CN104127466B

CN104127466B - 一种淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂及其应用

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Publication number: CN104127466B
Application number: CN201410419546.0A
Authority: CN
Inventors: 陈彦; 高霞; 王莹
Original assignee: Jiangsu Provincial Insititute of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Jiangsu Provincial Insititute of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2013-08-23
Filing date: 2014-08-22
Publication date: 2018-05-22
Anticipated expiration: 2034-08-22
Also published as: CN104127466A

Abstract

本发明涉及一种淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂及其应用，属于医药技术领域。它是以淫羊藿总黄酮、水解酶、生物粘附制剂及其它药剂学中常用的辅料制备成的可供口服的肠溶胶囊、肠溶丸剂或肠溶片剂等。按照本发明提供的技术方案开发的淫羊藿总黄酮仿生酶解口服给药系统在体内肠道环境下（37℃，pH 5.2~7.4），淫羊藿总黄酮可在肠道排空时间之前被完全酶解成更利于吸收的次级苷及苷元形式，并通过加入生物黏附剂延长该给药系统在肠道吸收位点的滞留时间，从而实现药物的“实时酶解，实时吸收”，进一步保证淫羊藿黄酮苷能充分酶解并提高生物利用度，为骨质疏松等症提供更有效、更稳定的治疗手段。

Description

一种淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，该制剂是将淫羊藿总黄酮、水解酶、生物粘附剂及药剂学中常用的辅料制备成肠溶胶囊、肠溶丸剂或肠溶片剂等，本发明还涉及该口服肠溶制剂的应用，属于医药技术领域。

背景技术

淫羊藿作为传统的补肾中药，在民间沿用已有千年历史，具有补肾阳，强筋骨、祛风湿的作用，临床常用于治疗阳痿遗精，筋骨萎软，风湿痹痛等症。

淫羊藿含有多种黄酮类成分，其中8-异戊烯基取代黄酮苷是其主要代表性活性黄酮，主要有淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B，朝藿定C和宝藿苷I等（结构见图1）。现代药理研究表明，淫羊藿异戊烯基取代黄酮苷具有很好的生物活性，除具有抗氧化、抗抑郁、抗肿瘤等作用外，还具有很好的抗骨质疏松活性。其作为一种有效的植物雌激素，可以选择性地和植物雌激素受体结合，治疗妇女更年期因雌激素缺乏引起骨丢失而导致的骨质疏松；另外还能够增强成骨细胞的分化增殖、促进骨基质钙化、抑制破骨细胞分化，从而抗骨质疏松，且次级苷和淫羊藿苷元的作用较强。

本课题组研究及已有文献表明，淫羊藿黄酮苷肠道渗透性低，吸收较差，水解是淫羊藿黄酮苷生物转化的起始步骤，去糖基化使得糖苷易于在肠道扩散和吸收。口服淫羊藿黄酮苷，主要以肠道代谢产物（次级苷或苷元）的形式被吸收而发挥疗效。但人体肠道内存在的水解酶（肠道粘膜酶和肠道菌酶）会因病理、人种、年龄、饮食、药物的影响而不同；且本课题组前期研究证实骨质疏松病理状态下，存在肠道酶与肠道菌缺失的现象，因此难以保证口服淫羊藿黄酮苷后能在肠道稳定快速地被水解吸收。因此，目前相关淫羊藿黄酮抗骨质疏松的制剂与专利如：如中国专利CN200610094777.4公开的一种仙茅总苷和淫羊藿总黄酮药物组合物及制备方法和用途，是直接将淫羊藿总黄酮、仙茅总苷和药学上的辅料组合制成固体或液体制剂，并不能很好地提高淫羊藿黄酮的生物利用度。虽然如中国专利CN03129242.9公开了一种含淫羊藿素、去甲基淫羊藿素的药物组合物及其用途，但由于淫羊藿素、去甲基淫羊藿素溶解度很低，仍然存在肠道难于溶解吸收等问题，此外为了提高淫羊藿黄酮苷的生物利用度，提高药效，人们尝试了多种药剂学方法，如制备自乳化软胶囊，速释滴丸、磷脂复合物、微孔渗透泵控释片以及PVP载药纳米纤维膜等给药系统，并通过体外溶出度测定和动物模型证实了这些方法虽能不同程度的提高淫羊藿总黄酮的生物利用度，但这些方法大多是通过增加淫羊藿黄酮原型药物的分散度而促进药物在体内的溶出过程，在制剂的过程中并没有考虑药物在体内的生物转化和吸收的具体过程，更没有考察在体内相关酶活力下降以及微生物菌群失调等特殊的生理病理状态下药物代谢及吸收情况的变化，因而在实际的临床应用中往往不能达到预期的效果。

鉴于上述问题，本发明提出：向制剂中加入外源性水解酶，采用人工干预的方法帮助患者体内对淫羊藿总黄酮进行高效地酶解，在体内实现淫羊藿黄酮的实时酶解，实时吸收；其次，通过加入生物粘附剂，延长制剂在肠道位点的滞留时间，使得酶解产物次级苷和苷元在肠道排空时间之前完成高效地吸收。

发明内容

本发明的目的是提供一种淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，能够实现淫羊藿总黄酮在肠道内实时酶解、实时吸收，且延长药物在肠道吸收位点的滞留时间，保证药物充分酶解并吸收，以改善淫羊藿总黄酮口服生物利用度低等缺陷。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，由淫羊藿总黄酮、水解酶和药学上可接受的辅料制备而成，所述药学上可接受的辅料至少包括生物粘附剂。

本发明所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂首先能够避开胃液的降解，然后在体内肠道环境（37℃，pH 5.2 ~ 7.4）下转化成次级苷及苷元，并伴随着在肠道排空时间内快速有效地吸收。

本发明所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂加入了可增加肠道滞留时间的生物黏附剂，能够延长药物在肠道吸收位点的滞留时间，保证药物充分酶解并吸收。

所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，所述淫羊藿总黄酮、水解酶及生物黏附剂的用量比为淫羊藿总黄酮1 mg : 水解酶酶活2~800U : 生物黏附剂0.1~0.6 mg，次优选淫羊藿总黄酮1 mg : 水解酶酶活6~600U : 生物黏附剂0.2~0.5 mg，最优选淫羊藿总黄酮1 mg: 水解酶酶活10~400U : 生物黏附剂0.3~0.4 mg。

其中，酶的相对用量是在体外模拟体内肠道环境（37℃，pH 5.2~7.4）下测定得到的。

在该用例范围内，所制备淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂在肠道环境（37℃，pH pH5.2 ~ 7.4）下，在肠道排空前，其中的淫羊藿总黄酮能够完全被释放、酶解并吸收。

本发明所述的水解酶为 β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、蜗牛酶、柚苷酶、橙皮苷酶、苦杏仁酶的一种或几种。优选蜗牛酶和β-葡萄糖苷酶。

本发明所述的生物黏附剂选自卡波姆、壳聚糖及其衍生物、海藻酸及其钠盐、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、白芨胶、阿拉伯胶中的一种或几种，优选卡波姆和羟丙基甲基纤维素。

本发明所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，所述淫羊藿总黄酮的制备方法优选但并不局限于为：用6 ~ 40倍量40% ~ 90%乙醇采用热回流提取后浓缩，所得的提取物经大孔吸附树脂法进一步纯化，得到含量不低于 60%的淫羊藿总黄酮纯品（紫外分光光度法测得，以淫羊藿苷为对照），总黄酮中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷I的总含量不低于 30%（HPLC测得）。

上述淫羊藿总黄酮的制备方法优选如下：称取淫羊藿药材，加15 ~ 19 倍量 50%乙醇，回流提取两次，每次 2 h，合并两次滤液，回收乙醇，浓缩，上大孔吸附树脂柱，分别用水、30%、60%乙醇洗脱，收集 60%乙醇洗脱液，浓缩，干燥得棕褐色淫羊藿总黄酮粉末。

本发明所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，除生物粘附剂以外的其他所述的辅料的加入质量是淫羊藿总黄酮的0 ~ 0.7倍，优选 0.3 ~ 0.5倍。

本发明所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂可进一步为肠溶丸剂、肠溶片剂或肠溶胶囊剂。

其中，所述肠溶丸剂的制备方法为：按比例分别称取淫羊藿总黄酮、水解酶、生物粘附制剂及其它药学上可接受的辅料，混合均匀，用适量润湿剂泛丸，包衣，干燥即得肠溶丸剂；

所述肠溶片剂的制备方法为：按比例分别称取淫羊藿总黄酮、水解酶、生物粘附制剂及其它药学上可接受的辅料，混合均匀，直接压片包衣或加入适量润湿剂，湿法制粒后压片包衣制成肠溶片剂；

所述肠溶胶囊剂的制备方法为：按比例分别称取淫羊藿总黄酮、水解酶、生物粘附制剂及其它药学上可接受的辅料，混合均匀，加入适量润湿剂，湿法制粒后干燥，整粒，制成肠溶胶囊。

其中，所述肠溶制剂的优选制备方法（此部分以酶为蜗牛酶，填充剂为 α-乳糖，生物黏附剂为卡波姆为例叙述）：分别取 42%淫羊藿总黄酮粉末、28%蜗牛酶、15% α-乳糖、15%卡波姆、适量 95%乙醇作为润湿剂，混合均匀，制成软材（握之成团、触之即散），过筛制粒，低温干燥，整粒，装入2号肠溶胶囊，每粒约0.22 g。

本发明所述的辅料选用医药上允许的肠溶制剂辅料选自填充剂、润湿剂与黏合剂、崩解剂、肠溶包衣剂、润滑剂中的一种或几种；

其中，所述的填充剂，选自糊精、蔗糖、α-乳糖、微晶纤维素、淀粉、甘露醇、木糖醇中的一种或几种；所述的润湿剂与黏合剂，选自水、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、淀粉浆、明胶、蔗糖中的一种或几种；所述的崩解剂，选自羧甲淀粉钠、微晶纤维素、干淀粉、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮中的一种或几种；所述的肠溶包衣剂，选自醋酸纤维素酞酸酯、聚乙烯醇酞酸酯、醋酸纤维素苯三酸酯、羟丙基纤维素酞酸酯或丙烯酸树脂中的一种或几种；所述的润滑剂，选自硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、微粉硅胶、氢化植物油、聚乙二醇类中的一种或几种。

本发明所述的湿润剂优选为95%乙醇。

此外，本发明进一步要求保护上述淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂在制备治疗骨质疏松药物中的应用。

本发明所述口服肠溶制剂与普通淫羊藿总黄酮相比，生物利用度可以提高0.5 ~2.5倍。

本发明在淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂中加入外源水解酶，能够模拟体内肠道酶与肠道菌的作用，在肠道内增强淫羊藿总黄酮的水解，保证淫羊藿黄酮在肠道排空前实时酶解、实时吸收，提高生物利用度，从而保持稳定和较好的抗骨质疏松等药效。

本发明在淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂中加入生物黏附剂，可以延长药物在肠道吸收位点的滞留时间，保证淫羊藿黄酮充分吸收，提高生物利用度，保持良好的抗骨质疏松作用。

附图说明

图1 为淫羊藿所含主要黄酮及酶解产物的化学结构示意图；

图2为淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率随时间的变化示意图；

图3为淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C酶解产物的生成率随时间的变化示意图；

图4为淫羊藿总黄酮中四种主要黄酮苷的转化率随时间的变化示意图；

图5为淫羊藿总黄酮中四种黄酮苷的主要酶解产物生成率随时间的变化示意图；

图6为淫羊藿总黄酮粉末的HPLC图谱；

图7为不同生物粘附剂对淫羊藿总黄酮释放度的影响示意图；

图8为不同生物粘附剂对大鼠肠道粘附力的比较示意图；

图9为淫羊藿总黄酮的累计释放曲线图；

图10为生物粘附肠溶胶囊中四种主要黄酮苷的转化率随时间的变化示意图；

图11为生物粘附肠溶胶囊中四种主要酶解产物的生成率随时间的变化示意图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步详细说明，但本发明的范围并不受这些实例的任何限制。

本发明实施例中所选用的水解酶信息：β-葡萄糖苷酶（>2 U/mg，sigma公司），纤维素酶（>400 U/mg，南京奥多福尼生物科技有限公司），蜗牛酶（>300 U/mg，上海源叶生物科技有限公司），柚苷酶（>10 U/mg，济宁和美生物工程有限公司），橙皮苷酶（>100 U/mg，河北百味生物科技有限公司），苦杏仁酶（>6 U/mg，上海泸峰化工有限公司）。

除特殊说明外，本发明所用的各种原料/制剂均为市售的已知产品。

实施例 1

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、β-葡萄糖苷酶8.4×10⁴U（42.0 g）、羟丙基甲基纤维素10.0 g、壳聚糖6.8 g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂，制成软材（握之成团、触之即散），过筛制粒，干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁混合均匀，压片，包衣，制成淫羊藿总黄酮口服肠溶片剂。所制得的肠溶片剂的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了0.52倍。

实施例 2

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、柚苷酶4.2×10⁵U（42.0 g）、低取代羟丙基纤维素15.0 g、卡波姆6.0 g，微晶纤维素12.6 g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂泛丸，包衣，干燥，制成淫羊藿总黄酮口服肠溶丸剂。所制得的肠溶丸剂的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了0.88倍。

实施例 3

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、纤维素酶3.36×10⁷U（84.0 g）、羟丙基甲基纤维素16.0 g、卡波姆4.6 g，白芨胶4.6 g，α-乳糖16.8 g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂，过筛制粒，干燥，整粒，装入肠溶胶囊。所制得的肠溶胶囊的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了1.13倍。

实施例 4

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、蜗牛酶2.52×10⁷U（84.0 g）、卡波姆4.2 g，α-乳糖8.4 g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂，过筛制粒，干燥，整粒，装入肠溶胶囊。所制得的肠溶胶囊的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了1.93倍。所制得的肠溶胶囊的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了1.84倍。

实施例 5

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、纤维素酶1.26×10⁷U（31.5 g）、橙皮苷酶4.2×10⁶U（42.0 g）、壳聚糖14.7 g，α-乳糖21.0 g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂，过筛制粒，干燥，整粒，装入肠溶胶囊。所制得的肠溶胶囊的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了1.37倍。

实施例 6

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、蜗牛酶1.26×10⁷U（42.0 g）、白芨胶8.4 g，α-乳糖12.6 g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂，过筛制粒，干燥，整粒，装入肠溶胶囊。所制得的肠溶胶囊的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了2.05倍。

实施例 7

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、纤维素酶8.4×10⁶U（21.0 g）、海藻酸钠12.6 g，α-乳糖25.2 g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂，过筛制粒，干燥，整粒，装入肠溶胶囊。所制得的肠溶胶囊的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了0.82倍。

实施例 8

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、橙皮苷酶3.36×10⁶U（33.6 g）、阿拉伯胶14.7g，α-乳糖29.4 g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂，过筛制粒，干燥，整粒，装入肠溶胶囊。所制得的肠溶胶囊的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了1.42倍。

实施例 9

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、橙皮苷酶2.1×10⁶U（21.0 g）、羧甲基纤维素钠4.2 g，α-乳糖16.8 g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂，过筛制粒，干燥，整粒，装入肠溶胶囊。所制得的肠溶胶囊的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了1.07倍。

实施例 10

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、苦杏仁酶2.52×10⁵U（42.0 g）、聚乙二醇4.2 g，α-乳糖15.1 g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂，过筛制粒，干燥，整粒，装入肠溶胶囊。所制得的肠溶胶囊的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了0.73倍。

实施例 11

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、β-葡萄糖苷酶4.2×10⁴U（21.0 g）、苦杏仁酶1.26×10⁵U（21.0 g）、柚皮苷酶4.2×10⁵U（42.0 g）、低取代羟丙基纤维素21.0g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂，过筛制粒，干燥，整粒，装入肠溶胶囊。所制得的肠溶胶囊的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了1.59倍。

实施例 12

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、纤维素酶8.4×10⁶U（21.0 g）、蜗牛酶1.26×10⁷U（42.0 g）、羟丙基甲基纤维素6.3 g，α-乳糖15.0 g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂，过筛制粒，干燥，整粒，装入肠溶胶囊。所制得的肠溶胶囊的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了1.16倍。

实施例 13

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、蜗牛酶8.4×10⁶U（28.0 g）、羟丙基甲基纤维素16.0 g、卡波姆8.0 g，α-乳糖15.0 g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂泛丸，包衣，干燥，制成淫羊藿总黄酮口服肠溶丸剂。所制得的肠溶丸剂的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了2.31倍。

实施例 14

称取淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、蜗牛酶8.4×10⁶U（28.0 g）、卡波姆15.0 g，α-乳糖15.0 g，混合均匀，加入适量95%乙醇作为润湿剂，过筛制粒，干燥，整粒，装入肠溶胶囊。所制得的肠溶胶囊的生物利用度比淫羊藿总黄酮粉末提高了2.52倍。

以下提供若干试验例以进一步说明本发明技术方案。

试验例 1 体外模拟肠道环境（37℃，人工肠液）下不同水解酶酶解淫羊藿黄酮苷及酶解产物鉴定

以淫羊藿苷为例，取4 份淫羊藿苷，每份10 mg，精密称定，分别置于密闭容器中，分别加入人工肠液10 mL，每组分别加入适量的β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、蜗牛酶、柚苷酶（各酶酶活均在规定范围内），在 37℃，转速为(100 ± 5) r·min^-1的气浴恒温振荡器中反应，按照不同水解酶特点反应1~6 h，取样 100 μL，立即加入900 μL甲醇终止反应，涡旋，13000 r·min^-1离心 10 min 后取上清液，过0.22 μm 微孔滤膜，进HPLC测定，计算淫羊藿苷转化率，并用UPLC/Q-TOF-MS联用技术鉴定酶解产物。

同样地，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C均可以按照上述方法进行酶解反应。

经UPLC/Q-TOF-MS鉴定结果表明，蜗牛酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、柚苷酶这四种酶酶解朝藿定A主要生成一个产物箭藿苷A，酶解朝藿定B主要生成一个产物箭藿苷B，酶解朝藿定C主要生成一个产物鼠李糖基淫羊藿次苷II（各产物结构见图 1）。对于淫羊藿苷，β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、柚苷酶酶解后均主要生成一个产物宝藿苷I，蜗牛酶酶解后生成两个产物宝藿苷I及淫羊藿苷元。不同水解酶对淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率见表 1。如结果（表1）所示，在体外模拟体内肠道环境（37℃，人工肠液）下，蜗牛酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、柚苷酶均可以酶解淫羊藿总黄酮中主要的黄酮苷单体，主要生成次级苷，表明它们均可用来作为淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂中的水解酶。

表1 不同水解酶对淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率

试验例 2 大鼠肠道酶酶解淫羊藿黄酮苷单体及酶解产物鉴定

取雌性SD大鼠，禁食过夜。用乌拉坦(剂量3 mL∙Kg^-1)肌肉注射麻醉。待大鼠麻醉好后，将大鼠全肠段取出，分别取十二指肠段、空肠段、回肠段和结肠段并用冰的生理盐水冲洗干净，然后用玻片边缘刮取肠黏膜，称重，按1 g : 4 mL的比例加入冰的生理盐水混合后组织匀浆机匀浆，匀浆液在3000 r∙min^-1，4℃离心10 min后取上清液，得到大鼠不同肠段肠黏膜孵育液。

取上述健康及骨质疏松病理状态下大鼠肠黏膜孵育液各4 mL，分别各加入2 mmol∙L^-1淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C供试品溶液1 mL，立即放入37℃恒温气浴振荡器中孵育，分别于2 h取样0.5 mL，立即加入1.5 mL乙腈，充分涡旋混合30 s，13000 r·min^-1，离心15 min，取上清液10 μL，进HPLC，测定转化率，并用UPLC/Q-TOF-MS联用技术鉴定酶解产物。

经UPLC/Q-TOF-MS鉴定结果表明，肠道酶酶解淫羊藿苷主要生成两个酶解产物宝藿苷I及淫羊藿苷元，酶解朝藿定A主要生成一个产物箭藿苷A，酶解朝藿定B主要生成一个产物箭藿苷B，酶解朝藿定C主要生成一个产物鼠李糖基淫羊藿次苷II。此试验例说明本发明所选用的水解酶酶解淫羊藿黄酮苷的主要产物与大鼠肠道酶的代谢产物基本一致，可以选用上述六种酶作为淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂中的水解酶。此外，四种淫羊藿黄酮苷在骨质疏松病理组大鼠肠道酶中的代谢速率显著变慢，说明大鼠骨质疏松病理组肠道酶缺失或酶活降低，因此更需要在制剂中加入外源水解酶帮助肠道对淫羊藿总黄酮进行高效地酶解。

试验例 3 大鼠肠道菌酶解淫羊藿黄酮苷单体并鉴定酶解产物

取新鲜的健康及骨质疏松病理组大鼠粪便按1 g : 4 mL的比例与冰的生理盐水混合制成悬浊液，1 000 r∙min^-1，离心10 min后取上清液，得到大鼠肠菌液。取0.3 mL的大鼠肠菌液加到2.7 mL的厌氧培养液中，混匀后即得肠菌孵育液。

取上述健康及骨质疏松病理状态下大鼠肠菌孵育液各4 mL，分别各加入淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C供试品溶液1 mL，立即放入37℃恒温气浴振荡器中孵育，于2h取样0.5 mL，立即加入1.5 mL乙腈，充分涡旋混合30 s，13 000 r·min^-1，离心15 min，取上清液10 μL，进HPLC，测定转化率，并用UPLC/Q-TOF-MS联用技术鉴定酶解产物。

经UPLC/Q-TOF-MS鉴定结果表明，肠道菌水解淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C各生成一个酶解产物，酶解淫羊藿苷主要生成宝藿苷I，酶解朝藿定A主要生成箭藿苷A，酶解朝藿定B主要生成箭藿苷B，酶解朝藿定C主要生成鼠李糖基淫羊藿次苷II。此试验例说明本发明所选用的水解酶酶解淫羊藿黄酮苷的主要产物与大鼠肠道菌的代谢产物基本一致，进一步说明可以选用上述六种酶作为淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂中的水解酶。此外，四种淫羊藿黄酮苷在骨质疏松病理组大鼠肠道菌中的代谢速率变慢，说明大鼠骨质疏松病理组的肠道菌群可能发生了变化，导致肠道菌群的活力有所下降，从而影响了对药物的代谢作用。因此更需要在制剂中加入外源水解酶帮助肠道对淫羊藿总黄酮进行高效地酶解。

试验例 4 大鼠肠灌流模型研究淫羊藿黄酮苷单体的吸收代谢及代谢产物鉴定

取雌性大鼠10只，体量240～270 g，分为两组，每组5只，一组作为空白组，另一组摘除卵巢造去卵巢骨质疏松动物模型，3个月后做肠灌流实验。肌肉注射50％乌拉坦溶液（0.7mL/300g）对大鼠麻醉，腹腔开口后，对十二指肠、空肠、回肠、结肠进行插管，之后将小肠部分小心放回腹腔，尽可能避免卷曲和扭结。将进口管隔离，在37℃循环水浴中保持灌注温度恒定。分别用灌注泵将10 μM的淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C小肠灌流液同时灌入四段肠段（十二指肠，空肠，回肠末端，结肠），泵的流速为0.2mL·min^-1。平衡30分钟，然后每隔30min收集4份出口管中样品。取肠灌流收集样品400 μL，加400 μL乙腈，离心，取上清液，供HPLC检测，并用UPLC/Q-TOF-MS联用技术鉴定代谢产物。

经UPLC/Q-TOF-MS鉴定结果表明，淫羊藿苷大鼠肠灌流后主要代谢产物为宝藿苷I，朝藿定A大鼠肠灌流后主要代谢产物为箭藿苷A，朝藿定B大鼠肠灌流后主要代谢产物为箭藿苷B，朝藿定C大鼠肠灌流后主要代谢产物为鼠李糖基淫羊藿次苷II。此试验例说明本发明所选用的水解酶酶解淫羊藿黄酮苷的主要产物与大鼠肠灌流的代谢产物基本一致，进一步说明可以选用上述六种酶作为淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂中的水解酶。此外，各淫羊藿黄酮在骨质疏松大鼠的肠道吸收明显减少，可能是由于大鼠摘除双侧卵巢后，各肠段肠道酶活力降低，导致各肠段代谢产物的量减少，因此更需要在制剂中加入外源水解酶帮助肠道对淫羊藿总黄酮进行高效地酶解。

试验例 5 蜗牛酶在37℃人工肠液中酶解淫羊藿黄酮苷单体

分别取淫羊藿苷50 mg、朝藿定A 10 mg、朝藿定B 10 mg、朝藿定C 10 mg，精密称定，分别置于密闭容器中，分别加入人工肠液10 mL，分别加入50、10、10、10 mg 的蜗牛酶，在 37℃，转速为( 100 ± 5) r·min^-1的气浴恒温振荡器中反应，分别在 0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8 h 时取样 100 μL，立即加入900 μL甲醇终止反应，涡旋，13 000r·min^-1离心 10 min 后取上清液，过0.22 μm 微孔滤膜，进HPLC测定并计算转化率。结果见图2、3，淫羊藿苷在6 h时基本酶解完全，朝藿定A和朝藿定C在2 h时基本酶解完全，朝藿定B在3 h时基本酶解完全。酶解产物箭藿苷A、箭藿苷B及鼠李糖基淫羊藿次苷II生成率的达峰时间与对应的反应物酶解完全所需时间基本一致，淫羊藿苷主要酶解产物宝藿苷I的生成率在4 h达到最大值。

综上所述，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C都能在6 h内酶解成相应的次级苷和苷元。

试验例 6 蜗牛酶在37℃人工肠液中酶解淫羊藿总黄酮

取淫羊藿总黄酮粉末143 mg（相当于100 mg 淫羊藿总黄酮），精密称定，置于密闭容器中，加入100 mg 蜗牛酶，及10 mL 人工肠液，在 37℃，转速为(100 ± 5) r·min^-1的气浴恒温振荡器中反应，分别在 0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、8 h 时取样 200 μL，加入适量甲醇稀释 20 倍，涡旋，13 000 r·min^-1离心 10 min 后取上清液，过0.22 μm 微孔滤膜，进样测定并计算主要淫羊藿黄酮单体的转化率或生成率。结果见图4、5，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C在2 h时基本酶解完全。酶解产物箭藿苷A、箭藿苷B及鼠李糖基淫羊藿次苷II生成率在2 h达到最大值。淫羊藿苷酶解产物宝藿苷I的生成率在2 h达到最大值。

综上所述，淫羊藿总黄酮中主要黄酮苷在2 h内能够酶解成相应的次级苷或苷元。

试验例 7 淫羊藿总黄酮的提取及分离纯化

称取淫羊藿 300 g，加 15 倍量50%乙醇，回流提取两次，每次 2 h，合并两次滤液，回收乙醇，浓缩，上AB-8大孔吸附树脂柱，用6 倍柱体积水洗涤至无色，再用5 倍柱体积30%乙醇洗去杂质，再用5 倍柱体积60% 的乙醇溶液进行洗脱，收集60%乙醇洗脱液，浓缩，冷冻干燥得棕褐色淫羊藿总黄酮粉末。

结果淫羊藿总黄酮粉末经紫外-可见分光光度计测定计算得总黄酮纯度为70.0%（以淫羊藿苷计）；经HPLC测定计算得淫羊藿苷含量为20.4%，总黄酮中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷Ⅰ的总含量为31.8%。淫羊藿总黄酮粉末的HPLC图谱见图6。

试验例 8 含不同生物黏附剂的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂的释放度考察

淫羊藿总黄酮生物粘附肠溶胶囊处方淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、蜗牛酶8.4×10⁶U（28.0 g）、α-乳糖15.0 g、不同生物粘附剂15.0 g、适量润湿剂。

按处方称取淫羊藿总黄酮粉末、蜗牛酶及α-乳糖，共5份，再分别加入不同生物黏附剂卡波姆（CP）、羟丙基甲基纤维素（HPMC）、低取代羟丙基纤维素（L-HPC）、壳聚糖（CS）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na），加入适量95%乙醇作为润湿剂，混合均匀，制成软材（握之成团、触之即散），过筛制粒，干燥，整粒，装入肠溶胶囊，每粒装入约0.22 g。照2010版药典中释放度测定法（附录XD第二法（一）法），考察各胶囊的释放度。结果如图7所示，本发明所选的不同生物黏附剂所制备的淫羊藿总黄酮口服肠溶胶囊均具有不同程度的缓释作用，且生物黏附剂能够延长淫羊藿总黄酮在肠道内的滞留时间，使淫羊藿黄酮达到实时酶解，实时吸收的效果。

试验例 9 含不同生物黏附剂的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂的生物黏附性考察

淫羊藿总黄酮生物粘附肠溶胶囊处方淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、蜗牛酶8.4×10⁶U（28.0 g）、α-乳糖15.0 g、不同生物粘附剂（卡波姆、羟丙基甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、壳聚糖或羧甲基纤维素钠） 15.0 g、适量润湿剂。

体外生物粘附力测定取禁食16 h的雌性SD大鼠，麻醉后取出小肠，用pH 6.8的磷酸盐缓冲液冲洗除去内容物，注意保持粘膜粘液层的完整。取实验药物，研成细粉，用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)制成10%的溶液，涂布于1 cm×1 cm背面带挂钩的硬塑料薄板上(a)，厚度0.1 cm，50℃烤干，为供试药物，备用。将肠组织剪切成小块，固定于1cm×1cm背面带挂钩的硬塑料薄板上(b)，取(a)，用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)润湿10 min后与(b)接触，并给予100g压力(100 g砝码)，维持10 s，将(a)挂钩垂直固定，在(b)挂钩上系一塑料袋，通过输液瓶以5 mL·min^-1速度向塑料袋中加水，直至因拉力过大而分离，称取塑料袋中水的重量，即为组织粘附力大小。

不同种类生物黏附剂对大鼠肠道粘附力的大小见图8，表明本发明所选的不同生物黏附剂均具有不同程度的生物黏附性，其中卡波姆的生物粘附力最大，为27.4 g·cm^-2。此实施例结果显示本发明通过加入生物黏附剂所制备的制剂能够延长淫羊藿黄酮在肠道位点的滞留时间，有利于淫羊藿黄酮在肠道排空时间之前完成高效地吸收。

试验例 10 淫羊藿总黄酮口服肠溶胶囊的释放及酶解的考察

淫羊藿总黄酮生物粘附肠溶胶囊处方（实施例14）淫羊藿总黄酮粉末 42.0 g、蜗牛酶8.4×10⁶U （28.0 g）、α-乳糖15.0 g、卡波姆15.0 g、适量润湿剂。

释放度考察照释放度测定法（附录XD第二法（一）法），以0.1 mol·L^-1盐酸溶液750 mL为释放介质，转速为(100±5) r·min^-1，依法操作，经2小时后，取溶液10 mL滤过，立即补充相同溶液，精密量取续滤液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液作为供试品（1）。然后向溶出杯中加入(37±0.5)℃的0.2 mol·L^-1磷酸钠溶液250mL（必要时调节pH值至6.8±0.05），继续运转，分别在0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 h时取样10mL，立即补充相同溶液，滤过，精密量取续滤液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液作为供试品（2）。另取本品1粒，重复上述释放度实验，待肠溶胶囊溶蚀完全后，精密量取续滤液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液作为空白对照溶液。测定270 nm处的紫外吸光度，计算累计释放度。取空白对照溶液、供试品（1）、供试品（2）各8 mL，吹干，加入1 mL甲醇溶解定容，离心，过滤，进HPLC。淫羊藿总黄酮的累计释放度曲线见图9；淫羊藿总黄酮中主要黄酮苷的转化率及主要酶解产物的生成率随时间变化规律见图10、11。

本实施例所选用的处方为制剂优选处方，由图9可知，所制备出的肠溶胶囊中淫羊藿总黄酮的释放缓慢，在0.1 mol·L^-1盐酸溶液中2 h内无裂缝或崩解；2 h时，累积释放度约30.93%；6 h时，累积释放度约67.51%；12 h时，累积释放度大于90%。由图 10、11可知，主要淫羊藿黄酮苷在12 h时基本酶解完全，主要酶解产物的量在12 h时基本达到最高值。主要淫羊藿黄酮苷朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的释放量在2 h时达到最大值，在0~2 h间呈上升趋势，表明它们的释放速度大于酶解速度；在2~14 h间呈下降趋势，表明它们的释放速度小于酶解速度。本实施例表明淫羊藿总黄酮在释放介质中能够实现缓慢释放并酶解，且生物黏附剂卡波姆能够延长淫羊藿黄酮在肠道内的滞留时间，有利于淫羊藿黄酮的实现实时酶解，实时吸收。

试验例 11 淫羊藿总黄酮口服肠溶胶囊的生物利用度研究

取骨质疏松雌性SD大鼠 12 只，随机分成两组，每组 6 只，给药前禁食不禁水12h，大鼠灌胃前取空白血浆0.5 mL于肝素化试管。1 h 后，各组分别灌胃给药淫羊藿总黄酮、淫羊藿总黄酮肠溶胶囊（实施例14制备），分别于给药后 0.083，0.25，0.5，0.75，1，2，3，4，6，8，10，12，24，48 h 眼眶取血0.5 mL于肝素化试管中，5 000 r·min^-1离心 5 min 取上清液，置于-20℃条件下保存待测。取200 μL 血浆样品置于具塞离心管中， 800 μL 乙酸乙酯沉淀蛋白，涡旋混匀 30 s，混匀后，8 000 r·min^-1离心 10 min。将上清液转移至另一尖底试管中，氮气吹干。残渣定量加入甲醇100 μL溶解，涡旋混匀 30 s，混匀后，8 000 r·min^-1 离心 10 min，取上清液，作为样品液，进HPLC测定。

本实验采用非房室模型计算淫羊藿黄酮药代动力学参数，比较研究淫羊藿总黄酮口服肠溶胶囊及普通淫羊藿总黄酮粉末的药代动力学差异。结果，淫羊藿总黄酮口服肠溶胶囊的AUC为54.76 mg·L^-1·h^-1，C_max为5.10 mg·L^-1，t_max为0.5 h，平均驻留时间为16.38h。淫羊藿总黄酮口服肠溶胶囊的生物利用度比普通淫羊藿总黄酮粉末提高了2.52倍。

Claims

1.一种淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，其特征在于，由淫羊藿总黄酮、水解酶和药学上可接受的辅料制备而成，所述药学上可接受的辅料包括生物粘附剂；

其中，所述淫羊藿总黄酮、水解酶及生物黏附剂的用量比为：淫羊藿总黄酮1 mg : 水解酶酶活2~800U : 生物黏附剂0.1~0.6 mg；

所述的水解酶为β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、蜗牛酶、柚苷酶、橙皮苷酶、苦杏仁酶的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，其特征在于，所述的淫羊藿总黄酮1 mg : 水解酶酶活6~600U : 生物黏附剂0.2~0.5 mg。

3.根据权利要求1所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，其特征在于，所述的淫羊藿总黄酮1 mg : 水解酶酶活10~400U : 生物黏附剂0.3~0.4 mg。

4.根据权利要求1所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，其特征在于，所述的水解酶为β-葡萄糖苷酶和蜗牛酶。

5.根据权利要求1所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，其特征在于，所述的生物黏附剂为卡波姆、壳聚糖及其衍生物、海藻酸及其钠盐、白芨胶、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、阿拉伯胶中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，其特征在于，所述的生物黏附剂为卡波姆和羟丙基甲基纤维素。

7.根据权利要求1-6任一项所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，其特征在于所述淫羊藿总黄酮的制备方法为：淫羊藿用6~40质量体积比倍量的40%~90%乙醇采用热回流提取后浓缩，经大孔吸附树脂法进一步纯化，得到含量不低于60%的淫羊藿总黄酮，其中，总黄酮中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷Ⅰ的总含量不低于30%。

8.根据权利要求1-6任一项所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，其特征在于，除生物粘附剂以外的其他所述的辅料的加入质量是淫羊藿总黄酮的0~0.7倍。

9.根据权利要求8所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，其特征在于，除生物粘附剂以外的其他所述的辅料的加入质量是淫羊藿总黄酮的0.3~0.5倍。

10.根据权利要求1所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，其特征在于，所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂为肠溶丸剂、肠溶片剂或肠溶胶囊剂。

11.根据权利要求10所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，其特征在于所述肠溶丸剂的制备方法为：按比例分别称取淫羊藿总黄酮、水解酶、生物粘附制剂及其它药学上可接受的辅料，混合均匀，用润湿剂泛丸，包衣，干燥即得肠溶丸剂；

所述肠溶片剂的制备方法为：按比例分别称取淫羊藿总黄酮、水解酶、生物粘附制剂及其它药学上可接受的辅料，混合均匀，直接压片包衣或加入润湿剂，湿法制粒后压片包衣制成肠溶片剂；

所述肠溶胶囊的制备方法为：按比例分别称取淫羊藿总黄酮、水解酶、生物粘附制剂及其它药学上可接受的辅料，混合均匀，加入润湿剂，湿法制粒后干燥，整粒，制成肠溶胶囊。

12.根据权利要求10所述的淫羊藿总黄酮口服肠溶制剂，其特征在于所述肠溶胶囊的制备方法如下：按重量百分比计，分别取 42%淫羊藿总黄酮粉末、28%蜗牛酶、15%卡波姆、15% α-乳糖，以 95%乙醇作为润湿剂，混合均匀，制成软材，过筛制粒，低温干燥，整粒，装胶囊即得。