KR20050077376A

KR20050077376A - ｒｐｌＬ 프로모터를 이용한 고효율 유산균 발현벡터ｐＫＨ10-ｌｕｃ

Info

Publication number: KR20050077376A
Application number: KR1020040004995A
Authority: KR
Inventors: 정대균; 이관훈; 박우정; 이정민; 정성균; 박정우
Original assignee: 주식회사 알엔에이
Priority date: 2004-01-27
Filing date: 2004-01-27
Publication date: 2005-08-02

Abstract

본 발명은 신규한 유산균용 벡터에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대장균 및 유산균의 복제원점, 유산균에서 유전자의 고발현을 위한 프로모터, 제1선별유전자인 항생제 저항성 유전자 및 제2선별유전자 유전자를 포함하는 유산균용 벡터에 관한 것이다. 본 발명에 따른 벡터는 대장균 및 유산균에서 높은 효율로 luciferase를 발현시키므로, E. coli와 유산균에서 shuttle-expression vector로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ｒｐｌＬ 프로모터를 이용한 고효율 유산균 발현벡터 ｐＫＨ10-ｌｕｃ{Expression vector pKH10-luc for Lactic acid bacteria by using rplL promoter}

본 발명은 신규한 유산균용 벡터에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대장균 및 유산균의 복제원점, 유산균에서 유전자의 고발현을 위한 프로모터, 제1선별유전자인 항생제 저항성 유전자 및 제2선별유전자 luciferase 유전자를 포함하는 유산균용 벡터에 관한 것이다.

김치는 온 국민이 즐겨먹는 건강식품으로 그 소비는 일정 수준을 계속 유지하고 있다. 주거환경의 변화와 주부의 취업확대 등의 이유로 공장김치의 수요는 계속 증가할 것이 분명하고 해외 수출 물량 역시 증가하고 있다. 1997년 해외 수출량은 12,069톤에서 98년에는 15,000톤으로 약 24% 증가하였고, 금액으로는 3,969 만불(97년)에서 4,200만불(98년)로 증가하였다. 따라서 양질의 김치를 대량 생산하는 기술과 저장성 개선기술 개발 및 다양한 김치제품의 개발은 국내 식품산업 발전뿐 아니라 외화획득에서도 매우 중요하다. 현재 김치 수출액의 94%를 일본시장이 차지하나 일본내의 자체생산 증가로 수출 감소가 예상되며 특히 김치산업의 주도권을 놓고 경쟁관계에 있는 현실을 감안하면 고품질 김치제품들을 개발하여 미국이나 유럽시장에 대한 수출물량을 증가시키는 노력이 필요하다.

따라서 외래 유전자의 클로닝을 통한 분자생물학적 이해는 궁극적으로 우수한 김치종균들의 개발과 이들을 이용한 저장성과 품질이 개선된 김치제조에 응용될 것이므로 경제적으로 매우 중요하다. 종래 많은 김치연구들(한국식품개발연구원, 생명공학연구소, 대학 연구소)을 통해 김치발효에 관련된 여러 미생물들의 동정과 생육 특성, 김치품질에 미치는 원료 및 부재료의 영향, 저장성 향상 방안 등이 밝혀졌다. 그러나 김치유산균 자체의 본질적 특성에 관한 연구, 특히 분자수준에서의 연구는 전무한 실정이다. 김치는 우리 민족 음식문화의 우수성을 온 세계에 알리는 문화상품일 뿐 아니라 수출을 통해 국내 관련 산업 성장에도 기여도가 크므로 김치산업의 지속적 성장과 경쟁력 우위 확보를 위한 기반연구가 절실히 요구된다.

김치 및 김치 미생물에 관한 해외 연구는 거의 없다. NCBI 메드라인(Medline) 검색 결과 확인된 김치 연구논문들은 몇 편에 불과하며 내용도 김치 소개나 외국 거주 한인들의 김치 섭취와 관련된 것들이다. 국내에서 이루어진 김치관련 연구는 60년대 이후 약 500여편 이상의 논문들이 발표되었고, 이중 90년 이후 약 200편 이상이 발표되었으며, 1995년 이후 논문의 수가 크게 증가하였다. 연구 주제로는 김치미생물과 효소들에 관한 것이 24%로 가장 많고, 다음으로 이화학적 특성 17%, 저장성 16%, 원재료 14% 순이며, 나머지 위생, 요리, 역사 등에 관한 연구들이 29%를 차지하고 있다(Lee HJ. et al., Kor. J. Microbiol. 31:346-353, 1993; Sang-Mo Kang et al., Kor. J. Apl. Microbiol. Biotechnol. 23(4):461-471, 1995). 또한 락토바실러스 파라프란타룸(Lactobacillus paraplantarum) C7 및 기타 유산균의 유전적, 생화학적 특성, 미생물을 이용한 발효조절에 관해서는 별다른 연구가 없었다. NTG 처리에 의해 내산성이 증가된 결과를 얻은 보고는 있으나, 내산성 기작에 관한 연구는 없었고, 특히 김치유산균을 대상으로 김치발효 중요 유전자들에 대한 분자생물학적 연구나 유전자도입 등의 유전자조작을 통한 균주 개량 시도는 찾아보기 힘들다.

이에 본 발명에서는 김치에서 분리한 락토바실러스 파라프란타룸 C7을 대상으로 산업적 응용가치를 높이기 위하여 락토바실러스 파라프란타룸 C7으로부터 분리된 플라스미드 pC7(Solar GD. et al., Microbiol. Mol. Bio. Rev. 62: 434-464, 1998)을 이용하여 개발된 대장균-유산균 셔틀벡터(shuttle vector)인 pLC5-gfp에 rplL promoter와 luciferase gene을 도입하여 pKH10-luc vector를 제작하였다.

따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 유산균용 벡터를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균 및 유산균의 복제원점, 유산균에서 유전자의 고발현을 위한 프로모터, 제1선별유전자인 항생제 저항성유전자, 제2선별유전자인 luciferase 유전자를 포함하는 유산균용 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에 따른 벡터는 대장균 및 유산균의 복제원점, 유산균에서 유전자의 고발현을 위한 프로모터, 제1선별유전자인 항생제 저항성 유전자, 제2선별유전자인 luciferase 유전자를 포함하는 점에 특징이 있다.

본 발명에서 대장균의 복제원점은 pUC18 벡터 유래의 복제원점인 것이 바람직하며, 유산균의 복제원점은 락토바실러스 파라프란타룸 C7에서 분리된 pC7 플라스미드 유래의 복제원점인 것이 바람직하다. 상기 pC7은 약 2Kb 크기이고, 38.5%의 G+C content를 가지며, 회전환복제(rolling circle replication)를 한다.

또한 본 발명의 벡터에 포함되는 프로모터는 유산균에서 유전자의 고발현을 위한 프로모터라면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 rplL 프로모터인 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터에 함유되는 제1선별유전자는 일반적인 항생제 저항성 유전자라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 에리쓰로마이신(erythromycin; Em) 저항성 유전자를 사용하는 것이 바람직하다.

나아가 본 발명의 벡터에는 luciferase 유전자가 제2선별유전자로서 포함된다. 상기 luciferase는 오랫동안 marker로써 이용되어온 물질이며, 발현양을 수치로 나타내기 쉬운 장점을 가지고 있다. 또한 luciferase는 CAT이나 GUS activity를 측정하는 것보다 반응시간이 짧으며, 다루는 데 위험성이 적고, back ground activity가 거의 나타나지 않는 장점을 지니고 있다(Kenneth R. et al., Promega notes magazine 44:24-32, 1993). 게다가 luciferase는 mammalian cell(De Wet, J. R., Wood, et al., Mol. Cell. Biol. 7:725-737, 1987), E. coli(Carmen Coronado et al., Plasmid 32, 336-341, 1994; De Wet, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7870-7873, 1985) 및 plant(Kenneth R. et al., Promega notes magazine 44:24-32, 1993)에서 많이 이용되어 왔다.

본 발명의 유산균용 벡터의 바람직한 제조과정이 도 1에 간략히 도시되어 있다. 본 발명의 벡터는 pLC5-gfp 벡터를 모체로 하여 제작될 수 있다. 상기 pLC5-gfp 벡터는 pLC4 내 pUC18 유래의 대장균 복제원점과, pLC4 내 pC7 유래의 유산균 복제원점, pMG36e 벡터 유래의 ptsH promoter, pEGFP vector 유래의 gfp gene 및 pLC4 유래의 항생제 유전자(Em)를 함유한다.

구체적으로 본 발명에서는 도 1에 도시된 바와 같이 상기 pLC5-gfp 벡터에서 ptsH 프로모터와 gfp 유전자를 제거한 후, pGL3-BASIC 벡터의 luc 유전자를 삽입하여 pKH10 벡터를 제조하고, 상기 pKH10 벡터에 rplL 프로모터를 다시 삽입하여 pKH10-luc 벡터를 제작하였다. 이와 같이 본 발명에서는 luciferase를 마커로 하여 E. coli 및 유산균에서 이용 가능한 shuttle-expression vector를 제작하였다. 제작된 pKH10-luc vector를 E. coli에 transformation 하여 그 발현을 luciferase assay를 통하여 확인하였다. 그 결과 E. coli와 Lactobacillus paraplantarum C7, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum 각각의 유산균에서 luciferase의 효율적 발현을 확인함으로서, pKH10-luc vector의 E. coli와 유산균에서 shuttle-expression vector로서의 유용성을 입증하였다.

또한 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 바람직하게 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질전환된 대장균과 유산균을 제공한다. 상기 대장균은 XL1-blue, JM-109 등 일반적인 대장균이라면 제한없이 사용될 수 있다. 또한 상기 유산균은 Lactobacillus paraplantarum C7, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum 등을 모두 포함한다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1>

유산균용 발현벡터의 제조

pC7의 유산균 origin과 pUC18의 E. coli origin을 이용하고, Em resistance gene을 도입하여 제작한 pLC5-gfp shuttle vector를 이용하고, rplL promoter를 도입하기 위하여 pMG36e vector를 이용하였다. pLC5-gfp shuttle vector에서 ptsH promoter와 gfp 부분을 EcoRI과 NotI site로 cutting하여 ptsH-gfp fragment를 제거하였다. Luciferase gene을 cloning 하기 위하여, luciferase gene이 들어있는 pGL3-Basic vector(Promega사)로부터 NcoI과 SalI site를 이용하여 luciferase gene을 얻어내고 gene cleaning 한 후, ptsH-gfp 부분이 제거된 vector에 cloning하여 pKH10 vector를 제작하였다. pKH10 vector에 NcoI site로 rplL promoter를 cloning 하여 pKH10-luc vector를 제작하였다(도 1 참조). 상기 pKH10-luc 벡터의 방향성은 서열분석을 통하여 확인하였다.

<실시예 2>

대장균 및 유산균에서 luciferase의 발현 측정

<2-1> 대장균 형질전환

상기 실시예 1에서 제작한 pKH10-luc 벡터를 이용하여 대장균 XL1-blue를 형질전환시켰다. 100-200ng의 pLC5-gfp 플라스미드 DNA를 40㎕ 대장균 컴퍼턴트 세포(competent cell)에 혼합한 후, 2-mm-큐벳(Bio-Rad), 2.5Kv, 25㎌ 콘덴스(capacitance), 200Ω 저항(resistance)의 조건으로 일렉트로포레이션(electroporation)을 수행하였다. 이후, 일렉트로포레이션한 세포를 SOC 배지에서 접종하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, 배양액을 에리쓰로마이신 항생제가 포함된 선택배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

<2-2> 유산균 형질전환

상기 실시예 1에서 제작한 pKH10-luc 벡터를 유산균에 도입하였다. 먼저 유산균을 5㎖ MRS배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 전배양하였다. 이후, 2% 글리신과 0.5M 수크로스가 첨가된 MRS 배지에서 O.D_600nm 0.5-0.7 정도가 될 때까지 배양하였다. 4℃에서 14,000rpm의 속도로 10분 동안 원심분리하여 세포를 수득하였다. 이후, 증류수 또는 PBS 버퍼로 세포를 2-3회 세척한 후, 20㎖ ice cold SMEB 버퍼(3.5× SMEB buffer : 272mM sucroce, 1mM MgCl₂)로 최종 세척하였다. 이후, 배지에 세포를 재현탁하여 유산균 컴퍼턴트 세포를 준비하였다.

1∼10㎍의 pKH10-luc 플라스미드를 상기 유산균 컴퍼턴트 세포와 혼합한 후, 2-mm-큐벳(Bio-Rad), 2.5Kv, 25㎌ 콘덴스, 무제한 저항(unlimited resistance, ∞Ω)의 조건으로 일렉트로포레이션을 수행하였다(Holo, H. et al., Appl. Environ. Microbiol. 55:3119-3123, 1989; Simons, S.D.G. et al., Appl. Environ. Microbiol. 55:1483-1489, 1989). 일렉트로포레이션한 유산균 세포를 0.5M 수크로스, 20mM MgCl₂, 2.0mM CaCl₂가 첨가된 MRS 배지에 접종하여 37℃에서 3∼4시간 동안 배양하였다. 이후, 에리쓰로마이신이 포함된 선택배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

<2-3> luciferase 발현 측정

overnight culture한 cell 1㎖을 14,000rpm에서 1분간 cell down하여 pellet을 얻은 후, distilled water 또는 PBS로 2∼3차례 washing하여 cell sample을 준비하였다. luciferase assay는 luciferase assay kit(Promega, USA)를 이용하였다. 90㎕에 1M K₂HPO₄(pH7.8)과 20mM EDTA mixture 10㎕를 첨가하고, LN₂에 급속 냉동하였다. 상온에서 해동하고, 여기에 준비된 lysis mix (1× CCLR(100mM potassium phosphate, pH 7.8, 1mM EDTA, 7mM 2-mercaptoethanol, 1% Triton X-100), 1.25㎎/㎖ lysozyme, 2.5㎎/㎖ BSA) 300㎕를 첨가하여 상온에서 10분간 방치하여 E. coli cell을 lysis 하였다. 유산균은 overnight culture한 cell 1㎖을 14,000rpm에서 1분간 cell down하여 pellet을 얻은 후, distilled water 또는 PBS로 2∼3차례 washing하여 cell sample을 준비하였다. E. coli와 동일한 buffer를 이용하고, 여기에 1:1의 비율로 glassbead를 섞어 1분간 vortex 하고, 1분간 cooling하는 작업을 4∼5차례 반복하였다. 14,000×g에서 5분간 centrifuge하여 상층액을 분리하는 작업을 수 차례 반복하여 glassbead 및 cell debris를 완전히 제거하였다. 이렇게 준비된 E. coli와 유산균의 sample을 Protein assay kit(Bio-Rad)을 이용하여 정량 하였다. sample 20㎕와 substrate 100㎕를 섞어 luminometer에서 15초간 측정하였다. 8∼10회 측정값의 평균값으로 수치를 결정하였고, sample의 양을 달리하여 측정값을 비교하였다.

gfp gene을 제거하고 luciferase gene을 삽입한 pKH10-luc vector를 E. coli 및 Lactobacillus paraplantarum C7, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum에 transformation 하여 luciferase assay를 수행하였다. promoter가 없는 pKH10 vector를 transformation한 E. coli와 rplL promoter를 보유한 pKH10-luc vector를 transformation한 E. coli에서 luciferase 발현양은 현저하게 차이가 났으며(결과 미도시), 유산균에서도 마찬가지의 결과를 보였다(도 2 참조).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 Lactobacillus paraplantarum C7 유래의 pC7 plasmid을 이용하고 형질전환된 균주의 정확한 모니터링을 위해 luciferase tagging 시스템을 도입시킨 새로운 유산균용 shuttle vector를 개발하였다. 본 발명에 따른 벡터는 대장균 및 유산균에서 높은 효율로 luciferase를 발현시키므로, E. coli와 유산균에서 shuttle-expression vector로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 pKH10-luc 벡터의 제조과정을 나타낸 것이다.

도 2는 대장균과 유산균에서 luciferase 발현을 관찰한 것이다.

레인 1; Lactobacillus bulgaricus

레인 2; Lactobacillus bulgaricus harboring pKH10

레인 3; Lactobacillus bulgaricus harboring pKH10-luc

레인 4; Lactobacillus plantarum

레인 5; Lactobacillus plantarum harboring pKH10

레인 6; Lactobacillus plantarum harboring pKH10-luc

레인 7; Lactobacillus paraplantarum C7

레인 8; Lactobacillus paraplantarum C7 harboring pKH10

레인 9; Lactobacillus paraplantarum C7 harboring pKH10-luc

레인 10; Leuconostoc mesenteroides

레인 11; Leuconostoc mesenteroides harboring pKH10c

레인 12; Leuconostoc mesenteroides harboring pKH10-luc

Claims

대장균 및 유산균의 복제원점, 유산균에서 유전자의 고발현을 위한 프로모터, 제1선별유전자인 항생제 저항성 유전자 및 제2선별유전자 luciferase 유전자를 포함하는 유산균용 벡터.
제1항에 있어서, 상기 유산균에서 고발현을 위한 프로모터는 rplL 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는 유산균용 벡터.
제2항에 있어서, 도 1에 개시된 pKH10-luc의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 유산균용 벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.