CN111118096A - 一种皂苷的酶催化制备方法 - Google Patents
一种皂苷的酶催化制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种皂苷的酶催化制备方法。该方法通过酶催化特异性地水解掉人参皂甙Rg3或水解薯蓣皂甙上的葡萄糖基，水解人参皂甙Rg3变成人参皂甙Rh2或水解薯蓣皂甙变成葡萄糖基薯蓣皂甙。产物单一，综合转化率达到85％以上，只需要通过重结晶就可以得到98％以上高纯度的产品，工艺简单、设备要求低，生产过程中的溶剂可以循环利用、绿色环保，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种皂苷的酶催化制备方法，属于生物化工领域，用于制备医药中间体。
背景技术
皂苷(saponin)是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，主要分布于陆地高等植物中，也少量存在于海星和海参等海洋生物中。许多中草药如人参、远志、桔梗、甘草、知母和柴胡等的主要有效成分都含有皂苷。有些皂苷还具有抗菌的活性或解热、镇静、抗癌等有价值的生物活性。皂苷由皂苷配基与糖、糖醛酸或其他有机酸组成。组成皂苷的糖常见的有D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、L-木糖。常见的糖醛酸有葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，这些糖或糖醛酸往往先结合成低聚糖糖链，然后与皂苷配基分子中C3-OH相缩合，或由两个糖链分别与皂苷配基分子中两个不同位置上的OH相缩合，皂苷配基分子中的-COOH也可能与糖连接，形成酯苷键。往往由于其结合的糖种类和数量等不同，造成其性质和活性的差异，这就给通过化学修饰改造结构提供了较大的空间。
人参作为传统中药，已经有四千年的使用历史了。上世纪90年代初，日本学者发现人参中的一种活性物质—人参皂甙Rg3具有选择性地抑制肿瘤细胞浸润和转移的作用。人参中共有40多种皂甙，但Rg3在新鲜的或自然干燥的人参药材中并不存在，在红参中的含量仅为十万分之三。人参皂甙不仅具有防癌和抗癌的作用，还有提高免疫、保肝、抗疲劳、保护脑神经细胞及抗血栓等药理作用。同时随着对人参研究的深入，日本学者首次从红参中发现了人参皂甙Rh2，这种皂甙是一种次生甙，是鲜人参加工制成红参时，由于某些结构相似的皂甙受热降解后生成的，其在红参中的含量约在十万分之一左右。人参皂甙Rh2在十年前就被发现有抗癌活性，但是由于含量低、提取效率低、成本过高，并没有被过度的开发和利用。近年来临床试验结果陆续被报导出来，人参皂甙Rh2对于抗癌的疗效极为惊人，被视为当今最具潜力的天然抗癌物质，研究证明人参皂甙Rh2对癌细胞有抑制及抗转移的效果，而且效果非常明显。人参皂甙Rh2不但具有抑制所有癌细胞的生长、诱导分化癌细胞和抗转移的功能，同时对人体无毒性。人参皂甙Rh2使癌细胞核枯萎、死亡的作用，不同于任何放化疗方法及药物。人参皂甙Rh2对人体尚有非常优秀的提升各种免疫机能的作用，对人体健康细胞毫无毒副作用，只专攻击癌细胞。具有极大的开发利用价值。三七与人参同为五加科人参属植物，有研究表明，三七茎叶也是人参皂甙Rh2和人参皂甙Rg3的重要来源。同时三七中含有大量的人参二醇组皂甙，这是制备人参甙Rh2和人参皂甙Rg3的提供良好的原料基础。
薯蓣皂素是黄姜或川地龙中重要的活性物质，具有雌激素和降低胆固醇的作用，具有抗菌、消炎、止咳等作用，由于其结构与甾体激素的结构极为相似，可作为合成甾体激素药物的主要中间体，是半合成甾族化合物的重要原料。以川地龙或黄姜生药为原料，经水解、提取而得。将薯蓣皂素进行开环、氧化、水解和消除反应，可制得孕甾双烯酮醇。再经肟化、重排和水解，可制得去氢表雄酮。中国化学家黄鸣龙等以薯蓣皂苷元为原料，用七步反应成功地合成了可的松。这些中间体在药物生产中有重要价值。由于薯蓣皂素在原药材中的含量较低，通常是以糖苷的形式存在，其中含量最高的为薯蓣皂苷，但由于薯蓣皂苷自身结构问题，在提取过程中与植物细胞壁黏贴紧密，因此提取效率低。工业上一般采用先发酵(酸解后)形成薯蓣皂素后再提取纯化获得，但这种方法存在着污水量大，污水酸性强，有机物及色素含量高，极难治理，处置不当容易对周围环境造成巨大污染，因此找到一个合适的方法对于其开发利用有着重要意义。
本发明通过一种皂甙糖苷水解酶对三七皂甙和薯蓣皂甙通过酸解和酶催化进行结构修饰改造，制备人参皂甙Rh2和薯蓣皂素。
发明内容
本发明的目的是克服现有人参皂甙Rh2在大自然中含量极低甚至无，直接通过植物提取来获得高纯度的人参皂甙Rh2势必会付出极其高昂的生产成本；薯蓣皂素在原药材中的含量较低，且由于自身结构问题，在提取过程中与植物细胞壁黏贴紧密，因此提取效率低，而且目前工业法存在着污水量大，污水酸性强，有机物及色素含量高，极难治理，处置不当容易对周围环境造成巨大污染等缺陷，提供一种可高效制备人参皂甙Rh2和薯蓣皂素的酶催化方法，解决现阶段人参皂甙Rh2和薯蓣皂素产量低、价格高的问题。具体为，将三七总皂甙或薯蓣皂甙原料用乙酸处理，提取其中的皂甙成分然后在磷酸盐缓冲液中以皂甙糖苷水解酶作为催化剂酶进行酶催化反应使三七总皂甙或薯蓣皂甙转变为人参皂甙Rh2或葡萄糖基薯蓣皂甙；之后在β葡萄糖水解酶作为催化剂酶进行酶催化反应进一步水解得到人参皂甙Rh2或薯蓣皂素粗产品；最后重结晶得到人参皂甙Rh2或薯蓣皂素纯品。
本发明所采取的技术方案：
(1)皂甙原料的酸解：将从中药材中提取而来的皂甙原料加入5％乙酸中，回流酸解4～10h，冷却析晶过滤，干燥获得酸解物；其中皂甙原料与乙酸的质量比为1：10～20；皂甙原料为三七总皂甙或薯蓣皂甙原料；
(2)皂甙酶催化水解：将步骤(1)得到的酸解物加入到pH在7.0～8.5之间磷酸盐缓冲液，加入皂甙糖苷水解酶作为催化剂酶在30～60℃下进行酶催化反应5～30h，冷却析晶过滤，干燥获得酶解物；其中酸解物：磷酸盐缓冲液：皂甙糖苷水解酶的质量比为1：5～20：0.01～0.1；
(3)皂甙水解脱葡萄糖：将步骤(2)得到的酶解物加入到pH在7.0～8.5之间磷酸盐缓冲液，加入β葡萄糖水解酶在30～60℃下进行酶催化反应1～5h，冷却析晶过滤，50℃下干燥获得皂甙粗产品；
(4)皂甙的提纯：将步骤(3)制备得到的皂甙粗产品在乙酸乙酯中进行重结晶3～5遍，得到98％以上含量的人参皂甙Rh2或薯蓣皂素纯品。
所述的酶催化制备皂苷的方法，皂甙糖苷水解酶的基因序列为SEQ ID No.1所示基因序列，或基因序列与SEQ ID No.1所示的基因序列具备95％以上的同源性且将人参皂甙Rg3水解成人参皂甙Rh2或者将薯蓣皂甙水解成葡萄糖基薯蓣皂甙的水解酶的基因序列。
所述的酶催化制备皂苷的方法，皂甙糖苷水解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示氨基酸序列，或氨基酸序列与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具备98％以上的同源性且将人参皂甙Rg3水解成人参皂甙Rh2或者将薯蓣皂甙水解成葡萄糖基薯蓣皂甙的水解酶的氨基酸序列。
所述的酶催化制备皂苷的方法，皂甙糖苷水解酶的细胞为基因工程改造的酵母菌或大肠杆菌。
所述的一种酶催化制备皂苷的方法，该酶催化制备皂苷的方法所制备得到的人参皂甙Rh2或薯蓣皂素含量≥98％，综合产率≥85％。
本发明的有益效果：该方法可以特异性地水解掉人参皂甙Rg3或水解薯蓣皂甙上的葡萄糖基，水解人参皂甙Rg3变成人参皂甙Rh2或水解薯蓣皂甙变成葡萄糖基薯蓣皂甙。产物单一，综合转化率达到85％以上，只需要通过重结晶就可以得到98％以上高纯度的产品，工艺简单，设备要求低，生产过程中的溶剂可以循环利用，绿色环保，适合工业化生产。本发明方法对原料的要求比较宽泛，不需要用高纯度的皂甙原料就可以高效地生产出高纯度的人参皂甙Rh2或薯蓣皂素，较大幅度地降低了生产成本。本发明过程中使用酸的量相比传统方法大大减少，并且水解母液还可进行多次的循环利用，极大地减轻了对环保的压力。
具体实施方式
以下介绍本发明制备方法的实施例，但以下实施例是用于说明本发明的示例，并不构成对本发明权利要求的任何限定。
实施例1
人参皂甙Rh2的制备，制备人参皂甙Rh2的反应方程式如式I所示。所用的皂甙糖苷水解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示氨基酸序列。
(1)皂甙原料的酸解：将从三七中提取而来的三七总皂甙原料100g加入1000mL的5％乙酸中，回流酸解10h，冷却析晶过滤，干燥获得酸解物；
(2)皂甙酶催化水解：将步骤(1)得到的酸解物21g加入到210mL的pH为8.0的磷酸盐缓冲液，加入200mg皂甙糖苷水解酶作为催化剂酶在60℃下进行酶催化反应20h，冷却析晶过滤，50℃下干燥获得酶解物；
(3)皂甙水解脱葡萄糖：本实施例不需要此步骤；
(4)皂甙的提纯：将步骤(3)制备得到的皂甙粗产品在乙酸乙酯中进行重结晶3遍，得到98％以上含量的人参皂甙Rh2纯品，综合产率88％。
实施例2
人参皂甙Rh2的制备，制备人参皂甙Rh2的反应方程式如式I所示。所用的皂甙糖苷水解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示氨基酸序列。
(1)皂甙原料的酸解：同实施例1；
(2)皂甙酶催化水解：将步骤(1)得到的酸解物21g加入到210mL的pH为8.0的磷酸盐缓冲液，加入100mg皂甙糖苷水解酶作为催化剂酶在60℃下进行酶催化反应30h，冷却析晶过滤，50℃下干燥获得酶解物；
(3)皂甙水解脱葡萄糖：本实施例不需要此步骤；
(4)皂甙的提纯：将步骤(3)制备得到的皂甙粗产品在乙酸乙酯中进行重结晶5遍，得到99％以上含量的人参皂甙Rh2纯品，综合产率86％。
实施例3
薯蓣皂素的制备，所用的皂甙糖苷水解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示氨基酸序列。
(1)皂甙原料的酸解：将从药材提取而来的薯蓣皂甙原料100g加入1000mL的5％乙酸中，回流酸解8h，冷却析晶过滤，干燥获得酸解物；
(2)皂甙酶催化水解，此步反应式如式II所示：将步骤(1)得到的酸解物100g加入到1000mL的pH为7.0的磷酸盐缓冲液，加入200mg皂甙糖苷水解酶作为催化剂酶在40℃下进行酶催化反应5h，冷却析晶过滤，50℃下干燥获得酶解物；
(3)皂甙水解脱葡萄糖，此步反应式如式III所示：将步骤(2)得到的酶解物65g加入到650mL的pH为8.0之间磷酸盐缓冲液，加入6mg的β葡萄糖水解酶在60℃下进行酶催化反应2h，冷却析晶过滤，50℃下干燥获得皂甙粗产品；
(4)皂甙的提纯：将步骤(3)制备得到的皂甙粗产品在乙酸乙酯中进行重结晶3遍，得到99％以上含量的薯蓣皂素纯品，综合产率86％。
实施例4
薯蓣皂素的制备，所用的皂甙糖苷水解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示氨基酸序列。
(1)皂甙原料的酸解：同实施例3；
(2)皂甙酶催化水解，反应式如式II所示：将步骤(1)得到的酸解物100g加入到1000mL的pH为7.0的磷酸盐缓冲液，加入100mg皂甙糖苷水解酶作为催化剂酶在60℃下进行酶催化反应5h，冷却析晶过滤，50℃下干燥获得酶解物；
(3)皂甙水解脱葡萄糖，此步反应式如式III所示：同实施例3；
(4)皂甙的提纯：将步骤(3)制备得到的皂甙粗产品在乙酸乙酯中进行重结晶3遍，得到99％以上含量的薯蓣皂素纯品，综合产率87％。
实施例5
薯蓣皂素的制备，所用的皂甙糖苷水解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示氨基酸序列。
(1)皂甙原料的酸解，此步反应式如式II所示：同实施例3；
(2)皂甙酶催化水解，此步反应式如式III所示：同实施例3；
(3)皂甙水解脱葡萄糖：将步骤(2)得到的酶解物65g加入到650mL的pH为7.5的磷酸盐缓冲液，加入10mg的β葡萄糖水解酶在60℃下进行酶催化反应5h，冷却析晶过滤，50℃下干燥获得皂甙粗产品；
(4)皂甙的提纯：将步骤(3)制备得到的皂甙粗产品在乙酸乙酯中进行重结晶3遍，得到99％以上含量的薯蓣皂素纯品，综合产率89％。
Claims (4)
1.一种皂苷的酶催化制备方法，其特征在于：皂苷的酶催化制备方法步骤如下：
(1)皂甙原料的酸解：将从中药材中提取而来的皂甙原料加入5％乙酸中，回流酸解4～10h，冷却析晶过滤，干燥获得酸解物；其中皂甙原料与乙酸的质量比为1：10～20；皂甙原料为三七总皂甙或薯蓣皂甙原料；
(2)皂甙酶催化水解：将步骤(1)得到的酸解物加入到pH为7.0～8.5之间磷酸盐缓冲液，加入皂甙糖苷水解酶作为催化剂酶在30～60℃下进行酶催化反应5～30h，冷却析晶过滤，干燥获得酶解物；酸解物：磷酸盐缓冲液：反式糖苷水解酶的质量比为1：5～20：0.01～0.1；
(3)皂甙水解脱葡萄糖：将步骤(2)得到的酶解物加入到pH为7.0～8.5之间磷酸盐缓冲液，加入β葡萄糖水解酶在30～60℃下进行酶催化反应1～5h，冷却析晶过滤，50℃下干燥获得皂甙粗产品；
(4)皂甙的提纯：将步骤(3)制备得到的皂甙粗产品在乙酸乙酯中进行重结晶3～5次，得到98％以上含量的人参皂甙Rh2或薯蓣皂素纯品。
2.根据权利要求1所述的酶催化制备皂苷的方法，其特征在于：皂甙糖苷水解酶的基因序列为SEQ ID No.1所示基因序列，或基因序列与SEQ ID No.1所示的基因序列具备95％以上的同源性且将人参皂甙Rg3水解成人参皂甙Rh2或者将薯蓣皂甙水解成葡萄糖基薯蓣皂甙的水解酶的基因序列。
3.根据权利要求1所述的酶催化制备皂苷的方法，其特征在于：皂甙糖苷水解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示氨基酸序列，或氨基酸序列与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具备98％以上的同源性且将人参皂甙Rg3水解成人参皂甙Rh2或者将薯蓣皂甙水解成葡萄糖基薯蓣皂甙的水解酶的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的酶催化制备皂苷的方法，其特征在于：皂甙糖苷水解酶的细胞为基因工程改造的酵母菌或大肠杆菌。
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