CN110669742A

CN110669742A - 一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法

Info

Publication number: CN110669742A
Application number: CN201911064908.8A
Authority: CN
Inventors: 孙芳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2020-01-10

Abstract

本发明涉及农药降解技术领域，尤其涉及一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法，包括以下步骤：1）菌种的活化；2）种子液的培养；3）发酵产酶培养；4）粗酶液的制备。本发明发酵培养基以麦芽糊精为碳源，玉米蛋白和蛋白胨为复合氮源，还添加了酪氨酸、水杨酸、胺鲜酯、儿茶素、藜芦醇、富勒烯水溶液、亚精胺、吐温‑80等能够促进朱红栓菌漆酶合成与分泌的物质，同时对发酵过程进行了分批补料和pH的调控，建立了优化的朱红栓菌液体发酵产漆酶的生产工艺，达到了提高漆酶活力和产量，降低漆酶生产成本的目的，为今后漆酶的工业化生产以及在农药降解领域的应用奠定基础。

Description

一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法

技术领域

本发明涉及农药降解技术领域，尤其涉及一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法。

背景技术

农药的种类按化学成分可分为有机氯类、有机磷类、有机氮类、有机硫类、砷制剂、拟除虫菊脂类等。20世纪60年代以来，许多国家开始禁止或限制使用有机氯农药，而有机磷农药以其品种多、药效高、防治范围广谱等特点，逐步发展成应用最广泛的农药类别。目前，世界上有机磷农药的种类已达150多种，我国生产的有机磷农药的品种就有20余种，年产量超过10万吨，占我国农药总产量的80%以上。有机磷农药都具有不同程度的毒性，其中甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、久效磷、敌敌畏等常用品种是剧毒农药。有机磷农药大量使用对生态环境中其他非靶标生物乃至土壤、水、大气整个生态系统中的产生负面影响日益严重，尤其是果蔬等农产品中的农药残留通过食物链在生物体内富集对人类造成严重危害更不容忽视。防治有机磷农药污染，除了发展高效低毒无污染的“绿色无公害有机磷农药”、制定有机磷农药安全合理使用制度外，研究降低和消除现有有机磷农药残毒是近年来发展的一种解决农药残留毒害的新方法。

农药的降解方法主要有物理法、化学法以及生物降解法三种。所谓生物降解就是通过生物的作用将农药分解为小分子无毒或低毒化合物，并最终降解为水、CO₂和矿物质的过程。相对于物理、化学降解技术，生物降解具有高效、彻底、无二次污染等优势，已经成为当前研究的热点。微生物由于其强大的代谢多样性，在有机磷农药残留降解中具有更大的优势。无论是单一还是共生的微生物对有机磷农药的降解代谢都是在酶的参与下进行的，微生物体内存在的各种酶都有降解代谢特定农药的酶系基因。降解代谢酶能够作用于磷酯键部位使磷酯键断裂，生成羧酸和醇，再进一步氧化、脱氢，从而使其脱毒。因此，可以认为微生物对有机磷农药的降解代谢主要是酶促降解。20世纪80年代，Horne等发现有机磷农药降解酶比产生这类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件，此外，由于降解酶不存在碳源的选择问题，酶的降解效果远胜于微生物本身。因此，研究从应用微生物菌体转向利用有机磷农药降解酶净化农药污染。常见的有机磷农药降解酶主要是水解酶类，包括磷酸酶、对硫磷水解酶、酯酶、硫基酰胺酶、裂解酶等，它们主要通过裂解P-O，P-S，P-N等键，使有机磷农药被降解，生成简单无机化合物。但是目前已开发的有机磷农药降解酶产品都具有一定的限制性，表现在有机磷农药降解范围较小，降解率不高等。

漆酶是一种含铜离子的多酚氧化酶，早在1883年，日本学者吉田（Yoshida）在日本漆树的汁液中发现了一种蛋白质，它能使汁液迅速固化；Bertrand和Laborde于1896年发现真菌也能分泌这种蛋白质，并首次将其命名为“漆酶”。漆酶能够催化氧化多种酚类和非酚类化合物，同时伴随有分子氧还原成水。漆酶主要分布在高等植物和真菌中，在动物、细菌体内发现相对较少，其中最重要的产生茵是白腐真茵。近些年，人们对漆酶的研究主要集中在烟管菌属（Bjerkandera）、革盖菌属（Coriolus）、层孔菌属（Fomes）、卧孔菌属（Perenniporia）、原毛平革菌属（Phanerochaete）、侧耳属（Pleurotus）、密孔菌属（Pycnoporus）、栓菌属（Trametes）等。漆酶作为白腐真菌胞外木质素氧化三大酶系的一种，具有广泛的底物作用范围，能够催化酚类、芳胺类、生物色素、羧酸类、金属有机物、甾体类激素和许多其他非酚类物质的氧化，使之生成相应的羰基化合物、醌类化合物。在催化底物氧化时，不会产生有害的活力氧和过氧化氢等中间产物，是一种非常绿色的反应，所以本质上称它是一种环保型酶。由于漆酶具有广泛的底物特性、催化效率高，使之在环境治理、纸浆废水处理、新型生物传感器研制、工业纺织染料转化、食品工业和绿色有机合成等方面有十分广泛的应用前景，尤其是用以对环境中难降解有机污染物进行降解和脱毒，实现生物修复。研究漆酶对有机磷农药的降解，对生态环境的保护与修复具有重大意义。

白腐真菌产生的胞外漆酶通常为次级代谢酶，产酶周期较长，且产出漆酶活力较低，直接影响到该酶的实际应用，使漆酶的工业化生产受到限制。目前，科研工作者最基本的一个研究思路就是通过优化改善发酵条件来进一步提高白腐真菌产漆酶的能力，使其达到工业化生产要求，同时还要降低生产的成本。朱红栓菌（Trametes cinnabarina (Jacq.)Fr.），别名红栓菌、朱血菌，属于多孔菌科栓菌属，有研究表明朱红栓菌是一种产漆酶能力较强的白腐真菌，但关于利用朱红栓菌来发酵生产漆酶的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种朱红栓菌液体发酵产漆酶的优化方法，以进一步提高漆酶的活力和产量，为实现该漆酶的工业化生产及漆酶制剂产品的研制提供理论依据和指导。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）菌种的活化：在无菌条件下，将保藏的朱红栓菌（Trametes cinnabarina (Jacq.)Fr.）菌株接种于PDA培养基平板上，28℃恒温培养至菌丝体长满平板表面；

2）种子液的培养：从活化的平板上用5mm打孔器打出5块菌饼，接种于种子培养基，摇瓶装液量为100mL/250mL，26℃、150r/min恒温振荡培养2d，制成一级种子液；将一级种子液以6%的接种量再接种于新鲜种子培养基中，摇瓶装液量为300mL/1000mL，26℃、150r/min恒温振荡培养2d，制成二级种子液；

3）发酵产酶培养：将二级种子液先在无菌条件下用匀浆仪均质30s，然后采用火焰接种法将其接入已灭菌的发酵培养基中，发酵罐装液量为60%（v/v）；发酵培养3d后开始补料，以20g/L麦芽糊精为补料量，每隔24h补料1次，连续补加3次；发酵培养时间一共为 7~8d；

4）粗酶液的制备：发酵结束后，将发酵液于6000r/min条件下离心10min，取上清液即为粗酶液。

所述步骤2）中，种子培养基的配方为：葡萄糖 18~22g/L，蛋白胨2.5~3.5g/L，酵母膏0.8~1.2g/L，K₂HPO₄1.0~2.0g/L，KH₂PO₄1.0~2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 1.3~1.7g/L，胺鲜酯0.7~0.9mg/L，VB₁0.3~0.5mg/L，pH值为5.6~6.0。

所述步骤3）中，二级种子液的接种量为8%~10%（v/v）。

所述步骤3）中，发酵培养基的配方为：麦芽糊精26~34g/L，玉米蛋白1.5~2.5g/L，蛋白胨1.5~2.5g/L，KH₂PO₄2.7~3.3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.3~1.7g/L，CaCl₂0.2~0.3g/L，NaCl0.1~0.2g/L，微量元素混合液8~12ml/L，苯甲基丙氨酸80~100mg/L，酪氨酸60~80mg/L，腺嘌呤24~32mg/L，水杨酸140~160μmol/L，胺鲜酯1.1~1.3mg/L，儿茶素0.4~0.6mmol/L，藜芦醇15~20μmol/L，富勒烯水溶液45~55ml/L，亚精胺3.5~3.9mg/L，吐温-80 0.7~1.3g/L。

所述步骤3）中，发酵过程采用加1mol/L的氨水和1mol/L盐酸对发酵液进行酸碱度调节，控制pH值维持在5.0~5.5。

所述步骤3）中，发酵温度为25~27℃，通气量为0.5~1vvm，搅拌转速为200~240r/min。

所述微量元素液包括以下组分：ZnSO₄·7H₂O 0.18g/L，MnSO₄·H₂O 0.37g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，CuSO₄·5H₂O 6.25mg/L，KAl（SO₄）₂·12H₂O 18.36mg/L，HBO₃ 10mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.15g/L，NaMoO₄·2H₂O11.75mg/L。

所述发酵培养基中富勒烯水溶液的制备方法为：将富勒烯粉末（纯度高于99.5%）用去离子水配制成浓度为1g/L的溶液，使用超声波分散仪进行超声分散10~15min。

本发明的有益效果为：

1）本发明采用白腐真菌中产漆酶能力较强的朱红栓菌作为生产菌株，对其发酵培养基成分进行优化，以麦芽糊精作为碳源，玉米蛋白和蛋白胨作为复合氮源，既有较好的发酵产酶效果，又能降低生产成本；添加适宜浓度的酪氨酸、水杨酸、胺鲜酯、儿茶素、藜芦醇、富勒烯水溶液、亚精胺和吐温-80能够促进朱红栓菌漆酶的合成与分泌，有效提高漆酶产量。

2）本发明对朱红栓菌发酵罐发酵生产漆酶的工艺条件进行优化，发酵过程中通过流加氨水和盐酸来控制发酵液pH值维持在最适pH值，有利于漆酶的合成；通过向发酵体系中分批补加碳源，可以使发酵液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证菌体的生长需要，又不造成不利影响，从而达到提高产率的目的，进一步提高了漆酶的产量。

3）利用本发明最佳发酵产酶条件下获得的漆酶粗酶液对有机磷农药进行降解，其中48h对甲基内吸磷的降解率达到54.2%，对敌百虫的降解率达到82.0%，具有较好的降解效果。

附图说明

图1为不同碳源对朱红栓菌产漆酶的影响图；

图2为水杨酸浓度对朱红栓菌产漆酶的影响图；

图3为儿茶素浓度对朱红栓菌产漆酶的影响图；

图4为富勒烯水溶液浓度对朱红栓菌产漆酶的影响图；

图5为不同补料量对朱红栓菌产漆酶的影响图；

图6为漆酶对甲基内吸磷的降解效果图；

图7为漆酶对敌百虫的降解效果图。

具体实施方式

实施例1

一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法，包括以下步骤：

1）菌种的活化：朱红栓菌（Trametes cinnabarina (Jacq.) Fr.）菌株，购买于宁波明舟生物科技有限公司。在无菌条件下，将保藏的菌株接种于PDA培养基平板上，28℃恒温培养至菌丝体长满平板表面。

种子培养基的配方为：葡萄糖 20g/L，蛋白胨3.0g/L，酵母膏1.0g/L，K₂HPO₄1.5g/L，KH₂PO₄1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，胺鲜酯0.8mg/L，VB₁0.4mg/L，pH值为5.8。

3）发酵产酶培养：将二级种子液先在无菌条件下用匀浆仪均质30s，然后采用火焰接种法将其接入已灭菌的发酵培养基中，接种量为8%，发酵罐装液量为60%（v/v），发酵温度为26℃，通气量为0.75vvm，搅拌转速为220r/min；发酵过程采用流加1mol/L的氨水和1mol/L盐酸对发酵液进行酸碱度调节，控制pH值维持在5.0~5.5；

发酵培养基的配方为：麦芽糊精30g/L，玉米蛋白2.0g/L，蛋白胨2.0g/L， KH₂PO₄3.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，CaCl₂0.25g/L，NaCl0.15g/L，微量元素混合液10ml/L，苯甲基丙氨酸90mg/L，酪氨酸70mg/L，腺嘌呤28mg/L，水杨酸150μmol/L，胺鲜酯1.2mg/L，儿茶素0.5mmol/L，藜芦醇17.5μmol/L，富勒烯水溶液50ml/L，亚精胺3.7mg/L，吐温-80 1.0g/L；

微量元素液包括以下组分：ZnSO₄·7H₂O 0.18g/L，MnSO₄·H₂O 0.37g/L，FeSO₄·7H₂O0.1g/L，CuSO₄·5H₂O 6.25mg/L，KAl（SO₄）₂·12H₂O 18.36mg/L，HBO₃ 10mg/L，CoCl₂·6H₂O0.15g/L，NaMoO₄·2H₂O11.75mg/L；

富勒烯水溶液的制备方法为：将富勒烯粉末（纯度高于99.5%）用去离子水配制成浓度为1g/L的溶液，使用超声波分散仪进行超声分散10~15min。

酶活测定方法

采用ABTS为底物，反应体系4.0mL，其中含1.95mL0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH3.0）、2.00mL0.5mmol/LABTS溶液和50μL粗酶液。30℃恒温水浴反应，测定反应前5min反应体系在420nm处吸光度的増加值。灭活的酶液作为空白对照。酶活定义：在上述条件下，每分钟催化氧化1μmol ABTS所需的酶量为1个酶活力单位（U）。

实施例2 发酵培养基成分对朱红栓菌产漆酶的影响

2.1不同碳源对朱红栓菌产漆酶的影响

分别以30g/L的葡萄糖、果糖、玉米淀粉、麦芽糊精和糖蜜为发酵培养基替代碳源，保持培养基其他成分不变，按照实施例1中的方法进行发酵产酶培养，7d后分别制备粗酶液测定漆酶活力，实验结果如图1所示。

从图1可知，以葡萄糖作为碳源时漆酶活力最高，达122.45U/mL，其次是麦芽糊精作为碳源，酶活力为110.32U/mL，糖蜜作为碳源时酶活力最低，为68.59U/mL。碳源作为发酵培养基最重要的成分之一，不仅给微生物生长繁殖提供所需的碳元素和能量，同时也参与微生物目的产物的合成代谢。目前实验室研究中常用高纯度试剂作为碳源，尤其是葡萄糖，虽然培养效果好，但成本过高，不适于工业化生产。而麦芽糊精是一种价格较为低廉的原料，并且对朱红栓菌发酵产漆酶的效果较好，适合于作为朱红栓菌工业化生产漆酶的碳源。

2.2水杨酸浓度对朱红栓菌产漆酶的影响

设置水杨酸浓度分别为0μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，150μmol/L，200μmol/L，250μmol/L，保持培养基其他成分不变，按照实施例1中的方法进行发酵产酶培养，7d后分别制备粗酶液测定漆酶活力，实验结果如图2所示。

从图2可知，当水杨酸浓度为150μmol/L 时，漆酶活力最高，为108.69U/mL，随着水杨酸浓度继续增加，漆酶活力逐渐下降，当水杨酸浓度达到250μmol/L 时，漆酶活力显著下降至59.20U/mL。因此适宜浓度的水杨酸对朱红栓菌产漆酶具有促进作用，原因可能是水杨酸参与了细胞间的信号传导过程，诱导了特定基因的表达，从而促进漆酶的合成；而水杨酸浓度过高会对菌体细胞产生毒害作用，对漆酶的合成不利。

2.3儿茶素浓度对朱红栓菌产漆酶的影响

设置儿茶素浓度分别为0mmol/L，0.25mmol/L，0.5mmol/L，0.75mmol/L，1.0mmol/L、1.25mmol/L，保持培养基其他成分不变，按照实施例1中的方法进行发酵产酶培养，7d后分别制备粗酶液测定漆酶活力，实验结果如图3所示。

从图3可知，在0.25~1.25mmol/L浓度范围内，儿茶素对朱红栓菌产漆酶都具有促进作用，当儿茶素浓度为0.5mmol/L时，漆酶活力达到最高，是不添加儿茶素时的1.7倍，说明此浓度的儿茶素对朱红栓菌产漆酶的诱导效果最好。朱红栓菌漆酶是一种诱导型酶，其合成在很大程度上需要诱导物的诱导作用，凡是与木质素单体结构相似的小分子芳香化合物都可以作为漆酶的诱导剂，常用的有ABTS、愈创木酚、邻联苯胺等。但这些芳香化合物具有毒性，对菌体的生长有抑制作用，而儿茶素是从茶叶等天然植物中提取出来的一类酚类活性物质，可以作为无毒的漆酶诱导剂代替这些有毒芳香化合物。

2.4富勒烯水溶液浓度对朱红栓菌产漆酶的影响

设置富勒烯水溶液浓度分别为0ml/L，5ml/L，10ml/L，25ml/L，50ml/L，100ml/L，保持培养基其他成分不变，按照实施例1中的方法进行发酵产酶培养，7d后分别制备粗酶液测定漆酶活力，实验结果如图4所示。

从图4可知，在 5~100ml/L 浓度范围内，富勒烯水溶液对朱红栓菌产漆酶都具有促进作用，并且漆酶活力随着富勒烯水溶液浓度的增加而逐渐升高，当富勒烯水溶液浓度为50ml/L时，漆酶活力已达到较高水平，继续提高富勒烯水溶液浓度至100ml/L，漆酶活力没有显著提高，因此选择50ml/L为富勒烯水溶液的适宜浓度。富勒烯是一种纳米材料，纳米材料具有很强的吸附性，易于吸附在菌体表面，可能会影响菌体细胞代谢通路，从而影响漆酶分泌；也可能促使菌体细胞产生氧化应激，从而促进漆酶的合成。

实施例3补料对朱红栓菌产漆酶的影响

在实施例1的基础上进行补料发酵实验：将二级种子液在无菌条件下用匀浆仪均质30s，然后采用火焰接种法将其接入已灭菌的发酵培养基中，接种量为8%，发酵罐装液量为60%（v/v），发酵温度为26℃，通气量为0.75vvm，搅拌转速为220r/min；发酵过程采用流加1mol/L的氨水和1mol/L盐酸对发酵液进行酸碱度调节，控制pH值维持在5.0~5.5；发酵培养3d后分别按照10g/L、20g/L、30g/L的补料量添加麦芽糊精，每隔24h补料1次，连续补加3次，以不补加麦芽糊精作为对照，7d后分别制备粗酶液测定漆酶活力，实验结果如图5所示。

从图5可知，与对照组相比，补加10~30g/L的麦芽糊精后，漆酶活力均得到提高。当麦芽糊精补加量为20g/L时，漆酶活力最高，达172.80U/mL，是对照组的1.6倍，说明在发酵中期适当补充菌体所需的营养物有利于漆酶的合成。当麦芽糊精补加量为30g/L时，漆酶活力比20g/L时有所降低，说明麦芽糊精的补加量不宜过多，补加量过多导致液体发酵培养基粘度增大，不利于溶解氧和营养物质的利用，所以选择20g/L的麦芽糊精补加量为宜。

实施例4 漆酶对有机磷农药的降解

采用实施例3中最佳补料发酵条件下获得的粗酶液进行实验，粗酶液的漆酶活力为172U/mL。反应在100mL磨口锥形瓶中进行，取10mL浓度为50mg/L的甲基内吸磷溶液和敌百虫溶液，用磷酸盐缓冲液调节pH 为8.0，分别加入10mL粗酶液，同时以不加粗酶液作为对照组，置于25℃恒温培养箱中进行反应，分别于不同时间点取样，采用紫外分光光度法测定体系中甲基内吸磷、敌百虫的浓度，计算降解率，实验结果如图 6和图7所示。

从图6可知，漆酶对甲基内吸磷的降解在24h后趋于稳定，甲基内吸磷在24h内的降解率为53.7%，在48h内的降解率为54.2%，而对照组降解率为1.6%。从图7可知，漆酶对敌百虫的降解趋势与甲基内吸磷较为一致，同样在24h后趋于稳定，敌百虫在24h内的降解率为80.6%，在48h内的降解率为82.0%，而对照组在48h内的降解率为3.3%。由以上结果可以看出，朱红栓菌的漆酶粗酶液对甲基内吸磷和敌百虫都具有一定的降解效果，尤其是对敌百虫降解效果更明显。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法，其特征在于，所述步骤2）中，种子培养基的配方为：葡萄糖 18~22g/L，蛋白胨2.5~3.5g/L，酵母膏0.8~1.2g/L，K₂HPO₄1.0~2.0g/L，KH₂PO₄1.0~2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 1.3~1.7g/L，胺鲜酯0.7~0.9mg/L，VB₁0.3~0.5mg/L，pH值为5.6~6.0。

3.根据权利要求1所述的一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法，其特征在于，所述步骤3）中，二级种子液的接种量为8%~10%（v/v）。

4.根据权利要求1所述的一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法，其特征在于，所述步骤3）中，发酵培养基的配方为：麦芽糊精26~34g/L，玉米蛋白1.5~2.5g/L，蛋白胨1.5~2.5g/L，KH₂PO₄2.7~3.3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.3~1.7g/L，CaCl₂0.2~0.3g/L，NaCl0.1~0.2g/L，微量元素混合液8~12ml/L，苯甲基丙氨酸80~100mg/L，酪氨酸60~80mg/L，腺嘌呤24~32mg/L，水杨酸140~160μmol/L，胺鲜酯1.1~1.3mg/L，儿茶素0.4~0.6mmol/L，藜芦醇15~20μmol/L，富勒烯水溶液45~55ml/L，亚精胺3.5~3.9mg/L，吐温-80 0.7~1.3g/L。

5.根据权利要求1所述的一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法，其特征在于，所述步骤3）中，发酵过程采用加1mol/L的氨水和1mol/L盐酸对发酵液进行酸碱度调节，控制pH值维持在5.0~5.5。

6.根据权利要求1所述的一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法，其特征在于，所述步骤3）中，发酵温度为25~27℃，通气量为0.5~1vvm，搅拌转速为200~240r/min。

7.根据权利要求1所述的一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法，其特征在于，所述微量元素液包括以下组分：ZnSO₄·7H₂O 0.18g/L，MnSO₄·H₂O 0.37g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，CuSO₄·5H₂O 6.25mg/L，KAl（SO₄）₂·12H₂O 18.36mg/L，HBO₃ 10mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.15g/L，NaMoO₄·2H₂O11.75mg/L。

8.根据权利要求4所述的一种提高有机磷农药降解漆酶活力的方法，其特征在于，所述发酵培养基中富勒烯水溶液的制备方法为：将富勒烯粉末（纯度高于99.5%）用去离子水配制成浓度为1g/L的溶液，使用超声波分散仪进行超声分散10~15min。