WO2019078410A1 - 진세노사이드 글리코시다제를 이용한 진세노사이드 20(s)-rg3 및 20(s)-rh2의 제조방법 - Google Patents

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glycosidase
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ginsenoside glycosidase
nucleic acid
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주식회사 모든바이오
도은경
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Definitions

  • the present invention relates to the use of a novel ( novel ) herbicide derived from Herbiconiux ginsengi or Flavobacterium johnsoniae to obtain ginsenoside 20 (S) -Rg3 or 20 (S) -Rh2 with high efficiency and high purity. (S) -Rg3 or 20 (S) -Rh2 using one ginsenoside glycosidase.
  • Saponin means a substance in which a non-sugar moiety is composed of a plurality of ring compounds in a glycoside widely present in the plant system. Since triterpene saponin, which is a saponin component contained in ginseng or red ginseng as a major physiologically active ingredient, has a chemical structure different from that of saponin found in other plants, in order to distinguish saponin from other plant saponins, ginseng ) Glycoside is called ginsenoside.
  • the ginsenosides are classified as protopanaxadiol-type (PPD type) ginsenoside, protopanaxatriol-type (PPT type) ginsenoside, and oleanolin acid type based on the structure of aglycone (oleanolic acid type) and ginsenosides. These three groups are classified according to the positions and the number of sugar moieties attached by glycosidic bonds at positions 3, 6 and 20 of the ring in the compound structure.
  • the basic skeleton of the oleanolic acid-based ginsenosides is 5-ring, which is the only ginsenoside Ro, and the aglycon is oleanolic acid.
  • ginsenosides are PPD-type ginsenosides.
  • PPD type ginsenoside include Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Gypenoside XVII, Compound O, Compound Mc1, F2, Compound Y ), Compounds Mc (Compound Mc), Rg3, Rh2, and CK.
  • the ginsenosides of the PPT type include Re, Rg1, Rf, Rg2, Rh1, F1 and the like.
  • major ginsenosides account for more than 90% of ginsenosides in dried ginseng, which is a very low absorption rate in vivo due to the large size of each compound.
  • major ginsenoside is relatively easily absorbed and has a more effective F2, Rg3, Rk1, Rg5, Rh1, Rh2, Rk2, Rh3, Gypenoside ) XVII, zifenoid LXXV and compounds K, Mc, Mc1 (compound K, Mc, Mc1).
  • Ginsenoside Rg3 one of the minor ginsenosides present in very small amounts in ginseng, is known to have antitumor activity. Ginsenoside Rg3 inhibits lung metastasis and inhibition of such metastasis is associated with inhibition of tumor-induced angiogenesis as well as inhibition of the invasion and adhesion of cancer cells . In addition, ginsenoside Rg3 is known to down-regulate NF-kB and AP-1 transcription factors involved in inflammation and the like.
  • Rg3 is known to reduce intracellular calcium levels, and it induces apoptosis in colon cancer, inhibits the proliferation of cancer cells in prostate cancer, (Cyclophosphamide) has been shown to inhibit the proliferation and angiogenesis of cancer cells.
  • Ginsenoside Rg3 has been known to have an anti-obesity effect through the AMP-activated protein kinase signaling pathway and PPAR-y inhibition, as well as the anticancer effects described above. For this reason, Rg3 has received much attention as a pharmaceutically active ingredient in various diseases including cancer and obesity.
  • 20 (S) -Rh2 one of the minor ginsenosides present in very small amounts in ginseng, is effective for the treatment of brain diseases such as stroke through the protection of brain cells.
  • brain diseases such as stroke through the protection of brain cells.
  • anticancer effects are exhibited in various carcinomas, and in some studies it has been disclosed that antiinflammatory effects can also be effective in treating skin diseases such as chronic dermatitis. That is, among the minor ginsenosides, 20 (S) -Rh2 has been widely known and used, and the substance of the pharmacological action is the focus of attention.
  • 20 (S) -Rg3 and 20 (S) -Rh2 as mentioned above correspond to the minor ginsenosides, and thus very small amounts are contained in ginseng itself. Even if a separate separation process is performed, it's difficult. Accordingly, various researches and developments have been made to separate and purify the above two components, but they have not sufficiently separated the above components. For example, chemical decomposition methods, enzymatic methods, and methods using glycoside synthesis have been suggested. However, the above-described methods are required to be 1) several steps in the manufacturing process, or 2) 3) the use of an inadequate catalyst for edible purposes, and 4) low yields, which are still limited in mass production.
  • the object of the present invention is to provide a method for producing a recombinant vector comprising a ginsenoside glycosidase isolated from Herbiconiux ginsengi , a vector-introduced transformant containing the nucleic acid encoding the gene , or a culture of the transformant (S) -Rg3 by treating with ginsenoside crude saponin.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing (a) a ginsenoside glycosidase isolated from Herbiconiux ginsengi , a vector-introduced transformant containing the nucleic acid encoding the same, or a culture of the transformant Treating water with ginsenoside crude saponin to prepare a reaction solution containing ginsenoside 20 (S) -Rg3; And (b) a transformant into which a vector containing a ginsenoside glycosidase isolated from Flavobacterium johnsoniae and a nucleic acid encoding the same is introduced into the reaction solution prepared in the step (a) , Or a process for producing a ginsenoside 20 (S) -Rh2 by treating a culture of the transformant.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing a recombinant vector comprising a ginsenoside glycosidase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a vector containing the nucleic acid encoding the protein, (S) -Rg3, comprising culturing the crude saponin of the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing a recombinant vector comprising a ginsenoside glycosidase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a vector containing the nucleic acid encoding the protein, ≪ / RTI > And a ginsenoside glycosidase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a vector containing the nucleic acid encoding the protein, or a culture of the transformant , And a composition for converting crude saponin to 20 (S) -Rh2.
  • the inventors of the present invention have developed a method for easily obtaining a minor form of rare ginsenosides 20 (S) -Rg3 and 20 (S) -Rh2 present in trace amounts in plants such as ginseng at a high yield
  • the crude saponin of ginseng containing PPD type ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, Rd, etc.
  • ginsenoside glycosidase isolated from Herbiconiux ginsengi (S) -Rg3 was treated with ginsenoside glycosidase isolated from Herbiconiux ginsengi (S) -Rg3, and then massively biotransformed to 20 (S) -Rh2 by treating ginsenoside glycosidase isolated from Flavobacterium johnsoniae , Thereby completing the invention.
  • the present invention relates to a method for the treatment of ginsenoside glycosidase isolated from Herbiconiux ginsengi , a vector-introduced transformant containing a nucleic acid encoding the gene , or a culture of the transformant to ginsenoside saponin To give gentenoside 20 (S) -Rg3.
  • the present invention also provides a method of producing a recombinant vector comprising (a) a ginsenoside glycosidase isolated from Herbiconiux ginsengi , a vector-introduced transformant containing the nucleic acid encoding the gene , or a culture of the transformant with ginseng Treating crude saponin to prepare a reaction solution containing ginsenoside 20 (S) -Rg3; And (b) a transformant into which a vector containing a ginsenoside glycosidase isolated from Flavobacterium johnsoniae and a nucleic acid encoding the same is introduced into the reaction solution prepared in the step (a) , Or a process for producing a ginsenoside 20 (S) -Rh2 by treating a culture of the transformant.
  • the present invention also relates to the use of a ginsenoside glycosidase isolated from Flavobacterium johnsoniae , a vector-introduced transformant containing the nucleic acid encoding the same, or a culture of the transformant with 20 (S) -Rg3 to provide gentamicin 20 (S) -Rh2.
  • Herbiconiux ginsengi is a gram-positive, aerobic, non-motile bacterium which is mesophilic, and phylogenetically belongs to Microbacteriaceae of Actinobacteria.
  • Herbiconiux ginsengi is preferably Herbiconiux ginsengi KACC 14262 T.
  • Flavobacterium johnsoniae is a microorganism having the characteristics of degrading gram-negative, bacillus, mesophilic, gliding mobility, heterotrophic, and various high-molecular substances (chitin, starch, protein, etc.).
  • Flavobacterium johnsoniae is preferably Flavobacterium johnsoniae KACC 11414 T.
  • Flavobacterium johnsoniae is preferably Flavobacterium johnsoniae KACC 11414 T.
  • the term " ginsenoside glycosidase " means a degrading enzyme that hydrolyzes the glucosidic linkage of a chain polysaccharide above the disaccharide.
  • the degree and function of the activity of ginsenoside glycosidase varies by enzyme type. Specifically, the ginsenoside glycosidase isolated from Herbiconiux ginsengi according to the present invention has the characteristic of beta-glucosidase. Also, the ginsenoside glycosidase isolated from Johnsonia ( Flavobacterium johnsoniae ) according to the present invention has the characteristic of beta-glucosidase.
  • the ginsenoside glycosidase according to the present invention can be obtained by biosynthesizing the crude saponin of ginseng containing PPD type ginsenosides (Rb1, Rb2, Rc, Rd, etc.) into ginsenoside 20 (S) Means an enzyme having an activity capable of biotransformation of 20 (S) -Rg3 to 20 (S) -Rh2.
  • the ginsenoside glycosidase may be derived from Herbiconiux ginsengi or Flavobacterium johnsoniae .
  • a protein variant having an amino acid sequence in which a part of the sequence is deleted, modified, substituted or added is also an amino acid sequence having substantially the same or corresponding biological activity as a ginsenoside glycosidase.
  • the ginsenoside glycosidase represented by SEQ ID NO: 3 has a remarkable effect on converting crude saponin, preferably crude saponin of PPD type, into 20 (S) -Rg3. Particularly, it is possible to produce only 20 (S) -Rg3 at a high concentration without further progressing reaction after the conversion of crude (20) (S) -Rg3 from crude saponin, (S) -Rg3 can be produced in large quantities without further separation of (R) and (S) -form.
  • the ginsenoside glycosidase represented by SEQ ID NO: 4 has a remarkable effect on converting 20 (S) -Rg3 to 20 (S) -Rh2.
  • the reaction can be performed without intermediate purification process to greatly reduce the reaction step and reduce the disappearance due to the purification.
  • (R) and (S) -Rh2 were produced in a large amount by solubilizing the 20 (S) -Rh2 form, which is highly soluble and capable of producing 20 (S) only a large amount of 20 (S) -Rh2 can be produced without further separation of the form.
  • the vector is an expression vector capable of expressing a desired protein in a suitable host cell, and comprises a nucleic acid construct, preferably a nucleic acid construct comprising an essential regulatory element operably linked to express a ginsenoside glycosidase according to the present invention .
  • the base sequence of the ginsenoside glycosidase according to the present invention preferably has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • a ginsenoside glycosidase having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 derived from Herbiconiux ginsengi KACC 14262 T is mixed with a plasmid vector pGEX4T (SEQ ID NO: 1) in which glutathione S- -1 (GE Healthcare, USA) to prepare a recombinant expression vector GST-BglHg.
  • a ginsenoside glycosidase having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 was inserted into the plasmid vector pGEX4T-1 (GE Healthcare, USA) in which glutathione S- ) To prepare a recombinant expression vector GST-BglFj.
  • transfection refers to a phenomenon in which DNA is introduced as a host and DNA is replicable as a factor of chromosome or by integration of chromosome integration, and foreign DNA is introduced into cells to cause artificial genetic change.
  • Any transformation method of the present invention can be used and can be easily carried out according to a conventional method in the art.
  • the transformant into which the vector containing the nucleic acid encoding the ginsenoside glycosidase protein of the present invention transformed by the above method has been introduced can be obtained by transforming crude saponin into ginsenoside 20 (S) -Rg3, or ginsenoside 20 (S) -Rg3 to ginsenoside 20 (S) -Rh2.
  • transformants containing ginsenoside glycosidase isolated from Herbiconiux ginsengi have a significant effect on converting crude saponin to ginsenoside 20 (S) -Rg3.
  • a transformant comprising a ginsenoside glycosidase isolated from Flavobacterium johnsoniae is also capable of converting ginsenoside 20 (S) -Rg3 to ginsenoside 20 (S) -Rh2 And has a remarkable effect.
  • the host is not particularly limited as long as it is capable of expressing the nucleic acid of the present invention.
  • Specific examples of the host that can be used in the present invention include bacteria belonging to the genus Escherichia such as E. coli ; Bacteria of the genus Bacillus such as Bacillus subtilis ; Bacteria of the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida ; Yeasts such as Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe , and the like; Animal cells and insect cells. It is preferably E. coli , more preferably E. coli BL21 (DE3).
  • the culture may mean the product obtained by culturing the transformant according to a known microorganism culture method.
  • the product may be a ginsenoside glycosidase that is separated from the lysate after the cultured microorganism is collected and disrupted.
  • the culture of the transformant into which the expression vector containing the nucleic acid encoding the ginsenoside glycosidase is introduced has the activity of converting crude saponin to convert to ginsenoside 20 (S) -Rg3, or 20 (S) -Rg3 to 20 (S) -Rh2.
  • Ginseng crude saponin refers to crude saponin before it is divided into components.
  • saponin of ginseng is extracted with a solvent such as ethanol, or it is contained at a high concentration of Rb1, Rb2, Rc or Rd using a porous resin.
  • any crude saponin containing Rb1, Rb2, Rc or Rd among the crude ginseng crude saponin can be used.
  • Such crude saponin can be obtained by extracting from leaves and roots of other ginseng including korean ginseng, fire ginseng, and mustard ginseng using a solvent, and more preferably, using a porous resin, ginsenosides such as sugar and protopanaxatriol series ginsenosides Is removed to increase the content of Rb1, Rb2, Rc or Rd.
  • ginsenosides such as sugar and protopanaxatriol series ginsenosides Is removed to increase the content of Rb1, Rb2, Rc or Rd.
  • a PPD type ginsenoside mixture containing Rb1, Rb2, Rc, Rd and the like is obtained by increasing the PPD type ginsenoside content thereof through a porous resin after extraction by an ethanol solvent .
  • ginsenoside 20 (S) -Rg3 is the basic carbon skeleton of saponin of the PPD type, and the 20th carbon of the minor ginsenoside in which two glucose (Glc ⁇ Glc) S-form in the body. It is easy to absorb in the body by eliminating saccharides, and has a property of dissolving in water differently from R-form.
  • ginsenoside 20 (S) -Rh2 has a basic carbon skeleton of saponin of PPD type, and has a structure in which one glucose (Glc) is bonded to carbon number 3 and S -form. It has the property of dissolving in the body by removing saccharides and dissolving in water differently from R-form.
  • a vector containing a ginsenoside glycosidase isolated from Herbiconiux ginsengi according to the present invention, a vector containing the nucleic acid encoding the gene , or a culture of the transformant is inoculated to ginseng crude saponin (S) -Rg3 is not limited to the method of producing ginsenoside 20 (S) -Rg3, but preferably produces 20 (S) -Rg3 under the following conditions.
  • Crude saponin can be used by dissolving 0.1 to 2% (w / v) of phosphate buffer 0.1M.
  • a vector-transformed culture containing a nucleic acid encoding a ginsenoside glycosidase isolated from Herbiconiux ginsengi may be used. More preferably, the cultured Herbiconiux ginsengi is collected and disrupted, and the ginsenoside glycosidase separated from the lysate can be collected and used, and it is preferable to use 1 U to 100 U.
  • the culture pH can be cultured at 6.0 to 8.0, more preferably at 6.5 to 7.5, and most preferably at about 7.0.
  • the incubation temperature is 28 to 40 ⁇ , preferably 30 to 37 ⁇ .
  • the incubation time is 12 to 72 hours, more preferably 24 to 48 hours.
  • the purity of 20 (S) -Rg3 can be increased through an additional purification step (for example, precipitation, re-melting, column chromatography, etc.) which is conventionally known. According to one embodiment of the present invention, the purity of 20 (S) -Rg3 is increased using Recycling Preparative HPLC.
  • a ginsenoside glycosidase isolated from Herbiconiux ginsengi according to the present invention, a vector-introduced transformant containing a nucleic acid encoding the gene , or a transformant obtained by transforming a culture of the transformant with ginseng Treating crude saponin to prepare a reaction solution containing ginsenoside 20 (S) -Rg3; And (b) a transformant into which a vector containing a ginsenoside glycosidase isolated from Flavobacterium johnsoniae and a nucleic acid encoding the same is introduced into the reaction solution prepared in the step (a) , Or a method of producing the ginsenoside 20 (S) -Rh2 by treating the culture of the transformant is not limited thereto, but preferably exhibits an ability to produce 20 (S) -Rh2 under the following conditions.
  • the step (a) is the same as that in the method for producing 20 (S) -Rg3.
  • Flavobacterium johnsoniae may be recovered from the cultured Flavobacterium johnsoniae and disrupted, and the ginsenoside glycosidase separated from the lysate may be collected and used in an amount of 1 U to 100 U.
  • the culture pH is 6.0 to 8.0, more preferably 6.5 to 7.5. Most preferably at about 7.0.
  • the incubation temperature is 28 to 40 ⁇ , preferably 30 to 37 ⁇ .
  • the incubation time is 12 to 72 hours, more preferably 24 to 36 hours.
  • the purity of 20 (S) -Rh2 can be increased through an additional purification process which is conventionally known. According to one embodiment of the present invention, the purity of 20 (S) -Rh2 is increased using Recycling Preparative HPLC.
  • a vector containing the ginsenoside glycosidase isolated from Flavobacterium johnsoniae according to the present invention, a vector containing the nucleic acid encoding the gene, or a culture of the transformant is cultured in a medium containing 20 (S) -Rg3 to produce gentianoside 20 (S) -Rh2 is not limited thereto, but preferably produces 20 (S) -Rh2 under the following conditions.
  • the method for producing the 20 (S) -Rh2 is the same as that for the step (b) of the method for preparing 20 (S) -Rh2.
  • the present invention relates to a method for producing a recombinant vector comprising a ginsenoside glycosidase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a vector containing a nucleic acid encoding the protein, or a culture of the transformant (S) -Rg3. ≪ / RTI >
  • the present invention relates to a method for producing a recombinant vector comprising the steps of: (a) cultivating a vector comprising a ginsenoside glycosidase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a vector containing the nucleic acid encoding the protein, or a culture of the transformant; And a ginsenoside glycosidase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a vector containing the nucleic acid encoding the protein, or a culture of the transformant , And a composition for converting crude saponin to 20 (S) -Rh2.
  • the process for the preparation of 20 (S) -Rg3 or 20 (S) -Rh2 according to the invention is characterized by the fact that in the minor form of the rare ginsenosides 20 (S) -Rg3 present in trace amounts in processed ginseng or ginseng, 20 (S) -Rh2 can be produced safely and efficiently, and the process is very simple, and the production efficiency is very high, which is advantageous in mass production for industrial use.
  • 1 is a schematic representation of the ginsenoside process of the present invention.
  • FIG. 3 shows the conversion of ginsenoside glycosidase (BglHg) from the strain Herbiococcinaceae to crude saponin comprising ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, Rd to convert to ginsenoside 20 (S) -Rg3 (S) -Rg3 was converted to ginsenoside 20 (S) -Rh2 by treating ginsenoside glycosidase (BglFj) from the strain Flavobacterium Johnsonii.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of the ginsenoside mixture (crude saponin) of the Korean ginseng on the ginseng, B of FIG. 3 after 48 hours of the treatment with ginsenoside glycosidase (BglHg), and C of the ginsenoside glycosidase BglFj) after 24 hours of treatment.
  • Leaves and roots of Korean ginseng were repeatedly extracted twice or more at room temperature for 1 to 2 hours with a 70% (v / v) alcohol content of 20 times volume and dried to obtain an extract.
  • the extract was re-dissolved in water and adsorbed on HP-20 resin.
  • the extract was washed with water to remove sugars and washed first with a 40% (v / v) alcohol to obtain protopanaxatriol (PPT)
  • PPT protopanaxatriol
  • Rg1 were first removed and then rinsed with a alcohol with an alcohol content of 80% (v / v) to obtain protopanaxadiol (PPD) series of ginsenosides Rb1, Rb2, Rc and Rd.
  • the extract was prepared.
  • Example 2-1 Preparation of recombinant expression vector and transforming microorganism containing novel ginsenoside glycosidase
  • Herbiconiux ginsengi KACC 14262 T and Flavobacterium johnsoniae KACC & lt ; RTI ID 0.0 > ( TM ) < / RTI & gt ; were used to prepare new ginsenoside glycosidases capable of converting major & A novel ginsenoside glycosidase was isolated from strain 11414 T.
  • Herbiconiux ginsengi KACC 14262 T and Flavobacterium johnsoniae KACC 11414 T strain was selected and its genomic DNA was extracted. Polymerase chain reaction (PCR) was performed using the genomic DNA as a template and each of the forward primers and the reverse primers. The primer sequences are shown in Table 1 below.
  • Each of the fragments amplified by the above reaction was inserted into a plasmid vector pGEX4T-1 (GE Healthcare, USA) into which glutathione S-transferase was inserted using an EzCloning Kit (Enzynomics) to obtain two recombinant expression vectors GST-BglHg GST-BglFj (derived from Flavobacterium jon sony).
  • Each of the recombinant expression vectors was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) strain by a conventional transformation method to produce Herbiconiux ginsengi KACC 14262 T or Flavobacterium johnsoniae , Transformants containing ginsenoside glycosidase from KACC 11414 T strain were prepared.
  • the transformed strain was inoculated into an Erlenmeyer flask containing 100 ml of LB medium supplemented with Ampicillin to prepare 600 The seed culture was carried out at 200 rpm in a shaking incubator at 37 ⁇ until the absorbance at nm was 0.6.
  • IPTG isopropyl-beta-D-thiogalactoside
  • the culture of the strain was centrifuged at 6,000 x g for 10 minutes at 4 ° C, suspended in 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) Was disrupted with a sonicator.
  • the cell lysate was centrifuged again at 13,000 x g for 15 minutes at 4 < 0 > C and then the water-soluble ginsenoside glycosidase was obtained from the supernatant which can be used for ginsenoside production.
  • the separated purified ginsenoside glycosidase was analyzed by SDS-PAGE, and the ginsenoside glycosidase from each Herbiconiux ginsengi KACC 14262 T was analyzed by BglHg, Flavobacterium Johnson ( The ginsenoside glycosidase derived from Flavobacterium johnsoniae KACC 11414 T strain was named BglFj.
  • the amino acid sequence of the ginsenoside glycosidase BglHg was 740, and the amino acid sequence thereof was represented by SEQ ID NO: 3.
  • the number of amino acids of the ginsenoside glycosidase BglFj was 766, and the amino acid sequence thereof was represented by SEQ ID NO: 4.
  • Example 2 The crude saponin prepared in Example 1 was dissolved in a 50 mM sodium phosphate buffer 0.1% (w / v), 0.2 U of ginsenoside glycosidase (BglHg) was added and the mixture was incubated at pH 7.0 and 37 ° C for 24 hours Lt; / RTI >
  • ginsenoside 20 (S) -Rh2 a portion of the sample was collected at intervals of 12 hours during the entire reaction period using the ginsenoside glycosidase (BglHg), and then ginsenoside glycosidase (BglFj) and cultured for 24 hours.
  • reaction was terminated by adding an aqueous-saturated butanol equivalent volume to each of the cultures.
  • n- butanol fraction was dried by evaporation, the residue was dissolved in CH 3 OH.
  • the dissolution solution was analyzed by thin layer chromatography (TLC), and the results are shown in FIG.
  • the ginsenosides Rb1, Rc and Rd (1) were converted (2) to ginsenoside 20 (S) -Rg3 by the ginsenoside BglHg, (S) -Rg3 was converted to 20 (S) -Rh2 (3).
  • HPLC HPLC was used to analyze the purity of ginsenoside 20 (S) -Rg3 and Rh2.
  • the column was a Prodigy ODS (2) C 18 column (5 ⁇ m, 150 ⁇ 4.6 mm Id; Phenomenex, USA), the guard column was Eclips XDB C 18 (5 ⁇ m, 150 x 4.6 mm Id), the mobile phase was water (A) and acetonitrile B).
  • Each isolate was dissolved in methanol at a concentration of 1 mg / ml, and then injected at a flow rate of 1.0 ml / min at 203 nm.
  • Example 4-1 Acquisition of enzyme solution containing ginsenoside glycosidase (BglHg)
  • the temperature of the fermenter was lowered to 25 ° C and 200 ml of glucose solution (600 g / L) was added to facilitate further growth of E. coli cells. 600 ml of 1 M sodium phosphate buffer was added thereto to maintain the pH at about pH 7.0 under stable pH conditions.
  • the final IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactoside) concentration of 0.1 mM was added to induce the large-scale expression of BglHg of ginsenoside glycosidase.
  • the culture of the strain was centrifuged at 6,000 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C.
  • E. coli about 30 g / L
  • 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) was added to the suspension, the cell solution was disrupted with a sonicator. The cell lysate was further centrifuged at 13,000 x g for 15 minutes at 4 DEG C to obtain a large amount of the enzyme solution containing the BglHg expressed in a water-soluble form.
  • Example 4-2 Mass production of ginsenoside 20 (S) -Rg3
  • the alcohol was added to 70% of the solution to inactivate the recombinase, and the ginsenoside 20 (S) -Rg3 was dissolved.
  • the dissolved ginsenosides were again adsorbed by HP20 porous resin, then washed with water, desorbed using 80% ethanol, and then discharged with a rotary evaporator to obtain high purity ginsenoside 20 (S) -Rg3 Respectively.
  • 250 g of the PPD mixture was reacted to obtain 142 g of ginsenoside 20 (S) -Rg3, which was confirmed by TLC.
  • Example 4-3 Production of ginsenoside 20 (S) -Rg3 with 98% purity
  • Example 5-1 Acquisition of enzyme solution containing ginsenoside glycosidase (BglFj)
  • a BglFj enzyme solution was obtained in the same manner as in Example 4-1 and in the same manner as in the mass production of BglHg enzyme solution.
  • the reaction solution after the conversion to 20 (S) -Rg3 in Example 4-2 was heat-treated at 80 DEG C for about 1 hour to inactivate the remaining BglHg enzyme. Thereafter, 2 L of BglFj enzyme solution was added to the reaction solution in which 20 (S) -Rg3 was dissolved, and the mixture was reacted for 24 hours while stirring at 150 rpm at a temperature of 37 ⁇ . To stop the reaction and to recover the converted 20 (S) -Rh2, the alcohol was added to 70% of the solution to inactivate the recombinase, and the ginsenoside 20 (S) -Rh2 was dissolved.
  • ginsenoside 20 (S) -Rh2 was again adsorbed on HP20 porous resin, then washed with water, desorbed using 80% ethanol, and then discharged with a rotary evaporator to obtain high purity ginsenoside 20 (S) -Rh2 could. Finally, 250 g of the PPD mixture was reacted to obtain 110 g of ginsenoside 20 (S) -Rh2, which was confirmed by TLC.

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Abstract

본원 발명은 진세노사이드 20(S)-Rg3 또는 20(S)-Rh2를 고효율 고순도로 얻기 위하여 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 이용하여 진세노사이드 20(S)-Rg3 또는 20(S)-Rh2 제조하는 방법에 관한 것이다. 본원 발명의 제조 방법에 따르면 인삼 또는 인삼의 가공품에 극미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 희귀 진세노사이드인 20(S)-Rg3 또는 20(S)-Rh2를 안전하고 효율적으로 다량 제조할 수 있으며, 특히 공정이 매우 간단하며 제조 효율이 매우 뛰어나 산업적인 용도로의 대량생산이 가능하다는 장점이 있다.

Description

진세노사이드 글리코시다제를 이용한 진세노사이드 20(S)-RG3 및 20(S)-RH2의 제조방법
본원 발명은 진세노사이드 20(S)-Rg3 또는 20(S)-Rh2를 고효율 및 고순도로 얻기 위하여 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi) 유래 또는 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) 유래의 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 이용하여 진세노사이드 20(S)-Rg3 또는 20(S)-Rh2를 제조하는 방법에 관한 것이다.
사포닌은 식물계에 널리 존재하는 배당체에서 당이 아닌 부분이 여러 고리 화합물로 이루어진 물질을 의미한다. 인삼 또는 홍삼에 주요 생리활성 성분으로 포함된 사포닌 성분인, 트리테르펜사포닌(triterpene saponin)은 타 식물에서 발견되는 사포닌과는 화학 구조가 상이하므로 이러한 인삼 사포닌을 타 식물계 사포닌과 구별하기 위해서 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 진세노사이드(Ginsenoside)라고 부른다.
진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계(Protopanaxadiol-type, PPD 타입) 진세노사이드, 프로토파낙사트라이올계(Protopanaxatriol-type, PPT 타입) 진세노사이드 및 올레아놀린산계(oleanolic acid 타입) 진세노사이드의 세 가지로 분류될 수 있다. 이러한 세 그룹은 화합물 구조 중 고리의 3번 탄소, 6번 탄소 및 20번 탄소 위치에 글리코시딕 결합(glycosicid bond)에 의해 부착되는 당 부위(sugar moieties)의 위치 및 수에 따라 분류된다. 올레아놀린산계 진세노사이드의 기본골격은 5환상이고, 여기에는 유일하게 진세노사이드 Ro가 있고, 그 아글리콘은 올레아놀릭산(oleanolic acid)이다. 현재, 180여종 이상의 진세노사이드들이 분리되었고, 이들 대부분은 PPD 타입의 진세노사이드이다. PPD 타입의 진세노사이드에는 예를 들어 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, 지페노사이드 XVII(Gypenoside XVII), 화합물 O(Compound O), 화합물 Mc1(Compound Mc1), F2, 화합물 Y(Compound Y), 화합물 Mc(Compound Mc), Rg3, Rh2, C-K가 포함된다. PPT 타입의 진세노사이드에는 Re, Rg1, Rf, Rg2, Rh1, F1 등이 포함된다.
또한, 건삼에서의 진세노사이드의 90% 이상을 차지하는 것은 메이저 진세노사이드이나 이는 각 화합물들의 큰 사이즈로 인하여 생체 내에서의 흡수율이 매우 낮은 문제점이 있다. 이에 따라, 진세노사이드의 약효를 증대시키기 위해 메이저 진세노사이드를 상대적으로 흡수도 잘 되며 약효도 더 뛰어난 F2, Rg3, Rk1, Rg5, Rh1, Rh2, Rk2, Rh3, 지페노사이드(gypenoside, Gyp) XVII, 지페노사이드 LXXV 및 화합물 K, Mc, Mc1(compound K, Mc, Mc1) 등의 마이너 진세노사이드로 전환시키기 위한 연구 개발이 진행되고 있다. 예를 들어, 위와 같은 전환을 위해 Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc 및 Rd 등의 메이저 진세노사이드에서 당을 구성하는 글루코스, 아라비노스, 람노스, 자일로스 등을 제거(deglycosylated)하는 전환 과정에 대한 연구가 진행되고 있으나, 일반적으로 이러한 전환 과정에서 손실이 상당히 크게 발생되며 목적하는 마이너 진세노사이드를 얻었을시에 이의 순도가 매우 낮은 문제점이 있다.
인삼에 매우 미량으로 존재하는 마이너 진세노사이드 중 하나인 진세노사이드 Rg3는 항암 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 진세노사이드 Rg3는 폐 전이(lung metastasis)를 억제하며, 상기와 같은 전이의 억제는 종양에 의해 유도되는 혈관신생(angiogensis)의 억제뿐만 아니라, 암세포의 침윤 및 부착(adhesion)을 억제하는 것과 관련되어 있다. 또한, 진세노사이드 Rg3는 염증 등에 관여하는 전사인자인 NF-kB 및 AP-1 전사인자를 하향조절(down-regulation)한다고 알려져 있다. 상기와 같은 기작 외에도 Rg3는 세포내 칼슘 수준을 감소키는 것으로 알려져 있으며, 대장암에서는 세포예정사(apoptosis)를 유발하며, 전립선암에서는 암세포의 증식을 억제하며, 난소암에서는 단독 또는 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)와 병용 사용하였을 때 암세포의 증식 및 혈관신생을 억제하는 것을 보인바 있다. 진세노사이드 Rg3는 상기와 같은 항암 효과 뿐만 아니라, AMPK(AMP-activated protein kinase) 신호전달 경로 및 PPAR-γ 억제를 통하여 항 비만 효과를 가지고 있음이 알려진바 있다. 이러한 이유로 Rg3는 암 및 비만 등을 포함하는 다양한 질병에서 약학적 활성 성분으로서 많은 주목을 받아 오고 있다.
또한 인삼에 매우 미량으로 존재하는 마이너 진세노사이드 중 하나인 20(S)-Rh2는 뇌세포 보호 효과를 통해 뇌졸중과 같은 뇌질환의 치료에 효과가 있음이 알려져 있다. 또한, 다양한 암종에서 항암 효과가 있음이 여러 학술논문 등에 개시되어 있으며, 일부 연구들에서는 항염증 효과를 통하여 만성 피부염과 같은 피부 질환들에도 치료 효과를 나타낼 수 있음이 개시되어 있다. 즉, 마이너 진세노사이드 중에서도 20(S)-Rh2는 그 용도가 매우 다양하게 알려지고 이용되고 있어 약리작용의 귀추가 주목되는 물질이다.
그러나, 위와 같은 20(S)-Rg3 및 20(S)-Rh2는 마이너 진세노사이드에 해당하여 인삼 자체에 매우 미량 포함되어 있으며 별도의 분리 공정을 거치더라도 위 두 성분을 다량으로 추출하는 것은 매우 어렵다. 이에 따라 위 두 성분을 분리 정제하여 사용하기 위한 다양한 연구 개발이 시도되었지만, 충분히 위 성분들을 분리하지 못하고 있다. 예를 들어, 화학적 분해 방법, 효소적 방법 및 배당체 합성을 이용한 방법 등이 제시되어 왔으나, 현재까지 알려진 위 방법들은 1) 제조 공정상 여러 단계를 거쳐야 하거나, 2) 제조과정에서 목적하는 성분이 다량 소실되며, 3) 식용에 부적합한 촉매를 사용하거나, 4) 낮은 수율을 나타내어 여전히 대량생산에 한계가 있는 실정이다.
효소적 방법으로,
α-L-아라비노피라노시다제(α-L-arabinopyranosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase), α-L-람노시다제(α-L-rhamnosidase) 등과 같은 다양한 효소를 이용한 생물 전환(biotransformation)에 대해 많은 연구가 있었으나, 대량 생산 방법으로서는 효과적이지 못하고, 많은 비용이 발생하는 문제를 해결하지 못하였다. 또한, 많은 미생물들에서 추출되거나 분리될 수 있는 위와 같은 효소들이 모두 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환시키는 것이 아니며, 특히 특정의 진세노사이드로 20(S)-Rg3 및 20(S)-Rh2와 같은 물질로 한정하였을 때 이용할 수 있다고 알려진 효소의 수는 극소수에 불과하다.
이러한 배경 하에, 인삼 등의 식물체에 미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 희귀 진세노사이드인 20(S)-Rg3 및 20(S)-Rh2와 같은 물질을 용이하게 고수율로 다량 수득하기 위한 방법에 대한 연구 개발이 필요한 실정이다.
따라서 본원 발명의 주된 목적은 인삼 또는 인삼의 가공품에 극미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 희귀 진세노사이드들, 특히 진세노사이드 20(S)-Rg3 및 20(S)-Rh2를 안전하고 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
구체적으로, 본원 발명의 목적은 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 인삼 조사포닌에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rg3을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본원 발명의 또 다른 목적은 (a) 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 인삼 조사포닌에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rg3을 포함하는 반응액 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 반응액에 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rh2를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본원 발명의 또 다른 목적은 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 20(S)-Rg3에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rh2를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본원 발명의 또 다른 목적은 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase), 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는, 조사포닌을 20(S)-Rg3으로 전환하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본원 발명의 또 다른 목적은 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase), 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물; 및 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase), 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는, 조사포닌을 20(S)-Rh2로 전환하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본원 발명자들은 인삼 등의 식물체에 미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 희귀 진세노사이드 20(S)-Rg3 및 20(S)-Rh2를 용이하게 고수율로 다량 수득하기 위한 방법을 개발하기 위하여 노력한 결과, PPD type의 진세노사이드들(Rb1, Rb2, Rc, Rd 등)을 포함하는 인삼의 조사포닌에 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제를 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rg3로 대량 생물전환시키고, 이에 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제를 처리하여 20(S)-Rh2로 대량 생물전환 시킴으로써 본원 발명을 완성하였다.
본원 발명은 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 인삼 조사포닌에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rg3을 제조하는 방법을 제공한다.
본원 발명은 또한 (a) 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 인삼 조사포닌에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rg3을 포함하는 반응액 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 반응액에 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rh2를 제조하는 방법을 제공한다.
본원 발명은 또한 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 20(S)-Rg3에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rh2를 제조하는 방법을 제공한다.
본원 발명에서 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)이란 그람 양성, 호기성, 운동성이 없는 간균이며, 중온성의 성질을 가지고 있으며 계통학적으로는Actinobacteria 문의 Microbacteriaceae 에 속해있는 미생물이다. 본원 발명에 있어서 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)는 바람직하게 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi) KACC 14262T이다.
본원 발명에서 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)이란 그람 음성, 간균, 중온성, 글라이딩 이동성, 종속영양성, 다양한 고분자 물질 (키틴, 전분, 단백질 등)을 분해하는 특징을 지니는 미생물이다. 본원 발명에 있어서 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)는 바람직하게 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) KACC 11414T이다.
본원 발명에서 진세노사이드 글리코시다제란 이당류 이상의 사슬형 다당류의 글루코시드 분자결합을 가수분해하는 분해하는 효소를 의미한다. 진세노사이드 글리코시다제의 활성 정도 및 기능은 효소 종류마다 차이가 있다. 구체적으로, 본원 발명에 따르는 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제는 베타-글루코시다제의 특징을 가진다. 또한, 본원 따르는 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제는 베타-글루코시다제의 특징을 가진다.
본원 발명에 따른 진세노사이드 글리코시다제는 PPD type의 진세노사이드들(Rb1, Rb2, Rc, Rd 등)을 포함하는 인삼의 조사포닌을 진세노사이드 20(S)-Rg3로 생물 전환시키거나 20(S)-Rg3을 20(S)-Rh2로 생물 전환시킬 수 있는 활성을 가지는 효소를 의미한다. 본원 발명에 있어서, 진세노사이드 글리코시다제는 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi) 또는 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi) KACC 14262T 또는 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) KACC 11414T로부터 진세노사이드 글리코시다제일 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 진세노사이드 글리코시다제일 수 있다. 상기 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 진세노사이드 글리코시다제 뿐만 아니라 상기 서열과 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 본원 발명에 따른 진세노사이드 글리코시다제의 활성과 동일활성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본원 발명의 범위 내에 포함된다.
상기 서열번호 3으로 표시되는 진세노사이드 글리코시다제는 조사포닌, 바람직하게 PPD type의 조사포닌을 20(S)-Rg3로 전환하는데 현저한 효과를 가진다. 특히, 조사포닌으로부터 20(S)-Rg3의 전환 후 추가로 더 진행되는 반응 진행 없이 20(S)-Rg3만을 높은 농도로 생산할 수 있어 높은 효율을 나타내며, 수용성인 20(S)-Rg3 형태만을 다량으로 생산하여 (R) 및 (S)-form의 추가적인 분리 과정 없이 20(S)-Rg3만을 다량으로 생산할 수 있다.
상기 서열번호 4로 표시되는 진세노사이드 글리코시다제는 20(S)-Rg3을 20(S)-Rh2로 전환하는데 현저한 효과를 가진다. 특히, 상기 서열번호 서열번호 3으로 표시되는 진세노사이드 글리코시다제를 이용하여 조사포닌으로부터 20(S)-Rg3로의 전환 후 해당 배양액에 바로 서열번호 4로 표시되는 진세노사이드 글리코시다제를 투여하여 배양하여도 높은 전환능을 보여 중간 정제 과정 없이 반응을 수행하여 반응 단계를 크게 축소하고 정제에 따른 소실을 줄일 수 있다. 또한, 전환 후 추가의 반응이 최소화되어 20(S)-Rh2를 높은 농도로 생산할 수 있어 높은 효율을 나타내며, 수용성인 20(S)-Rh2 형태만을 다량으로 생산하여 (R) 및 (S)-form의 추가적인 분리 과정 없이 20(S)-Rh2만을 다량으로 생산할 수 있다.
본원 발명에서 벡터는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물, 바람직하게 본원 발명에 따른 진세노사이드 글리코시다제가 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 말한다. 본원 발명에 따른 진세노사이드 글리코시다제의 염기 서열은 바람직하게 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열을 가진다.
본원 발명의 일실시예에 따르면, 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi) KACC 14262T로부터 유래된 서열번호 1의 염기서열을 가지는 진세노사이드 글리코시다제를 글루타티온 S-트랜스퍼라제가 삽입되어 있는 플라스미드 벡터 pGEX4T-1(GE Healthcare, USA)에 삽입하여, 재조합 발현 벡터 GST-BglHg를 제조하였다. 또한 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) KACC 11414T로부터 서열번호 2의 염기서열을 가지는 진세노사이드 글리코시다제를 글루타티온 S-트랜스퍼라제가 삽입되어 있는 플라스미드 벡터 pGEX4T-1(GE Healthcare, USA)에 삽입하여, 재조합 발현 벡터 GST-BglFj를 제작하였다.
본원 발명에서 형질전환은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 본원 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 상기의 방법으로 형질전환된 본원 발명의 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체는 조사포닌을 진세노사이드 20(S)-Rg3로, 또는 진세노사이드 20(S)-Rg3을 진세노사이드 20(S)-Rh2로 생물전환 전환시킬 수 있는 활성을 지닌다. 구체적으로, 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제를 포함하는 형질전환체는 조사포닌을 진세노사이드 20(S)-Rg3로 전환하는데 현저한 효과를 가진다. 또한, 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제를 포함하는 형질전환체는 진세노사이드 20(S)-Rg3을 진세노사이드 20(S)-Rh2로 전환하는데 현저한 효과를 가진다.
본원 발명에서 숙주는 본원 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본원 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)같은 바실러스(Bacillus)속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)같은 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)같은 효모; 동물세포 및 곤충 세포가 있다. 바람직하게는 E. coli이며, 보다 바람직하게는 E. coli BL21(DE3)이다.
본원 발명에서 배양물은 상기 형질전환체를 공지된 미생물 배양방법에 따라 배양한 다음 수득한 산물을 의미할 수 있다. 이 산물은 배양된 미생물을 수거하여 이를 파쇄한 후 파쇄물로부터 분리되는 진세노사이드 글리코시다제일 수 있다. 상기 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터가 도입된 형질전환체의 배양물은 조사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 20(S)-Rg3로 전환시킬 수 있는 활성을 지니거나 20(S)-Rg3을 20(S)-Rh2로 전환시킬 수 있는 활성을 지닌다.
인삼 조사포닌(crude saponin)은 성분별로 나뉘기 전의 미정제 상태의 사포닌을 말하는 것으로 일반적으로 인삼시료를 에탄올 등의 용매로 추출하거나 다공성 수지를 이용하여 고농도로 Rb1, Rb2, Rc 또는 Rd 등을 포함하게 한 것을 말한다. 본원 발명에서는 이러한 인삼 조사포닌 중에서 Rb1, Rb2, Rc 또는 Rd가 함유되어 있는 조사포닌이라면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 이러한 조사포닌은 고려인삼, 화기삼, 죽절삼을 포함한 여타인삼의 잎 및 뿌리로부터 주정을 사용하여 추출하는 방법으로 얻을 수 있고, 보다 바람직하게는 다공성 수지를 이용하여 당 및 protopanaxatriol 계열의 진세노사이드 등을 제거하여 Rb1, Rb2, Rc 또는 Rd의 함량을 높인 조사포닌을 사용하는 것이 좋다. 본 발명의 일실시예에 따르면, Rb1, Rb2, Rc, Rd 등 포함을 포함하는 PPD type 진세노사이드 혼합물이며, 이는 에탄올 용매에 의해 추출 후 다공성 수지를 통해 이의 PPD type 진세노사이드 함량을 높힌 것일 수 있다.
본원 발명에서 진세노사이드 20(S)-Rg3는 PPD 타입의 사포닌의 기본 탄소 골격에 있어, 3번 탄소에 두 개의 글루코스(Glc→Glc)가 결합되어 있는 형태의 마이너 진세노사이드 중 20 번째 탄소에서 S-form을 가지는 것을 말하며 당류가 제거되어 체내 흡수가 용이하며 R-form과 상이하게 물에 잘 녹는 특성을 지닌다.
본원 발명에서 진세노사이드 20(S)-Rh2는 PPD 타입의 사포닌의 기본 탄소 골격에 있어, 3번 탄소에 1 개의 글루코스(Glc)가 결합되어 있는 형태의 마이너 진세노사이드 중 20 번째 탄소에서 S-form을 가지는 것을 말하며 당류가 제거되어 체내 흡수가 용이하며 R-form과 상이하게 물에 잘 녹는 특성을 지닌다.
본원 발명에 따른 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 인삼 조사포닌에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rg3을 제조하는 방법은 이에 제한되지 않으나 바람직하게 하기 조건 하에서 우수한 20(S)-Rg3 생산능을 보인다.
조사포닌은 0.1 내지 2% (w/v)의 phosphate 버퍼 0.1M에 용해하여 사용가능하다. 또한, 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체의 배양물을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게 배양된 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)을 수거하여 이를 파쇄한 후 파쇄물로부터 분리되는 진세노사이드 글리코시다제를 모아서 사용할 수 있으며, 1 U 내지 100 U로 사용하는 것이 바람직하다. 배양 pH는 6.0 내지 8.0, 보다 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 가장 바람직하게는 약 7.0에서 배양될 수 있다. 배양온도는 28 내지 40 ℃ 바람직하게 30 내지 37℃이다. 배양 시간은 12 내지 72 시간이며, 보다 바람직하게 24 내지 48 시간이다.
상기 반응 후 통상적으로 알려진 추가의 정제 공정 (예컨대, 침전, 다시 녹임, 컬럼 크로마토그래피 등)을 통해 20(S)-Rg3의 순도를 높힐 수 있다. 본 발명의 일실시 양태에 따르면 Recycling Preparative HPLC를 이용하여 20(S)-Rg3의 순도를 높힌다.
본원 발명에 따른 (a) 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 인삼 조사포닌에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rg3을 포함하는 반응액 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 반응액에 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rh2를 제조하는 방법은 이에 제한되지 않으나 바람직하게 하기 조건 하에서 우수한 20(S)-Rh2 생산능을 보인다.
상기 (a) 단계는 앞서 20(S)-Rg3을 제조하는 방법에서의 조건과 동일하다.
상기 (b) 단계 수행 전 70 ℃ 내지 90 ℃, 바람직하게는 약 80 ℃에서 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제의 불활성화를 4시간 이상, 바람직하게 6시간 내지 12시간 동안 수행하여 효소를 비활성화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 배양된 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)을 수거하여 이를 파쇄한 후 파쇄물로부터 분리되는 진세노사이드 글리코시다제를 모아서 사용할 수 있으며, 1 U 내지 100 U로 사용하는 것이 바람직하다. 배양 pH는 6.0 내지 8.0, 보다 바람직하게는 6.5 내지 7.5. 가장 바람직하게는 약 7.0에서 배양될 수 있다. 배양온도는 28 내지 40 ℃ 바람직하게 30 내지 37℃이다. 배양 시간은 12 내지 72 시간이며, 보다 바람직하게 24 내지 36 시간이다.
상기 반응 후 통상적으로 알려진 추가의 정제 공정을 통해 20(S)-Rh2의 순도를 높힐 수 있다. 본 발명의 일실시 양태에 따르면 Recycling Preparative HPLC를 이용하여 20(S)-Rh2의 순도를 높힌다.
본원 발명에 따른 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 20(S)-Rg3에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rh2를 제조하는 방법은 이에 제한되지 않으나 바람직하게 하기 조건 하에서 우수한 20(S)-Rh2 생산능을 보인다.
상기 20(S)-Rh2를 제조하는 방법은 앞서 살핀 20(S)-Rh2를 제조하는 방법의 (b) 단계에서의 조건과 동일하다.
본원 발명은 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase), 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는, 조사포닌을 20(S)-Rg3으로 전환하기 위한 조성물을 제공한다.
본원 발명은 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase), 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물; 및 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase), 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는, 조사포닌을 20(S)-Rh2로 전환하기 위한 조성물을 제공한다.
본원 발명에 따른 20(S)-Rg3 또는 20(S)-Rh2의 제조 방법은 인삼 또는 인삼의 가공품에 극미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 희귀 진세노사이드인 20(S)-Rg3 및 20(S)-Rh2를 안전하고 효율적으로 제조할 수 있으며, 특히 공정이 매우 간단하며 제조 효율이 매우 뛰어나 산업적인 용도로 대량생산이 가능하다는 장점이 있다.
도 1은 본원 발명의 진세노사이드 제조방법을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 진세노사이드 BglHg에 의해 진세노사이드 Rb1, Rc, Rd 등을 포함하는 조사포닌이 진세노사이드 20(S)-Rg3로 전환되고, 이어 처리한 BglFj에 의해 20(S)-Rg3가 20(S)-Rh2로 전환되었음을 확인한 TLC 분석결과를 나타낸 것이다: (S) 표준품; (1) PPD 타입 기질을 포함하는 조사포닌; (2) 진세노사이드 BglHg에 의해 전환된 20(S)-Rg3; (3) BglFj에 의해 전환된 20(S)-Rh2.
도 3은 허비코뉴 진셍지 균주로부터의 진세노사이드 글리코시다제 (BglHg)를 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd를 포함하는 조사포닌에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rg3로 전환하고, 이에 플라보박테리엄 존소니에 균주로부터의 진세노사이드 글리코시다제 (BglFj)를 처리하여 20(S)-Rg3를 진세노사이드 20(S)-Rh2로 전환시킨 HPLC 분석결과를 나타낸 것으로, 도 3의 A는 고려인삼의 PPD 타입 진세노사이드 혼합물(조사포닌), 도 3의 B는 진세노사이드 글리코시다제(BglHg) 처리 48시간 후, 도 3의 C는 진세노사이드 글리코시다제(BglFj) 처리 24시간 후의 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본원 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본원 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본원 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 조사포닌 추출
고려인삼의 잎 및 뿌리를 20 배 체적의 알코올 함량 70%(v/v)의 주정으로 상온에서 1-2시간 동안 2회 이상 반복하여 추출하고 건조하여 추출물을 수득하였다. 이 추출물을 물에 다시 용해시켜서 HP-20 수지에 흡착시킨 후, 물로 세정하여 당을 제거하고 알코올 함량 40%(v/v)의 주정으로 1차 세정하여 protopanaxatriol (PPT) 계열인 진세노사이드 Re와 Rg1을 우선적으로 제거한 후, 알코올 함량 80%(v/v)의 주정으로 세정하여 protopanaxadiol (PPD) 계열인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd가 용출되어 나온 것을 획득하여 건조하여, 조사포닌 추출물을 제조하였다.
실시예 2. 신규 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase)의 제조
실시예 2-1: 신규 진세노사이드 글리코시다제를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작
메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있는 신규 진세노사이드 글리코시다제를 제조하기 위하여, 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi) KACC 14262T 및 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) KACC 11414T 균주로부터 신규 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase)를 분리하였다.
구체적으로, 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi) KACC 14262T와 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) KACC 11414T 균주를 선발하고, 이의 게놈 DNA를 추출하였다. 상기 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 각각의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 상기 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
[표 1]
Figure PCTKR2017014307-appb-I000001
상기 반응로 증폭된 단편 각각에 대한 서열 분석을 통해, 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi) KACC 14262T로부터 유래된 진세노사이드 글리코시다제의 염기 서열을 서열번호 1로 확인하였으며, 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) KACC 11414T 균주로부터 유래된 진세노사이드 글리코시다제의 염기 서열을 서열번호 2로 확인하였다.
상기 반응으로 증폭된 단편 각각을, 글루타티온 S-트랜스퍼라제가 삽입되어 있는 플라스미드 벡터 pGEX4T-1(GE Healthcare, USA)에 EzCloning Kit(Enzynomics)를 이용하여 삽입하여, 2개의 재조합 발현 벡터 GST-BglHg (허비코뉴 진셍지 유래), GST-BglFj (플라보박테리엄 존소니에 유래)를 제작하였다. 상기 재조합 발현 벡터 각각을 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환(transformation)시켜, 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi) KACC 14262T 또는 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) KACC 11414T 균주로부터 유래된 진세노사이드 글리코시다제를 포함하는 형질전환체들을 제조하였다.
실시예 2-2: 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase)의 분리
실시예 2-1의 형질전환체들로부터 진세노사이드 글리코시다제를 대량 생산하기 위하여, 상기 형질전환된 균주를 앰피실린(Ampicillin)이 첨가된 LB 배지 100 ㎖가 들어있는 삼각플라스크에 접종하여 600 nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 37 ℃의 진탕 배양기에서 200 rpm으로 종균 배양을 실시하였다. 가용성 단백질의 발현여부를 여러 온도(18, 22, 25, 30 및 37℃)에 따라 확인하기 위하여 여기에 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside)를 최종 0.1 mM 농도가 되도록 첨가하여 위 각 균주로부터 진세노사이드 글리코시다제의 대량 발현을 유도하였다.
균주가 정체기(stationary phase)에 들었을 때, 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 100mM 인산나트륨 버퍼(Sodium phosphate buffer, pH 7.0)를 첨가하여 현탁한 후, 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리한 다음, 수용성인 진세노사이드 글리코시다제를 진세노사이드 생산에 사용될 수 있는 상등액으로부터 획득하였다.
분리정제된 진세노사이드 글리코시다제를 SDS-PAGE로 분석하였으며, 각각의 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi) KACC 14262T로부터 유래된 진세노사이드 글리코시다제를 BglHg, 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) KACC 11414T 균주로부터 유래된 진세노사이드 글리코시다제를 BglFj로 명명하였다.
상기 진세노사이드 글리코시다제 BglHg 아미노산 개수는 740개이며, 이의 아미노산 서열을 서열번호 3으로 표시하였다. 또한, 진세노사이드 글리코시다제 BglFj 아미노산 개수는 766개이며, 이의 아미노산 서열을 서열번호 4로 표시하였다.
실시예 3. 진세노사이드 글리코시다제 BglHg 및 BglFj의 진세노사이드 생물 전환능 확인
상기 실시예 1에서 제조한 조사포닌을 50 mM 인산 나트륨 버퍼 0.1%(w/v)에 용해한 후, 진세노사이드 글리코시다제 (BglHg) 0.2U을 첨가하여 pH 7.0 및 37℃ 조건 하에서 24 시간동안 배양하였다.
이와 별도로, 진세노사이드 20(S)-Rh2을 획득하기 위해 상기 진세노사이드 글리코시다제 (BglHg)를 이용한 전체 반응 기간 동안 시료의 일부를 12시간 간격으로 수거하여, 이에 진세노사이드 글리코시다제 (BglFj) 처리하여 24시간동안 배양하였다.
상기 각각의 배양액에 수용액-포화된 부탄올 동량 부피를 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. n-부탄올 분획을 건조하여 증발시키고, 잔기를 CH3OH에 용해시켰다.
위 용해액을 TLC(thin layer chromatography)로 분석하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인되는 바와 같이, 진세노사이드 Rb1, Rc, Rd의 경우(1) 진세노사이드 BglHg에 의해 진세노사이드 20(S)-Rg3로 전환(2)되었으며, 이어 처리한 BglFj에 의해 20(S)-Rg3는 20(S)-Rh2로 전환(3)되었음이 확인되었다.
실험예 : HPLC 분석 조건
진세노사이드 20(S)-Rg3 및 Rh2의 순도를 분석하기 위하여 HPLC를 이용하였다. 컬럼은 Prodigy ODS(2) C18 column(5μm, 150 x 4.6mm I.d.; Phenomenex, USA), 가드컬럼은 Eclips XDB C18(5μm, 150 x 4.6mm I.d.), 이동상은 water(A) 및 acetonitrile(B)로서 gradient elution을 실시하였다. 각 분리물질을 메탄올에 1 mg/ml 용해한 후 25 μl injection한 후 flow rate 1.0 ml/min, 203 nm에서 detection하였다.
실시예 4. 신규한 진세노사이드 글리코시다제(BglHg)를 이용한 진세노사이드 20(S)-Rg3 대량 생산
실시예 4-1: 진세노사이드 글리코시다제(BglHg)를 포함하는 효소액 획득
100 g 이상의 대량 단위로 20(S)-Rg3을 생산하기 위한 효소액을 대량으로 얻기 위해서 10L 단위의 발효기(fermentor)에 형질전환된 E. coli 세포를 키우는 과정을 아래와 같이 수행하였다. 본 배양에 앞서, 본 배양 전날 500 ml 플라스크에 앰피실린이 함유된 LB 배지에 GST-BglHg 이 함유되어 있는 형질전환된 E.coli BL21(DE3) 세포를 접종하여 배양한 후, 다음날 10 L 발효기에서 6 L 볼륨의 LB(Luria-Bertani media)에 접종하여 600 nm에서의 흡광도가 3이 될 때까지 37 ℃의 진탕 배양기에서 500 rpm으로 배양을 수행하였다. 수용성 재조합 단백질인 BglHg의 발현 유도하기 위해서 발효기의 온도를 25℃로 낮추고, E.coli 세포의 추가 성장을 원활히 하기 위하여 글루코스 용액(600 g/L)을 200 ml 넣어주었다. 여기에 1M 인산나트륨 버퍼 600 ml를 넣어주어서 안정적인 pH 조건으로 약 pH 7.0을 유지하였다. 여기에 최종 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside) 농도가 0.1 mM이 되도록 첨가하고, 진세노사이드 글리코시다제 BglHg의 대량 발현을 유도하였다. 8 시간 동안 이를 배양하여 균주가 정체기(staionary phase)에 들었을 때, 상기 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여, E.coli를 200 g 얻었다 (30g/L 전후). 이에 100 mM 인산나트륨 버퍼(Sodium phosphate buffer, pH 7.0)를 첨가하여 현탁한 다음, 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 수용성으로 발현된 상기 BglHg가 포함된 효소액을 대량으로 획득하였다.
실시예 4-2: 진세노사이드 20(S)-Rg3 대량 생산
상기 실시예 4-1에서 대량으로 얻어진 효소액 2L에 최대 농도 5%인 PPD type 진세노사이드 혼합물(Rb1, Rb2, Rc, Rd 등 포함, 조사포닌) 6L를 37℃의 온도에서 150rpm으로 교반시키면서 48시간 반응시켰다.
한편, 반응 전 PPD type 진세노사이드 혼합물에 대한 HPLC 분석을 실험예에 기재된 바와 같이 수행하여 그 결과는 도 3의 A에 나타내었다.
반응을 중단시키고 전환된 20(S)-Rg3을 회수하기 위하여 주정을 70%가 되도록 첨가하여 재조합 효소는 불활성시켜 다운시키고, 진세노사이드 20(S)-Rg3는 용해시켰다. 용해된 진세노사이드는 다시 알코올 농도를 낮추어 HP20 다공성 수지로 흡착 후, 물로 세척 후, 80% 에탄올을 이용하여 탈착시킨 후, 감압식 회전 증발기로 날려서 순도 높은 진세노사이드 20(S)-Rg3를 획득하였다. 최종적으로 PPD 혼합물 250 g을 반응시켜서 142g의 고농도의 진세노사이드 20(S)-Rg3을 얻을 수 있었으며, 이를 TLC로 확인하였다.
상기 얻어진 진세노사이드 20(S)-Rg3에 대한 HPLC 분석을 실험예에 기재된 바와 같이 수행하였다. 그 결과를 도 3의 B에 나타내었으며, HPLC 분석결과 순도는 크로마토그램의 면적비 비율상 75.4%로 상당히 높은 비율로 20(S)-Rg3이 생성됨을 확인하였다.
실시예 4-3: 98% 순도의 진세노사이드 20(S)-Rg3 생산
상기 실시예 4-2에서 얻어진 진세노사이드 20(S)-Rg3의 순도를 올리기 위하여 Japan Analytical Instrument사의 Recycling Preparative HPLC를 이용하였다. 75%의 ACN에 20(S)-Rg3를 500 mg 녹여서 동일조건의 용매 (ACN 75%) 7ml/min 속도로 ODS AP 컬럼 (50 φ × 500 mm) 으로 분취하여 크로마토그램의 면적비 비율상 순도 99%의 240 mg의 진세노사이드 20(S)-Rg3를 획득할 수 있었다.
실시예 5. 신규한 진세노사이드 글리코시다제(BglFj)를 이용한 진세노사이드 20(S)-Rh2 대량 생산
실시예 5-1: 진세노사이드 글리코시다제(BglFj)를 포함하는 효소액 획득
상기 실시예 4-1에서와 BglHg 효소액의 대량 생산 방법과 동일하게, BglFj 효소액을 획득하였다.
실시예 5-2: 진세노사이드 20(S)-Rh2 대량 생산
상기 실시예 4-2에서 20(S)-Rg3로의 전환반응이 끝난 반응액에 80 ℃에서 1시간 가량 열처리를 하여 남아있는 BglHg 효소를 비활성시켰다. 그 후에 BglFj 효소액 2L를 20(S)-Rg3가 녹아있는 반응액에 첨가하여 37 ℃의 온도에서 150 rpm으로 교반시키면서 24시간 반응시켰다. 반응을 중단시키고 전환된 20(S)-Rh2을 회수하기 위하여 주정을 70%가 되도록 첨가하여 재조합 효소는 불활성시켜 다운시키고, 진세노사이드 20(S)-Rh2는 용해시켰다. 용해된 진세노사이드는 다시 알코올 농도를 낮추어 HP20 다공성 수지로 흡착 후, 물로 세척 후, 80% 에탄올을 이용하여 탈착시킨 후, 감압식 회전 증발기로 날려서 순도 높은 진세노사이드 20(S)-Rh2를 획득할 수 있었다. 최종적으로 PPD 혼합물 250 g을 반응시켜서 110g의 진세노사이드 20(S)-Rh2을 얻을 수 있었으며, 이를 TLC로 확인하였다.
상기 얻어진 진세노사이드 20(S)-Rh2에 대한 HPLC 분석을 실험예에 기재된 바와 같이 수행하였다. 그 결과를 도 3의 C에 나타내었으며, HPLC 분석결과 순도는 크로마토 그램의 면적비 비율상 72.8%로 상당히 높은 비율로 20(S)-Rh2가 생성됨을 확인하였다.
실시예 5-3: 98% 순도의 진세노사이드 20(S)-Rh2 생산
상기 실시예 5-2에서 얻어진 진세노사이드 20(S)-Rh2의 순도를 올리기 위하여 Japan Analytical Instrument사의 Recycling Preparative HPLC를 이용하였다. 90%의 ACN에 20(S)-Rh2를 500 mg 녹여서 동일조건의 용매 (ACN 75%) 7ml/min 속도로 ODS AP 컬럼 (50 φ × 500 mm) 으로 분취하여 크로마토 그램의 면적비 비율상 순도 99%의 235 mg의 진세노사이드 20(S)-Rh2를 획득할 수 있었다.

Claims (11)

  1. 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 인삼 조사포닌에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rg3을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 진세노사이드 글리코시다제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 진세노사이드 20(S)-Rg3을 제조하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 진세노사이드 글리코시다제는 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체의 배양물에 포함된 것인, 진세노사이드 20(S)-Rg3을 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 인삼 조사포닌에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rg3을 제조하는 단계는 pH 6.0 내지 8.0, 온도 28 내지 40 ℃ 및 배양시간 12 내지 72시간으로 처리하는 것인, 진세노사이드 20(S)-Rg3을 제조하는 방법.
  5. (a) 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 인삼 조사포닌에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rg3을 포함하는 반응액 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 반응액에 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rh2를 제조하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (a) 단계의 진세노사이드 글리코시다제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되며, 상기 (b) 단계의 진세노사이드 글리코시다제는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 진세노사이드 20(S)-Rh2를 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 진세노사이드 글리코시다제는 허비코뉴 진셍지(Herbiconiux ginsengi)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체의 배양물에 포함되는 것이며, 상기 (b) 단계에서 진세노사이드 글리코시다제는 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae)로부터 분리된 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체의 배양물에 포함되는 것인, 진세노사이드 20(S)-Rh2를 제조하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 (a)단계에서 인삼 조사포닌에 처리하여 진세노사이드 20(S)-Rg3을 제조하는 단계는 pH 6.0 내지 8.0, 온도 28 내지 40 ℃ 및 배양시간 12 내지 72시간으로 처리하는 것이며, 상기 (b)단계에서 진세노사이드 20(S)-Rh2를 제조하는 단계는 pH 6.0 내지 8.0, 온도 28 내지 40 ℃ 및 배양시간 12 내지 72시간으로 처리하는 것인, 진세노사이드 20(S)-Rh2를 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 (b) 단계 진행 전 70 ℃ 내지 90 ℃로 4시간 이상 가열하여 진세노사이드 글리코시다제의 불활성화를 수행하는 단계를 더 포함하는 것인, 진세노사이드 20(S)-Rh2를 제조하는 방법.
  10. 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase), 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는, 조사포닌을 20(S)-Rg3으로 전환하기 위한 조성물.
  11. 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase), 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물; 및 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase), 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는, 조사포닌을 20(S)-Rh2로 전환하기 위한 조성물.
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