CN105949043A - 一种抗菌消炎化合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌消炎化合物的制备方法，包括：酶解：将紫草粉碎，分散于水中，加入复合酶制剂进行酶解；以质量百分比计，所述复合酶制剂的组成为：纤维素酶，50～80％；果胶酶，15～30％；其余为木聚糖酶；所述复合酶制剂的平均酶活为10000～50000单位；所述复合酶制剂的添加量为紫草质量的0.2～0.8％；碱水提取：酶解后向体系中加入氢氧化钠进行提取，得紫草萃取物；分离纯化：从所述的紫草萃取物中分离纯化得所述的紫草素。本发明公开了生产周期短、步骤少、损耗低、绿色环保的高纯度紫草素生产工艺。
Description
技术领域
本发明涉及化合物制备，具体涉及从紫草中提取和纯化紫草素的方法。
背景技术
紫草素(Shikonin)具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节、杀菌、抗病毒等作用。由于提取技术和分离纯化成本过高，目前国内以紫草素为原料的新药产品暂未正式进入市场，因此紫草素提取和纯化技术的突破，是实现该天然产物进一步开发成药物制剂的关键。
目前市场上能够规模化提供的紫草素仅仅为含量不到0.5％的粗提物，具有高纯度(含量达90％以上)紫草素制备能力的机构寥若星辰，其制备规模仅仅为实验室毫克级。能够规模化生产的高纯度高收率紫草素是国内外趋之若鹜的亟需品。2015年刘晓华等采用正交设计，得到优化工艺即为用20倍用量的95％乙醇在60℃浸提两次，时间为4h，提取中发现温度超过60℃，紫草素的破坏程度较大。与我们试验结果一致，乙醇提取浓缩对紫草素破坏很大。2010年李根优选出油法提取紫草素的最佳工艺。方法以紫草素的含量为工艺考察指标，用高效液相色谱建立左旋紫草素含量测定方法，结果选用紫草，加8倍菜籽油，温度140℃，加热0.5h为最优提取工艺。结论优选的提取工艺合理、可行，质量可控。但油浸法生产成本太高。
因此提供一种低生产成本，高纯度的紫草素的制备方法都具有较大的现实意义。
发明内容
为解决上述从紫草中提取紫草素的现有技术存在的问题，本发明人经过大量的生产实践，终于发明出一种生产周期短、步骤少、损耗低、绿色环保的高纯度紫草素生产工艺。
一种抗菌消炎化合物的制备方法，包括：
(1)酶解：将紫草粉碎，分散于水中，加入复合酶制剂进行酶解；
以质量百分比计，所述复合酶制剂的组成为：纤维素酶，50～80％；果胶酶，15～30％；其余为木聚糖酶；所述复合酶制剂的平均酶活为10000～50000单位；所述复合酶制剂的添加量为紫草质量的0.2～0.8％；
(2)碱水提取：酶解后向体系中加入氢氧化钠进行提取，得紫草萃取物；
(3)分离纯化：从所述的紫草萃取物中分离纯化得所述的紫草素。
紫草经过粉碎可充分提高提取效果，但也不能粉碎太细，否则不好过滤，一般粉碎至10～40目，优选为20目。
本申请采用廉价无污染的水作为提取溶剂，紫草粉碎后分散于水中，一般液料比(即提取溶剂与原料紫草的体积质量比)为10～16：1，优选为12～14:1。
复合酶为一定比例的纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶，可以充分水解紫草的植物细胞壁纤维和其中的胶质，有利于下一步碱水提取紫草过程中，紫草素的充分释放和溶出。复合酶制剂的配比为纤维素酶质量分数50～80％，果胶酶质量分数为15～30％，其余为木聚糖酶,复合酶制剂的平均酶活为10000～50000单位，酶活单位遵从1961年国际酶学会议规定，是指在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。优选的，以质量百分比计，所述复合酶制剂的组成为：纤维素酶，50～65％；果胶酶，20～30％；其余为木聚糖酶。复合酶制剂的平均酶活为35000～45000单位。更优选的，以质量百分比计，所述复合酶制剂的组成为：纤维素酶，50％；果胶酶，30％；其余为木聚糖酶。
优选的，所述复合酶制剂的添加量为紫草质量的0.2～0.4％，更优选为0.2％。
另外，适宜的酶解时间和温度有利于充分提取紫草素，所述酶解的时间6～15小时，酶解的温度35～55℃。优选的，所述酶解的时间6～12小时，酶解的温度35～45℃。更优选的，所述酶解的时间12小时，酶解的温度45℃。
为提高酶解效果，酶解过程中不断搅拌。
酶解结束后即可进行碱水提取，氢氧化钠的浓度可以为20％(水溶液)，其加入量为至氢氧化钠的终浓度为0.2～0.5M，提取时间1～2h，采用浓适中的碱浓度，可以减少副产物的产生，提取时间过短，水解不完全，提取时间过长，也会增加副产物，提取可在室温中进行，并在提取过程中进行搅拌。
碱水提取得到紫草素萃取物。由于紫草素属于小极性物质，通常采用有机溶剂提取，但在碱性条件下，紫草素可以形成可溶性盐，并且紫草素的其他酰基化衍生物也可以在碱水中全部水解转化为紫草素可溶性盐。
所述的分离纯化包括：将所述的紫草素萃取物过滤后经氧化铝柱层析、甲醇解析、浓缩、干燥得到紫草素粗品，紫草素粗品经乙醇结晶，过滤并干燥后得纯度大于98％的紫草素纯品。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
本发明先用复合酶制剂酶解处理紫草，降解紫草中的细胞壁纤维素和果胶类物质，让包裹在其中的紫草素在碱水提取条件下，充分从紫草中释放和溶出，有效缩短了提取时间，提高了有效成分的提取率，而使用碱水直接提取达不到这样的提取效果；并且碱水条件下将紫草素衍生物全部转化为紫草，紫草素收率进一步提高；避免使用有机溶剂，减少了脂溶性杂质的溶出，有利于后续简化纯化工艺。
本发明采用水作为提取溶剂，无毒，廉价易得。
综上所述，本发明通过将以上多项技术进行有效集成，实现了从紫草中提取和纯化紫草素的低成本、少步骤、低损耗和绿色环保生产，市场竞争力强，应用前景广阔。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
纤维素酶：河北百味生物科技有限公司，批号15112586。
果胶酶：河北百味生物科技有限公司，批号15100725。
木聚糖酶：河北百味生物科技有限公司，批号16041806。
实施例1
(1)原料药材的处理：将原料紫草进行粉碎，粉碎至20目；
(2)酶解：加入12倍(即液料比为12：1)纯化水和药材质量0.4％的复合酶制剂进行酶解，酶解时间10小时，酶解温度45℃，酶解过程中不断搅拌；
复合酶制剂组成为：纤维素酶质量分数60％，果胶酶质量分数为25％，其余为木聚糖酶，复合酶制剂的平均酶活为45000单位。
(3)碱水提取：酶解后加入质量分数为20％的氢氧化钠溶液，至氢氧化钠终浓度为0.3M，室温搅拌2h提取紫草素，得到紫草素萃取物。
(4)分离纯化：将萃取物过滤后经6倍量氧化铝柱层析、3倍柱体积的甲醇解析、浓缩、干燥得到紫草素粗品；紫草素粗品经乙醇三次结晶，过滤并干燥后得纯度98.5％的紫草素纯品，收率为84.6％。
本领域人员可以理解：“将萃取物过滤后经6倍量氧化铝柱层析、3倍柱体积的甲醇解析、浓缩、干燥得到紫草素粗品”的含义为：将萃取物过滤后加入到填料为氧化铝的层析柱中，然后用3倍柱体积的甲醇进行洗脱，洗脱下来的溶液进行浓缩、干燥得到紫草素粗品，其中，6倍量是指柱体积为上样量的六倍。
实施例2
(1)原料药材的处理：将原料紫草进行粉碎，粉碎至20目；
(2)微波辅助酶解：加入10倍纯化水和药材质量0.2％的复合酶制剂进行酶解，酶解时间6小时，酶解温度35℃，酶解过程中不断搅拌；
复合酶制剂组成为：纤维素酶质量分数50％，果胶酶质量分数为30％，其余为木聚糖酶,复合酶制剂的平均酶活为35000单位。
(3)碱水提取：解后加入质量分数为20％的氢氧化钠溶液，至氢氧化钠终浓度为0.2M，室温搅拌1h提取紫草素，得到紫草素萃取物。
(4)分离纯化：将萃取物过滤后经6倍量氧化铝柱层析、3倍柱体积的甲醇解析、浓缩、干燥得到紫草素粗品；紫草素粗品经乙醇三次结晶，过滤并干燥后得纯度98.2％的紫草素纯品，收率为82.3％。
实施例3
(1)原料药材的处理：将原料紫草进行粉碎，粉碎至20目；
(2)微波辅助酶解：加入16倍纯化水和药材质量0.8％的复合酶制剂进行酶解，酶解时间15小时，酶解温度55℃，酶解过程中不断搅拌；
复合酶制剂组成为：纤维素酶质量分数80％，果胶酶质量分数为15％，其余为木聚糖酶,复合酶制剂的平均酶活为30000单位。
(3)碱水提取：解后加入质量分数为20％的氢氧化钠溶液，至氢氧化钠终浓度为0.2～0.5M，室温搅拌2h提取紫草素，得到紫草素萃取物。
(4)分离纯化：将萃取物过滤后经6倍量氧化铝柱层析、3倍柱体积的甲醇解析、浓缩、干燥得到紫草素粗品；紫草素粗品经乙醇三次结晶，过滤并干燥后得纯度98.6％的紫草素纯品，收率为81.4％。
实施例4
改变酶制剂中各酶的含量，其余实施例3，进行紫草素的提取。
表1
| 纤维素酶 | 果胶酶 | 木聚糖酶 | 紫草素纯度 | 紫草素收率 | |
| 实验组4-1 | 50％ | 15％ | 35％ | 98.2％ | 85.3％ |
| 实验组4-2 | 80％ | 15％ | 5％ | 98.5％ | 82.9％ |
| 实验组4-3 | 65％ | 20％ | 15％ | 98.6％ | 84.1％ |
| 实验组4-4 | 50％ | 30％ | 20％ | 98.3％ | 87.2％ |
| 对比组4-1 | 30％ | 50％ | 20％ | 89.3％ | 74.9％ |
| 对比组4-2 | 90％ | 5％ | 5％ | 84.6％ | 78.1％ |
实施例5
改变纯化水的加入量，其余制备步骤及参数同实施例3，进行紫草素的提取。
表2
实施例6
改变复合酶制剂的加入量，其余制备步骤及参数同实施例3，进行紫草素的提取。
表3
| 复合酶制剂 | 紫草素纯度 | 紫草素收率 | |
| 实验组6-1 | 0.2％ | 98.7％ | 83.7％ |
| 实验组6-2 | 0.4％ | 98.4％ | 82.2％ |
| 实验组6-3 | 0.6％ | 98.6％ | 81.8％ |
| 对比组6-1 | 1.2％ | 93.6％ | 68.8％ |
| 对比组6-1 | 0.1％ | 98.6％ | 56.8％ |
实施例7
改变酶解的时间和温度，其余制备步骤及参数同实施例3，进行紫草素的提取。
表4
| 酶解时间 | 酶解温度 | 紫草素纯度 | 紫草素收率 | |
| 实验组7-1 | 6h | 55℃ | 98.4％ | 83.8％ |
| 实验组7-2 | 8h | 55℃ | 98.5％ | 81.8％ |
| 实验组7-3 | 12h | 55℃ | 98.1％ | 84.1％ |
| 对比组7-1 | 4h | 55℃ | 98.6％ | 74.6％ |
| 对比组7-2 | 18h | 55℃ | 94.8％ | 85.1％ |
| 实验组7-4 | 15h | 45℃ | 98.6％ | 85.3％ |
| 实验组7-5 | 15h | 35℃ | 98.4％ | 76.3％ |
| 对比组7-3 | 15h | 20℃ | 95.5％ | 72.6％ |
| 对比组7-4 | 15h | 60℃ | 94.3％ | 67.1％ |
对比例1
本实施例为不采用复合酶进行酶解，直接碱水提取，步骤如下：
(1)原料药材的处理：将原料紫草进行粉碎，粉碎至20目，加入16倍纯化水；
(2)碱水提取：向体系中加入质量分数为20％的氢氧化钠溶液，至氢氧化钠终浓度为0.2～0.5M，室温搅拌2h提取紫草素，得到紫草素萃取物。
(3)分离纯化：将萃取物过滤后经氧化铝柱层析、甲醇解析、浓缩、干燥得到紫草素粗品；紫草素粗品经乙醇三次结晶，过滤并干燥后得纯度98.6％的紫草素纯品，收率为34.4％。
本发明按照上述实施例进行了说明应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种抗菌消炎化合物的制备方法，其特征在于，包括：
(1)酶解：将紫草粉碎，分散于水中，加入复合酶制剂进行酶解；
以质量百分比计，所述复合酶制剂的组成为：纤维素酶，50～80％；果胶酶，15～30％；其余为木聚糖酶；所述复合酶制剂的平均酶活为10000～50000单位；所述复合酶制剂的添加量为紫草质量的0.2～0.8％；
(2)碱水提取：酶解后向体系中加入氢氧化钠进行提取，得紫草萃取物；
(3)分离纯化：从所述的紫草萃取物中分离纯化得所述的紫草素。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，紫草粉碎至20～40目。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，液料比为10～16：1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以质量百分比计，所述复合酶制剂的组成为：纤维素酶，50～65％；果胶酶，20～30％；其余为木聚糖酶。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述复合酶制剂的添加量为紫草质量的0.2～0.4％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的时间6～15h，酶解的温度35～55℃。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，氢氧化钠在体系中的终浓度为0.2～0.5M。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，碱水提取的时间为1～2h。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的分离纯化包括：将所述的紫草素萃取物过滤后经氧化铝柱层析、甲醇解析、浓缩、干燥得到紫草素粗品，紫草素粗品经乙醇结晶，过滤并干燥后得所述的紫草素。
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