TWI472615B - 生產可溶性重組三葉因子胜肽之轉形株及可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法 - Google Patents

Description

生產可溶性重組三葉因子胜肽之轉形株及可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法

本發明是有關於生產三葉因子胜肽之轉形株及三葉因子胜肽之製造方法，特別是有關於一種生產可溶性重組三葉因胜肽之轉形株及可溶性重組三葉因子之製造方法。

現代人因為飲食習慣不正常以及生活壓力大，常導致腸胃發炎潰爛以致最後形成腫瘤，因此腸胃道不適儼然成為現代人的文明病。其中已證實造成胃潰瘍的主要原因是幽門螺旋桿菌，而目前治療胃潰瘍的方法多為服用抗生素或胃乳，但以抗生素和胃乳治療僅能清除幽門螺旋桿菌，無法修復因胃液侵蝕受損的黏膜。

三葉因子胜肽(trefoil factor,TFFs)為哺乳類動物腸胃道本有的黏膜損傷修復因子，具有三環結構(trefoil domain)，由保留性半胱胺酸殘基間之鏈內雙硫鍵所組成，可藉由刺激細胞的移動、抑制細胞自殺和發炎，修復腸胃道上皮組織以保護消化系統，並應用於消化系統損傷之修復。人類三葉因子胜肽共有三類，其中第一型三葉因子胜肽(TFF1)表現於胃，而第二型三葉因子胜肽(TFF2)和第三型三葉因子胜肽(TFF3)則表現於腸道。

先前技術曾採用酵母菌做為重組三葉因子胜肽之表現系統。然而，上述表現系統存在以下問題。首先，酵母菌生長較慢，重組三葉因子胜肽產量較低。其次，所生產之第一型重組三葉因子胜肽，僅於模擬胃酸環境下具有促進傷口癒合之生物活性，於應用層面上受到侷限。

因此，本發明提供一種生產可溶性重組三葉因子胜肽之轉形株及一種可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法。利用乳酸鏈球菌酸誘導系統及本發明之培養方式大量生產可溶性重組三葉因子胜肽，所生產的可溶性重組三葉因子胜肽於pH2.4和pH7.0環境下皆具有促進傷口癒合之生物活性。

本發明之一態樣是在提供一種生產可溶性重組三葉因子胜肽之轉形株，包含：乳酸鏈球菌(Lactococcus lactis ，編號NZ9000)宿主細胞，以及一酸誘導型重組質體。其中酸誘導型重組質體包含依序排列之如序列辨識編號1所示之一酸誘導型啟動子序列、如序列辨識編號2所示之 一第一核酸片段、如序列辨識編號3所示之一第二核酸片、如序列辨識編號4所示之一第三核酸片段及如序列辨識編碼5所示之一第四核酸片段。

根據本發明之一實施例，其中第三核酸片段係編碼如序列辨識編號6所示之重組三葉因子胜肽。

根據本發明之另一實施例，其中可溶性重組三葉因子胜肽係分泌至轉形株之外。

根據本發明之再一實施例，其中可溶性重組三葉因子胜肽具有單體、雙體、三聚體或四聚體之蛋白質複合體。

根據本發明之又一實施例，其中可溶性重組三葉因子胜肽具有促進傷口癒合之活性，且於pH2.4及pH7.0環境下皆具有促進傷口癒合之活性。

藉此，本發明之轉形株可將生產之重組三葉因子胜肽分泌至胞外以得可溶性重組三葉因子胜肽，所生產的可溶性重組三葉因子胜肽具有雙體、三聚體、四聚體之蛋白質複合體，且無論在pH2.4或7.0環境下，均具有細胞傷口癒合活性。

本發明之另一態樣是在提供一種可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法，包含：提供一液態培養物，其中液態培養物包含本發明之轉形株。轉形株培養過程自體分泌有機酸至液態培養物中，當液態培養物之pH值為5.5至6.5時酸誘導型重組質體被啟動誘導，以表現可溶性重組三葉因子胜肽並分泌至轉形株之外。之後去除轉形株，以獲得含有可溶性重組三葉因子胜肽之上清液。最後由上清液中 分離出可溶性重組三葉因子胜肽。

根據本發明之一實施例，其中轉形株培養過程更包含加入20%至40%之氨水維持pH值為6.0-6.5。

根據本發明之另一實施例，其中轉形株培養過程更包含添加30%至50%之乳酸，以及加入20%至40%之氨水維持pH值為6.0至6.5。

根據本發明之再一實施例，其中轉形株培養過程更包含加入20%至40%之氨水維持pH值為6.0至6.5，以及添加新鮮培養液和40%至60%之葡萄糖液。

藉此，本發明可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法，因為其不須添加抗生素及昂貴的誘導劑，在成本考量下非常適合工業化。且本發明之培養方法能於小量批次培養放大時，提高可溶性重組三葉因子胜肽產量，以符合工業化的需求。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

為讓本發明知上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖繪示nisin誘導轉形株於不同時間點的生長情形及蛋白質表現分析圖。

第2圖繪示本發明之轉形株於不同時間點的生長情形及蛋 白質表現分析圖。

第3圖繪示本發明之可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法之一實施例醱酵過程分析圖。

第4圖繪示本發明之可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法之另一實施例醱酵過程分析圖。

第5圖繪示本發明之可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法之再一實施例醱酵過程分析圖。

第6圖繪示本發明之可溶性重組三葉因子胜肽雙體之Tricine-SDS-PAGE電泳分析圖。

第7圖繪示可溶性重組三葉因子胜肽之原態膠片電泳分析圖

第8圖繪示本發明之可溶性重組三葉因子胜肽經pH7.0磷緩衝溶液處理之MALDI-TOF分析圖。

第9圖繪示本發明之可溶性重組三葉因子胜經pH2.4緩衝液處理後之MALDI-TOF分析圖。

第10圖繪示以細胞癒合試驗分析不同劑量的可溶性重組三葉因子胜肽對細胞移行的影響效應之顯微照片圖。

第11圖繪示細胞癒合試驗結果之量化圖。

本說明書揭示內容提出一種生產可溶性重組三葉因子胜肽之轉形株，以及可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法。以下為本說明書所用特定名詞的說明。

「三葉因子胜肽」一詞在此係指第一型三葉因子 (trefoil factor 1,TFF1)，由60個胺基酸所組成，大小約為14KDa，具有一個三葉結構，存在於腸胃黏膜的小凹細胞(foveolar cells)中，通常以同源雙體形式存在。

「可溶性」一詞在此係指重組蛋白質於表現系統中分泌至培養液中且溶於水，於表現系統中不會形成不溶於水的包涵體結構或是堆積聚集形成不溶於水的形式。

「乳酸鏈球菌」一詞在此係指Lactococcus lactis ，為革蘭氏陽性菌之兼性厭氧菌，不具致病性，且有常久食用歷史，為食品級宿主；其異源蛋白質表現量相較於革蘭氏陰性菌高出許多，且可將異源蛋白質分泌於胞外。另一方面，乳酸鏈球菌不似枯草桿菌具有多重的蛋白質水解系統。為適合用作生產醫療保健蛋白質的宿主。在一例示中，前述的「乳酸鏈球菌」尤指荷蘭NIZO食品研究所編號為NZ9000之菌株為較佳。然必須說明的是，上述乳酸鏈球菌(NZ9000)僅為本發明生產可溶性重組三葉因子胜肽之轉形株及可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法之一實施方式，本發明並不限於此，亦可使用其他菌株之乳酸鏈球菌表現重組三葉因子胜肽。

「誘導型」一詞在此係指用於作異源蛋白表現的微生物表現系統，依啟動子功能區分為持續型系統與誘導型系統。持續型系統可持續引發外源基因表現外源蛋白質，但若外源蛋白質對宿主有害，則會傷害宿主甚至造成死亡。誘導型系統則需於特定環境下才能誘發外源基因表現，可避免持續表現具細胞毒性的蛋白質所引起的傷害。 於本說明書所提及之「誘導型」系統有兩種形式，第一種為酸誘導系統，其啟動子受pH值誘導，可於生長期間代謝產有機酸而自我誘導(self-inducible)生產蛋白質。第二種為乳酸鏈球菌素(nisin)誘導系統，需於環境中加入nisin誘導啟動子表現目標蛋白質。

「單體」、「雙體」、「三聚體」和「四聚體」等詞在此係指蛋白質複合體，根據其亞基數目來描述，單體為只有一個蛋白質多肽鏈，雙體為含兩個亞基，三聚體為含三個亞基，四聚體為含四個亞基。先前研究指出(Marchbank,Westley,May,Calnan,& Playford,1998)，第一型三葉因子存在較高比例的同源雙體及多聚體時，可提高細胞移動及修復的活性。

下文提出多個實施例來說明本發明的某些態樣，係用以有利於本發明所屬技術領域中具有通常知識者，可在不需過度解讀的情況下完整利用並實踐本發明，而不應將這些實施例視為對本發明範圍的限制，但用於如何實施本發明的材料及方法。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

試驗例1：生產可溶性重組三葉因子胜肽之轉形株 (1)質體構築

本發明之一實施例之酸誘導型重組質體pNZAUS-SacBATFF1內插子(insert)之基因排列，依序包含酸誘導型啟動子P170序列、第一核酸片段、第二核酸片段、第三核酸片段以及第四核酸片段。酸誘導型啟動子P170序 列如序列辨識編號1所示，酸誘導型啟動子P170受pH值誘導，當pH值小於6.5啟動誘導而可生產蛋白質。第一核酸片段序列如序列辨識編號2所示，係為Lactobacillus acidophilus S-layer protein基因之5' untranslated region(5'UTRslpA)，此片段所形成的RNA二級結構可以達到穩定mRNA進而增加異源蛋白表現產量。第二核酸片段序列如序列辨識編號3所示，係為枯草桿菌之果聚糖蔗糖酶(levansucrase)訊息胜肽(SP_SACB )，此片段可引導新合成蛋白質藉由乳酸鏈球菌的sec-dependent分泌系統通過細胞膜分泌至胞外。第三核酸片段序列如序列辨識編號4所示，係為重組三葉因子胜肽。第四核酸片段序列如序列辨識編號5所示，係為Lactobacillus acidophilus 之終止子(TslpA)。將內插子片段先以Bgl II/Xba I截切，再與經同樣限制酶截切的載體pNZ8008(NIZO food research,Netherlands)利用T4接合酶(T4 DNA ligase)以適當莫耳數比例進行接合，得到構築完成之pNZAUS-SacBATFF1。

本發明另構築以乳酸鏈球菌素(nisin)為誘導物的誘導型重組質體pNZNS-SacBATFF1作為比較例。pNZNS-SacBATFF1內插子之基因排列，依序包含誘導型啟動子PnisA序列、第一核酸片段、第二核酸片段、第三核酸片段以及第四核酸片段。誘導型啟動子PnisA序列如序列辨識編號7所示，誘導型啟動子PnisA受nisin誘導，於環境中加入nisin可啟動誘導而生產蛋白質。第一核酸片段序列如序列辨識編號2所示，係為5'UTRslpA。第二核酸片 段序列如序列辨識編號3所示，係為訊息胜肽SP_SACB 。第三核酸片段序列如序列辨識編號4所示，係為重組三葉因子胜肽。第四核酸片段序列如序列辨識編號5所示，係為終止子TslpA。將內插子片段先以Bgl II/Xba I截切，再與經同樣限制酶截切的載體pNZ8008(NIZO food research,Netherlands)利用T4接合酶(T4 DNA ligase)以適當莫耳數比例進行接合，得到構築完成之pNZNS-SacBATFF1。

(2)乳酸鏈球菌之轉形作用

將質體轉形入乳酸鏈球菌宿主，可以包含但不限定以下列步驟完成。首先製備乳酸鏈球菌電勝任細胞，挑取單一菌落接種於適量GM17培養液(Difco^TM ,BD,USA)中，於30℃靜置培養。接種培養菌液體積1/100之隔夜培養菌液於新鮮SGM17培養液(含0.5M蔗糖和1%甘胺酸之GM17培養液)中，30℃靜置培養至OD₆₀₀ 為0.2~0.7，將菌液冰浴30分鐘後倒入已滅菌之離心瓶中，於4℃以離心力7000×g離心15分鐘，棄除上清液收集菌體。以與培養菌液等體積之冰冷滅菌Wash buffer I(0.5M蔗糖、10%甘油)清洗菌體，充分懸浮菌體後，於4℃以離心力7000xg離心15分鐘後棄除上清液。再分別以培養菌液體積1/2之冰冷滅菌Wash buffer II(0.5M蔗糖、10%甘油、0.05M EDTA)、培養菌液體積1/2之冰冷滅菌Wash buffer I及1mL之冰冷滅菌Wash buffer I重覆上述清洗菌體之步驟3次。最後以1/1000~1/500培養菌液體積之冰冷滅菌Wash buffer I懸浮菌體並分裝成數管(40μL/管)，以液態氮急速冷凍後置於 -80℃保存，即為乳酸鏈球菌電勝任細胞。

進行電轉形實驗時，取40μL之乳酸鏈球菌電勝任細胞於冰上融解並加入1μL誘導型重組質體pNZAUS-SacBATFF1，吸取置入預冷之電極管(cuvette)中，冰浴5分鐘後，於電場強度2.25kV、電阻200Ω、電容25μF條件下進行電轉形。再生培養於1mL之SGM17MC培養液〔含20mM氯化鎂(pH 6.8)和2mM氯化鈣之SGM17培養液〕中，30℃靜置培養3小時。以離心力10000×g離心10分鐘棄除上清液後，塗抹於含適量抗生素之SR固態培養基〔1%胰蛋白腖(tryptone)、0.5%酵母抽出物(yeast extract)、20%蔗糖(sucrose)、1%葡萄糖(glucose)、2.5%明膠(gelatin)、1.5%洋菜膠(agar)、2.5mM氯化鎂(pH6.8)、2.5mM氯化鈣(pH6.8)〕上，30℃厭氧培養16小時。使用菌落聚合酶鏈鎖反應(colony PCR)篩選轉形株，以偵測菌落是否含有目標DNA片段，即獲得本發明之轉形株。依上述方式將誘導型重組質體pNZNS-SacBATFF1電轉形至乳酸鏈球菌宿主中，即獲得比較例之nisin誘導型轉形株。

試驗例2：可溶性重組三葉因子胜肽之表現 (1)Nisin誘導系統

將nisin誘導型轉形株培養於含5μg/ml氯黴素(chloramphenicol,Cm)之GM17培養液中，於30℃靜置隔夜培養。經由兩次隔夜活化後接種於2.5公升的FMB培養液〔1.5%大豆蛋白(soytone)、1%葡萄糖(glucose)、17mM磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄₎ 、1%酵母抽出物(yeast extract)、1mM 七水硫酸鎂(MgSO₄ ‧7H₂ O)、0.1mM一水硫酸錳(MnSO₄ ‧H₂ O)、72mM磷酸氫二鉀(K₂ HPO₄ )〕，由OD₆₀₀ 至0.1開始生長，30℃培養至OD₆₀₀ 至0.3~0.6時加入100ng/ml nisin誘導生產可溶性重組三葉因子胜肽，培養的過程中以濃度20%至40%的氨水調整pH值維持為6.0-6.5，在OD₆₀₀ 將進入平穩期時加入1.5公升新鮮的FMB培養液及50ml 50%葡萄糖液以補充菌體生長所需的氮源及碳源，同時也將培養基中的nisin調整至100ng/ml。每兩個小時取菌液。將上清液與菌體離心分離，用TCA沉澱濃縮上清液後以Tricine-SDS-PAGE蛋白質電泳與西方墨點法分析蛋白質表現量。

請參照第1圖，為nisin誘導型轉形株於不同時間點的生長情形及蛋白質表現分析圖，偵測時間點為誘導後2、4、6、7、8、10、12、16及24小時。(A)部分為以Tricine-SDS-PAGE蛋白質電泳和西方墨點法偵測可溶性重組三葉因子胜肽之表現，其中『S』代表純化之重組三葉因子標準品，做為分泌表現定量之參考。(B)部分為於上述時間點測量OD₆₀₀ 值及蛋白質濃度。第1圖結果顯示第7小時添加入新的FMB培養液後，第12小時菌體密度可達OD₆₀₀ 7.54，在誘導後第14小時具有最高的表現量可達2.45μg/ml。

(2)酸誘導系統批次培養

為測試本發明之轉形株最適生長條件，將本發明之轉形株培養於含5μg/ml Cm之GM17培養液中，於30℃ 靜置隔夜培養。隨後接種菌液至含5μg/ml Cm之FMB培養液中，調整起始OD₆₀₀ 至0.1，在30℃靜置培養24小時，每2小時測量OD₆₀₀ 、pH值之變化，並取出1ml菌液於4℃以離心力7820×g離心10分鐘，用TCA沉澱濃縮上清液後以Tricine-SDS-PAGE蛋白質電泳與西方墨點法分析蛋白質表現量。

請參照第2圖，為本發明之轉形株於不同時間點的生長情形及蛋白質表現分析圖，偵測時間點為培養0、2、4、6、8、10、12及24小時。(A)部分為以Tricine-SDS-PAGE蛋白質電泳和西方墨點法偵測可溶性重組三葉因子胜肽之表現，其中『S』代表純化之重組三葉因子標準品，做為分泌表現定量之參考。(B)部分為於上述時間點測量OD₆₀₀ 值、蛋白質濃度及pH值。第2圖結果顯示，在第6小時可溶性重組三葉因子胜肽才開始表現，且在第6小時表現量最高可達0.85μg/ml，之後表現量持續下降。

試驗例3：可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法

由試驗2結果顯示，酸誘導系統最佳的誘導pH值為5.5至6.5，在乳酸鏈球菌生長對數期(2-4小時)時，因為乳酸累積較少無法進行誘導所以沒有條帶的出現，在8小時後pH值降低到5以下將會影響乳酸鏈球菌的生長以及酸誘導系統的蛋白質表現，使得蛋白質無法持續的表現，以致在小量批次培養放大至1公升大量批次醱酵時，酸誘導系統無法成功的純化到足量的蛋白質，因此酸誘導系統需要以提供主動誘導、調整pH值、加入新的培養基增加碳氮 原等方式，提高可溶性重組三葉因子胜肽的產量。因此本發明以下述培養的方式提升酸誘導系統可溶性重組三葉因子胜肽之產量。

根據本發明之製造方法之一實施例，目的在於維持酸誘導系統誘導環境為pH值6.0-6.5，持續讓酸誘導系統表現可溶性重組三葉因子胜肽，使表現系統不會因為乳酸菌產生有機酸，使蛋白表現停滯。本發明之轉形株經由兩次隔夜活化後，接種於3.5公升FMB培養液中，調整起始OD₆₀₀ 至0.1，在30℃靜置繼續培養。在培養液pH值為6.5以下時，酸誘導型啟動子p170會自我誘導表現重組三葉因子胜肽，此時加入濃度20%至40%的氨水調整培養液的pH值維持為6.0-6.5，並持續醱酵12小時且在不同時間點取出1ml菌液測量OD600，而後於4℃以離心力7820×g離心10分鐘，分離上清液與菌體，分析蛋白質表現量及菌體生長情形。

請參照第3圖，為本發明之製造方法之一實施例醱酵過程分析圖，偵測時間點為培養2、4、6、8、10、12、14、16及24小時。(A)部分為以Tricine-SDS-PAGE蛋白質電泳和西方墨點法偵測可溶性重組三葉因子胜肽之表現，其中『S』代表純化之重組三葉因子標準品，做為分泌表現定量之參考。(B)部分為於上述時間點測量OD₆₀₀ 值、蛋白質濃度及pH值。第3圖結果顯示，在第14小時可溶性重組三葉因子胜肽表現量可達1.56μg/ml，提升了目標蛋白的表現。但在後續時間點中，發現蛋白有降解的現象，顯示 濃度20%至40%的氨水，提供醱酵全程24小時，對於蛋白質的穩定度有一定的影響。

根據本發明之製造方法之另一實施例，目的在於希望經由主動誘導的方式，將酸誘導系統中可溶性重組三葉因子胜肽表現時間提前。酸誘導系統批次培養以及前述本發明之製造方法之一實施例中，其誘導表現的酸源都為乳酸菌自身產生的有機酸，因此培養基要達到誘導表現的目標pH值需要4-6小時，本發明之製造方法之另一實施例是利用主動提供有機酸(濃度30%至50%之乳酸)以利酸誘導系統提前表達目標蛋白。本發明之轉形株經由兩次隔夜活化後，接種於3.5公升FMB培養液中，調整起始OD600至0.1，在30℃靜置繼續培養。於OD₆₀₀ 達0.4~0.6時，加入濃度30%至50%的乳酸調整pH值至6.5誘導可溶性重組三葉因子胜肽表現，在誘導期間以濃度20%至40%的氨水調整培養液的pH值維持於6.0-6.5，並持續醱酵24小時且在不同時間點取出1ml菌液測量OD₆₀₀ ，而後於4℃以離心力7820×g離心10分鐘，分離上清液與菌體，分析蛋白質表現量及菌體生長情形。

請參照第4圖，為本發明之製造方法之另一實施方式醱酵過程分析圖。偵測時間點為誘導後2.5、4.5、6.5、8.5、10.5、12.5、14.5、16.5及26.5小時。(A)部分為以Tricine-SDS-PAGE蛋白質電泳和西方墨點法偵測可溶性重組三葉因子胜肽之表現，其中『S』代表純化之重組三葉因子標準品，做為分泌表現定量之參考。(B)部分為於上述時 間點測量OD₆₀₀ 值、蛋白質濃度及pH值。第4圖結果顯示，蛋白質的表現雖然沒有如預期提早表現，但蛋白質最高之表現量提早至誘導後10小時可達1.91μg/ml，此法可以減低氨水的用量，也可避免拉長培養時間而使蛋白質降解。

根據本發明之製造方法之再一實施例，目的在於添加入新的培養液提供碳源和氮源，藉由宿主菌體密度提升及有害物質的稀釋，視其是否對於蛋白質的表現量有助益。本發明之轉形株經由兩次隔夜活化後，接種於2公升FMB培養液中，調整起始OD₆₀₀ 至0.1，在30℃靜置繼續培養。在培養液pH值為6.5以下時，酸誘導型啟動子p170會自我誘導表現可溶性重組三葉因子胜肽，此時加入濃度20%至40%的氨水調整培養液的pH值維持在6.0-6.5，在進入平穩期時加入1公升新鮮的FMB培養液及50ml 40%至60%葡萄糖液補充氮源以及碳源，在加入新鮮的FMB培養液後每2小時取出1ml菌液測量OD₆₀₀ ，而後於4℃以離心力7820×g離心10分鐘，分離上清液與菌體，分析蛋白質表現量及菌體生長情形。

請參照第5圖，為本發明之製造方法之再一實施方式醱酵過程分析圖。偵測時間點為培養6、8小時及加入新鮮的FMB培養液後2、4、6、8、10、12及24小時。(A)部分為以Tricine-SDS-PAGE蛋白質電泳和西方墨點法偵測可溶性重組三葉因子胜肽之表現，其中『S』代表純化之重組三葉因子標準品，做為分泌表現定量之參考。(B)部分為於上述時間點測量OD₆₀₀ 值、蛋白質濃度及pH值。第5圖 的結果顯示，本發明之製造方法之再一實施例於加入新培養基後6小時OD₆₀₀ 能提升至8，而本發明之製造方法之一實施例及另一實施例，在生長曲線的表現當進入平穩期時，OD₆₀₀ 僅能達5。在西方墨點法轉漬圖中顯示在加入新鮮的FMB後12小時有最高的蛋白表現量可達2.58μg/ml。

試驗例4：可溶性重組三葉因子的蛋白質鑑定 (1)同源雙體測定

為評估兩系統所表現的可溶性重組三葉因子胜肽是否形成同源雙體，於可溶性重組三葉因子胜肽的溶液中添加0.05%之戊二醛，其可使交聯成雙體的可溶性重組三葉因子胜肽在進行Tricine-SDS-PAGE蛋白質電泳時不會分離為單體，請參照第6圖，為可溶性重組三葉因子胜肽雙體之Tricine-SDS-PAGE電泳分析圖。(A)部分TFF1/MPHI為酸誘導系統所生產之可溶性重組三葉因子胜肽，(B)部分TFF1/MNICE為nisin誘導系統所生產之可溶性重組三葉因子胜肽。其中『1』皆表示未經戊二醛處理的樣品，『2』皆表示經戊二醛處理的樣品。第6圖結果顯示，酸誘導系統所生產之可溶性重組三葉因子胜肽之雙體佔36%，nisin誘導系統所生產之可溶性重組三葉因子胜肽之雙體佔34%，另外更產生三聚體及四體。兩系統所表現的可溶性重組三葉因子胜肽其單體以及同源雙體的比例上類似。

(2)原態膠蛋白質電泳

為了解於原態及模擬胃酸環境(pH2.4)下，可溶性重組三葉因子胜肽是否具有雙體或多寡體，將於nisin誘導 系統及酸誘導系統所生產之可溶性重組三葉因子胜肽分別溶於pH7.0磷酸緩衝液及經模擬胃酸環境pH值的pH2.4緩衝液(Na2HPO4-citricacid,pH2.4)，另一組可溶性重組三葉因子胜肽加入10mM還原劑(DTT)處理作為對照組，所有的樣品以原態膠片電泳分離，原態膠適用原態之蛋白質電泳，不需添加SDS使蛋白質變性，泳動率與原態蛋白質之電荷、構形、分子量有關，再以銀染方式進行呈色分析。

請參照第7圖及表一，第7圖為可溶性重組三葉因子胜肽之原態膠片電泳分析圖，其中TFF1/MPHI為酸誘導系統所生產之可溶性重組三葉因子胜肽，TFF1/MNICE為nisin誘導系統所生產之可溶性重組三葉因子胜肽。表一為各樣品經原態膠蛋白質電泳分離後，經定量分析單體、雙體、三聚體和四聚體片段所佔的百分比。

發現兩系統所生產的可溶性重組三葉因子胜肽，在pH7.0環境下主要構型差異不大，皆為三聚體比例較少。而在pH值為2.4環境下，可溶性重組三葉因子胜肽同源雙體與多聚體的比例些微的上升，三聚體的構型依然較不顯著。

(3)MALDI-TOF分析

為確認酸誘導系統所生產之可溶性重組三葉因子胜肽於不同pH值下所含各種多寡體的分子量，將可溶性重組三葉因子胜肽分別溶於pH7.0磷酸緩衝液及pH2.4緩衝液，樣品進一步經由基質輔助雷射脫附游離/飛行時間質譜儀(MALDI-TOF)分析。請參照第8圖和第9圖，為可溶性重組三葉因子胜肽於pH7.0磷緩衝液和pH2.4緩衝液處理下MALDI-TOF分析圖。結果顯示可溶性重組三葉因子胜肽含有五個明顯的聚合體，且在pH2.4緩衝液處理後具有比例較高的同源雙體以及多聚體，證明原態膠蛋白質電泳所觀測之結果。

試驗例5：傷口癒合試驗

以傷口癒合試驗(wound healing assay)分析不同劑量的本發明之可溶性重組三葉因子胜肽及比較例nisin誘導型可溶性重組三葉因子胜肽，對於細胞移行的影響效應以偵測對細胞傷口癒合的活性。觀察細胞移行(migration)的方法係將人類胃癌細胞(AGS cells)先以Ham’s F-12K培養基〔1.802g/L葡萄糖(glucose)、146mg/L殼胺醯胺(glutamine〕，培養於37℃含5% CO₂ 之培養箱中，滿盤後，將5×10⁴ cells/ml的細胞種植於培養皿(35mm×10mm)後，以含有10%胎牛血清的Ham’s F-12K培養基培養於37℃含5% CO₂ 之培養箱18小時，生長至滿盤後，置換含10%胎牛血清之Ham’s F-12K培養基並分別添加以pH2.4緩衝液或pH7.0磷酸緩衝液溶解之不同濃度(200ng/ml、400 ng/ml、800ng/ml)可溶性重組三葉因子胜肽，以觀察不同pH值環境及不同濃度之可溶性重組三葉因子胜肽對於細胞癒合能力的影響。將細胞培養於37℃含5% CO₂ 之培養箱中，0、24、48小時拍照觀察細胞層傷口之癒合狀況並測量細胞移行距離。

請參照第10圖和第11圖，第10圖細胞癒合試驗的顯微照片圖。第11圖為細胞癒合試驗細胞移行之距離量化圖。其中C7.0和C2.4僅加入pH7.0磷緩衝液和pH2.4緩衝液的對照組。MNICE400 7.0和MNICE400 2.4為加入溶解於pH7.0磷酸緩衝液和pH2.4緩衝液中，濃度為400ng/ml nisin誘導系統所生產之可溶性重組三葉因子胜肽的組別。MPHI200 7.0、MPHI400 7.0和MPHI800 7.0為加入溶解於pH7.0磷酸緩衝液中，濃度分別為200ng/ml、400ng/ml和800ng/ml酸誘導系統所生產之可溶性重組三葉因子胜肽的組別。MPHI400 2.4為為加入溶解於pH2.4緩衝液中濃度為400ng/ml酸誘導系統所生產之可溶性重組三葉因子胜肽的組別。

結果顯示，在pH2.4環境下，酸誘導系統和nisin誘導系統所生產的可溶性重組三葉因子胜肽，所展現的細胞癒合活性效果較C2.4對照組佳，兩系統生產之可溶性重組三葉因子胜肽皆具有細胞癒合活性。但在pH7.0的環境下，nisin誘導系統所生產的可溶性重組三葉因子胜肽不具有傷口癒合活性。而酸誘導系統所生產之可溶性重組三葉因子胜肽，濃度越高細胞癒合效率越好，在濃度400ng/ml 以上的之可溶性重組三葉因子胜肽具有較明顯的位移效率。顯示酸誘導系統生產的可溶性重組三葉因子胜肽無論在pH2.4或7.0環境下，均具有較高細胞傷口癒合活性。

根據上述試驗結果，本發明之轉形株能成功生產可溶性重組三葉因子胜肽，而本發明之製造方法所生產的可溶性重組三葉因子胜肽具有雙體、三聚體、四聚體之蛋白質複合體，且無論在pH2.4或7.0環境下，均具有細胞傷口癒合活性。相較於nisin誘導系統轉形株之比較例，其所生產的可溶性重組三葉因子胜肽僅於pH2.4環境下具有細胞傷口癒合活性。因此本發明所生產之可溶性重組三葉因子胜肽可應用於在胃及腸不同pH環境下，均具有細胞傷口癒合活性，且其功能性無顯著差異性。且在成本考量下酸誘導系統非常適合工業化，因為其不須添加抗生素及昂貴的誘導劑。故此本發明之轉形株及製造方法，具有工業化生產大量運用於生醫保健市場之潛能。

然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

<110> 國立中興大學

<120> 生產可溶性重組三葉因子胜肽之轉形株及可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法

<160> 7

<210> 1

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> enhancer,promoter

<223> P170

<400> 1

<210> 2

<211> 191

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 5'UTL

<223> 5'UTL

<400> 2

<210> 3

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> signal peptide

<223> 訊息胜肽之核苷酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 203

<212> DNA

<213>

<220> CDS

<223> 重組三葉因子(TFF1)之核苷酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> terminator

<220> 終止子

<223>

<400> 5

<210> 6

<211> 68

<212> PRT

<213>

<220>

<223> 重組三葉因子(TFF1)之胺基酸序列

<400> 5

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> enhancer,promoter

<223> PnisA

<400> 7

Claims (7)

1. 一種生產可溶性重組三葉因子胜肽之轉形株，包含：一宿主細胞，其中該宿主細胞為乳酸鏈球菌(Lactococcus lactis ，編號NZ9000)；以及一酸誘導型重組質體，其中該酸誘導型重組質體包含依序排列之如序列辨識編號1所示之一酸誘導型啟動子序列、如序列辨識編號2所示之一第一核酸片段、如序列辨識編號3所示之一第二核酸片段、如序列辨識編號4所示之一第三核酸片段及如序列辨識編碼5所示之一第四核酸片段，其中該第三核酸片段係編碼如序列辨識編號6所示之一重組三葉因子胜肽，且該重組三葉因子胜肽於pH2.4及pH7.0環境下皆具有促進傷口癒合之活性。
2. 如請求項1所述之生產可溶性重組三葉因子胜肽之轉形株，其中該可溶性重組三葉因子胜肽係分泌於該轉形株之外。
3. 如請求項1所述之生產可溶性重組三葉因子胜肽之轉形株，其中該可溶性重組三葉因子胜肽具有單體、雙體、三聚體或四聚體之蛋白質複合體。
4. 一種可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法，包含：提供一液態培養物，其中該液態培養物包含如請求項1至3任一項所述之轉形株； 該轉形株培養過程自體分泌一有機酸酸至該液態培養物中，當該液態培養物之pH值為5.5至6.5時該酸誘導型重組質體被啟動誘導，以表現該可溶性重組三葉因子胜肽並分泌至該轉形株之外；去除該轉形株，以獲得含有該可溶性重組三葉因子胜肽之一上清液；以及由該上清液中分離出該可溶性重組三葉因子胜肽。
5. 如請求項4所述之可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法，其中該轉形株培養過程更包含加入20%至40%之氨水維持pH值為6.0-6.5。
6. 如請求項4所述之可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法，其中該轉形株培養過程更包含：添加30%至50%之乳酸；以及加入20%至40%之氨水維持pH值為6.0-6.5。
7. 如請求項4所述之可溶性重組三葉因子胜肽之製造方法，其中該轉形株培養過程更包含：加入20%至40%之氨水維持pH值為6.0-6.5；以及添加一新鮮培養液和40%至60%之葡萄糖液。