KR20110019226A

KR20110019226A - 글루칸수크라제를 이용한 아스코르브산 ２글루코시드의 생산방법

Info

Publication number: KR20110019226A
Application number: KR1020090076848A
Authority: KR
Inventors: 김중수; 김용모; 연민지; 손동호; 장영효; 송재준; 최종현; 최낙식; 정민영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-08-19
Filing date: 2009-08-19
Publication date: 2011-02-25
Also published as: KR101073990B1

Abstract

본 발명은 아스코르브산 2-글루코시드의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 글루칸수크라제를 이용하여 L-아스코르브산의 글리코실화를 통하여 증가된 안정성을 가지는 아스코르브산 2-글루코시드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 다양한 산업분야에 사용되고 있는 L-아스코르브산 유도체인 아스코르브산 2-글루코시드를 수크로스와 같은 풍부한 탄수화물 자원을 이용하여 합성할 수 있어 경제적이며, 또한 우수한 효율로 아스코르브산 2-글루코시드를 생산하는바 유용하다.

글루칸수크라제, 글리코실화, L-아스코르브산, 아스코르브산 2-글루코시드

Description

글루칸수크라제를 이용한 아스코르브산 ２글루코시드의 생산방법{Method for Preparing Ascorbic Acid 2-Glucoside Using Glucansucrase}

본 발명은 아스코르브산 2-글루코시드의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 글루칸수크라제를 이용하여 L-아스코르브산의 글리코실화를 통하여 증가된 안정성을 가지는 아스코르브산 2-글루코시드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-아스코르브산(L-ascorbic acid, L-AsA)은 약학 제제, 사료, 식품 보존제 및 화장품을 포함한 다양한 산업적 응용에 사용되고 있다. 그러나, L-AsA가 산화 조건 및 열조건에서 불안정하기 때문에 L-AsA의 불안정성을 극복하기 위하여, 지금까지 L-아스코르브산 2-포스페이트(AA-2P), L-아스코르브산 2-설페이트(AA-2S) 및 L-아스코르브산 2-메틸 에테르(AA-2M)을 포함한 많은 안정한 유도체들이 연구되어져왔다.

한편, 글리코실화 반응은 당 수용기의 수용성, 분자안정성 및 생물학적 활성을 향상시키며, 다양한 글리코실화된 산물은 항산화제, 항생제 및 항암제와 같은 생물학적 화합물로서 개발되고 있다. 이에 증가된 안정성을 가지는 글리코실 유도체인 L-아스코르브산 2-글루코사이드(L-ascorbic acid 2-glucoside, AA-2G)는 산업적으로 다양하게 사용되기 위하여, 글리코실화 반응에 의하여 효소학적으로 합성되고 있다. 즉, AA-2G는 L-AsA와 같은 수용 기질과, 말토오즈, 수크로즈 또는 다른 α-글루칸과 같은 공여 기질로부터 포유동물 및 벼 종자 α-글루코시다아제(I. Yamamoto et al., Chem . Pharm . Bull ., 38(11):3020, 1990), Bacillus stearothermophilus 싸이클로덱트린 글루카노트랜스퍼라제(CGTase)(M. Tanaka et al., Biochim. Biophys. Acta., 1078(2):127, 1991) 및 Bifidobacterium longum 슈크로스 포스포릴라아제(H.K. Kang et al., FEMS Microbiol. Lett., 292:33, 2009)에 의한 글리코실화 반응에 의하여 합성된다. 그러나, 여전히 산업적으로 유용한 AA-2G를 경제적으로 더욱 간이한 방법으로 효율적으로 합성할 수 있는 방법의 개발이 요구되어 왔다.

한편, 글루칸수크라제(glucansucrases, EC 2.4.1.5)는 수크로스(sucrose)로부터 글루칸(glucan)의 합성하는 효소로서, 물이 수용체로서 사용될 때 글루코오스 모이어티를 전달함으로써 글루칸의 수용분해를 촉진할 수 있다. 이들은 또한 성장하는 글루칸 주쇄로 글루코오스 모이어티의 글루코실 전달에 의하여 글루칸을 합성할 수 있으며, 글루코어스 모이어티를 다른 사카라이드로 글리코실화하여 올리고사카라이드를 합성할 수 있다. 그러나, 상기와 같은 제한적인 용도만이 알려져 있을 뿐 아직까지 글루칸수크라제를 이용하여 L-AsA로부터 AA-2G를 합성한 예는 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 아스코르브산 2-글리코시드를 효율적이고 경제적으로 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 김치에서 분리한 L. latis EG001로부터 분리한 신규한 글루칸수크라제를 수크로스 및 L-아스코르브산과 함께 혼합하여 반응시키는 간이한 방법으로 아스코르브산 2-글리코시드를 효율적으로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 산업적으로 유용한 아스코르브산 2-글리코시드를 효율적이고 경제적인 방법으로 합성할 수 있는 새로운 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 글루칸수크라제(glucansucrase)를 이용한 아스코르브산 2-글루코시드(ascorbic acid 2-glucoside)의 생산방법을 제공한다:

(a) L-아스코르브산 및 이당류를 글루칸수크라제와 함께 혼합하여 글리코실화 반응을 수행하는 단계; 및

(b) 상기 글리코실화 반응으로 생성된 아스코르브산 2-글루코시드를 회수하는 단계.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 글루칸수크라제(glucansucrase)를 이용한 아스코르브산 2-글루코시드(ascorbic acid 2-glucoside)의 생산방법을 제공한다:

(a) L-아스코르브산 및 수크로스를 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 글루칸수크라제와 함께 혼합하여 글리코실화 반응을 수행하는 단계; 및

본 발명은 글루칸수크라제를 이용하여 L-아스코르브산의 글리코실화를 통하여 아스코르브산 2-글루코시드를 생산하는 새로운 방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 방법은 다양한 산업분야에 사용되고 있으며 증가된 안정성을 가지는 L-아스코르브산 유도체인 아스코르브산 2-글루코시드를 수크로스와 같은 풍부한 탄수화물 자원을 이용하여 합성할 수 있어 경제적이며, 또한 우수한 효율로 아스코르브산 2-글루코시드를 생산하는바 유용하다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본원에서, "L-아스코르브산"은 유리 L-아스코르브산과, 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염 및 이들의 혼합물 등으로 된 L-아스코르브산염을 포함하는 개념이다.

본원에서, "아미노산"은 자연적으로 발생하는 아미노산 및 합성아미노산과, 아미노산 유사체와 자연발생하는 아미노산과 기능이 유사한 아미노산의태체(amino acid minetics)를 의미한다.

본 발명은 일 관점에서, 다음 단계를 포함하는 글루칸수크라제(glucansucrase)를 이용한 아스코르브산 2-글루코시드(ascorbic acid 2-glucoside)의 생산방법에 관한 것이다:

본 발명은 약학 제제, 사료, 식품 보존제 및 화장품 등 산업적으로 다양하게 이용될 수 있는 아스코르브산 2-글루코시드를 효소학적으로 합성하는 방법에 관한 것으로, 글루칸수크라제를 L-아스코르브산 및 수크로스와 함께 혼합하여 반응시키는 경우 글리코실화 반응을 수행하여 아스코르브산 2-글르코시드(AA-2G)를 생산함을 확인한 것에 기인한다.

종래 아스코르브산 2-글루코시드(AA-2G)는 알파-글루코시다아제 및 싸이클로덱트린 글루카노트랜스퍼라제와 같은 몇몇 효소에 의한 글리코실화 반응에 의하여 합성되는 것이 보고된 바 있으나, 글루칸수크라제에 대한 AA-2G(안정한 L-AsA 글루코시드)의 형성은 보고된 적은 없었다.

본 발명에서는, 먼저 김치 유산균으로부터 페놀-황산법 (Phenol-sulfuric acid)을 이용하여 글루칸 함량이 높은 균주인 Leuconostoc l actis EG001를 선별 (Meulenbeld and Hartmans Biotechnol . and Bioeng., 70(4), 2000)한 후, 선별된 균주로부터 염색체 DNA를 분리한 다음, 이를 주형으로 PCR을 수행하여 글루칸수크 라제 관련 유전자를 증폭시키고, 또한 증폭된 글루칸수크라제 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 대장균에 도입시켜 글루칸수크라제 유전자의 발현을 유도함으로써 글루칸수크라제를 대량으로 제조하였다. 이때, 제조된 글루칸수크라제는 약 165kDa의 분자량을 가지며 서열번호 1의 1500개의 아미노산 서열로 구성되는 효소로서, 이에 본 발명에 있어서, 상기 글루칸수크라제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것임을 특징으로 한다. NCBI BlastP 검색 결과, 상기 L. l actis EG001로부터 유래된 글루칸수크라제는 Leuconostoc mesenteroides (AAN38835)의 dextransucrase (DsrR), Leuconostoc mesenteroides (CAB76565)의 dextransucrase (DsrB), Leuconostoc citreum KM20 (YP_001727410)의 glucosyltransferase에 각각 75%, 70%, 70%의 상동성을 갖는 것으로 나타났으며, 이에 신규한 글루칸수크라제인 것으로 확인되었다.

또한, 상기 글루칸수크라제의 생산을 위하여 대장균에 도입되는 벡터의 글루칸수크라제 유전자는 TTG를 시작코돈으로 하고, TAA를 종결코돈으로 이루어지는 서열번호 2의 4503개의 염기로 구성되는 유전자로서, 이에 상기 글루칸수크라제는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자에 의하여 코딩되는 것임을 특징으로 한다.

본 발명에서는 또한, 제조한 글루칸수크라제를 수크로스 및 L-아스코르브산과 함께 혼합한 반응혼합물과 반응시킨 다음 그 반응산물에 대하여 TLC 분석을 수행한 결과, 수크로스 및 L-아스코르브산은 감소하고 표준 AA-2G와 동일한 R_f 값(R_f value, 0.35)을 가지는 산물이 생성됨을 확인하였다. 아울러, 상기 반응 산물에 대 하여 HPLC 분석을 추가적으로 수행한 결과, 표준 AA-2G와 동일한 retention time에서 피크(peak 2)를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이에 글루칸수크라제에 의한 글리코실화 반응에 의하여 L-아스코르브산 및 수크로스로부터 AA-2G (Ascorbic acid 2-glucoside)가 합성됨을 확인하였다.

이때, 상기 글리코실화 반응을 위한 혼합배양물은 필수적으로 글루칸수크라제, 수크로스 및 L-아스코르브산을 포함하는데, 이외 통상적인 배양을 위한 물질을 포함할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 자명할 것이다. 또한, 본 발명의 실시예에서는 이당류로서 수크로스를 사용하였으나, 이외 락토오스(lactose), 말토오스(Maltose), 트레할로스(trehalose), 셀로비오스(cellobiose), 코지비오스(kojibiose), 니게로스(nigerose), 이소말토스(isomaltose), β,β-트레할로스( β,β-trehalose), 소포로스(sophorose), 라미나리비오스(laminaribiose), 겐티오비오스(gentiobiose), 튜라노스(turanose), 말툴로스(maltulose), 팔라티노스(palatinose), 겐티오비울로스(gentiobiulose), 멜리비오스(melibiose), 루티노스(rutinose) 등 및 그 혼합물을 이용하여 글리코실화 반응을 수행할 수 있다.

한편, Leuconostoc lactis EG001 균주 유래 글루칸수크라제의 최적 반응 조건을 알아보기 위하여, DNS 방법에 의해 반응온도의 영향을 조사한 결과, 효소의 최적 반응온도는 30℃이며, 25℃~35℃에서 상대적으로 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 글리코실화 반응은 바람직하게는 25~35℃에서 수행하며, 더욱 바람직하게는 30℃에서 수행한다.

아울러, 상기 효소의 pH의 영향을 조사한 결과, pH 5에서 최대 활성을 나타내었으며, 산성 pH에서 비교적 안정하다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 글리코실화 반응은 바람직하게는 pH 4.5~6에서 수행하며, 더욱 바람직하게는 pH 5에서 수행한다.

본 발명에 있어서 또한, 상기 합성된 아스코르브산 2-글루코시드의 회수는 반응결과물로부터 분리함으로써 이루어지는데, 예시적으로 분자량 및/또는 친화성 차이를 이용하는 정제방법, 즉, 멤브레인 븐리법, 겔 여과 크로마토그래피법, 컬럼 크로마토그래피법, 고속액체크로마토그래피법 및 이온 교환 크로마토그래피법 등을 이용하여 정제하여 수득할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: Leuconostoc lactis EG001 균주 유래 글루칸수크라제의 발현 및 분리

1-1: 균주의 분리 및 선별

한국전통발효음식인 김치로부터 유산균(lactic acid bacteria, LAB)의 혼합배양물을 분리하였다. 김치 유산균은 MRS 배지 (Proteose peptone No.3 10g/L, Beef Extract 10g/L, Yeast Extract 5g/L, Sucrose 20g/L, Polysorbate 80 1g/L, Ammonium citrate 2g/L, Sodium Acetate 5g/L, Magnesium Sulfate 0.1g/L, Manganese Sulfate 0.05g/L, Dipotassium phosphate 2g/L)에 접종하고 30℃에 배양하였다. 그 다음, 수집된 김치유산균에서 글루칸(glucan) 함량이 높은 균주를 분리하기 위하여 페놀-황산법(Phenol-sulfuric acid)을 실시하였다 (Meulenbeld and Hartmans, Biotechnol . and Bioeng ., 70(4), 2000). 즉, 김치 유산균을 배양한 후, 배양액 100㎕에 75% 에탄올 1㎖을 넣고 침전시켜 건조 후, 증류수 100㎕에 녹였다. 상기 준비된 100㎕의 시료와 5% 페놀 100㎕를 1.5㎖ 튜브에 넣고 실온에서 30초 동안 배양하였다. 튜브를 얼음에 넣고, 125㎕의 황산을 넣은 후 30초 동안 혼합하였다. 그리고 80℃ water bath에서 30분 동안 반응시키고, 튜브를 상온에서 식힌 후, Ultrospec 3100-Pro 스펙트로포토메터(Amersham Biosciences, USA)를 이용하여 흡광도 490nm에서 측정하였다. 이때 기준물질(standard)로 글루코스를 사용하여 글루칸 함량이 높은 균주를 선별하였다.

선별된 균주는 16S rRNA 유전자서열을 NCBI 데이터베이스에서 검색한 결과, L. lactis의 16S rRNA와 99% 일치하는 것으로 나타났다. 이에 선별된 균주는 Leuconostoc lactis EG001로 명명하였다.

1-2: 글루칸수크라제 유전자 분리 및 재조합 벡터 제작

실시예 1-1에서 선별된 글루칸 함량이 높은 균주인 L. lactis EG001 균주를 LB broth (100㎍/㎖ ampicillin)에 배양한 후, 게노믹 DNA를 추출하였다. 샘플 균 주의 염기서열을 알기 위해, 추출한 게노믹 DNA를 template로 사용하고, 기존에 알려져 있는 Degenerate 프라이머(서열번호 3 및 4)를 사용하여 Degenerate PCR을 수행하였다(S. Kralj et al., Biocatalysis and Biotransformation, 21(4-5), 181-187, 2003).

Forward primer: 5'-GAYAAYWSNAAYCCNRYNGTNC-3' (서열번호 3)

Reverse primer: 5'-ADRTCNCCRTARTANAVNYKNG-3' (서열번호 4)

상기에서, Y=C or T, R=A or G, W=A or T, S=G or C, D=A, T or G, V=A, G, or C, K=G or T, N=A,T,G or C임.

즉, 상기 게노믹 DNA 100ng, 10×PCR 완충용액, 10mM dNTP, 각 프라이머 5μM, 1U EF-Taq polymerase(Solgent, Korea)를 포함하는 20㎕의 혼합물에 대하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 3분간 변성 (denaturation)을 수행한 후, 95℃에서 30초간 변성, 52℃에서 1분 풀림 (annealing), 72℃에서 1분 연장 (extension)을 30회 반복하였다. 그리고 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하였다. 확보된 PCR 산물은 pGEM T-easy 벡터(Promega)에 클로닝하고 염기서열을 확인하였다.

그 다음, 전체 글루칸수크라제 단백질을 코딩하는 글루칸수크라제 유전자를 증폭하기 위하여 인버스 PCR(inverse PCR)을 수행하였다. 상기 L. lactis EG001 균주로부터 얻은 게노믹 DNA는 제한효소로 처리한 후, 셀프 라이게이션 (self-ligation)시켰다. 한편, 상기 Degenerate PCR의 결과로 얻은 염기서열로부터 하기 프라이머들을 제작하였다.

1 st PCR 용 프라이머

Forward primer: 5'-CACGATAGTGAAGTGCAAACG-3' (서열번호 5)

Reverse primer: 5'-ATCGTTGGCAGTAATCGAGC-3' (서열번호 6)

2 nd PCR 용 프라이머

Forward primer: 5'-ATAGCTTAGCACCAACAACAGAAC-3' (서열번호 7)

Reverse primer: 5'-GTTTCGCTGGCCTTGTTCA-3' (서열번호 8)

PCR 반응은 25ng의 원형 게노믹 DNA 단편, 10×PCR 완충용액, 10mM dNTP, 각 프라이머 2μM, 2U EF Taq polymerase(Solgent, Korea)를 포함하는 50㎕의 혼합물에 대하여 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 3분간 변성 (denaturation)을 수행한 후, 94℃에서 30초간 변성, 50℃에서 45초 어닐링 (annealing), 72℃에서 2분 연장 (extension)을 30회 반복하였다. 그리고 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하였다. 확보된 PCR 산물은 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하여 시퀀싱하였다.

그리고, Copycontrol Fosmid Library Production Kit을 이용하여 fosmid library를 제작하고 (fosmid library 제작은 Epicentre사의 manual에 따라 제작되었음), 제작된 library를 colony PCR 하여 insert가 제대로 삽입되어 있는 것을 확인 후 fosmid를 정제하였다. Colony PCR 수행전에 하기 서열번호 9 및 10의 프라이머를 제작하였다.

Primer: 5'-ACTGTGGCTTTCAACACCCA-3' (서열번호 9)

Primer: 5'-TGTGCGCGCATCTTGGGTA-3' (서열번호 10)

PCR 증폭을 위해 fosmid library를 D.W.에 희석해서 100ng을 사용하였다. PCR 증폭은 2U LA Taq polymerase(TaKaRa), 10배 polymerase buffer (MgCl₂ 포함) 5㎕, 10mM dNTP 1㎕, 각 프라이머 (5uM) 5㎕, 주형 DNA (염색체 DNA) 25ng을 함유하는 PCR 반응용액 (50㎕)을 준비한 후, 유전자 증폭기를 이용하여 수행하였다.

PCR 반응은 94℃에서 1분간 변성 (denaturation)을 수행한 후, 94℃에서 30초간 변성, 68℃에서 1.5분 어닐링 (annealing)을 30회 반복하였다. 그리고 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하고, 4℃에서 유지시켰다. PCR 수행으로 fosmid library를 선택하여 Alkaline 방법으로 purification 한 뒤 염기서열을 확인하였다.

상기 degenerate PCR, inverse PCR 결과 및 fosmid library의 서열분석 결과를 통하여 Leuconostoc lactis EG001 균주 유래의 글루칸수크라제 유전자 서열을 완결하였는데, 글루칸수크라제 유전자는 TTG를 시작코돈으로 하고, TAA를 종결코돈으로 이루어지는 4503개의 염기로 구성되는 서열번호 2의 핵산서열로 표시된다.

한편, Leuconostoc lactis EG001 균주 유래의 글루칸수크라제를 대장균 BL21(DE3)(Novagen)에서 대량 생산하기 위하여, 상기 확인한 글루칸수크라제 유전자를 발현 벡터인 pET-22b(+)의 NcoI-NotI 부위에 삽입하여 재조합 DNA를 제조하였다.

먼저 글루칸수크라제의 PCR 증폭을 위해 Leuconostoc lactis EG001 균주의 게노믹 DNA를 분리하고, NcoI site을 삽입시킨 서열번호 11의 정방향 프라이머, NotI site를 삽입시킨 서열번호 12의 역방향 프라이머를 제작하였다.

Forward primer: 5'-AT CCATGG ATAGTAACCAAAACACAACTGGTT-3' (서열번호 11)

Backward primer: 5'-AT GCGGCCGC CATATTGACGAGATCACCGTTG-3' (서열번호 12)

PCR 반응은 분리한 게노믹 DNA 100ng, 10×PCR 완충용액, 10mM dNTP, 각 프라이머 0.2μM, 1U Taq polymerase(Solgent, Korea)를 포함하는 20㎕의 혼합물에 대하여 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 3분간 변성 (denaturation)을 수행한 후, 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초 풀림 (annealing), 72℃에서 1분 연장 (extension)을 25회 반복하였다. PCR 산물은 제한효소 NcoI 및 NotI로 자른 후, pET-22b(+) expression vector(Invitrogen, USA)의 NcoI-NotI 부위에 subcloning하여 재조합 벡터를 제조하였다.

1-3: 재조합 대장균 배양에 의한 글루칸수크라제의 발현 및 정제

글루칸수크라제의 과잉 생산을 위하여, 실시예 1-2에서 제조된 재조합 벡터를 대장균 BL21(DE3) (Novagen)에 도입하였고, 얻어진 형질전환체를 100㎍/㎖ 앰피실린 (ampicillin)이 첨가된 LB 액체배지에서 37℃에서 배양하였다. 그 후, OD₆₀₀이 0.5가 되었을 때, 20℃에서 12시간 동안 0.1mM의 IPTG를 처리함으로써 글루칸수크라제의 발현을 유도하였다. 배양체를 원심분리하여 침전된 세포(0.14g)를 회수하고, 회수한 세포를 100mM Tris-HCl 완충용액(pH7.4), 10mM imidazole, 1mM PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride), 및 protease inhibitor cocktail (Roche, USA)을 포함한 5㎖ 용해 완충용액에 현탁하였다. 세포는 초음파로 파쇄한 후, 원심분 리(12000×g, 15min, 4℃)하여 상등액을 회수하였다. 상기 상등액은 2㎖ Ni-NTA agarose와 4℃에서 1시간 동안 혼합하여 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 컬럼은 20mM Tris-HCl (pH 8.0), 300mM NaCl, 및 200mM imidazole을 포함하는 완충용액으로 씻었으며, 250mM imidazole로 보충한 상기 완충용액을 이용하여 단백질을 컬럼에서 용출시켰다. 용출된 단백질은 Amicon Ultra-15 (Millipore, 50K NMWL device)로 농축한 후, 20% 글리세롤(glycerol), 100mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.4)을 포함한 투석 완충용액에 넣어 4℃에서 투석 (dialysis)을 수행하였다.

정제된 효소는 약 165kDa의 분자량을 가지며, 서열번호 1로 표시되는 1500개의 아미노산 서열로 구성되는 것으로 확인되었다.

실시예 2: L. lactis EG001 균주 유래 글루칸수크라제의 분석 및 이를 이용한 아스코르브산 2-글루코시드의 생산

2-1: L. lactis EG001 균주 유래 글루칸수크라제의 분석

실시예 1-3의 정제된 Leuconostoc lactis EG001 균주 유래 글루칸수크라제의 최적 반응 조건을 알아보기 위하여, DNS 방법에 의해 반응온도, pH의 영향을 조사하였다 (Gail Lorenz Miller, Analytical Chemistry, 31(3), 426-428). 즉, 50mM Sodium acetate (pH 5.2), 100mM sucrose, 1mM CaCl₂, 적당히 희석된 정제된 효소를 포함하는 혼합물을 30℃에서 30분간 배양한 다음, 최종 과당(fructose)을 DNS법(DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) 용액 처리 후, 흡광도 측정)으로 측정하였다. 효소의 유닛(U)은 30℃에서 수크로스가 분해되어 분당 생산되는 과당의 μmole 수를 의미한다. 최적 pH를 결정하기 위해서는, 표준 효소반응에서 각기 다른 완충용액을 사용하였다. 최적 pH 결정에 사용된 완충용액은 50mM sodium acetate buffer (pH 3-6), 50mM sodium phosphate buffer (pH 6-8), 그리고 50mM Tris-HCl buffer (pH 8-9)를 사용하였다. 각 pH buffer에서 상대적인 활성을 조사한 결과, 도 1(a)에 나타난 바와 같이, pH 5에서 최대 활성을 나타내었으며, 산성 pH에서 비교적 안정하다는 것을 확인하였다.

또한, 최적 반응온도를 알아보기 위해 정제된 효소를 사용하여 10~50℃ 범위에서 5℃ 간격으로 상대적인 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 1(b)에 나타난 바와 같이, 효소의 최적 반응온도는 30℃이며, 25℃~35℃에서 상대적으로 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 열에 대한 안정성을 조사하기 위해 10~45℃ 범위에서 잔존 활성을 측정하였다. 각 지정된 온도에서 3시간 방치 후에 잔존 활성을 확인한 결과, 도 1(c)에 나타난 바와 같이, 30℃ 이하에서 잔존 활성이 높게 남아있는 것을 확인하였다.

2-2: 아스코르브산 2-글루코시드의 생산

글리코실화 반응은 50mM sodium acetate (pH 5.2), 1 mM MgCl₂,0.1% L-아스코르브산(L-ascorbic acid), 100 mM sucrose, 및 적당히 희석된 정제된 효소를 혼합한 다음, 반응혼합물을 30℃에서 3시간 배양함으로써 수행되었다. 그 후 산물 은 TLC (thin layer chromatography)를 이용하여 분석하였다. 즉, 시료를 실리카 겔 60 F254 TLC 플레이트(Merck, Germany)에 스팟팅한 후, nitromethane/1-propanol/water (2:5:1.5, v/v/v)로 구성되는 용매 시스템으로 전개시켰다. 그리고 나서, 플레이트는 메탄올에서 10% H₂SO₄로 스프레이하여 비주얼화하였다.

그 결과, 도 2(a)에 나타난 바와 같이, 상기 효소 반응을 3시간 동안 수행한 결과(lane 6)를 효소를 포함하지 않거나 효소반응이 일어나기 전의 경우(lane 4 및 5)와 대비하여 보면, 수크로스 및 L-아스코르브산은 감소하고 각각 다른 R_f 값을 가지는 3개의 새로운 산물 (P1, P2 및 P3)이 나타난 것을 확인할 수 있었다 (lane 1: sucrose; lane 2: L-ascorbic acid; lane 3: AA-2G(Ascorbic acid 2-Glucoside); lane 4: non-enzyme; lane 5: enzyme reaction (0h); lane 6: enzyme reaction (3h)). 이러한 반응 산물 중 P2의 R_f 값(R_f value, 0.35)은 standard AA2G의 R_f 값(R_f value, 0.35)과 동일한 것으로 나타났다.

한편, 추가적으로 상기 반응 산물에 대하여, HPLC 분석을 수행하였다. 즉, 이동상으로 0.1 M KH₂PO₄ buffer (pH 2.0)를 이용하고, 0.7 mL/min의 유속으로 하여 Gemini 5㎛ C18 110A column (4.6×250 mm, Phenomenex, USA)로 HPLC (high-performance liquid chromatography)를 수행하였다. 반응산물의 피크는 diode array detector (DAD)를 이용하여 240nm에서 검출되었다.

그 결과, 도 2(b)에 나타난 바와 같이, 상기 반응 산물이 표준 AA2G와 동일 한 retention time에서 피크(peak 2)를 보이는 것을 확인할 수 있었다 (peak 1, L-ascorbic acid; peak 2, AA2G). 이러한 결과는 글루칸수크라제에 의한 글리코실화 반응에 의하여 L-아스코르브산 및 수크로스로부터 AA2G (Ascorbic acid 2-glucoside)가 합성되었음을 의미한다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 Leuconostoc lactis EG001 균주 유래 글루칸수크라제의 pH 변화에 따른 상대적인 활성(a), 온도변화에 따른 상대적인 활성(b) 및 온도변화에 따른 잔존활성의 측정결과(c)를 나타내는 그래프이다.

도 2는 Leuconostoc lactis EG001 균주 유래 글루칸수크라제에 의한 L-아스코르브산 및 수크로스의 글리코실화 반응산물의 TLC 분석결과(A) 및 HPLC 크로마토그래피 분석 결과(B)를 나타낸다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for Preparing Ascorbic Acid 2-Glucoside Using Glucansucrase <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1500 <212> PRT <213> amino acid sequence for glucansucrase derived from Leuconostoc lactis EG001 <400> 1 Leu Glu Asn Ala Thr Gln Val Arg Lys Lys Leu Tyr Lys Ala Gly Lys 1 5 10 15 Asn Trp Val Val Gly Gly Val Ile Thr Ala Gly Ala Ala Leu Ala Phe 20 25 30 Val Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ala Ala Asp Ser Asn Gln Asn Thr Thr 35 40 45 Gly Ser Gln Val Thr Val Thr Ala Pro Glu Ala Ala Ala Ser Ala Thr 50 55 60 Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Pro Thr Thr Ala Ala Ala Thr Thr Thr 65 70 75 80 Ala Ala Gln Ala Asp Thr Ser Ser Ala Thr Thr Pro Gln Pro Pro Val 85 90 95 Ala Pro Thr Thr Pro Val Ala Pro Thr Gln Ala Gln Pro Ala Thr Thr 100 105 110 Ala Ala Thr Thr Glu Gln Pro Gln Gln Pro Ala Ala Asp Thr Thr Pro 115 120 125 Ala Pro Gln Thr Gly Tyr Val Glu Lys Ala Gly Ala Trp Tyr Tyr Val 130 135 140 Asn Ala Asp Gln Ser Tyr Ala Lys Gly Leu Thr 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Ser Gln Leu Gly Leu 355 360 365 Val Glu Asn Pro Thr Pro Tyr Thr Leu Gln Asp Asp Gln Val Ala Leu 370 375 380 Asn Lys Ala Ser Glu Thr Leu Gln Gln Ala Ile Glu Thr Lys Ile Gly 385 390 395 400 Leu Thr Asn Ser Thr Asp Trp Leu Lys Thr Ala Met Ala Asn Phe Ile 405 410 415 Thr Thr Gln Pro Gln Trp Asn Gln Thr Ser Glu Asp Pro Asn Ser Asp 420 425 430 His Leu Gln Lys Gly Ala Leu Thr Phe Val Asn Ser Pro Leu Thr Pro 435 440 445 Asp Thr Asn Ser Ala Phe Arg Leu Leu Asn Arg Thr Pro Ala Asn Gln 450 455 460 Thr Asn Thr Gln Asn Tyr Thr Val Asp Asn Ser Lys Gly Gly Tyr Glu 465 470 475 480 Leu Leu Leu Ala Asn Asp Val Asp Asn Ser Asn Pro Val Val Gln Ala 485 490 495 Glu Gln Leu Asn Trp Leu His Tyr Leu Met Asn Phe Gly Ser Ile Thr 500 505 510 Ala Asn Asp Ala Asp Ala Asn Phe Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val 515 520 525 Asp Asn Val Asp Ala Asp Leu Leu Gln Ile Ala Ala Asp Tyr Phe Lys 530 535 540 Ala Ala Tyr Gly Val Asp Lys Asn Asp Ala Thr Ala Asn Gln His Leu 545 550 555 560 Ser Ile Leu Glu Asp Trp Ser His Asn Asp Pro Leu Tyr Val Asn Asp 565 570 575 Phe Gly Asp Asn Gln Leu Thr Met Asp Asp Tyr Ala His Thr Gln Leu 580 585 590 Ile Trp Ser Leu Thr Lys Asn Ser Asp Ile Arg Gly Thr Met Gln Arg 595 600 605 Phe Met Asp Tyr Tyr Leu Val Asn Arg Ser Gln Asp Ser Thr Glu Asn 610 615 620 Thr Ala Thr Pro Asn Tyr Ser Phe Val Arg Ala His Asp Ser Glu Val 625 630 635 640 Gln Thr Val Ile Ala Gln Ile Val Ser Asp Leu His Pro Asp Val Glu 645 650 655 Asn Ser Leu Ala Pro Thr Thr Glu Gln Leu Leu Glu Ala Phe Lys Val 660 665 670 Tyr Asn Ala Asp Gln Lys Leu Ala Asp Lys Lys Tyr Thr Gln Tyr Asn 675 680 685 Met Pro Ser Ala Tyr Ala Met Leu Leu Thr Asn Lys Asp Thr Val Pro 690 695 700 Arg Val Tyr Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr Asp Asp Gly Gln Tyr Met Ala 705 710 715 720 Thr Lys Ser Pro Tyr Phe Asn Ala Ile Asp Thr Leu Leu Lys Ala Arg 725 730 735 Ile Gln Tyr Val Ala Gly Gly Gln Ala Met Ala Val Asp Asn His Asp 740 745 750 Ile Leu Thr Ser Val Arg Tyr Gly Asn Gly Ala Met Thr Ala Thr Asp 755 760 765 Lys Gly Asp Ala Asp Thr Arg Thr Gln Gly Ile Gly Val Ile Ile Ser 770 775 780 Asn Asn Lys Asp Leu Ala Leu Gln Ala Gly Glu Thr Val Thr Leu His 785 790 795 800 Met Gly Ala Ala His Lys Lys Gln Ala Phe Arg Leu Leu Leu Gly Thr 805 810 815 Thr Gln Asp Gly Leu Asp Tyr Tyr Asn Thr Asp Asp Ala Pro Ile Arg 820 825 830 Tyr Thr Asp Asn Asn Gly Asp Leu Ile Phe Asn Ser Gln Asp Val Tyr 835 840 845 Gly Val Gln Asn Pro Gln Val Ser Gly Phe Leu Ala Val Trp Val Pro 850 855 860 Val Gly Ala Ser Ala Thr Gln Asp Ala Arg Thr Ala Ser Asp Thr Thr 865 870 875 880 Ser His Thr Asp Gly Lys Thr Phe His Ser Asn Ala Ala Leu Asp Ser 885 890 895 Gln Val Ile Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Phe Gln Ala Phe Ala Thr Thr 900 905 910 Pro Asp Glu Tyr Thr Asn Ala Val Ile Ala Lys Asn Gly Ser Leu Phe 915 920 925 Lys Asp Trp Gly Val Thr Ser Phe Gln Leu Ala Pro Gln Tyr Arg Ser 930 935 940 Ser Thr Asp Thr Ser Phe Leu Asp Ser Ile Ile Gln Asn Gly Tyr Ala 945 950 955 960 Phe Thr Asp Arg Tyr Asp Leu Gly Phe Gly Thr Pro Thr Lys Tyr Gly 965 970 975 Thr Val Asp Gln Leu Arg Asp Ala Ile Lys Ala Leu 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Ala Asp Thr 1380 1385 1390 Gly Leu Thr Thr Ile Gly Asp Gln Leu Gln Tyr Phe Gly Thr Asp Gly 1395 1400 1405 Val Gln Val Lys Gly Ala Phe Val Thr Asp Pro Ala Thr Gln Ala Thr 1410 1415 1420 Tyr Tyr Phe Asn Ala Thr Thr Gly Asp Ala Val Ala Asn Gln Tyr Phe 1425 1430 1435 1440 His Ile Lys Gly Asp Trp Tyr Leu Thr Asp Asp Asn Ala Arg Leu Val 1445 1450 1455 Lys Gly Phe Lys Val Val Asn Asn Lys Val Gln His Phe Asp Glu Thr 1460 1465 1470 Thr Gly Val Gln Thr Lys Ser Thr His Leu Thr Lys Ala Gln Lys Gln 1475 1480 1485 Tyr Ile Phe Asp His Asn Gly Asp Leu Val Asn Met 1490 1495 1500 <210> 2 <211> 4503 <212> DNA <213> glucansucrase gene derived from Leuconostoc lactis EG001 <400> 2 ttggaaaacg caacacaagt tagaaaaaaa ctttataaag ccggtaaaaa ctgggtcgtc 60 ggtggtgtca ttacagccgg tgctgcccta gcctttgtcg cgggagcaac gactgctgca 120 gctgatagta accaaaacac aactggttca caggtaacag tgacagcgcc agaagccgca 180 gcgtcagcga cgactacaac gacaacgaca acgccgacca ctgctgcagc aacaacgaca 240 gccgctcagg cagataccag tagtgcaacg acaccacaac cccctgtcgc gcccactaca 300 cctgtagcac caacacaggc acaacctgcc acaaccgcag caacgactga gcaaccgcaa 360 caaccagcag ctgacactac ccctgcccca caaactggct acgtggaaaa agctggggct 420 tggtactatg ttaatgctga tcaatcctat gcaaaaggct taacgaccat tgcgggtcac 480 ttacaatatt ttgataccac tggccgccaa acaaagggcg cctacgtcac agaaaacggc 540 aagacttact attttgacgc taacacgggt aacgccttga ctggcttgca acacgttgcc 600 ggtcaaactg tggctttcaa cacccaaggt gaacaaattt tcagcgactt ttacacggcc 660 gctgacggcc aaacttatta ttttggtacc aacggtcaag ctgcagtcgg tgtcacgagt 720 atcgctggtc acaattatta tttcgacgct gcgggtcaac tgaagaaagg ctatgctggc 780 gaaattgacg gccaaatgcg gacatttgat gccacaactg gtcaagaagt gtcagccacc 840 acgtcacaaa tcacggaagg tttgactgcc caaaatgacg actacacggc ccacaacgcc 900 gtgcatagca ctgccagtgc agactttgat aaccttgatg gttatttgac agcatcatct 960 tggtatcgtc caaccgacat tttgcgcgat ggtaacaagt gggaagcttc aacagccacg 1020 gacatgcgcc caattttgtc ggtttggtgg cctgataagc aaacccaggt cgactacttg 1080 aactacatgt cacaacttgg ccttgtcgaa aacccaacgc cttataccct 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cgtcaatatg 4500 taa 4503 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 gayaaywsna ayccnryngt nc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 adrtcnccrt artanavnyk ng 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 cacgatagtg aagtgcaaac g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 atcgttggca gtaatcgagc 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 atagcttagc accaacaaca gaac 24 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 gtttcgctgg ccttgttca 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 actgtggctt tcaacaccca 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgtgcgcgca tcttgggta 19 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 11 atccatggat agtaaccaaa acacaactgg tt 32 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 12 atgcggccgc catattgacg agatcaccgt tg 32

Claims

다음 단계를 포함하는, 글루칸수크라제(glucansucrase)를 이용한 아스코르브산 2-글루코시드(ascorbic acid 2-glucoside)의 생산방법:

(a) L-아스코르브산 및 이당류를 글루칸수크라제와 함께 혼합하여 글리코실화 반응을 수행하는 단계; 및

(b) 상기 글리코실화 반응으로 생성된 아스코르브산 2-글루코시드를 회수하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 글리코실화 반응은 25~35℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 아스코르브산 2-글루코시드의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 글리코실화 반응은 pH 4.5~6에서 수행되는 것을 특징으로 하는 아스코르브산 2-글루코시드의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 글루칸수크라제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 아스코르브산 2-글루코시드의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 글루칸수크라제는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 아스코르브산 2-글루코시드의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 글루칸스크라제는 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EG001 유래인 것을 특징으로 하는 아스코르브산 2-글루코시드의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 이당류는 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 말토오스(Maltose), 트레할로스(trehalose), 셀로비오스(cellobiose), 코지비오스(kojibiose), 니게로스(nigerose), 이소말토스(isomaltose), β,β-트레할로스( β,β-trehalose), 소포로스(sophorose), 라미나리비오스(laminaribiose), 겐티오비오스(gentiobiose), 튜라노스(turanose), 말툴로스(maltulose), 팔라티노스(palatinose), 겐티오비울로스(gentiobiulose), 멜리비오스(melibiose) 및 루티노스(rutinose)로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 아스코르브산 2-글루코시드의 생산방법.
다음 단계를 포함하는, 글루칸수크라제(glucansucrase)를 이용한 아스코르브산 2-글루코시드(ascorbic acid 2-glucoside)의 생산방법:

(a) L-아스코르브산 및 수크로스를 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 글루칸수크라제와 함께 혼합하여 글리코실화 반응을 수행하는 단계; 및

(b) 상기 글리코실화 반응으로 생성된 아스코르브산 2-글루코시드를 회수하는 단계.
제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 글리코실화 반응은 pH 4.5~6 및 25~35℃의 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 아스코르브산 2-글루코시드의 생산방법.