用化には至っていない。 さらに、 乳酸菌が菌 体外に産生するェキソポリサッカライ ドの生合成に関与する遺伝子について も報告されているが （特許文献 8 ) 、 このェキソポリサッカライ ドは食品の 増粘ゃクリーム化の目的のために使用することを目的としており、 上記の PS _ PGに含まれる多糖とは構造が異なるものである。
特許文献 1 ：特開平 8 _ 9 2 1 1 2号公報
特許文献 2：特開 2 0 0 3 _ 7 3 2 8 6号公報
特許文献 3：特開 2 0 0 2 _ 2 4 1 2 9 2号公報
特許文献 4：特開平 1 0— 1 3 9 6 7 4号公報
特許文献 5：特公平 6— 9 9 3 1 4号公報
特許文献 6：特開昭 6 3— 1 9 6 5 2 1号公報
特許文献 7：特開 2 0 0 3 _ 6 3 9 9 1号公報
特許文献 8：特開平 9 _ 2 6 9号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、 マクロファージ及び/又は免疫担当細胞からのサイ ト力インの 産生調節に関与する遺伝子及びその利用法を提供することに関する。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029のゲノム情報を検討した 結果、 多糖一ペプチドグリカン複合体 （PS— PG) の多糖成分の合成に関与す る遺伝子群の中に、 種々のサイ トカインの産生調節に関与する遺伝子があり 、 該遺伝子を利用することにより、 微生物における種々のサイ トカインの産 生を調節できることを見出した。
[0009] すなわち、 本発明は以下の発明に係るものである。
1 ) 以下の （a) 〜 （c) から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子
( a ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 82、 84、 86、 88、 90、 92、 94、 96、 98、 1 00、 1 02、 1 04、 1 06及び 1 08に示すいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
( b ) ( a ) のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 且つサイ トカイン産生調節 能を有するタンパク質
( c ) ( a ) のァミノ酸配列と 90 %以上の同一性を有するアミノ酸配列 からなり、 且つサイ トカイン産生調節能を有するタンパク質
2) 以下の （d) 〜 （ f ) から選ばれるポリヌクレオチドからなる遺伝子
( d ) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 8 1、 83、 8 5、 87、 89、 9 1、 93、 95、 97、 99、 1 0 1、 1 03、 1 05 及び 1 07に示すいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(e) (d) の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 且つサイ トカイン産生調節 能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
( f ) (d) の塩基配列と 90 <½以上の同一性を有する塩基配列からなり 、 且つサイ トカイン産生調節能を有するタンパク質をコードするポリヌクレ ォチド
3) 上記遺伝子を微生物に導入するか又は微生物が有する当該遺伝子を改変 することを特徴とする微生物のサイ トカイン産生調節方法
4) 上記遺伝子が導入又は改変されてなる微生物
5) 上記微生物を含有する飲食品
6) 上記微生物を含有する医薬品
7 ) 上記遺伝子の有無及び/又はその発現量を測定することを特徴とするサ ィ トカイン産生調節能を有する微生物のスクリーニング方法
8) 上記ポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター
9) 上記組換えベクターを含む宿主微生物
1 0) 上記ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダィズする核酸断片
1 1 ) 上記ポリヌクレオチド又はその一部を含む DNAアレイ又は DNAチップ 発明の効果
[0010] 本発明の遺伝子又はポリヌクレオチド若しくはその断片を利用することに より、 微生物によるマクロファージ及び/又は免疫担当細胞からのサイ トカ イン産生調節能を自在に変化させたり、 所望のサイ トカイン産生調節能を有 する微生物をスクリーニングすることができる。
また、 本発明の遺伝子が導入又は改変された微生物を用いることにより、 所望のサイ トカイン産生調節能を有する飲食品、 医薬品の製造が可能となる 図面の簡単な説明
[0011] [図 1]pYSSE3、 PYAP300の図である。
[図 2]BALB/cマウス脾臓細胞におけるラク トバチルス■カゼィ YIT 9029遺伝 子破壊株の TNF-ひ誘導能を示す図である （菌体添加量は 3 g/mL) 。
[図 3]BALB/cマウス脾臓細胞におけるラク トバチルス■カゼィ YIT 9029遺伝 子破壊株の IL-12p70誘導能を示す図である （菌体添加量は 。
[図 4]BALB/cマウス脾臓細胞におけるラク トバチルス■カゼィ YIT 9029遺伝 子破壊株の IL-10誘導能を示す図である （菌体添加量は 。
[図 5]BALB/cマウス脾臓細胞におけるラク トバチルス■カゼィ YIT 9029遺伝 子破壊株の IL-6誘導能を示す図である （菌体添加量は 3 g/mL) 。 [図 6]マウスマクロファージ RAW264.7細胞における TNF-ひ誘導能を示す図であ る (菌体添加量は 25 g/mL) 。
[図 7]マウスマクロファージ RAW264.7細胞における IL-10誘導能を示す図であ る (菌体添加量は 25 gZmL) 。
[図 8]LPSで刺激したマウスマクロファージ RAW264.7細胞における I L-6産生誘 導抑制活性を示す図である （菌体添加量は 。
[図 9]マウスマクロファージ RAW264.7細胞における TNF-ひ誘導能を示す図であ る （菌体添加量は 1 g/mL) 。
[図 10]マウスマクロファージ RAW264.7細胞における - 10誘導能を示す図であ る （菌体添加量は 1 g/mL) 。
[図 11]マウスマクロファージ J774.1細胞における IL_12p40誘導能を示す図で ある （菌体添加量は 1 g/mL) 。
[図 12]マウスマクロファージ RAW264.7細胞における TNF-ひと IL-10誘導能、 及 び J774.1細胞における IL-12p40誘導能を示す図である （菌体添加量は 25 mL) 。
[図 13]ラク トバチルス■カゼィの各菌株における s ^遺伝子の検出を示す図 である。 各レーンの菌株名は、 1, YIT 9029 ;2, YIT 0180；3, YIT 0005 ;4, YIT 0006 ;5, YIT 0009 ;6, YIT 0123；7, YIT 0128；8, YIT 000 3；9, YIT 0007:10, YIT 0010:11, YIT 0015:12, YIT 0038 ;13, YIT
0047；14, YIT 0171 ;15, YIT 0209 ;16, YIT 0226 ;17, YIT 0262； 18 , YIT 0289；19, YIT 0290 ;20, YIT 0295 ;21, YIT 0322 ;22, YIT 0 393 ;23, YIT 10029である。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、 アミノ酸配列および塩基配列の相同性 （同一性） は、 遺伝情報処理ソフ トゥヱァ GENETYX (ゼネ亍イツクス社製） を用いた Lipman- P erson法 (Lipman, D. J. and Pearson, W. R. 1985. Rapid and sens itive protein similarity searches. Science227: 1435-1441)によるホ モロジ一解析 （Search homology) プログラムを用いることが出来る。 具体 的には、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029の PS— PG合成に関与する遺伝子を 既知の多糖合成遺伝子と相同性比較して解析することにより算出したもので あり、 パラメ一タ一としては、 Unit Size to compare=2, Pick up Lo cation=5とし、 結果を％表示させて行う。
[0013] また、 遺伝子とは、 2本鎖 D N Aのみならず、 それを構成するセンス鎖お よびアンチセンス鎖といった各 1本鎖 D N Aを包含する趣旨であり、 またそ の長さに何ら制限されるものではない。 また、 ポリヌクレオチドとしては、 RNA、 DN Aを例示でき、 DNAは、 c DNA、 ゲノム DNA、 合成 DN Aを包含する。
[0014] 本発明の遺伝子は、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029から見出され、 CDS1 A CPS!BV CPSIC CDS1D、 CDS1E、 CDS1F、 CDS1G、 CDS1 J、 CDS 2 A、 CDS2G、 CQ. s2D. CDS2E. CDS2 CDS2G. CDS2H. CDS3A、 CDS3B及び CDS3Gと命名された遣 伝子、 及び遺伝子番号 L£Sm、 LCS111 K LCS1128及び LGS1890の遺伝子、 並 びに当該遺伝子から演繹される遺伝子であり、 マクロファージ及び/又は免 疫担当細胞からのサイ トカイン産生を促進又は抑制する機能を有するタンパ ク質をコードするものである。 これら遺伝子と既存のデータベース上に登録 されている遺伝子とのホモロジ一検索を行った結果、 90%以上の配列同一 性を有するポリヌクレオチドは見出されず、 これらはいずれも新規な遺伝子 である。
[0015] 本発明の遺伝子は、 具体的には、 以下の （a) 〜 （c) から選ばれるタン パク質をコードする遺伝子である。
( a ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 82、 84、 86、 88、 90、 92、 94、 96、 98、 1 00、 1 02、 1 04、 1 06及び 1 08に示すいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
( b ) ( a ) のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 且つサイ トカイン産生調節 能を有するタンパク質
( c ) ( a ) のァミノ酸配列と 90 %以上の同一性を有するアミノ酸配列 からなり、 且つサイ トカイン産生調節能を有するタンパク質
[0016] ここで、 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 82、 84 、 86、 88、 90、 92、 94、 96、 98、 1 00、 1 02、 1 04、 1 06及び 1 08に示すいずれかのアミノ酸配列において、 1若しくは 2以 上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、 1若しく は数個、 好ましくは 1〜1 0個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加された ァミノ酸配列が含まれ、 付加には、 両末端への 1〜数個のァミノ酸の付加が 含まれる。
[0017] アミノ酸の欠失、 置換、 付加は、 例えば、 配列番号 2等に示すアミノ酸配 列からなるタンパク質が 1塩基置換等の天然に生じる変異や、 部位特異的変 異導入法や突然変異処理等によって遺伝子に人為的に導入される変異等によ り生じ得るものが包含される。 斯かるアミノ酸の欠失、 置換もしくは付加を 人為的に行う場合の手法としては、 例えば、 配列番号 2等で示されるァミノ 酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して慣用の部位 特異的変異導入を施し、 その後このポリヌクレオチドを常法により発現させ る手法が挙げられる。
また、 アミノ酸の置換としては、 例えば、 疎水性、 電荷、 p K、 立体構造 上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換を挙げることが できる。
[0018] また、 （a) のアミノ酸配列と 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列 としては、 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 82、 84 、 86、 88、 90、 92、 94、 96、 98、 1 00、 1 02、 1 04、 1 06及び 1 08に示すそれぞれのアミノ酸配列において相当する配列を適 切にァライメントした時、 当該アミノ酸配列と 900/0以上、 より好ましくは 95 %以上の同一性を有するァミノ酸配列を意味する。
[0019] 「サイ ト力イン産生調節能」 とは、 マクロファージ及び/又は免疫担当細 胞からの個々のサイ トカインの産生を促進又は抑制することを意味し、 一つ の遺伝子が異なるサイ トカインの産生の促進又は抑制作用を有する場合も包 含される。
[0020] ここで、 サイ ト力インとしては、 特に限定されるものではなく、 IFN-ひ、 I FN- S、 I FN- r等のインタ一フエロン類や、 IL_1、 IL_2、 IL_3、 IL_4、 IL-5 、 IL_6、 IL_7、 IL_8、 IL_9、 IL_10、 IL_11、 IL_12、 IL_13、 IL_14、 IL_15、 I L_16、 IL_17、 IL_18、 IL_19、 IL_20、 IL_21、 IL_22、 IL_23、 IL_24、 IL_25、 IL_26、 IL_27、 IL_28、 I L_29等のインタ一ロイキン類や、 TNF-ひ、 TNF_S等 の腫瘍壊死因子類や、 GXGL1、 GXGL2、 GXGL3、 GXGL4、 GXGL5、 GXGL6、 GXGL7、 GXGL8、 GXGL9、 GXGL10、 GXGL11、 CXCL12, GXGL13、 GXGL14、 GXGL15、 CXCL16 、 CCLU GGL2、 GGL3、 GGL4、 GGL5、 GGL6、 GGL7、 GGL8、 GGL9、 GGL10、 CCL11 、 GGL12、 GGL13、 GGL14、 GGL15、 GGL16、 GGL17、 GGL18、 GGL19、 GGL20、 CCL2 1、 CCL22, GGL23、 GGL24、 GGL25、 GGL26、 GGL27、 GGL28、 GL1、 GL2、 GX3Gし M GP、 MIP、 RANTES、 Eotaxi n等のケモカインや、 GM- GSF、 G_GSF、 M-GSF等のコ ロニー刺激因子類や、 EGF、 PDGF、 FGF、 NGF、 VEGF、 TGF、 KGF、 IGF、 SGF、 BD NF、 GNTF、 0SM、 I IGF等の増殖因子類や、 トロンポポェチン （TP0) 、 ステム セルファクタ一 （SGF) 、 白血病阻害因子 （LIF) 、 プロラクチンホルモン、 B MP、 ァクチビン、 レブチン、 アディポネクチン、 プロスタグランジン （PG) 類、 一酸化窒素 （NO) 等を例示することができる。
[0021] また、 免疫担当細胞とは、 免疫応答に関与する細胞を意味し、 特に制限は ないが、 例えばマクロファージ、 樹状細胞、 ランゲルハンス細胞、 単球、 T細 胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 ナチュラルキラー T細胞等の細胞が挙げ られる。
[0022] 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 82、 84、 86、
88、 90、 92、 94、 96、 98、 1 00、 1 02、 1 04、 1 06及 び 1 08に示すいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質と既知のタンパ ク質との相同性 （同一性） を以下に示す。 尚、 同一性検索は、 遺伝情報処理 ソフトウヱァ GENETYXを使用し、 該塩基配列によって規定されるタンパク質の アミノ酸配列と、 公開されている主に乳酸菌のゲノムや DNA断片の塩基配列に より規定されるタンパク質のァミノ酸配列との比較を行なうことにより、 同 —性を有する遺伝子を検索した。 同一性の指標としては、 該アミノ酸配列全 体あるいは一部でもより長い領域での同一性が 20%以上を目安に行なった
[0023] 配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （GpslA) は、 その アミノ酸配列において、 ラク トバチルス■デルブルツキ■サブスピ一シ一ズ ■ ブルガリクス Lfi 5株由来の菌体外多糖合成に関与する^遺伝子にコ一ド されるタンパク質と 37. 5%の同一性、 ラク トコッカス■ラクテイス■サ ブスピーシ一ズ■クレモリス H02株由来の菌体外多糖合成に関与する β 遺伝 子にコードされるタンパク質と 30. 9<½の同一性を持ち、 また、 ラク トバ チルス■ラムノーサス RW—9595M由来の菌体外多糖合成に関与する^遺伝子 にコードされるタンパク質とは 70. 2%の、 ラク トバチルス■ガッセリ ATG C 33323のドラフト配列 （JGI) から予想されるタンパク質とは 40. 6 %の 同一性を有する。
[0024] 配列番号 4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （GpslB) は、 その アミノ酸配列において、 ラク トバチルス■デルブルツキ■サブスピ一シ一ズ ■ ブルガリクス Lfi 5株由来の菌体外多糖合成に関与する^遺伝子にコ一ド されるタンパク質と 46. 4<½の同一性、 ラク トコッカス■ラクテイス■サ ブスピーシ一ズ■クレモリス H02株由来の菌体外多糖合成に関与する^遺伝 子にコードされるタンパク質と 4 1. 70/0の同一性を持ち、 また、 ラク トバ チルス■ラムノーサス RW—9595M由来の菌体外多糖合成に関与する^遺伝子 にコードされるタンパク質とは 85. 8%の同一性、 ラク トバチルス■ァシ ドフィルス NGFM由来の菌体外多糖合成に関与する^遺伝子にコ一ドされる タンパク質とは 40. 6%の同一性を有する。
[0025] 配列番号 6に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （GpslG) は、 その アミノ酸配列において、 ストレプトコッカス 'サ一モフィラス GNRZ1066由来 の多糖合成に関与する I 遺伝子にコ一ドされるタンパク質と 46. 3%の 同一性、 ラク トコッカス■ラクテイス■サブスピ一シ一ズ■ラクテイス IL140 3由来の多糖合成に関与する ι 遺伝子にコ一ドされるタンパク質と 43. 4 %の同一性を有する。
[0026] 配列番号 8に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （GpslD) は、 その アミノ酸配列において、 ストレプトコッカス 'サリバリウス NGFB2393由来の 多糖合成に関与する ^遺伝子にコ一ドされるタンパク質と 43. 5%の同 一性を有する。
[0027] 配列番号 1 0に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （GpslE) は、 そ のアミノ酸配列において、 ラク トコッカス■ラクテイス■サブスピ一シ一ズ
■クレモリス H02株由来の菌体外多糖合成に関与する β 遺伝子にコ一ドされ るタンパク質と 24. 8%の同一性、 ストレプトコッカス■サリバリウス NGF Β2393由来の多糖合成に関与する seal遺伝子にコ一ドされるタンパク質と 22 . 0%の同一性、 ラク トコッカス■ラクテイス■サブスピ一シ _ズ■ラクテ イス IL1403由来の多糖合成に関与する ys 遺伝子にコ一ドされるタンパク質 と 23. 0%の同一性を有する。
[0028] 配列番号 1 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （GpslF) は、 そ のアミノ酸配列において、 20%以上の同一性を示すタンパク質は見出され なかった。
[0029] 配列番号 1 4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （GpslG) は、 そ のアミノ酸配列において、 ラク トバチルス■ プランタルム WGFS1由来の 遺伝子にコードされるタンパク質と 30. 6%の同一性を有し、 また、 部分 的にはストレプトコッカス■サ一モフィラス GNRZ1066由来の菌体外多糖合成 に関与する^遺伝子にコ一ドされるタンパク質と 84アミノ酸残基中 39. 3%の同一性、 ラク トコッカス■ラクテイス■サブスピ一シ一ズ■ラクティ ス IL1403由来のァセチル基転移に関与する 遺伝子にコ一ドされるタンパ ク質と 116アミノ酸残基中 34. 5%の同一性を有する。
[0030] 配列番号 1 6に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （GpslJ) は、 そ のアミノ酸配列において、 ラク トバチルス■デルブルツキ■サブスピ一シ一 ズ■ ブルガリクス Lfi 5由来の菌体外多糖合成に関与する 遺伝子にコ一ド されるタンパク質と 58. 3%の同一性、 ラク トバチルス .ジョンソニ NGG53 3由来の菌体外多糖合成に関与する ^遺伝子にコ一ドされるタンパク質と 4 4. 1 %の同一性、 ラク トバチルス■ラムノ一サス RW-9595M由来の菌体外多 糖合成に関与する Μΐ£遺伝子にコ一ドされるタンパク質と 79. 3%の同一 性、 ラク トバチルス■ァシドフィルス NGFM由来の菌体外多糖合成に関与する E E遺伝子にコードされるタンパク質と 65. 7%の、 ストレプトコッカス - サ一モフィラス FI9186由来の菌体外多糖合成に関与する 遺伝子にコ一ド されるタンパク質と 47. 5%の同一性を有する。 また、 該アミノ酸配列の 約 37%に相当する箇所は、 部分配列のみが知られているラク トバチルス■ パラカゼィ Type-V由来の多糖合成に関与する遺伝子の一部 （遺伝子番号 11596 438) から得られるアミノ酸配列と 96. 7%の同一性を有するが、 その他の 箇所については明らかではない。
[0031] 配列番号 82に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （Gps2A) は、 そ のァミノ酸配列において、 他の微生物等の遺伝子にコードされるタンパク質 のァミノ酸配列との同一性はなかつた。
[0032] 配列番号 84に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （Gps2G) は、 そ のアミノ酸配列において、 ェンテロコッカス■ フエカリス V583株の遺伝子番 号 EF2195の遺伝子にコ一ドされる糖転移酵素とされるタンパク質と 38. 3 %の同一性を持ち、 また、 ストレプトコッカス■ ミュータンス UA159株の菌体 外多糖合成に関与する ^遺伝子にコ一ドされるタンパク質と 34. 7%の 同一性を有する。
[0033] 配列番号 86に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （Gps2D) は、 そ のアミノ酸配列において、 ラク トバチルス■ プランタルム WGFS1株の遺伝子番 号 Ιρ_1763の遺伝子にコ一ドされる糖転移酵素とされるタンパク質と 42. 4 %の同一性を持ち、 また、 ェンテロコッカス■ フヱカリス V583株の遺伝子番 号 EF2181の遺伝子にコ一ドされる糖転移酵素とされるタンパク質のアミノ末 端側 100ァミノ酸残基において 38. 3 %の同一性を有する。
[0034] 配列番号 88に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （Gps2E) は、 そ のアミノ酸配列において、 ラク トバチルス■ァシドフィルス NGFM株の遺伝子 番号 LBA0526の遺伝子にコ一ドされる糖転移酵素とされるタンパク質と 3 5 . 9 %の同一性を持ち、 また、 ラク トバチルス■デルブルツキ■サブスピ一シ —ズ■ ブルガリクス ATGG1 1842株の遺伝子番号 Ldb0454の遺伝子にコ一ドされ る糖転移酵素とされるタンパク質と 3 5 %の同一性を有する。
[0035] 配列番号 9 0に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （Gps2F) は、 そ のアミノ酸配列において、 ラク トバチルス■ プランタルム WGFS1株の遺伝子番 号 l p_3093の遺伝子にコ一ドされるムラミダ一ゼとされるタンパク質と 208ァ ミノ酸残基の部分で 5 1 . 0 %の同一性を持ち、 また、 ェンテロコッカス■ フエ力リス V583株の遺伝子番号 EF21 74の遺伝子にコ一ドされるタンパク質と 3 26ァミノ酸残基の部分で 3 0 . 7 %の同一性を有する。
[0036] 配列番号 9 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （Gps2G) は、 そ のアミノ酸配列において、 ラク トバチルス■ プランタルム WGFS1株の遺伝子番 号 Ι ρ_1231の遺伝子にコ一ドされる繰り返しュニット移送酵素 （リピートュニ ットトランスポ一タ一） とされるタンパク質と 4 5 . 9 %の同一性を持ち、 また、 ラク トバチルス■ァシドフィルス NGFM株の遺伝子番号 LBA1 724の遺伝子 にコードされる繰り返しュニット移送酵素とされるタンパク質と 4 2 . 6 % の同一性を有する。
[0037] 配列番号 9 4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （Gps2H) は、 そ のァミノ酸配列において、 他の微生物等の遺伝子にコードされるタンパク質 のァミノ酸配列との同一性はなかつた。
[0038] 配列番号 9 6に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （Gps3A) は、 そ のアミノ酸配列において、 ラク トバチルス■ プランタルム WGFS1株の遺伝子番 号 Ι ρ_1275の遺伝子にコ一ドされる糖転移酵素とされるタンパク質と 6 6 . 4 %の同一性を持ち、 また、 ラク トバチルス■デルブルツキ■サブスピ _シ_ ズ■ ブルガリクス ATGG1 1842株の遺伝子番号 Ldb1838の遺伝子にコ一ドされる 糖転移酵素とされるタンパク質と 5 5 . 7 <½の同一性を有する。
[0039] 配列番号 9 8に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （Gps3B) は、 そ のアミノ酸配列において、 ラク トバチルス■ プランタルム WGFS1株の遺伝子番 号 I ρ_1276の遺伝子にコ一ドされる糖転移酵素とされるタンパク質と 59. 7 %の同一性を持ち、 また、 ラク トバチルス■デルブルツキ■サブスピ _シ_ ズ■ ブルガリクス ATGG11842株の遺伝子番号 Ldb1837の遺伝子にコ一ドされる 糖転移酵素とされるタンパク質と 54. 1 %の同一性を有する。
[0040] 配列番号 1 00に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 （Gps3G) は、 そのアミノ酸配列において、 ラク トバチルス■ プランタルム WGFS1株の遺伝子 番号 I p J 277の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と 49. 7 <½の同一性を持ち、 また、 ラク トバチルス■デルブルツキ■サブスピ一シ —ズ■ ブルガリクス ATGG11842株の遺伝子番号 Ldb1836の遺伝子にコ一ドされ る糖転移酵素とされるタンパク質と 39. 5%の同一性を有する。
[0041] 配列番号 1 02に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 (LCS0838P) は、 そのアミノ酸配列において、 ラク トバチルス■デルブルツキ■サブスピ _シ_ズ■ ブルガリクス ATGG11842株の遺伝子番号 Ldb1569の遺伝子にコ一ド される多糖輸送タンパク質 （ポリサッカライ ドトランスポートタンパク質） とされるタンパク質と 49. 9%の同一性を持ち、 また、 ラク トバチルス - ァシドフィルス NGFM株の遺伝子番号 LBA1616の遺伝子にコ一ドされる多糖輸送 タンパク質とされるタンパク質と 48. 9%の同一性を有する。
[0042] 配列番号 1 04に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 (LCS1111P) は、 そのアミノ酸配列において、 ェンテロコッカス■ フエカリス V583株の遺 伝子番号 EF2176の遺伝子にコ一ドされる糖転移酵素とされるタンパク質と 220 アミノ酸残基の部分で 30. 4%の同一性を持ち、 また、 ラク トバチルス - デルブルツキ■サブスピ _シ_ズ■ ブルガリクス ATGG11842株の遺伝子番号 Ld b0178の遺伝子にコ一ドされる糖転移酵素とされるタンパク質と 224アミノ酸 残基の部分で 29. 9 %の同一性を有する。
[0043] 配列番号 1 06に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 (LCS1128P) は、 そのアミノ酸配列において、 ラク トバチルス■ァシドフィルス NGFMの遺 伝子番号 LBA1283の遺伝子にコードされる糖転移酵素とされるタンパク質と 5 3. 2<½の同一性を持ち、 また、 ラク トコッカス■ラクテイス IL1403株の^ ^ 丄遺伝子にコ一ドされる糖転移酵素とされるタンパク質と 53. 1 %の同一性 を有する。
[0044] 配列番号 1 08に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質 (LCS1890P) は、 そのアミノ酸配列において、 ラク トバチルス 'ジョンソニイ NGG533株の 菌体外多糖合成に関与する^遺伝子にコ一ドされるタンパク質と 295ァミノ 酸残基の部分で 1 8. 3<½の同一性を持ち、 また、 ラク トコッカス■ラクテ イス■サブスピ一シ一ズ■クレモリス H02株の菌体外多糖合成に関与する 遺伝子にコードされるタンパク質と 344アミノ酸残基の部分で 1 8. 3%の同 一性を有する。
[0045] 本発明の遺伝子は、 好適には、 以下の （d ) 〜 （ f ) から選ばれるポリヌ クレオチドからなる遺伝子が挙げられる。
( d ) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 81、 83、 8 5、 87、 89、 91、 93、 95、 97、 99、 1 01、 1 03、 1 05 及び 1 07に示すいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
( e) (d ) の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 且つサイ トカイン産生調節 能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
( f ) (d) の塩基配列と 90 <½以上の同一性を有する塩基配列からなり 、 且つサイ トカイン産生調節能を有するタンパク質をコードするポリヌクレ ォチド
[0046] 配列番号 1に示す塩基配列からなる D N A (ee !A遺伝子と命名） は、 それ がラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロファ —ジ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ、 IL-6、 11_-10及び11_-12の産生に おいて、 抑制作用を有する。
[0047] 配列番号 3に示す塩基配列からなる D N A (e I遺伝子と命名） は、 それ がラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロファ —ジ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ、 IL-6、 11_-10及び11_-12の産生に おいて、 抑制作用を有する。 [0048] 配列番号 5に示す塩基配列からなる D N A (e ^l伝子と命名） は、 それ がラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロファ —ジ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ、 IL-6、 IL-10及び IL-12の産生に おいて、 抑制作用を有する。
[0049] 配列番号 7に示す塩基配列からなる D N A (e ^遺伝子と命名） は、 それ がラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロファ —ジ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ、 IL-6、 IL-10及び IL-12の産生に おいて、 抑制作用を有する。
[0050] 配列番号 9に示す塩基配列からなる D N A 遺伝子と命名） は、 それ がラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロファ ージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ、 IL-6、 IL-12の産生において抑制 作用を有する。
[0051] 配列番号 1 1に示す塩基配列からなる DN A (s £遺伝子と命名） は、 そ れがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロフ ァージ及び/又は免疫担当細胞力 らの TNF-ひ、 IL- 6、 及び IL- 12の産生におい て、 抑制作用を有する。
[0052] 配列番号 1 3に示す塩基配列力 らなる D NA (s ^遺伝子と命名） は、 そ れがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロフ ァージ及び/又は免疫担当細胞力 らの TNF-ひ、 IL- 6、 及び IL- 12の産生におい て、 抑制作用を有する。
[0053] 配列番号 1 5に示す塩基配列力 らなる D NA (ee Li遺伝子と命名） は、 そ れがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロフ ァージ及び/又は免疫担当細胞力 らの TNF-ひ、 IL- 6、 IL- 10及び IL- 12の産生 において、 抑制作用を有する。
[0054] 配列番号 81に示す塩基配列力 らなる D NA (2β§2Δ遺伝子と命名） は、 そ れがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロフ ァージ及び/又は免疫担当細胞力 らの TNF-ひ産生を変化させず、 IL-10産生を 抑制する作用を有する。 [0055] 配列番号 83に示す塩基配列からなる D NA (2 ^遺伝子と命名） は、 そ れがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロフ ァージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ産生を亢進させ、 IL-10産生を抑 制する作用を有する。
[0056] 配列番号 85に示す塩基配列からなる D NA (2 ^遺伝子と命名） は、 そ れがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロフ ァージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ及び I L-10産生を抑制する作用を 有する。
[0057] 配列番号 87に示す塩基配列からなる DNA 遺伝子と命名） は、 そ れがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロフ ァージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ産生を亢進させ、 IL-10産生を抑 制する作用を有する。
[0058] 配列番号 89に示す塩基配列からなる D NA (£β≤£Ε遺伝子と命名） は、 そ れがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロフ ァージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ産生を亢進させ、 IL-10産生を抑 制する作用を有する。
[0059] 配列番号 9 1に示す塩基配列からなる D NA (£β≤££遺伝子と命名） は、 そ れがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロフ ァージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ及び I L-10産生を抑制する作用を 有する。
[0060] 配列番号 93に示す塩基配列からなる D NA (2β§2Η遺伝子と命名） は、 そ れがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロフ ァージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ及び I L-10産生を抑制する作用を 有する。
[0061 ] 配列番号 95に示す塩基配列からなる D NA (2 ^遺伝子と命名） は、 そ れがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロフ ァージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ及び I L-10産生を抑制する作用を 有する。 [0062] 配列番号 97に示す塩基配列からなる D N A (2 ^遺伝子と命名） は、 そ れがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロフ ァージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ及び IL-10産生を抑制する作用を 有する。
[0063] 配列番号 99に示す塩基配列からなる D N A (2 ^遺伝子と命名） は、 そ れがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては、 マクロフ ァージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ及び IL-10産生を抑制する作用を 有する。
[0064] 配列番号 1 0 1に示す塩基配列からなる D N A (遺伝子番号 LGS0838の遺伝 子） は、 それがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては 、 マクロファージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ及び IL-10産生を抑制 する作用を有する。
[0065] 配列番号 1 03に示す塩基配列からなる D N A (遺伝子番号 L£milの遺伝 子） は、 それがラク トバチルス■カゼィ ΥΙΤ 9029に存在する場合にあっては 、 マクロファージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ産生を変化させず、 I L-10産生を抑制する作用を有する。
[0066] 配列番号 1 05に示す塩基配列からなる D Ν Α (遺伝子番号 L£m2Sの遺伝 子） は、 それがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては 、 マクロファージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ産生を変化させず、 I L-10産生を抑制する作用を有する。
[0067] 配列番号 1 07に示す塩基配列からなる D N A (遺伝子番号 LGS1890の遺伝 子） は、 それがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に存在する場合にあっては 、 マクロファージ及び/又は免疫担当細胞からの TNF-ひ及び IL-10産生を抑制 する作用を有する。
[0068] 本発明において、 「ストリンジェン卜な条件下」 とは、 例えば Molecular cloning ― a Laboratory manual 2nd edition (Sambrookb、 1989)に 記載の条件等が挙げられる。 例えば、 6 XS S C ( 1 XS S Cの組成： 0. 1 5M 塩化ナトリウム、 0. 0 1 5M クェン酸ナトリウム、 p H 7. 0 ) 、 0. 5% S DS、 5 Xデンハート及び 1 0 Om g/m L二シン精子 D N Aを含む溶液に当該塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチ ドとともに 65 °Cで 8〜 1 6時間恒温し、 ハイブリダィズさせる条件が挙げ られる。
[0069] また、 （d) の塩基配列と 90<½以上の同一性を有する塩基配列としては 、 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 81、 83、 85、 8 7、 89、 91、 93、 95、 97、 99、 1 01、 1 03、 1 05及び1 07に示すそれぞれの塩基配列において相当する配列を適切にァライメント した時、 当該塩基配列と 90 <½以上、 より好ましくは 95 %以上の同一性を 有する塩基配列を意味する。
[0070] 本発明の遺伝子は、 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 8
1、 83、 85、 87、 89、 91、 93、 95、 97、 99、 1 01、 1 03、 1 05及び 1 07の配列を参考にプライマ一を作製し、 ラク トバチル ス■カゼィ YIT 9029の DNAをテンプレートとする常法の PGR法で容易に得るこ とができる。
すなわち、 例えば、 いずれかの遺伝子の N末端開始コ ドンを含む配列からな るオリゴヌクレオチド A、 及び該遺伝子の終始コ ドンを含む配列と相補的な配 列からなるオリゴヌクレオチド Bを化学合成し、 これらのオリゴヌクレオチド Aと Bを 1セットにし、 ラク トバチラス .カゼィ YIT 9029の DNAをテンプレー トとして PGR反応を行なうことにより得ることができる。 また、 こうして得ら れる遺伝子断片を効率よくプラスミ ドベクター等にクローニングを行なうた めに、 ォリゴヌクレオチドプライマ一の 5'末端側に制限酵素切断のための配 列を付加して用いることもできる。 ここで、 プライマ一としては、 本発明の 遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等 が一般的に使用できるが、 既に取得された本発明遺伝子やその断片も良好に 利用できる。 当該ヌクレオチドとしては、 配列番号 1等に対応する部分ヌク レオチド配列であって、 1 0〜 50個の連続した塩基、 好ましくは 1 5〜3 5個の連続した塩基等が挙げられる。 また、 P C Rの条件は、 例えば 2000塩基対の長さの DNA断片を得る場合には 、 9 4 °C 2分、 （9 5 °C 1 0秒、 5 2 °〇 1 0秒、 7 2 °C 2分） x 3 0サイクル、 7 2 °C 7分が挙げられる。
[0071 ] また、 その当該塩基配列に従い、 DNA合成機により人工的に合成して得るこ ともできる。
[0072] 本発明の遺伝子は、 種々のサイ トカインの産生調節に関与する遺伝子であ ることから、 これを微生物に導入する、 或いは微生物が有する当該遺伝子を 改変することにより、 当該微生物において、 サイ ト力インの産生を調節する ことができる。
本発明の遺伝子の導入は、 当該遺伝子を、 元来有しない微生物に、 単独或 いは組み合わせて導入することにより行うことができる。 遺伝子を導入する 方法としては DNAの取り込み能を利用したコンビテンス法、 プロ トプラストを 利用したプロ トプラスト PEG法及び高電圧パルスを利用したエレク トロポレー シヨン法等を利用すればよく、 特にエレク トロポレーシヨン法が好ましい。 また、 遺伝子を微生物染色体に組み込む場合には、 相同組換えを利用した方 法、 部位特異的に組み込む方法を用いることができる。
[0073] 本発明の遺伝子の改変には、 当該遺伝子の発現阻害若しくは発現抑制、 又 は発現増強が挙げられる。
遺伝子の発現を阻害するには、 本発明の遺伝子を破壊、 欠損すればよく、 この方法としては、 全く別の DNA断片を遺伝子の内部に挿入する挿入失活法ゃ 段階的な相同組換えによって標的遺伝子の一部又は全部を欠失する段階的二 重交叉法を用いればよく、 特に段階的二重交叉法が好ましい。
具体的には、 標的遺伝子の一部又は全部を欠失する場合には、 欠失領域を はさむ両側の領域を染色体 DNAから分離するか、 あるいは PGR法によって増幅 して分離し、 例えば PYSSE3のような大腸菌では増殖するが対象とする微生物 中では複製が出来ないプラスミ ドベクターにそれら両 DNA断片を本来の向きと 同じ向きに並んだ状態でクロ一ニングする。 次に、 得られる組換えプラスミ ド DNAを、 欠失を起こさせようとする微生物にエレク トロポレーシヨン法等を 用いて導入し、 生じる抗生物質耐性のクローンから、 PGR法等によって目的の 欠失領域の上流又は下流のク口一二ングした領域との相同領域で組換えを起 こしてプラスミ ドが染色体上に挿入したクローンを選択する。 こうして得た クローンを、 抗生物質を含まない培地で継代培養を繰り返すことによって、 プラスミ ドが再び近接して存在する相同領域間の組換えによって染色体から 離脱し、 菌の増殖に伴って消失することによって、 抗生物質耐性をなくした クローンを選択する。 こうして得たクローンから PGR法等によって標的遺伝子 領域を欠失したクローンを分離することができる。
[0074] 遺伝子の発現を抑制するには、 本発明の遺伝子の mRNAの 5 ' 末端領域と相 補的な短い RNAを合成することによる、 いわゆる RNA干渉による方法や、 該遺 伝子の発現を制御する領域又は制御遺伝子を破壊若しくは欠損等して改変す る方法を用いることができ、 特に該遺伝子の発現を制御する領域の改変が好 ましい。 具体的には、 遺伝子の転写を制御するプロモーターの配列を改変す ることによって、 該遺伝子の mRNAへの転写量を多くしたり、 少なくしたりす ることができる。
[0075] 遺伝子の発現を増強するには、 本発明の遺伝子を運ぶ組換えプラスミ ドを 対象とする微生物に導入すること、 該遺伝子を染色体の別の場所に部位特異 的組換えによつて組み込むことによつて微生物内での該遺伝子のコピー数を 増加させること、 該遺伝子の発現を制御する制御領域を改変したり、 制御遺 伝子を改変することによって発現を増加させる方法等によって行えばよいが 、 特に該遺伝子のコピー数を増加させる方法が好ましい。 具体的には、 1個 の微生物細胞あたり複数個のコピー数を持つプラスミ ドに、 対象とする遺伝 子をその遺伝子の本来のプロモータ一配列とリポソーム結合部位を含めてク ローニングするか、 別の遺伝子から分離した、 あるいは化学合成によって作 成したプロモーターとリボソーム結合部位の下流に該遺伝子のポリべプチド をコ一ドする領域だけをつなげてクローニングした組換えプラスミ ドを作成 し、 微生物細胞内にエレク トロポレーシヨン法などによって導入することに よって、 微生物細胞内での該遺伝子のコピー数を上げることができる。 [0076] ここで、 遺伝子導入又は改変の対象となる微生物は、 特に限定されるもの ではなく、 グラム陽性細菌、 グラム陰性細菌、 酵母等を用いることができる 力 グラム陽性細菌を好適に利用することができ、 特に生体への安全性が確 認されているラク トバチルス属細菌等の利用が好ましい。 ラク トバチルス属 細菌の中でも、 ラク トバチルス■カゼィ、 ラク トバチルス■パラカゼィ、 ラ ク トバチルス■ゼァェ、 ラク トバチルス■ラムノ一サス等のラク トバチルス ■カゼィグループに属する細菌の利用が好ましく、 特にラク トバチルス■力 ゼィを好適に利用することができる。 また、 サイ ト力イン産生調節遺伝子を 元来有する微生物としては、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9018ゃラク トバチ ルス■カゼィ YIT 9029が挙げられる。
[0077] 例えば、 ラク トバチルス■カゼィ ATGG 334に、 該遺伝子のオペロン構造や プロモータ一の位置を考慮して、 好ましくは CDS1A CDS1B. CDS1 CDS1D. c
DS1E. CDS1 CDS1 G及び CDS1 J遺伝子をコードする DNA断片をプロモーターの 下流に導入した場合、 マクロファージからの TNF-ひ、 IL-10、 IL-12の産生が 効率的に抑制された改変体を得ることができ （実施例 6) 、 また、 ラク トバ チルス■カゼィ YIT 9029において、 SE A遺伝子等を欠損させると TNF-ひ、 I L-12、 IL-10及び IL-6の産生を促進し、 且つリポポリサッカライ ドの刺激によ るマクロファージからの I L-6産生抑制活性が消失した改変体を得ることがで きる （実施例 4、 5) 。 さらに、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029において 、 CDS2A遺伝子、 e ^遺伝子等を欠損させるとマクロファージからの TNF-ひ 、 IL-10産生が変化した改変体を得ることができる （実施例 4) 。
[0078] 斯くして得られる遺伝子導入又は改変された微生物は、 各々が有するサイ トカイン産生調節能に応じ、 種々の薬理作用を発揮する飲食品や医薬品とし て利用することができる。 例えば、 Th1型の免疫応答を促進するサイ トカイン (IL-2、 11_-12及び ^ 等） の産生を促進する微生物を含有する飲食品や医 薬品は、 I型アレルギー、 アトピー性皮膚炎、 花粉症の抑制等の効果や、 細 菌及びウィルス感染、 がん細胞増殖等を抑制する効果が期待でき、 逆に Th2型 の免疫応答を促進するサイ ト力イン （IL-4、 IL-5及び IL-10等） の産生を促進 する微生物を含有する飲食品や医薬品は、 炎症性腸疾患や粥状動脈硬化の要 因としての炎症等の抑制、 I型糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマト 一デス、 多発性筋炎、 シエーグレン症候群、 移植拒絶反応、 膠原病、 多発性 硬化症、 自己免疫性萎縮性胃炎等の自己免疫疾患を抑制する等の応用効果が 期待できる。
また、 自然免疫系の抗原提示細胞の一つであるマクロファージが産生する T NF-ひは、 炎症を通した生体防御機構に広く関わるサイ ト力インであり、 その 受容体の偏在性や複数のシグナル伝達経路を活性化でき、 様々な遺伝子の発 現を誘導、 抑制できることから、 生体防御、 生体恒常性、 発生、 分化などへ の非常に多面的な生理効果が期待できる。
また、 マクロファージゃ単球、 血管内皮細胞、 繊維芽細胞及びケラチノサ イ トから産生される I L-6は、 B細胞や形質細胞 （プラズマ細胞） を増殖させ 、 l gG、 I gM及び I gA抗体の産生を増強させる作用、 T細胞の分化や活性化、 肝 細胞に作用し G-react i ve prote i n (CRP) やハプトグロビンなどの急性期蛋 白を誘導する作用、 関節リウマチ患者の関節液中に著明に増加するなど、 宿 主防御、 急性相反応、 免疫反応、 造血において重要な役割が期待できる。 また、 抗原提示細胞 （マクロファージゃ樹状細胞） や B細胞によって産生 される I L-12は、 強力な I FN- rの誘導因子であり、 T細胞からは産生されない 。 I L-12はナイーブヘルパー T細胞 (ThO細胞）を Th1細胞に分化させる作用、 N K細胞や N K T細胞を活性化させる作用など複数の作用を及ぼすことから、 自然免疫系と獲得免疫系の橋渡し役として生理効果が期待できる。
[0079] 遺伝子導入又は改変された本発明の微生物を飲食品や医薬品とする場合、 菌体は、 生菌又は加熱菌体 （死菌体） のいずれでもよく、 又凍結乾燥したも のであってもよく、 あるいはこれら微生物を含む培養物として利用すること もできる。 また、 所望のサイ ト力イン産生調節能が保存されている限りは、 菌体処理物を利用することも可能である。
[0080] 医薬品として使用する場合は、 本発明の微生物を固体又は液体の医薬用無 毒性担体と混合して、 慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。 こ のような製剤としては、 例えば、 錠剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤等の固形 剤、 溶液剤、 懸濁剤、 乳剤等の液剤、 凍結乾燥製剤等が挙げられる。 これら の製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。 上記の医薬用無毒 性担体としては、 例えば、 グルコース、 乳糖、 ショ糖、 澱粉、 マンニトール 、 デキストリン、 脂肪酸グリセリ ド、 ポリエチレングリコール、 ヒドロキシ ェチルデンプン、 エチレングリコール、 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪 酸エステル、 アミノ酸、 ゼラチン、 アルブミン、 水、 生理食塩水等が挙げら れる。 また、 必要に応じて、 安定化剤、 湿潤剤、 乳化剤、 結合剤、 等張化剤 、 賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
[0081 ] また、 遺伝子導入又は改変された本発明の微生物は、 上記のような製剤と するだけでなく、 飲食品に配合して使用することもできる。 飲食品に配合す る場合は、 そのまま、 または種々の栄養成分と共に含有せしめればよい。 こ の飲食品は、 各々の微生物が有するサイ トカイン産生調節能に応じ、 種々の 薬理作用を発揮する保健用食品又は食品素材として利用できる。 具体的に本 発明の方法により得られた微生物を飲食品に配合する場合は、 飲食品として 使用可能な添加剤を適宜使用し、 慣用の手段を用いて食用に適した形態、 す なわち、 顆粒状、 粒状、 錠剤、 カプセル、 ペースト等に成形してもよく、 ま た種々の食品、 例えば、 ハム、 ソーセージ等の食肉加工食品、 かまぼこ、 ち くわ等の水産加工食品、 パン、 菓子、 バター、 粉乳に添加して使用したり、 水、 果汁、 牛乳、 清涼飲料、 茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。 な お、 飲食品には、 動物の飼料も含まれる。
[0082] さらに飲食品としては、 本発明の微生物を利用した発酵乳、 乳酸菌飲料、 発酵豆乳、 発酵果汁、 発酵植物液等の発酵飲食品の例が挙げられる。 これら 発酵飲食品の製造は常法に従えばよい。 例えば発酵乳を製造する場合は、 ま ず、 殺菌した乳培地に本発明の微生物を単独又は他の微生物と同時に接種培 養し、 これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。 次いで、 別途調製したシ ロップ溶液を添加混合し、 ホモゲナイザー等で均質化し、 更にフレーバーを 添加して最終製品に仕上げればよい。 このようにして得られる発酵乳は、 プ レーンタイプ、 ソフトタイプ、 フルーツフレーバ一タイプ、 固形状、 液状等 のいずれの形態の製品とすることもできる。
[0083] 本発明の遺伝子は、 サイ トカイン産生調節能を有する微生物のスクリー二 ングのために使用することもできる。
すなわち、 本発明の遺伝子の有無及び/又はその発現量を測定することに より、 サイ トカイン産生調節能を有する微生物をスクリーニングすることが できる。
ここで、 遺伝子の有無及び/又はその発現量の測定は、 本発明の遺伝子や 遺伝子由来の mRNAを検出し得るプローブやプライマ一を用いて、 微生物にお ける標的とする遺伝子の有無、 コピー数や発現量をサザーンハイブリダィゼ —シヨン法や DNAマイクロアレイや RT-PGR法により行うことができる。 そして 、 標的遺伝子やその発現の有無により、 目的の微生物を選択すればよい。
[0084] なお、 本発明の遺伝子は、 PS— PGの合成や糖転移酵素の機能を有している ため、 PS— PGの合成や PS— PGを有する微生物のスクリーニングといった目的 にも利用できる。 また、 細菌が免疫機能等を発現する為に必要な糖鎖構造を 有するか否かのスクリーニングといった目的や、 細菌に本来持たない糖鎖を 発現させて機能改善する目的にも利用できる。
[0085] ( d ) 〜 （ f ) で示されるポリヌクレオチド又はその一部 （断片） を含む 本発明の組換えベクターは、 大腸菌及び対象とする微生物において該べクタ 一の導入を選択できるような遺伝子マーカーを有している任意のベクター （ 例えば、 pHY400、 pSA3、 pYSSE3等） を用いてインビトロライゲ一シヨン法等 の公知の方法により得ることができる。
[0086] また、 上記の組換えベクターを含む宿主微生物は、 公知の方法、 すなわち 、 当該組換えべクタ一を宿主微生物に導入する場合はエレク トロポレーショ ン法等の方法により、 微生物染色体に組み込む場合は該微生物と相同な DNA領 域を持つ組換えべクタ一をエレク トロポレーシヨン法等により導入した後に 相同組換えにより染色体に組み込まれたものを PGR法等によって確認する等の 方法を用いることにより得ることができる。 [0087] また、 （d) 〜 （ f ) で示されるポリヌクレオチド又はその一部 （断片） を含む本発明の DNAアレイ又は DNAチップは、 フォトリソグラフィ一法等の公 知の方法により作製することができる。 この DNAァレイ又は DNAチップを用い ることにより、 本発明の遺伝子を発現する微生物をスクリーニングすること ができる。
[0088] 尚、 上述した微生物の遺伝子導入又は改変や微生物のスクリーニングを効 率よく行うためには、 本発明のポリヌクレオチド又はその一部を含む組換え ベクタ一、 本発明のポリヌクレオチドの一部断片からなる PGR及び RT-PGR用プ ライマ一、 ポリヌクレオチド又はその一部を増幅することができる PGR及び RT -PGR用プライマ一、 ポリヌクレオチド又はその一部からなるハイブリダィゼ —シヨン用の核酸断片を用いることが好ましい。
ここで、 使用されるプライマ一等の核酸断片としては、 本発明の遺伝子の 塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的 に使用できるが、 当該ヌクレオチドとしては、 配列番号 1、 3、 5、 7、 9 、 1 1、 1 3、 1 5、 81、 83、 85、 87、 89、 91、 93、 95、 97、 99、 1 01、 1 03、 1 05及び 1 07に示すそれぞれの塩基配列 に対応する部分ヌクレオチド配列であって、 1 0〜 50個の連続した塩基、 好ましくは 1 5〜35個の連続した塩基が好ましい。
[0089] 以下、 実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明する。
実施例
[0090] 実施例 1 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029の遺伝子解析 （遺伝子の抽出） ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029の PS-PG合成及び糖転移酵素に関連する 遺伝子を、 既知の微生物由来多糖合成遺伝子との相同性等をもとに染色体上 から検索した。 すなわち、 ゼネテイツクス社製 遺伝情報処理ソフトウェア G ENETYXを用いた Lipman-Person法（Lipman, D. J. and Pearson, W. R.
1985. Rapid and sensitive protein simi larity searches. Scien ce 227: 1435-1441)により、 個々の上記遺伝子にコードされるタンパク質の アミノ酸配列を相手として、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029のゲノム配列 から予想されるタンパク質をコードすると思われるオープンリーディングフ レーム （0RF) の全てに対してホモロジ一解析した。 その結果、 数十に上る多 糖合成及び糖転移に関与する可能性がある遺伝子を規定すると考えられる 0RF を抽出した。 これらのうち配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5 、 8 1、 83、 85、 87、 89、 9 1、 93、 95、 97、 99、 1 0 1 、 1 03、 1 05及び 1 07に記載の遺伝子はデータベース上にある既存遺 伝子とのホモ口ジ一検索により新規遺伝子であることを確認した。
実施例 2 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029の遺伝子破壊株の分離— 1 ： 配列番号 3記載の遺伝子 (CDS1B) を欠損する変異株の作成は次のように行 つた。
配列番号 3内部の配列から選択した配列の 5' 末端側に制限酵素 I切 断部位を含む配列を付加したォリゴヌクレオチド 5' -cgggatccgagccaaaacat gttgttgct-3' (配列番号 1 7) 、 及び配列番号 3と相補的な配列から選択し た配列の 5' 末端側に制限酵素 E≤i I切断部位を含む配列を付加したオリゴ ヌクレ才チ卜 5 _aactgcagtgttacgacaacaaccccgt_3 (酉己歹 ij番号 1 8) ¾：プ ライマ一とし、 KOD Plus DNAポリメラ一ゼ （T0Y0B0社製、 製品番号 K0D-201 ) を用いて本酵素に添付の方法に従って、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029 の DNAをテンプレートとして PGR反応を行った。 こうして増幅される DNA断片は CDS1B遺伝子のァミノ末端と力ルポキシル末端の両側を欠いた部分配列である 。 生成物を等量のトリス—ィ一ディ一ティ一ェ一 （10mM Tris(pH 8.0) -1m M EDTA, TEと呼ぶ） 飽和フエノールークロロフオルム一イソアミルアルコ —ル （25 : 24 : 1) と混合し、 よく攪拌した後、 15,000xg 5分の遠心を行つ て、 2層に分離した。 上層の水層を回収し、 その 10分の 1量の 3M炭酸ナトリウ ム溶液 （pH7) と 3倍量の 99. 5%エタノールを加え、 _20°Cに 30分間以上置 いた後に、 4°Cで 15,000xg 15分間の遠心を行った。 上清を捨て、 沈殿物に 7 0%エタノールを加えて洗浄し、 15,000xg 5分間の遠心をした後エタノール を捨て、 沈殿物を真空乾燥した。 [0092] この沈殿物を 100 1_の Hバッファ一 （タカラバイオ社製） 反応液中で制限酵 素 BamH Iと I (タカラバイオ社製） で切断 （37°Cで 20時間） した後、 前 述の TE飽和フヱノ一ル -クロロフォルム-ィソアミルアルコール処理 （溶媒混 合から水層回収まで） を 2回繰り返し、 回収した水層に 10分の 1量の 3M炭酸ナ トリウム溶液 （pH7) と 3倍量の 9 9. 5%エタノールを加え、 _20°Cに 30分間 以上置いた後に、 4°Cで 15, 000xg 15分間の遠心を行った。 上清を捨て、 沈殿 物に 70%エタノールを加えて洗浄し、 15, 000xg 5分間の遠心をした後ェタノ ールを捨て、 沈殿物を真空乾燥した。
[0093] プラスミ ドベクタ一として、 プラスミ ド pUG19に由来する大腸菌用複製領域 と、 大腸菌とラク トバチルスの両方で機能するプラスミ ド pAM;S 1に由来する エリスロマイシン耐性遺伝子を持つ PYSSE3 (図 1 ) を用いた。 pYSSE3 DNAを 100 1_の Hバッファ一 （タカラバイオ社製） 反応液中で制限酵素 Iと E≤l
I (タカラバイオ社製） で切断 （37°Cで 20時間） した後、 10倍濃度の GIPバ ッファー （T0Y0B0社製） 20 1_と水を加えて容量を 200 1_とし、 力一フィンテ スティンフォスファタ一ゼ （T0Y0B0社製） 3 Lを加えて 37°Cで 2時間インキュ ベ一卜した。 その後、 前述の TE飽和フエノール -クロロフオルム -イソアミル アルコール処理とェタノール沈澱処理を行い、 沈殿物を真空乾燥した。
[0094] 上記 s ^遺伝子内部配列からなる DNA断片と制限酵素切断したプラスミ ド ベクタ—をそれぞれおよそ 0 01〜0 1 gずつ混合し、 これに等容量の DNAライ ゲ一シヨンキット Ver.2.1 (タカラバイオ社製） 夜を加えて 16°Cで 30分間ィ ンキュベ一卜した後、 氷中に置いた。
[0095] 次に、 溶解後氷中に置いた JM109コンビテントセル （T0Y0B0社製） 100 1_に 上記反応液 5 1_を加え、 軽く混合して氷中で 30分間インキュベートした後、 4 2°Cに 30秒間さらして反応をとめ、 再び氷中に戻した。 この菌液に S0G培地 （T 0Y0B0社製） を 1mL加え 37°Cで 1時間培養した後にエリスロマイシン （注射用ェ リスロマイシン、 ダイナポット社製） を 500;Ug/mLの濃度で加えた LB寒天培 地 （ 1 L中に 10gバク トトリプトン、 5gバク トイ一ストエキストラク ト、 5g塩 化ナトリウム、 15g寒天を含む） に塗布して、 37°Cでインキュベートした。 [0096] 生成したエリスロマイシン耐性のコ口二一を 500 u g/mLのエリスロマイシ ンを添加した L B培地で生育し、 ウイザ一ドプラス SVミニプレップ DNAピュー リフィケ一シヨンシステム （プロメガ社製） を用いて組換えプラスミ ド DNAを 抽出した。
[0097] ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029への DNA導入には、 該微生物を MRS培地 （ ディフコ社製） に生育し、 対数増殖期にある培養液を 5,000xg 4°Cで 5分間遠 心して集菌し、 菌体を氷冷した 20mM HEPES(pH7.0)と 1 0%グリセロールで それぞれ 1回ずつ洗浄し、 洗浄菌体を （初めの培養液のクレット値） の 1 0%グリセロールに懸濁した。 菌懸濁液 50 1_と組換えプラスミ ド DNA溶液 3 ； uLを混合し、 2國幅のエレク トロポレーシヨン用キュべッ卜に入れ、 ジーン パルサ一 I I (バイオラッド社製） を用いて、 1.5kV, 200Ω、 キャパシタンス 25 Fでエレク トロボレ一シヨンを行った。 この液に MRS培地 1mLを加え、 37°C で 2時間培養後、 エリス口マイシンを 20 g/mLの濃度で加えた MRS寒天培地に 塗布し、 37°Cで 2日又は 3日間インキュベ一トした。
[0098] 生育したエリスロマイシン耐性コロニーの一部をとり、 50 しの丁已に懸濁後 、 94°Cで 2.5分間処理し、 その一部をテンプレートとして用い、 ラク トバチル ス■カゼィ YIT 9029染色体の 遺伝子内にあって、 しかもプラスミ ドに クローニングした CDS1B遺伝子内部の配列にはない配列から選ばれたプライマ —と、 プラスミ ドベクタ一にあって、 クロ一ニングした s ^遺伝子内部断片 の近傍にある配列から選ばれたプライマ一を用いて、 PGR解析を行うことによ り、 導入したプラスミ ドがラク トバチルス■カゼィ YIT 9029染色体の e I 遺伝子内部の組換えプラスミ ド上の e I遺伝子断片と相同な領域に組み込ま れて、 e I遺伝子が分断 （破壊） されていることを確認した。 こうして得た クローンを QCDSIBとした。
[0099] 上記 Ω^ Ιの分離に用いた方法と同様の方法により、 cps1A. CDS1D、 CPS1 £、 CDS1F、 CDS1G、 eeLiの各遺伝子の破壊株を分離し、 それぞれ QCDS1A、 Ω CDS1D、 QCDS1E、 QCDS1F、 QCDS1G、 QeeLiとした。 また、 プラスミ ドべク ター PYSSE3の導入の影響を確認するため、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029 のゲノム配列において有効な遺伝子を含まないと考えられる領域の一部 (
1と略記） を同様に破壊した破壊株を分離し、 Y I T 9029/pYSSE3とした。 この ときに用いた各遺伝子の内部配列増幅用の PGR用プライマーの配列を表 1に示 した。
ほ 1
Figure imgf000031_0001
上記 Qefisl Bの分離に用いた方法と同様の方法により、 eps2A、 CES2C C£S2 D CDS2E、 CDS2F、 CDS2G、 CDS2 CDS3A、 CDS3B及び CDS3Gの各遺伝子、 並び に遺伝子番号 LGS0838、 LCS111 K LGS1128及び LGS1890の各遺伝子の破壊株を 分離し、 それぞれ QCDS2A、 QCPS2C. QCPS2D. QCPS2E. QCPS2F. QCPS2G 、 QCDS2 QCDS3A、 QCDS3B、 QCDS3G、 QLCS0838. QLCS111 K QLGS1128 及び QLGS1890とした。 このときに用いた各遺伝子の内部配列増幅用の PGRプ ライマ一配列を表 2に示した。
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[0103] 実施例 3 ラク トバチルス■カゼィ Y I T 9029の遺伝子破壊株の分離 _ 2 ： 配列番号 1記載の遺伝子 (cps1 A) を欠損する変異株の作成は次のように行 つた。 ee !A遺伝子の上流約 1 kbp近傍の領域から選択した配列とその 5 ' 末端 fJlcPst I切断部位を持つ配列を付加したォリゴヌクレオチド 5' -atactgca gattggcatgggttttc-3' (配列番号 3 3 ) と ee !A遺伝子内部の 5 ' 末端に近い 領域から選択した配列の相補鎖からの配列とその 5 ' 末端側に EcoR I切断部 位を持つ配列を付加したォリゴヌクレオチド 5' -taagaattcagcttcgtattttgg taca-3' (配列番号 3 4 ) を一つのセットとし、 ee !A遺伝子内部の 3 ' 末端 に近い領域から選択した配列とその 5 ' 末端側に EcoR I切断部位を持つ配列 を付加したォリゴヌクレオチド 5' -gaagaattcaatatgcaggattta-3' (配列番 号 3 5 ) と SE A遺伝子の下流約 1 kbp近傍の領域から選択した配列の相補鎖か らの配列とその 5 ' 末端側に I切断部位を持つ配列を付加したオリゴヌ ■7レ才チ卜 ΰ _atatctagattcccccaaccatact_3' (酉己歹 ij番号 3 6 ) を つ一つ のセットとして、 それぞれ KOD P l us DNAポリメラ一ゼ （T0Y0B0社製、 製品 番号 K0D-201 ) を用いて酵素に添付の方法に従って、 ラク トバチラス■カゼィ Y I T 9029の DNAをテンプレートとして PGR反応を行った。 それぞれの生成物は 実施例 2と同様にして TE飽和フエノールークロロフオルム一イソアミルアル コール処理とェタノール沈澱処理を行い、 沈殿物を真空乾燥した。
[0104] この沈殿物を、 前者は 100 1_の Hバッファ一 （タカラバイオ社製） 反応液中 で制限酵素 Iと E I (タカラバイオ社製） で、 後者は 100 Lの Mバッ ファー （タカラバイオ社製） 反応液中で制限酵素 Iと Iで切断 （37 °Cで 20時間） した後、 実施例 2と同様にして得た沈殿物を真空乾燥した。 また、 実施例 2と同様の方法により、 制限酵素 Iと Iで切断した プラスミ ドベクタ一 PYSSE3を調製した。
[0105] ライゲ一シヨン反応は、 上記の 2種類の DNA断片と制限酵素 Iと I で切断したプラスミ ドべクタ一をそれぞれおよそ 0. 01〜0. 1 u gずつ混合し、 これに等量の DNAライゲ一シヨンキット Ver. 2. 1 (タカラバイオ社製） 夜を加 えて 16°Cで 30分間インキュベ一トした後、 氷中に置いた。 次に、 実施例 2と同様の方法により、 エリスロマイシン耐性のコロニーか ら、 目的の断片を有する組換えプラスミ ド DNAを分離した。
こうして生成したプラスミ ドは、 ベクターの制限酵素 I切断部位と I切断部位の間に、 2つの DNA断片が £ I切断部位をはさんで並んで挿入 されていた。
[0106] ラク トバチルス .カゼィ YI T 9029への DNA導入とエリスロマイシン耐性を 獲得したクロ一ンの分離は実施例 2と同様の方法により行った。
エリスロマイシン耐性のコロニーの一部をとり、 50 1_の了 に懸濁後、 94°C で 2. 5分間処理し、 その一部をテンプレートとして用い、 ラク トバチルス■力 ゼィ YI T 9029染色体上にある、 クローン化した 2つの塩基配列領域のすぐ外 側にある領域から選ばれた配列を有するプライマーとプラスミ ドベクタ一上 の領域から選ばれた配列を有するプライマ一を用いて、 PGR解析を行って、 導 入したプラスミ ドが第一段階の相同組換えにより、 ラク トバチルス■カゼィ Y I T 9029染色体の SE A遺伝子の上流域又は下流域の、 組換えプラスミ ド上の 断片と相同な領域に組み込まれていることを確認した。
[0107] 次にこうして得たクローンをエリスロマイシンを含まない MRS培地に植えて
37°Cで一夜培養して増殖し、 その 0. 1%を新鮮な MRS培地に植え継いで再び 37°C で一夜培養する操作を 5回繰り返した。 こうして得た培養液を MRS寒天培地に コロニーが 100〜300個程度が生育するように適宜希釈して塗布し、 37°Cで 2日 間培養した。 生育したコロニーをレプリカ法により、 20 g/mLのエリスロマ イシン入り MRS寒天培地と通常の MRS寒天培地に移し、 37°Cで 1日間培養した後 、 エリスロマイシン入り寒天培地には生育せず、 通常の寒天培地にのみ生育 するコロニーを選択した。
[0108] 選択したコロニーの一部をとり、 50 1_の TEに懸濁後、 94°Cで 2. 5分間処理 し、 その一部をテンプレートとして用い、 プラスミ ドにクロ一ニングした 2 つの領域内の配列を有するプライマーとこれら 2つの領域の間にある領域か ら選択された配列を有するプライマ一を用いて PGRを行った場合には、 増幅さ れる DNAがなく、 また同時にこれら 2つの領域からそれぞれ選択された配列を 有する 2つのプライマ一を用いて PGRを行ったときには、 ラク トバチルス■力 ゼィ YIT 9029の元の配列から予想される大きさの DNAよりも欠失した領域分 だけ短し、 DNAが増幅されることを確認することによって、 染色体に挿入してい たプラスミ ドが、 挿入の時に利用した相同配列間の相同的組換え部位とは異 なるもう一方の相同配列間で第二段階の相同的組換えを起こすことにより、 染色体からプラスミ ドが脱落したものを選択した。 このクローンにおいては
、 プラスミ ドに由来する配列が消失すると同時に、 ee !A遺伝子の中央の部分 が欠失している。 こうして得たクローンを Aee lAとした。
[0109] 上記の方法と同様の方法により、 CPS1C. cps1E. eeLiの各遺伝子の欠失に よる破壊株を分離し、 それぞれ ACDS1G、 ACDS!E. As ^iとした。 このとき に用いた PGR用プライマ一の配列を表 3に示した。 また、 同様の方法により、 遺伝子ごとにその上流域と下流域の最適の領域を増幅し、 プラスミ ドベクタ —へのクロ一ニング、 該組換えプラスミ ドのラク トバチルス■カゼィ YIT 90 29への導入、 段階的二重交叉法による遺伝子の欠失を起こさせることにより 、 その他の遺伝子 (CDS1B. CDS1D. CDS1 CDS1G) の内部が欠失した変異株 を分離することが可能である。 ただし、 £ £遺伝子の欠失のためには大腸菌 及び乳酸菌で複製が可能なシャトルベクタープラスミ ドである pH4611 (Mayum i Kiwaki et aに， Bioscience Microflora Vol.20(4), 121-129, 20 02) をプラスミ ドベクタ一として用いた。 PH4611は乳酸菌において複製が可 能であるが、 エリスロマイシンを加えないで培養すると、 プラスミ ド脱落頻 度が高いために、 継代培養を繰り返した後にはェリス口マイシン耐性を有す るクローンが著しく減少し、 エリスロマイシン耐性を有するクローンはブラ スミ ドが染色体に組み込まれたクローンであることが確認される。 当該クロ ーンを更に継代培養を行なうことにより、 プラスミ ドが染色体から相同組換 えによって切り出され、 脱落したものを容易に選択することができ、 基本的 な操作は PYSSE3のような非複製型ベクターを使う場合と同じである。
[0110] ほ
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施例 4 サイ ト力イン産生調節遺伝子による微生物のサイ ト力イン産生調 節能の改変：
ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029由来遺伝子欠損変異株の挿入失活変異株 7株 （実施例 2の Ω£β 1Α、 QCDS1B、 QCDS1D、 QCDS1E、 QCDS1F、 QCPS!G 、 QCPSU) については、 その対照株として YIT 9029/pYSSE3を、 完全欠失変 異株 4株 （実施例 3) については、 その対照株として YIT 9029を用いた。 こ れら 13株を MRS培地 （ディフコ社製） で、 37°Cで一晩培養し、 蒸留水で洗浄集 菌した後、 100°Cで 30分間処理し加熱死菌体を調製し凍結乾燥した。 凍結乾燥 菌体を終濃度 1 mg/mLとなるように PBSで懸濁し、 121°C 20分オートクレー ブで処理した後、 10%牛胎児血清加 RPM卜 1640培地 （SIGMA社製） （以下培養 液と略） で希釈して使用した。
マクロファージ及び/又は免疫担当細胞は、 8〜15週齢のメスの8 1_8/0マ ウス 4匹 （日本 SLG) から脾臓を摘出して使用した。 すなわち、 10mM HEPES を含むハンクス緩衝液 （HBSS) 中で脂肪繊維等を除去した BALB/cマウス脾臓 を注射筒押部位でつぶし、 30mL HBSSに全細胞を回収した。 この細胞浮遊液 を 70 mフィルターでろ過した後、 遠心洗浄 （1, 500rpm, 5分、 4°C) を行 つた。 遠心上清を除去した後、 ポルテックス等で細胞を良く分散させ、 赤血 球溶血液 8mL (2mL/脾臓 1個） を添加して室温で 5分反応させた。 反応後 、 直ちに HBSSを加えて 30mLとし遠心洗浄した。 同様に、 遠心上清を除去した 後、 ポルテックス等で細胞を良く分散させ、 再度 HBSS 30mLを加えて遠心洗 浄した。 再度、 遠心上清を除去した後、 培養液 20mLに分散させた。 細胞数を 測定した後、 BALB/cマウス脾臓細胞数が 5x10ゾ mLになるように培養液で希釈 し、 96ゥエル細胞培養プレートに 100 L/wel Iずつ分注した （5x105cel Is/we I Ι/200 L) 。
次に、 上述の培養液で希釈した乳酸菌加熱死菌体を 100 L/wel lずつ、 終 濃度 3あるいは 30 g/mLとなるように分注した （各群の n = 3) 。
菌体添加後、 直ちに 37°Cの 5 %G02ィンキュベータ一に移し 24時間培養した 。 培養後上清を回収し、 上清中の TNF-ひ、 IL-12p70、 I L-10及び I L- 6濃度を E USA法で測定し、 平均値と標準偏差を求めた。 [0113] その結果、 次のことが判明した （図 2〜図 5) 。
( 1 ) QCDSIAは、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 BALB /Gマウス脾臓細胞における TNF-ひ、 IL_12p70、 I L-10及び I L_ 6産生を亢進さ せた。 同様に、 ACDSIAは、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029と比して、 BAL B/cマウス脾臓細胞における TNF-ひ、 IL- 12p70、 I L-10及び I L- 6産生を亢進さ せた。 このことは、 ee!A遺伝子は TNF-ひ、 IL_12p70、 IL-10及び IL- 6産生を 抑制する遺伝子であることを意味する。
[0114] (2) Ω≤ ^は、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 BALB /Gマウス脾臓細胞における TNF-ひ、 IL- 12p70、 I L-10及び I L_ 6産生を亢進さ せた。 このことは、 s 遺伝子は TNF-ひ、 IL_12p70、 I L-10及び I L_ 6産生を 抑制する遺伝子であることを意味する。
[0115] (3) ASE^は、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029と比して、 BALB/cマウ ス脾臓細胞における TNF-ひ、 IL_12p70、 I L-10及び I L_ 6産生を亢進させた。 このことは、 遺伝子は TNF-ひ、 IL- 12p70、 I L-10及び I L_ 6産生を抑制す る遺伝子であることを意味する。
[0116] (4) Ω^ ΰは、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 BALB /cマウス脾臓細胞における TNF-ひ、 IL- 12p70、 I L-10及び I L- 6産生を亢進さ せた。 このことは、 s ^遺伝子は TNF-ひ、 IL_12p70、 I L-10及び I L- 6産生を 抑制する遺伝子であることを意味する。
[0117] (5) Ω≤ £は、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 BALB /Gマウス脾臓細胞における TNF-ひ、 IL- 12p70、 I L-10及び I L_ 6産生を亢進さ せた。 同様に、 ACDSIEは、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029と比して、 BAL B/cマウス脾臓細胞における TNF-ひ、 IL-12p70及び I L- 6産生を亢進させた。 このことは、 £ £遺伝子は TNF-ひ、 IL- 12p70及び IL- 6産生を抑制する遺伝 子であることを意味する。
[0118] (6) Ω≤ £は、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 BALB /Gマウス脾臓細胞における TNF-ひ、 IL- 12p70及び IL- 6産生を亢進させた。 こ のことは、 2 S1F遺伝子は TNF-ひ、 IL_12p70及び IL-6産生を抑制する遺伝子 であることを意味する。
[0119] (7) Ω^ ^は、 ラク トバチルス .カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 BALB /cマウス脾臓細胞における TNF-ひ、 IL_12p70及び IL-6産生を亢進させた。 こ のことは、 遺伝子は TNF-ひ、 IL_12p70及び IL-6産生を抑制する遺伝子 であることを意味する。
[0120] (8) Qee Liは、 ラク トバチルス .カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 BALB /cマウス脾臓細胞における TNF-ひ、 IL_12p70、 I L-10及び I L- 6産生を亢進さ せた。 同様に、 AcpslJは、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029と比して、 BAL B/cマウス脾臓細胞における TNF-ひ、 IL_12p70、 I L-10及び I L- 6産生を亢進さ せた。 このことは、 s ii遺伝子は TNF-ひ、 IL_12p70、 I L-10及び I L_ 6産生を 抑制する遺伝子であることを意味する。
[0121] サイ トカイン産生調節遺伝子による微生物のサイ トカイン産生調節能の改変
(2) ：
ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029由来遺伝子欠損変異株の挿入失活変異株 1 4株 （実施例 2の Ω£β≤£Α、 QCDS2 QCDS2D、 QCDS2E、 QCDS2 QCDS2 G QCDS2H、 QCDS3A、 QCDS3B、 QCDS3 QLGS0838、 QLCS111 K QLGS112 8、 QLCS1890) について、 その対照株として YIT 9029/pYSSE3を用いた。 こ れら 1 4株を MRS培地 （ディフコ社製） で、 37°Cで一晩培養し、 蒸留水で洗浄 集菌した後、 100°Cで 30分間処理し加熱死菌体を調製し凍結乾燥した。 凍結乾 燥菌体を終濃度 1 mg/mLとなるように PBSで懸濁し、 121°C、 20分オートクレ ーブで処理した後、 10%牛胎児血清加 RPM卜 1640培地 （SIGMA社製） （以下培 養液と略） で希釈して使用した。 次に、 上述の培養液で希釈した乳酸菌加熱 死菌体を 100 L/wel lずつ、 終濃度 2 5 g/mLとなるように分注した （各群 の n = 3) 。
マウスマクロファージ RAW264. 7細胞 （ATGGから購入） は、 常法通り 37°C、 5 %G02インキュベータ一中で培養して使用した。 遠心分離 （1, 500rpm、 5分 、 4°C) により細胞を回収した後、 培養液で 106/mLに懸濁し、 96ゥヱル細胞 培養用プレートに 100;uL/wel Iずつ分注した。 マウスマクロファージ RAW264.7細胞添加後、 直ちに 37°Cの 5%G02インキュ ベータ一に移し 24時間培養した。 培養後上清を回収し、 上清中の TNF-ひ及び I L-10濃度を ELISA法で測定し、 平均値と標準偏差を求めた。
その結果、 次のことが判明した （図 6〜図 7) 。
( 1 ) QCDS2Aは、 ラク トバチルス .カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マウ スマクロファージ RAW264.7細胞における TNF-ひを変化させず、 IL-10産生を亢 進させた。 このことは、 2£§2Δ遺伝子は TNF-ひを変化させず、 IL-10産生を抑 制する遺伝子であることを意味する。
( 2 ) QCDS2Gは、 ラク トバチルス .カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マウ スマクロファージ RAW264.7細胞における TNF-ひを抑制し、 IL-10産生を亢進さ せた。 このことは、 £β≤££遺伝子は TNF-ひを亢進させ、 IL-10産生を抑制する 遺伝子であることを意味する。
( 3 ) QCDS2Dは、 ラク トバチルス .カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マウ スマク口ファージ RAW264.7細胞における TNF-ひ及び IL-10産生を亢進させた。 このことは、 CDS2D遺伝子は TNF-ひ及び I L-10産生を抑制する遺伝子であるこ とを意味する。
( 4) Ω£β≤££は、 ラク トバチルス .カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マウ スマクロファージ RAW264.7細胞における TNF-ひを抑制し、 IL-10産生を亢進さ せた。 このことは、 遺伝子は TNF-ひを亢進させ、 IL-10産生を抑制する 遺伝子であることを意味する。
(5) QCDS2Fは、 ラク トバチルス .カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マウ スマクロファージ RAW264.7細胞における TNF-ひを抑制し、 IL-10産生を亢進さ せた。 このことは、 ee§2E遺伝子は TNF-ひを亢進させ、 IL-10産生を抑制する 遺伝子であることを意味する。
( 6 ) QCDS2Gは、 ラク トバチルス .カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マウ スマク口ファージ RAW264.7細胞における TNF-ひ及び IL-10産生を亢進させた。 このことは、 e ^遺伝子は TNF-ひ及び I L-10産生を抑制する遺伝子であるこ とを意味する。 ( 7 ) QCDS2Hは、 ラク トバチルス .カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マウ スマク口ファージ RAW264.7細胞における TNF-ひ及び IL-10産生を亢進させた。 このことは、 遺伝子は TNF-ひ及び I L-10産生を抑制する遺伝子であるこ とを意味する。
(8) QCDS3Aは、 ラク トバチルス .カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マウ スマク口ファージ RAW264.7細胞における TNF-ひ及び IL-10産生を亢進させた。 このことは、 CDS3A遺伝子は TNF-ひ及び I L-10産生を抑制する遺伝子であるこ とを意味する。
( 9 ) QCDS3Bは、 ラク トバチルス .カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マウ スマク口ファージ RAW264.7細胞における TNF-ひ及び IL-10産生を亢進させた。 このことは、 CDS3B遺伝子は TNF-ひ及び I L-10産生を抑制する遺伝子であるこ とを意味する。
( 1 0) QCDS3Gは、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マ ウスマク口ファージ RAW264.7細胞における TNF-ひ及び IL-10産生を亢進させた 。 このことは、 遺伝子は TNF-ひ及び IL-10産生を抑制する遺伝子である ことを意味する。
(1 1 ) QLGS0838は、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マウスマク口ファージ RAW264.7細胞における TNF-ひ及び IL-10産生を亢進させ た。 このことは、 遺伝子番号 L£Smの遺伝子は TNF-ひ及び IL-10産生を抑制 する遺伝子であることを意味する。
(1 2) QLGS""は、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マウスマクロファージ RAW264.7細胞における TNF-ひを変化させず、 IL-10産生 を亢進させた。 このことは、 遺伝子番号 LOmilの遺伝子は TNF-ひを変化させ ず、 I L-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。
(1 3) QLGS1128は、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マウスマクロファージ RAW264.7細胞における TNF-ひを変化させず、 IL-10産生 を亢進させた。 このことは、 遺伝子番号 L£m2^の遺伝子は TNF-ひを変化させ ず、 I L-10産生を抑制する遺伝子であることを意味する。 ( 1 4) QLGS1890は、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029/pYSSE3と比して、 マウスマク口ファージ RAW264.7細胞における TNF-ひ及び IL-10産生を亢進させ た。 このことは、 遺伝子番号 L£ ^の遺伝子は TNF-ひ及び IL-10産生を抑制 する遺伝子であることを意味する。
[0123] 実施例 5 LPSで刺激した RAW264.7細胞における IL-6産生能のサイ トカイン産 生調節遺伝子破壊株による改変：
マウスマクロファージ RAW264.7細胞 （ATGGから購入） は、 常法通り 37°C、 5 %G02インキュベータ一中で培養して使用した。 遠心分離 （1,500rpm、 5分 、 4°C) により細胞を回収した後、 実施例 4記載の培養液で 106/mLに懸濁し 、 96ゥヱル細胞培養用プレートに lOO ^L/wel Iずつ分注した。 次に、 大腸菌 由来リポポリサッカライ ド（LPS;10;Ug/mL)を単独で、 又は実施例 4と同様に 調製したラク トバチルス■カゼィ ATGG 334 (基準株） 、 ラク トバチルス■力 ゼィ YIT 9029、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に由来する遺伝子破壊株 QCDS1A、 QCDS1B、 ACDSIC. QCDS1D、 QCDS1E、 QCDS1 QCDSIG及び QCD の加熱死菌体 5 g/mLを LPSと共に添加して 37°C、 5 %G02インキュベータ 一中 24時間培養した。 培養終了後上清を回収し、 培養上清中の IL-6量を ELISA 法で測定した。 LPSを単独で添加した場合の IL-6産生量を基準値とし、 菌体添 加後の IL-6産生抑制率 (%)を算出し、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029株の I L-6産生抑制を 100%として他の株の IL-6産生抑制効果を百分率 （％) で評価 した （図 8) 。
[0124] ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029加熱死菌体を LPSとともに添加したとき は、 LPS単独で刺激した場合と比して IL-6産生は著しく抑制された。 これに対 して、 上記遺伝子破壊株や本発明の遺伝子を持たないラク トバチルス■カゼ ィ ATGG 334を LPSと共に添加したときには、 I L-6の産生は亢進された。 この ことは、 cps!A cps!B CDS1G、 CDS1D、 CDS1E、 CDS1F、 CPS1G¾ t cpsUia-is 子は、 LPS刺激によるマクロファージの I L-6の産生を抑制する遺伝子であるこ とを意味する。
[0125] 実施例 6 ラク トバチルス■カゼィ ATGG 334に本発明の遺伝子を導入した変 異株のサイ トカイン産生調節能の改変：
cps1A (配列番号 1 ) 、 cps1B (配列番号 3) 、 cps!C (配列番号 5) 、 c^si D (配列番号 7) 、 cps1E (配列番号 9) 、 cps1F (配列番号 1 1 ) 、 cps!G ( 配列番号 1 3) 及び CDS 1 J (配列番号 1 5) の 8個の遺伝子を含む領域を取得 する為に、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029株の DNAを錶型に ee !A遺伝子上 流のリポソーム結合部位配列を含む領域の配列とその 5 ' 末端側に l切断 咅 |5位を含む酉己歹 ijをもつォリゴヌクレオチド 5' -taacccgggtggacttgattacacaa gc-3' (配列番号 49) 、 及び ee Li遺伝子下流の領域の相補鎖の配列とその 5 ' 末端側に I切断部位を含む配列を持つォリゴヌクレオチド 5' -taac tgcagacactctttttacactgcg-3' (配列番号 50) のプライマ一セットを用い、 KOD Plus DNAポリメラ一ゼを用いて、 添付の方法に従い PGRを行い、 CDS!A 、 CDS1B. CDS1 CDS1D. CDS1E. CDS1 CDS1G及び CDS1J遣伝子を含わ DNA断 片を増幅した。 増幅した DNAは実施例 2と同様に精製、 濃縮、 制限酵素切断等 の処理を行った。 また、 プラスミ ドベクタ一 pYAP300 (ファージ FSWの ai!Eサ ィ 卜と M遺伝子を運び、 ラク トバチルス■カゼィの ail^サイ 卜に部位特異的 に挿入することができるプラスミ ド、 図 1 ) も実施例 2と同様に制限酵素切 断と力一フィンテスティンフォスファタ一ゼ処理、 精製、 濃縮を施した。 両 者を混合してベクタ一中の転写プロモーターの下流に CDS1Aから CDS1Jまでの 遺伝子が挿入されるように結合し、 大腸菌 JM109コンピテントセルに導入し、 500 g/mLェリス口マイシンを含む LB寒天培地に塗布して、 37°Cで 2日間培養 した。 得られたコロニーからプラスミ ドを抽出し、 その大きさと制限酵素切 断による断片の大きさから目的の組換えプラスミ ドを得た。
次に、 ラク トバチルス■カゼィ ATGG 334を MRS培地に増殖させ、 対数増殖 期にある培養液を 5,000xg、 4°Cで 5分間遠心して集菌し、 実施例 2の方法に従 つてエレク トロボレ一シヨンを行った。 この液に MRS培地 1mLを加え、 37°Cで 2 時間培養後、 エリスロマイシンを 20 g/mLの濃度で加えた MRS寒天培地に塗 布し、 37°Cで 2日又は 3日間インキュベートして、 エリスロマイシン耐性のコ ロニ一を得た。 得られたコロニーの一部をとり、 目的のプラスミ ドが目的の 位置に挿入していることを、 ラク トバチルス■カゼィ ATGG 334染色体上の サイ ト近傍の領域から選択された配列を有するプライマーと、 クロ一ニン グされた CDS1Aから CDS1Jまでの領域の末端に比較的近い領域から選択された 配列を有するプライマ一とを用いて PGR法によって確認した。
[0127] こうして得られたラク トバチルス■カゼィ YIT 9029に由来する ee !A、 QQS IB, CDS1G、 CDS1D、 CDS1E、 CDS1F、 CDS1 G及び CDS1 J遺伝子を持つラク トバチ ルス■カゼィ ATGG 334を ATGG334 CDS1A-Jとした。 この遺伝子導入株の菌体 を実施例 4と同様に調製した。
[0128] RAW264.7細胞 （ATGGから購入） 及び J774.1細胞 （現 RIKEN Bio Resource
Center (旧 RIKEN Gene Bank) から購入） は、 実施例 5と同様に使用した 。 実施例 4記載の培養液で希釈した乳酸菌加熱死菌体を 100 1_加え （終濃度 1 u g/mL) 、 37°C、 5 %G02インキュベータ一中で 24時間培養した。 培養後、 直ちに培養上清を回収して上清中の TNF-ひ、 11_-10及び11_-12 40濃度を已1_ 法で測定した （図 9〜 1 1 ) 。
[0129] ラク トバチルス .カゼィ YIT 9029株の遺伝子を導入した ATGG 334 CDS!A
ii加熱死菌体を 1 ;"gZmL添加した場合の TNF-ひの産生量は、 親株の ATGG 33 4よりも低かった。 このことは、 導入した遺伝子が、 親株である ATGG 334の 免疫調節作用に関し、 TNF-ひの産生を抑制するように変化させたことを意味 する。 また ATGG 334 SE^L zii株の IL-10及び IL-12p40産生に対する効果につ いても、 ATGG 334の示す産生誘導能に対して顕著に誘導活性が低下した。 こ のことは、 ee !Aから ee Liまでの遺伝子の導入が親株 ATGG 334のマクロファ ージ細胞株に対する IL-10及び IL-12p40の産生誘導活性を抑制したことを意味 する。
[0130] 実施例 7 ラク トバチルス■カゼィ ΥΙΤ 9029Δ≤ £変異株への野生型 e ^ 遺伝子導入によるサイ トカイン産生調節能の改変：
e ^遺伝子上流のリポソーム結合部位配列を含む配列とその 5 ' 末端側に
Siral切断部位を含む配列を持つォリゴヌクレオチド 5' -tcccccgggttgggggaa tctatcg-3' (配列番号 5 1 ) と 遺伝子下流の領域の相補鎖の配列とその 5 ' 末端側に I切断部位を含む配列を持つォリゴヌクレオチド 5' -aaac tgcagttatattttccatcgataaa-3' (配列番号 52) をプライマ一とし、 ラク ト バチラス■カゼィ YIT 9029の DNAをテンプレートとして KOD Plus DNAポリ メラ一ゼによって e ^遺伝子を増幅した。 増幅した DNAは実施例 2と同様に 精製、 濃縮、 制限酵素切断等の処理を行い、 同じく制限酵素切断とカーフィ ンテスティンフォスファタ一ゼ処理、 精製、 濃縮を施したプラスミ ドベクタ —PYAP300とを混合して、 ベクタ一中の転写プロモーターの下流に e ^l伝 子が挿入されるように結合し、 大腸菌 JM109コンビテントセルに導入し、 500 ； ug/mLエリスロマイシンを含む LB寒天培地に塗布して、 37°Cで 1 日間培養し た。 得られたコロニーからプラスミ ドを抽出し、 その大きさと制限酵素切断 による断片の大きさから目的の組換えプラスミ ドを得た。
[0131] 次に、 ラク トバチルス .カゼィ YIT 9029 変異株を MRS培地に増殖し
、 対数増殖期にある培養液を 5,000xg、 4°Cで 5分間遠心して集菌し、 実施例 2 の方法に従ってエレク トロポレーシヨンを行った。 この液に MRS培地 1mLを加 え、 37°Cで 2時間培養後、 エリスロマイシンを 20 g/mLの濃度で加えた MRS寒 天培地に塗布し、 37°Cで 2日又は 3日間インキュベートして、 エリスロマイシ ン耐性のコロニーを得た。 得られたコロニーの一部をとり、 目的のプラスミ ドが attBサイ トに揷入していることを、 ラク トバチルス■カゼィ YIT 9029染 色体上の 2ϋβサイ ト近傍の領域から選択された配列を有するプライマーと、 クローニングされた £ ^の領域から選択された配列を有するプライマーとを 用いて PGR法によって確認した。 こうして得られた株を ACDS1GZCDS1G株とし た。 この遺伝子導入株の菌体を実施例 4と同様に調製した。
[0132] 実施例 6と同様に RAW264.7及び J774. 1細胞を用いて、 これに ACDS1GZCDS1 £株菌体を添加して、 サイ トカインの産生を調べたところ、 TNF-ひ、 IL-12p40 及び IL-10のいずれのサイ トカインの産生も Δ^ ^こ比して著しく低下し、 元のラク トバチルス■カゼィ YIT 9029の持つサイ トカイン産生誘導能と同等 、 又はそれよりも更に低下することが観察された （図 1 2) 。 このことは、 への e ^l伝子の再導入が細胞壁多糖の合成を復帰させるが、 異な る位置に導入されたことによって、 その発現量が異なるために、 更に強くサ イ ト力イン産生を抑制するようになったと結論された。
実施例 8
図 1 3に記載のラク トバチルス■カゼィの各菌株を MRS平板培地で培養し、 生育したコロ二一を TEに懸濁し、 94°Cで 3分間熱処理したものを DNA抽出液と した。 これを錶型として、 表 1に記載の 遺伝子内部の配列を増幅するた めのプライマ一を用いて TaKaRa ExTaq (タカラバイオ社製） を用いて、 94°C 2分、 （94°C 10秒、 53°C 10秒、 72°C 1 . 5分） x30、 72°C 5分の条件で P GRを行ない、 増幅産物の有無をァガロースゲル電気泳動によって調べた。 そ の結果、 図 1 3に示すように Y I T 9029で検出される DNA断片と同じ大きさの D NA断片が、 ごく限られた数の菌株からも検出され、 これらの菌株が少なくと も S ^遺伝子を持つことが示された。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の （a) 〜 （c) から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子。
( a ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 82、 84、 86、 88、 90、 92、 94、 96、 98、 1 00、 1 02、 1 04、 1 06及び 1 08に示すいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
( b ) ( a ) のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 且つサイ トカイン産生調節 能を有するタンパク質
( c ) ( a ) のァミノ酸配列と 90 %以上の同一性を有するアミノ酸配列 からなり、 且つサイ トカイン産生調節能を有するタンパク質
[2] 以下の （d) 〜 （ f ) から選ばれるポリヌクレオチドからなる遺伝子。
( d ) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 8 1、 83、 8 5、 87、 89、 9 1、 93、 95、 97、 99、 1 0 1、 1 03、 1 05 及び 1 07に示すいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(e) (d) の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 且つサイ トカイン産生調節 能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
( f ) (d) の塩基配列と 90 <½以上の同一性を有する塩基配列からなり 、 且つサイ トカイン産生調節能を有するタンパク質をコードするポリヌクレ ォチド
[3] 請求項 1又は 2記載の遺伝子を微生物に導入するか又は微生物が有する当 該遺伝子を改変することを特徴とする微生物のサイ トカイン産生調節方法。
[4] 遺伝子の改変が、 請求項 1又は 2記載の遺伝子の発現阻害若しくは抑制、 又は発現増強である請求項 3記載の方法。
[5] 請求項 1又は 2記載の遺伝子が導入又は改変されてなる微生物。
[6] 微生物がグラム陽性細菌である請求項 5記載の微生物。
[7] グラム陽性細菌がラク トバチルス属細菌である請求項 6記載の微生物。
[8] ラク トバチルス属細菌がラク トバチルス■カゼィである請求項 7記載の微 生物。
[9] 請求項 5〜 8のいずれか 1項記載の微生物を含有する飲食品。
[10] 請求項 5〜 8のいずれか 1項記載の微生物を含有する医薬品。
[1 1 ] 請求項 1又は 2記載の遺伝子の有無及び/又はその発現量を測定すること を特徴とするサイ トカイン産生調節能を有する微生物のスクリーニング方法
[12] 請求項 2記載のポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター。
[13] 請求項 1 2記載の組換えベクターを含む宿主微生物。
[14] 請求項 2記載のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする核酸断片
[15] 請求項 2記載のポリヌクレオチド又はその一部を含む DNAアレイ又は DNAチ ップ。
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