JP5681359B2

JP5681359B2 - Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−ｌ−システインの製造方法

Info

Publication number: JP5681359B2
Application number: JP2009285979A
Authority: JP
Inventors: 高瀬　秀樹; 秀樹高瀬; 宏之大橋
Original assignee: Mercian Corp
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 2009-12-17
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2029-12-17
Also published as: JP2011125256A

Description

本発明は、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオン[以下、3MH-S-GSHと略記することがある]から生物学的変換によってＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン[以下、3MH-S-Cysと略記することがある]を製造する方法に関する。

Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインは、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンとともに、ワインの重要な香気物質の一つである３−メルカプトヘキサン−１−オール[以下、3MHと略記することがある]の前駆体物質として知られている。３−メルカプトヘキサン−１−オールは、ソーヴィニヨンブラン種などのブドウを原料にして醸造されたワインに含まれることが報告されており、ワイン中に微量に存在するだけでグレープフルーツやパッションフルーツなどのニュアンスを与える重要な成分である。

ワイン中に含まれる３−メルカプトヘキサン−１−オールの生成経路は、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインの変換まではブドウ自身の内在性酵素によって行われ、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインから３−メルカプトヘキサン−１−オールへの変換はアルコール発酵中に酵母によって行なわれていると報告されている(非特許文献１)。

しかしながら、近年Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンが酵母に直接取り込まれ、３−メルカプトヘキサン−１−オールに変換されているという学説も発表された（非特許文献２）。酵母によるこれらの前駆体物質の変換については、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンから３−メルカプトヘキサン−１−オールへの経路、またはＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインから３−メルカプトヘキサン−１−オールへの経路のいずれが主要経路であるかについては未だ定説が確立されていない。

一方、酵母のモデル培地を用いた試験においては、酵母によってアルコール発酵中に起こるＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンから３−メルカプトヘキサン−１−オールへの変換率はＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインから３−メルカプトヘキサン−１−オールへの変換率と比較して１／３０〜１／２０以下であることが報告されている（非特許文献１）。しかし、酵母がＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換を行うという報告はない。

Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換は、前述のようにブドウの内在性酵素によって行われている可能性が示唆されている。しかし、この反応は、主にブドウが樹上で成熟する過程に起こるため、人為的にコントロールすることは困難である。

また、ブドウに含有するＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインを増加させる方法として貴腐菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｘｃｉｎｅｒｅａ）を利用する方法がある（非特許文献３および４）。ブドウに貴腐菌を感染させると、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインの量が増加するが、ブドウに貴腐菌を感染させるには、湿度の高い朝と乾燥した日照のある午後という自然条件が必要であること、さらに果皮が薄めのブドウ品種であること等の条件が必要であり、そのような自然条件を人為的にコントロールすることは困難であり、かつブドウ品種が制限されるという問題点がある。

Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの生物学的変換については、前述の他、Ｉｎｖｉｔｒｏ反応系でγ−ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ（シグマアルドリッチ社製）が変換を行うと報告されている（非特許文献５）。しかしながら、該変換能を有する微生物についての報告例はない。

ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｎｏｌｏｇｙｖｏｌｕｍｅ２：ＴｈｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｗｉｎｅａｎｄＳｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ２００６，ｐ２２２．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．２００８，５６，９２３０−９２３５．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．２００７，５５，１４３７−１４４４．Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ２００８，１１８３，１５０−１５７Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．２００２，５０，４０７６−４０７９．

本発明の第一の目的は、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインを効率的な生物学的変換によって製造する方法を提供することである。第二の目的は該方法により製造し、単離精製したＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインを提供するものである。

本発明者らは、前記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、ブドウの果皮中に３−メルカプトヘキサン−１−オールの前駆体物質であるＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンおよびＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインが存在し、その含有量はＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンの方が上回って存在する場合が多いことを見出した。また、特定の乳酸菌がＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換する能力を有していることを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔７〕に関する。
〔１〕Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンのＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの生物学的変換方法によるＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインの製造方法であって、
（Ａ）前記生物学的変換を行いうるものであり、かつラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物から選ばれる菌株またはその培養菌体の調製物の存在下においてＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンをインキュベーション処理する工程、および
（Ｂ）インキュベーション処理液からＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインを単離する工程、
を包含することを特徴とするＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインの製造方法。
〔２〕工程（A）においてインキュベーション処理液のｐＨが３〜９の範囲、変換温度が１０〜４０℃の範囲、および変換時間が１２〜１４４時間の範囲である〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕工程（A）においてインキュベーション処理液のｐＨが５〜９の範囲である〔１〕または〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕工程（A）においてインキュベーション処理液の温度が２０〜３０℃の範囲である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔５〕工程（A）においてインキュベーション処理液の時間が４８〜９６時間の範囲である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔６〕前記ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がラクトバチルスプランタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルスペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルスマリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｍａｌｉ）またはラクトバチルスヒルガルデイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｉｌｇａｒｄｉｉ）に属する微生物である〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の製造方法で製造したＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン。

本発明の製造方法を用いると、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインを効率良く生産することができる。

本発明の生物学的変換方法では、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物であって、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンをＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインに変換する能力を有する微生物、またはそれらの培養菌体調製物であれば、種および株の種類を問うことなく使用できる。好ましい微生物としては、上記変換能を有するラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルスペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルスマリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｍａｌｉ）およびラクトバチルスヒルガルデイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｉｌｇａｒｄｉｉ）を挙げることができる。また、上記微生物の変換能に比べて、変換能が劣るものの、ラクトバチルスブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルスデルブルウエスキーサブスピーシーズデルブルウエスキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルスデルブルウエスキーサブスピーシーズブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルスアシドフィルス（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐＨｉｌｕｓ）、ラクトバチルスラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルスケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバチルスフルクトサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルスアシディピスチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｉｐｉｓｃｉｓ）、ラクトバチルスファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルスパラカゼイサブスピーシーズトレランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉｓｕｂｓｐ．ｔｏｌｅｒａｎｓ）、ラクトバチルスサケイサブスピーシーズサケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉｓｕｂｓｐ．ｓａｋｅｉ）も使用することができる。接種する乳酸菌は１種類を単独で使用してもよいし、複数を混合して使用してもよい。

本発明によれば、これらのいずれかの菌株またはその培養菌体の存在下で出発原料（または基質）であるＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンがインキュベーション処理される。この処理は、前記菌株を培養する際に、その培養液中に基質を添加して行うかあるいは、場合により前記菌株の培養菌体を、例えばそのままもしくはホモジェナイズ等の処理をした培養菌体調製物の懸濁液中に基質を添加し、インキュベーションして行うこともできる。培養液への基質の添加は、培養前または培養後一定期間経過したときのいずれで行ってもよい。上記菌体は、上記いずれかの菌株を栄養源含有培地に接種し、培養することにより製造することができる。

このような培養菌体の調製物を用意するための菌株の培養または基質が添加された状態で行われる菌株の培養は、原則的には通性嫌気性菌の培養方法に準じて行うことができる。培養に用いられる培地としては、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成、半合成培地、天然培地、などいずれも利用可能である。培地組成としては、炭素源としてのグルコース、果糖などの単糖類、ショ糖、麦芽糖などのオリゴ糖類、多糖類、糖アルコール、グリセロール、クエン酸、リンゴ酸などの有機酸、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、モルト等の炭水化物を単独または組み合わせて用いることができる。窒素源としては、アミノ酸、たんぱく質、尿素、大豆、大豆フレーク、ピーナッツミール、綿花ミール、カゼイン水解物、ペプトン、肉エキス、コーン・スチープリカー、魚粉、乾燥酵母、酵母エキス等の有機窒素源、アンモニウム塩、硝酸塩等の無機窒素源を、単独または組み合わせて用いることができる。その他、例えばパントテン酸カルシウム、ビオチン、ビタミンＢ１等のビタミン類、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、塩化コバルト、硫酸銅、塩化鉄、塩化マンガン、モリブデン酸ナトリウム、硫酸亜鉛等の塩類、重金属塩類も必要に応じ添加使用することができる。また、緩衝作用を持たせるためにリン酸塩等を添加してもよい。天然培地としては、例えばＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンを含むブドウ果皮抽出液が挙げられる。ブドウ果皮抽出液は、そのまま培地として用いてもよいし、さらに前記炭素源、窒素源等を添加してもよい。

培養条件は、前記乳酸菌が良好に生育し得る範囲内で適宜選択することができる。通常、ｐＨ３〜９、１０℃〜４０℃で１２〜１４４時間程度培養する。上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、当業者であれば容易に最適条件を選択できるであろう。

培養液の初発ｐＨは、例えば、ｐＨ３〜９の範囲が適当であり、好ましくはｐＨ４〜９、さらに好ましくはｐＨ５〜９の範囲が望ましい。ｐＨが３を下回った場合、またはｐＨが９を上回った場合には乳酸菌の生育が極端に遅くなるためである。ｐＨ調整にはｐＨ調整剤を用いることができ、ｐＨ調整剤は特に限定されず、公知のｐＨ調整剤を使用することができる。

培養温度は、乳酸菌の増殖に適した温度であればよく、例えば、１０℃〜４０℃の範囲が適当であり、好ましくは１５℃〜３５℃の範囲、さらに好ましくは２０℃〜３０℃の範囲が望ましい。培養温度が１０℃を下回った場合、または培養温度が４０℃を上回った場合には乳酸菌の生育が極端に遅くなるためである。

培養期間は、培養液の初発ｐＨ、培養温度等の条件にもよるが、乳酸菌を接種後１２〜１４４時間の範囲が適当であり、好ましくは２４〜１２０時間の範囲、より好ましくは４８〜９６時間の範囲である。また、培養方法としては、静置培養、振とう培養、深部通気攪拌培養などが挙げられる。

また、培養菌体調製物は、培養終了後、遠心分離または濾過により分離した菌体または予めホモジェナイズ等した菌体を適当な溶液に懸濁して調製する。菌体の懸濁に使用できる溶液は、前記した培地であるか、あるいは水、Ｇｏｏｄ緩衝液（例えば、ＭＯＰＳ緩衝液等）、グリシン‐塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸‐リン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス‐塩酸緩衝液、グリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液などの緩衝液を単独または混合したものである。緩衝液のｐＨは、好ましくはｐＨ３〜９、さらに好ましくはｐＨ４〜９を挙げることができる。

本発明の出発原料（または基質）とは、天然原料由来のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンを含有する天然原料抽出液、天然原料から単離精製されたＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンまたは有機合成で得たＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンのいずれでも良い。天然原料抽出液としては、例えば、ブドウ果皮由来のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンを含有するブドウ果皮抽出液が挙げられる。

こうして生成した目的のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインを反応混合物から単離するには、種々の既知精製手段を選択、組み合わせて行うことができる。例えば、遠心分離により固形物を除いた後、反応液上清をイオン交換吸着樹脂へ吸着、溶出、シリカゲル等によるカラム法あるいは薄層クロマトグラフィー、逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー等を、単独あるいは適宜組み合わせ、場合により反復使用することにより分離精製することができる。

試料中のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンおよびＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインの量は以下の分析法を用いて測定することができる。

（分析法）
試料を０．１％（ｖ／ｖ）蟻酸を含む１０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液を用いて適当な倍率で希釈し、０．４５μｍのフィルターでろ過したものをＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを用いて定量する。検量線を引くために用いた標品については、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンはＣ．Ｐ．ｄｅｓＧａｃｈｏｎｓ、Ｔ．Ｔｍｉｎａｇａらの方法（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．２００２，５０，４０７６−４０７９．）に従い、またＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインはＣ．Ｔｈｉｂｏｎ、Ｓ．Ｓｈｉｎｋａｒｕｋらの方法（Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ２００８，１１８３，１５０−１５７．）に従い、有機合成することで得た。

[使用機器]
３２００ＱＴＲＡＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（ＡｐｌｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
[ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件]
インターフェース：ＴｕｒｂｏＶｓｏｕｒｃｅ
イオン化モード：ＥＳＩ（ｐｏｓｉｔｉｖｅモード）
イオン源パラメーター：ｃｕｒｔａｉｎｇａｓ１５ｐｓｉ、ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｇａｓ３ｐｓｉ、ｉｎｏｓｐｒａｙｖｏｌｔａｇｅ５５００Ｖ、ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ７００℃、ｉｏｎｓｏｕｒｃｅｇａｓ１７０ｐｓｉ、ｉｏｎｓｏｕｒｃｅｇａｓ２７０ｐｓｉ、ｉｎｔｅｒｆａｃｅｈｅａｔｅｒＯＮ
測定モード：ＭＲＭモード
選択イオン：Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンｍ／ｚ４０８．２→１６２．１（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｅｎｅｒｇｙ２７Ｖ)、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインｍ／ｚ２２２．２→８３．２（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｅｎｅｒｇｙ１９Ｖ)

[ＬＣ条件]
カラム：アトランティス（Ａｔｌａｎｔｉｓ）Ｔ３、３μｍ、２．１×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社）
カラム温度：４０℃
注入量：１０μｌ
移動相Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）蟻酸を含む水
移動相Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）蟻酸を含むアセトニトリル
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
グラジェント：移動相Ａと移動相Ｂの混合率を移動相Ａ：移動相Ｂ＝９０：１０から移動相Ａ：移動相Ｂ＝０：１００まで１０分かけて上げ、その後移動相Ａ：移動相Ｂ＝９０：１０に戻し、５分間キープした。

以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１各種ブドウの果汁および果皮（果汁搾汁粕）中の３−メルカプトヘキサン−１−オール前駆体物質の含有量の測定
表１に記載した各種ブドウを手動の圧搾式ジューサーで搾汁し、果汁と果皮（果汁搾汁粕）を得た。果皮からの３−メルカプトヘキサン−１−オール前駆体物質の抽出は、果皮２０ｇに対して２．５倍量の水（５０ｇ）を加え、１０℃で２４時間浸漬することにより行った。各種ブドウの果汁、果皮１００ｇ当たりに含有する３−メルカプトヘキサン−１−オール前駆体物質の含有量（μｇ）を上記分析方法で測定した。結果を表１に示す。

実施例２ＭＲＳ培地を用いた各種乳酸菌のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換能力の評価（１）
Ｄｉｆｃｏ社製ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＭＲＳＢｒｏｔｈを１Ｌのイオン交換水に５５ｇ混合し、オートクレーブにより滅菌することでＭＲＳ培地（ｐＨ６．５）を作成し、クリーンベンチ内でＣ．Ｐ．ｄｅｓＧａｃｈｏｎｓ、Ｔ．Ｔｍｉｎａｇａらの方法で調製したＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンを１２５０ｎＭとなるように混合した。これを滅菌済１５ｍｌファルコンチューブに約１０ｍｌずつ分注し、そこに各種乳酸菌を最終濃度１０⁶〜１０⁹ ｃｆｕ／ｍｌの範囲で接種し、３０℃で７２時間培養後、培養混合物中のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインを測定した。結果を表２に示す。

結果、ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルスペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ロイコノストックメセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ぺディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）がＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換能力を有していた。なかでもラクトバチルスペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）が高い変換能力を有していた。

実施例３ＭＲＳ培地を用いた各種乳酸菌のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換能力の評価（２）
実施例２と同様にＭＲＳ培地（ｐＨ６．５）を作成し、有機合成により調製したＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンを１０００ｎＭになるように溶解させ、次いで滅菌済１５ｍｌファルコンチューブに約１０ｍｌずつ分注した。これに表３記載の各種乳酸菌を最終濃度１．０×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌで接種し、３０℃で７２時間静置培養した後、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンとＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインの濃度を実施例1と同様の分析方法で測定した。結果を表３に示す。

結果、表３に記載の全てのラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌がＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換能力を有していた。なかでもラクトバチルスデルブルウエスキーサブスピーシーズデルブルウエスキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルスデルブルウエスキーサブスピーシーズブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルスマリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｍａｌｉ）、ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）が高い変換能力を有していた。

実施例４果皮抽出液を用いた各種乳酸菌のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換能力の評価（１）
ブドウ（シャルドネ種）をメンブランプレス（ブーハー・バスラン社製）で搾汁して得た水分含量６６．８％（ｗ／ｗ）のブドウ果皮を１ヶ月間冷凍保存した。冷凍状態のブドウ果皮１．５ｋｇに対して、３．０ｋｇ（２倍量）の水を加え、２０℃で２４時間浸漬後、手動の圧搾式ジューサーで圧搾し、Ｂｒｉｘ５％のブドウ果皮抽出液を得た。得られたブドウ果皮抽出液にベントナイトを５００ｐｐｍ添加後３０分攪拌し、５℃で２４時間静置した。上澄みを珪藻土濾過した後、フラッシュエバポレーターにて品温６０℃で減圧濃縮し、Ｂｒｉｘ５０％まで濃縮した。ブドウ果皮抽出液の３−メルカプトヘキサン−１−オール前駆体物質濃度を測定し、Ｂｒｉｘ２０％換算で算出したところ、ブドウ果皮抽出液中に含まれる３−メルカプトヘキサン−１−オール前駆体物質濃度は、９０１４．２ｎＭ{Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン:２８９５．８ｎＭ、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオン:６１１８．４ｎＭ}であった。

このブドウ果皮抽出液をＢｒｉｘ２０％に調整し、出発原料とした。このとき、出発原料中に含まれる３−メルカプトヘキサン−１−オール前駆体物質濃度は、９０１４．２ｎＭ{Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン:２８９５．８ｎＭ、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオン:６１１８．４ｎＭ}であった。これに発酵助成剤ＦｅｒｍａｉｄＫ（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ社）１００ｍｇ／ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／ｌを加え、１００ｍｌずつ１８０ｍｌ容のガラス容器に分注した。このとき、ｐＨは４．４であった。表４記載の乳酸菌をそれぞれ最終濃度１．０×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌで接種し、２０℃で２４時間静置培養した。培養した後、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンとＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインの濃度を実施例１と同様の分析方法で測定した。また、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン生成量は培養後の培養液中のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン濃度から培養前の出発原料中のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン濃度を引くことで求めた。結果を表４に示す。

結果、表４に記載の全てのラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）がＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換能力を有していた。

実施例５果皮抽出液を用いた各種乳酸菌のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換能力の評価（２）
ブドウ（シャルドネ種）をメンブランプレス（ブーハー・バスラン社製）で搾汁して得た水分含量６６．８％（ｗ／ｗ）のブドウ果皮を３０〜５０日間冷凍保存した。冷凍状態のブドウ果皮８ｔに対して１６ｔ（２倍量）の水を加え、１５〜２０℃でメンブランプレス（ブーハー・バスラン社製）内で回転させながら３時間浸漬した後、圧搾し、Ｂｒｉｘ４．６％のブドウ果皮抽出液を得た。得られたブドウ果皮抽出液に混濁成分の沈降促進のため、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）１０００ｐｐｍとベントナイト５００ｐｐｍ添加後３０分攪拌し、５℃で２４時間静置した。上澄みを遠心（４０００ｒｐｍ）し、９５℃で加熱殺菌した後、真空薄膜式循環濃縮機にて品温３０〜４０℃で減圧濃縮し、Ｂｒｉｘ５０％まで濃縮した。ブドウ果皮抽出液の３−メルカプトヘキサン−１−オール前駆体物質濃度を測定し、Ｂｒｉｘ２０％換算で算出したところ、ブドウ果皮抽出液中に含まれるＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンが１９６０．８ｎＭ（８００ｐｐｂ）（Ａ）、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインが５２０３．６ｎＭ（１１５０ｐｐｂ）（Ｂ）であり、３−メルカプトヘキサン−１−オール前駆体物質濃度{（Ａ）＋（Ｂ）}は７１６４．４ｎＭ（１９５０ｐｐｂ)であった。

このブドウ果皮抽出液をおよそＢｒｉｘ２０％（ｐＨ４．２)に調整し、これを出発原料とした。このとき、出発原料中に含まれる３−メルカプトヘキサン−１−オール前駆体物質濃度は７１６５ｎＭ{Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン:５２０４ｎＭ、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオン:１９６１ｎＭ}であった。この出発原料を３００ｍｌずつ３６０ｍｌ容のガラス容器に分注し、表５記載の乳酸菌を最終濃度１．０×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌで接種し、３０℃で４８時間静置培養した。培養した後、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンとＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインの濃度を実施例1と同様の分析方法で測定した。また、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン生成量は培養後の培養液中のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン濃度から培養前の出発原料中のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン濃度を引くことで求めた。結果を表５に示す。

結果、表５に記載の全てのラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌がＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換能力を有していた。なかでもラクトバチルスヒルガルデイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルスマリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｍａｌｉ）が高い変換能力を有していた。

実施例６Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換（反応時間の変動が及ぼす影響）
実施例４と同様に、ブドウ果皮を水で抽出し、濃縮することで得たブドウ果皮抽出液をおよそＢｒｉｘ２２％（ｐＨ４．２)に調整し、これを出発原料とした。このとき、出発原料中に含まれる３−メルカプトヘキサン−１−オール前駆体物質濃度は８０２８．１ｎＭ{Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン：６２４４．３ｎＭ、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオン：１７８３．８ｎＭ}であった。出発原料５００ｍｌを７５０ｍｌ容のガラス容器に分注し、乳酸菌（ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）：ｖｉｎｉｆｌｏｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ（クリスチャンハンセン社製）を最終濃度３．５×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌで接種し、２０℃で１４４時間静置培養した。経時的にサンプリングを行い、乳酸菌によるＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換推移を調べた。サンプリングした培養液中のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンとＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインの濃度を実施例１と同様の方法で分析した。また、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン生成量は培養後の培養液中のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン濃度から培養前の出発原料中のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン濃度を引くことで求めた。結果を表６に示す。

実施例７Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換（培養時のｐＨが及ぼす影響）
実施例４と同様に、ブドウ果皮を水で抽出し、濃縮することで得たブドウ果皮抽出液をおよそＢｒｉｘ２０％に調整し、これを出発原料とした。このとき、出発原料中に含まれる３−メルカプトヘキサン−１−オール前駆体物質濃度は５６６９．４ｎＭ{Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン:４４１６．３ｎＭ、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオン:１２５３．１ｎＭ}であった。この出発原料各５００ｍｌを水酸化ナトリウム、塩酸を用いて初発ｐＨをｐＨ２〜９のいずれかに調整した後、７５０ｍｌ容のガラス容器に分注し、培養温度２０℃で乳酸菌ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）：ｖｉｎｉｆｌｏｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ（クリスチャンハンセン社製）を最終濃度６．０×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌで接種し、４８時間静置培養した。培養した後、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンとＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインの濃度を実施例１と同様の方法で分析した。また、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン生成量は培養後の培養液中のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン濃度から培養前の出発原料中のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン濃度を引くことで求めた。結果を表７に示す。

実施例８Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンからＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの変換（培養温度の変動が及ぼす影響）
実施例４と同様に、ブドウ果皮を水で抽出し、濃縮することで得たブドウ果皮抽出液をおよそＢｒｉｘ２２％（ｐＨ４．２）に調整し、これを出発原料とした。このとき、出発原料中に含まれる３−メルカプトヘキサン−１−オール前駆体物質濃度は６２１６．５ｎＭ{Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン:４７９６．４ｎＭ、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオン:１４２０．１ｎＭ}であった。この出発原料各５００ｍｌを７５０ｍｌ容のガラス容器に分注し、１０〜４０℃の各培養温度で乳酸菌ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）：ｖｉｎｉｆｌｏｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ（クリスチャンハンセン社製）を最終濃度６．０×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌで接種し、４８時間静置培養した。培養後、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンとＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインの濃度を実施例１に記載した方法で分析した。また、Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン生成量は培養後の培養液中のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン濃度から培養前の出発原料中のＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システイン濃度を引くことで求めた。結果を表８に示す。

Claims

Ｓ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンのＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインへの生物学的変換方法によるＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインの製造方法であって、
（A）前記生物学的変換を行いうるものであり、かつラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物から選ばれる菌株またはその培養菌体の調製物の存在下においてＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−グルタチオンをインキュベーション処理する工程、および
（B）インキュベーション処理液からＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインを単離する工程、
を包含することを特徴とするＳ−３−（ヘキサン−１−オール）−Ｌ−システインの製造方法。
工程（A）においてインキュベーション処理液のｐＨが３〜９の範囲、インキュベーション処理液の温度が１０〜４０℃の範囲、およびインキュベーション処理の時間が１２〜１４４時間の範囲である請求項１に記載の製造方法。
工程（A）においてインキュベーション処理液のｐＨが５〜９の範囲である請求項１または請求項２に記載の製造方法。
工程（A）においてインキュベーション処理液の温度が２０〜３０℃の範囲である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
工程（A）においてインキュベーション処理の時間が４８〜９６時間の範囲である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
前記ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルスペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルスマリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｍａｌｉ）またはラクトバチルスヒルガルデイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｉｌｇａｒｄｉｉ）に属する微生物である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。