CN103820354B - 一种伯克霍尔德氏菌fh4菌株的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种伯克霍尔德氏菌FH4菌株及其筛选方法和应用，所述伯克霍尔德氏菌FH4菌株的保藏号为CGMCC？No.8271，该菌株酶解浒苔的应用方法为，将冻存的FH4菌株于LB斜面培养基中活化培养，然后挑取一满环于LB液体培养基中，振荡培养24-28h后取1-2mL菌液于已灭菌纤维素液体发酵培养基中，振荡培养5-7天；再将发酵液低温离心，取上清液为粗酶液或是将发酵液过滤，取滤液为粗酶液。将粗酶液与干净的浒苔粉于45-55℃条件下反应。所述伯克霍尔德氏菌FH4菌株具有产纤维素酶的能力，能有效地将浒苔中的纤维素类物质降解为还原糖，而且生产成本低，设备简单，反应温和，适合大规模工业生产。

Description

一种伯克霍尔德氏菌FH4菌株的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种伯克霍尔德氏菌FH4菌株及其筛选方法和应用。

背景技术

目前，世界石油资源供应渐趋紧张、环境污染日益严重，能源问题也越来越受到人们的关注。近两年来，各大能源消费国竞先寻求替代石油的新能源，生物乙醇燃料以其突出的环保性和可再生性，受到许多国家的重视和积极扶持。生物乙醇作为可再生资源，可减少对石油的消耗，能直接作为液体燃料或者同汽油混合使用。

2007年开始，我国黄海海域连续7年爆发大规模浒苔，浒苔糖类成分分析结果显示，其纤维素含量为13.3％、半纤维素含量为28.01％、淀粉含量为2.475％、水溶性多糖含量为11.503％、水溶性戊聚糖含量11.25％。纤维素是由葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成的线状大分子物质，是地球上最丰富的多糖物质。1904年，在蜗牛消化液中人们首次发现了纤维素酶，从此，对于纤维素酶的研究日益深入。纤维素酶并不是单一酶，是一个酶系的总称。浒苔中的纤维素是用于制取生物乙醇的主要成分，在对浒苔中的纤维素降解时，一般采用商品纤维素酶，但是，商品纤维素酶成本较高，纤维素酶解过程对环境造成污染，不适合大规模工业生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种伯克霍尔德氏菌FH4菌株，该菌株可分泌纤维素酶，对浒苔中的纤维素类物质有降解效果，可将纤维素有效降解为还原糖，为浒苔进一步能源化利用奠定了基础。

本发明的另一目的是提供一种伯克霍尔德氏菌FH4菌株的筛选方法。

本发明的另一目的是提供一种伯克霍尔德氏菌FH4菌株酶解浒苔的应用方法。

为了实现以上技术效果，本发明通过如下技术方案来实现：

一种伯克霍尔德氏菌FH4菌株，其特征在于：保藏号为CGMCCNo.8271。

上述伯克霍尔德氏菌FH4菌株的筛选方法，其步骤包括：

(1)将腐烂的浒苔藻体的悬液加入到选择培养基中，摇床培养2-3天；

(2)将步骤(1)中的选择培养液经梯度稀释后的菌悬液，涂布在鉴别培养基上，待菌落长出；

(3)在长出菌落的平板上用刚果红染色法筛选有透明圈的菌株，并用平板划线分离法分离、提纯。

所述步骤(1)中，腐烂的浒苔藻体的悬液与选择培养基的体积比为1:25-45；摇床培养的温度为25-35℃，转速为135-145r/min。

所述步骤(1)中，选择培养基中的组分包括纤维素粉、硝酸钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母膏、水解酪素及陈海水，各组分的加入配比依次为3-5g：1g：0.3-0.5g：1.1-1.3g：0.8-1g：0.4-0.5g：0.4-0.5g：0.4-0.5g：950-1050mL。

所述步骤(2)中，鉴别培养基中的组分包括羧甲基纤维素钠、酵母膏、磷酸二氢钾、琼脂、土豆汁及陈海水，各组分的加入配比依次为5-10g：1g：0.1-0.3g：12-16g：90-110mL：950-1050mL。

上述伯克霍尔德氏菌FH4菌株酶解浒苔的应用方法：

(a)将伯克霍尔德氏菌FH4菌株于LB液体培养基中振荡培养22-26小时，然后在菌液中加入冻存缓冲液，于-20℃保存；

(b)将步骤(a)中的伯克霍尔德氏菌FH4菌株于LB斜面培养基中斜面活化培养，然后挑取一满环于LB液体培养基中，振荡培养24h后取1mL菌液于已灭菌纤维素液体发酵培养基中，振荡培养5-7天；将发酵液低温离心，取上清液为粗酶液或是将发酵液过滤，取滤液为粗酶液；

(c)将干净的浒苔干燥、粉碎，然后与步骤(b)中的粗酶液于45-55℃条件下反应45-50小时。

所述步骤(a)中，振荡培养的温度为25-35℃，转速为135-145r/min；所述缓冲液是体积浓度为45-55％的甘油，缓冲液与LB培养基的体积比为1：1-1.5。

所述步骤(b)中，振荡培养的温度为30-35℃，转速为135-145r/min；离心分离温度为3-5℃，离心转速为3500-4500r/min，离心时间为10-20分钟。

所述步骤(b)中，纤维素液体发酵培养基中的组分包括酵母浸膏、蛋白胨、羧甲基纤维素钠及陈海水，各组分的加入配比依次为1g：3-6g：8-12g：950-1050mL。

所述步骤(c)中，将干净的浒苔于55-65℃下干燥10-14小时，然后粉碎至70-90目；浒苔与粗酶液的加入量比为1g：45-55mL。

陈海水由上海金山区城市沙滩海域采集备用。

本发明筛选得到的菌株属于伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)，该菌株保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.8271，其16SrDNA序列，如下：

TTACACATGCAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGATCTTTGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGATGGCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGGTTCTAATATAACCGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGCTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAATCCTGCTGAGAGGCGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGATACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTGGCTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGGTCACCACGGTAGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGAA

本发明的有益效果是：1、本发明提供的伯克霍尔德氏菌FH4菌株可分泌纤维素酶，而且在应用时，直接将该菌株的液体发酵体系与浒苔纤维素作用，能有效地将浒苔中的纤维素降解为还原糖，为更进一步地制备生物乙醇做好准备。2、本发明以绿潮藻浒苔为原料，变废为宝，而且生产成本低，设备简单，反应温和，操作简便,适合大规模工业生产。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

陈海水：是指由上海金山区城市沙滩海域大量采集备用的海水。

实施例1

伯克霍尔德氏菌FH4菌株的筛选

(1)分别采自自然条件生长及绿潮海域密集漂浮的腐烂浒苔藻体，采集地为山东青岛第一海水浴场和第六海水浴场。采集后用保温箱低温运输带回实验室进行细菌筛选。

将采集到的腐烂浒苔藻体悬液1mL，加入装有30mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，30℃，140r/min震荡培养2～3天，直至培养液变浑浊。

其中选择培养基为：纤维素粉5g，

硝酸钠1g，

氯化钾0.5g，

磷酸氢二钠1.2g，

磷酸二氢钾0.9g，

硫酸镁0.5g，

酵母膏0.5g，

水解酪素0.5g，

陈海水1000mL。

(2)将选择培养后的培养基进行梯度稀释：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，将稀释度为10^-5、10^-6的菌悬液各取0.2mL涂布在鉴别培养基上，48h后观察菌落。

其中鉴别培养基为：羧甲基纤维素钠5-10g，

酵母膏1g，

磷酸二氢钾0.25g，

土豆汁100mL，

琼脂15g，

陈海水1000mL。

(3)在长出菌落后的鉴别培养基平板上滴加1％的刚果红溶液染色，15min后倒去多余刚果红溶液，然后加入1mol/L的氯化钠溶液，荡去表面刚果红，15min后倒去溶液，观察透明圈，测量透明圈的直径，将透明圈较大的菌株进行平板划线分离得到纯菌株。

实施例2

粗酶液的制取。

(1)将实施例1中得到的伯克霍尔德氏菌FH4于LB液体培养基中，28℃，140r/min培养24h，然后在菌液中添加冻存缓冲液。缓冲液的体积浓度为50％的甘油，缓冲液与菌液的加入体积比为1:1，加入冻存缓冲液，为了更好地保护伯克霍尔德氏菌FH4菌株，使得该菌株不会因为脱水而死亡。

(2)将上述中的伯克霍尔德氏菌FH4菌株于LB培养基中斜面活化培养，活化2代后挑取一满环于LB液体培养基中，28℃，140r/min培养24h后取1mL于50mL灭菌冷却的纤维素液体发酵培养基中，35℃、140r/min振荡培养6天。

其中液体发酵培养基为：

酵母浸膏1g，

蛋白胨5g，

羧甲基纤维素钠10g，

陈海水1000ml。

(3)将步骤(2)中得到的液体发酵培养液于4℃，4000r/min离心15分钟，取上清液作为粗酶液。

粗酶液的活性测定：

滤纸酶活(FPA)测定：将新华1号滤纸剪成1×6cm大小卷成小卷，放进25mL比色管内，加入1mL柠檬酸缓冲液(pH＝4.8)，再加入1mL本实施例中制得的粗酶液，摇匀使滤纸完全浸泡在溶液中，50℃准确保温1h后立即按DNS法测还原糖，测得酶活力为16.42U/mL。

CMC酶活测定：移取1mL本实施例中所得的粗酶液于25mL比色管中，加入1mL含0.5％CMC-Na的柠檬酸缓冲液(pH＝4.4)，50℃准确保温30min后立即按DNS法测还原糖，测得酶活力为36.00U/mL。

实施例3

粗酶液的制取。

步骤(1)和步骤(2)同实施例2。

(3)将步骤(2)中得到的液体发酵培养液过滤，取其过滤溶液作为粗酶液。

粗酶液的活性检测：

滤纸酶活(FPA)测定：测定方法同实施例2，测得酶活力为22.28U/mL。

CMC酶活测定：测定方法同实施例2，测得酶活力为45.77U/mL。

实施例4

粗酶液对浒苔的酶解应用。

(1)以黄海海域大量暴发的绿潮藻浒苔为原料，清洗除去贝壳、沙石等杂物后，清水漂洗海藻3-4遍，放置于60℃烘箱中12h，烘干后用粉碎机粉碎1分钟，过80目筛后备用。

(2)将1g干燥的浒苔粉置于三角瓶中，加入到实施例3中制得的粗酶液中，浒苔粉与粗酶液的加入配比为1g:50mL，于50℃水浴锅中反应48h，然后按DNS法，测得还原糖得率为12.8％，说明粗酶液对浒苔中的纤维素类物质有很好地降解作用，可将纤维素降解为还原糖，为浒苔进一步制取生物乙醇做好了准备。

实施例5

粗酶液对浒苔的酶解应用。

(1)以黄海海域大量暴发的绿潮藻浒苔为原料，清洗除去贝壳、沙石等杂物后，清水漂洗海藻3-4遍，放置于60℃烘箱中12h，烘干后用粉碎机粉碎1分钟，过80目筛后备用。

(2)将1g干燥的浒苔粉置于三角瓶中，加入到实施例2中制得的粗酶液中，浒苔粉与粗酶液的加入配比为1g:50mL，于50℃水浴锅中反应48h，然后按DNS法，测得还原糖得率为11.5％，说明粗酶液对浒苔中的纤维素类物质有很好地降解作用，可将纤维素降解为还原糖，为浒苔进一步制取生物乙醇做好了准备。

Claims (5)

1.一种伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)FH4菌株酶解浒苔的应用方法，其特征在于：该菌株的保藏号为CGMCCNo.8271，其步骤为，

(a)将伯克霍尔德氏菌FH4菌株于LB液体培养基中振荡培养22-26小时，然后在菌液中加入冻存缓冲液，于-20℃--25℃保存；

(b)将步骤(a)中的伯克霍尔德氏菌FH4菌株于LB斜面培养基中斜面活化培养，然后挑取一满环于LB液体培养基中，振荡培养24-28h后取1-2mL菌液于已灭菌纤维素液体发酵培养基中，振荡培养5-7天；将发酵液低温离心，取上清液为粗酶液或是将发酵液过滤，取滤液为粗酶液；

(c)将干净的浒苔干燥、粉碎，然后与步骤(b)中的粗酶液于45-55℃条件下反应45-50小时。

2.根据权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌FH4菌株酶解浒苔的应用方法，其特征在于：所述步骤(a)中，振荡培养的温度为25-35℃，转速为135-145r/min；所述缓冲液是体积浓度为45-55％的甘油，缓冲液与菌液的体积比为1：1-1.5。

3.根据权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌FH4菌株酶解浒苔的应用方法，其特征在于：所述步骤(b)中，振荡培养的温度为30-35℃，转速为135-145r/min；离心分离温度为3-5℃，离心转速为3500-4500r/min，离心时间为10-20分钟。

4.根据权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌FH4菌株酶解浒苔的应用方法，其特征在于：所述步骤(b)中，纤维素液体发酵培养基中的组分包括酵母浸膏、蛋白胨、羧甲基纤维素钠及陈海水，各组分的加入配比依次为1g：3-6g：8-12g：950-1050mL。

5.根据权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌FH4菌株酶解浒苔的应用方法，其特征在于：所述步骤(c)中，将干净的浒苔于55-65℃下干燥10-14小时，然后粉碎至60-100目；浒苔与粗酶液的加入量比为1g：45-55mL。