CN103045655A

CN103045655A - 一种以碱蓬为原料制备生物乙醇的方法

Info

Publication number: CN103045655A
Application number: CN2012105406046A
Authority: CN
Inventors: 王能飞; 明凯利; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: First Institute of Oceanography SOA
Current assignee: First Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2012-12-14
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2032-12-14
Also published as: CN103045655B

Abstract

本发明涉及能源领域，公开了一种以碱蓬原料制备生物乙醇的方法。包括以下步骤：（1）收集碱蓬杆并进行除杂，粉碎等前处理；（2）将处理后的碱蓬杆与氢氧化钠溶液混合，在100℃～115℃下预处理10min～30min；（3）将南极低温菌株活化并接种于麸皮产酶培养基中，培养获得低温酶；（4）将碱蓬杆预处理液pH调为4.5～5.5，按一定的量添加低温酶或常温纤维素酶或两者复配酶，接种8%的酵母活化液，在一定条件下进行同步糖化发酵；（5）将发酵液进行蒸馏获得高纯度生物乙醇。本发明利用碱蓬杆为原料制备生物乙醇，工艺简单可行，实现了碱蓬高效资源化利用，具有一定的经济效益，且将南极低温酶在同步糖化发酵中进行了应用，提高了发酵效果。

Description

一种以碱蓬为原料制备生物乙醇的方法

技术领域

本发明属于生物质能源领域，涉及到一种制取生物乙醇的方法，具体为一种以盐碱地植物碱蓬杆为原料制取生物乙醇的技术方法，尤其涉及南极低温纤维素酶在碱蓬杆同步糖化发酵生产乙醇中的应用。

背景技术

随着化石资源的日益枯竭和环境污染的不断恶化，不断寻求绿色新型可再生资源普遍为世界各国所重视，其中以生物质为原料开发生产生物乙醇是当今能源领域的一个研究热点，并成为世界各国研究和推广的重要课题之一。当前我国，在“不与人争粮，不与粮争地”的原则下，第二代生物乙醇的研究开发取得了重要进展，然而仍面临不少问题，如原料的供给存在制约及收集成本较高，工艺技术上存在瓶颈等等。

当前生物乙醇在原料上主要是以废弃的农作物秸杆（如麦秆、稻草杆、玉米杆等）为主要原料，虽然对这些废弃农作物的研究和利用具有重要的意义，但是这些原料来源仍然有限，仍然受到粮食和土地供给的制约，且在现实中收购这些原料成本费用较高。自然界中每年通过光合作用可以生成约1550亿吨的纤维资源，然而并未被能源研究者充分重视。因此，寻找更多纤维含量高、易降解的自然生长的生物质原料以降低成本势在必行。碱蓬为生长在盐碱湿地的藜科（Chenopodiaceae）碱蓬属（Suaeda spp.）一年生草本植物，在我国东北、西北及沿海湿地广泛存在。由于其具有耐盐碱、耐贫瘠等特点,加之其新鲜茎叶中含有丰富的蛋白质和多种微量元素，其籽粒中含有较高的脂肪含量，故当前对碱蓬的研究利用主要针对其生态价值和营养价值。而碱蓬作为一年生植物，每年秋季后都会产生大量的碱蓬枯秆并最终大多数通过泥土自然降解而消失掉，而这些枯干中含有丰富的纤维素和半纤维素，这并未被人们所重视，如将其中的纤维成分加以研究利用开发生物乙醇等能源产品无疑具有重要的研究意义。

分步糖化发酵（SHF）和同步糖化发酵（SSF）是当前制取生物乙醇较常用的两种基本发酵方式，尤其是同步糖化发酵具有简化设备，节约总生产时间，并能克服葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用等诸多优点，因而在工业化生产中更常用。但在同步糖化发酵中最大的弊端是酵母的低温发酵温度与纤维素酶高酶解温度之间的矛盾，而当前研究应用中大多是取二者的折中温度，这既降低了纤维素酶的酶活，也影响了发酵效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种以碱蓬为原料制备生物乙醇的方法，解决当前同步糖化发酵制取乙醇中酵母与纤维素酶的各自最适作用温度不一致的这一关键问题，提高同步发酵效率。本发明利用野生碱蓬枯杆为原料制取生物乙醇，并将从南极土样中筛选到的一株产低温纤维素酶的菌株QP7应用于碱蓬同步糖化发酵制取乙醇中，获得了较好的发酵效果，尤其是该菌株所产低温酶与常温酶复配时，极大的提高了发酵效果，本发明中所应用菌株QP7保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO:M2012257，保藏日期2012年6月28日。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种以碱蓬为原料制备生物乙醇的方法，具体步骤如下：

（1）碱蓬杆的前处理：收集秋季碱蓬枯杆，去杂、干燥后，将碱蓬杆进行粉碎处理；

（2）碱蓬杆的预处理：将经步骤（1）处理后的碱蓬杆与浓度为0.5%～1.0%（w/w）的氢氧化钠溶液以1:8～1:25（g/ml）的料液比，在100℃～115℃处理10min～30min；

（3）碱蓬杆发酵培养基的制备：将（2）预处理后的碱蓬杆料液ph值调为4.5～5.5，并添加至终浓度(w/v)为0.3%的酵母粉,0.5%的蛋白胨，0.02%的尿素，0.4%的硫酸镁，0.01%磷酸氢二铵；

（4）同步糖化发酵制备乙醇：

①应用常温纤维素酶在步骤（3）制备好的发酵培养基中接入质量比8%的高活性酿酒酵母，以15u/g～25u/g量添加常温纤维素酶，在34±2℃、110～150rpm发酵24～72h；

或②应用低温纤维素酶在步骤（3）制备好的发酵培养基中接入质量比8%的高活性酿酒酵母，以15u/g～25u/g量添加上述方法制备的低温纤维素酶的粗酶液，在34±2℃、110～150rpm发酵24～72h；

或③低温酶与常温酶联合复配应用在步骤（3）制备好的发酵培养基中接入质量比8%的高活性酿酒酵母，以总酶活为15u/g～25u/g的量按一定比例添加常温纤维素酶和低温纤维素酶的粗酶液，在34±2℃、110～150rpm发酵24～72h；

（5）检测步骤（4）获得的发酵液中乙醇含量，并将其蒸馏得到高纯度生物乙醇；

所述的低温纤维素酶是由从南极土样中筛选出来的南极低温菌株QP7产生，该菌株的保藏地：中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO:M2012257。

进一步，所述的步骤（4）中低温酶与常温酶联合复配应用时常温纤维素酶和上述方法制备的低温纤维素酶的粗酶液分别以酶活量2:1比例添加。

进一步，所述的低温纤维素酶的粗酶液制备方法，具体包括以下步骤：

①将实验室保存的从南极土样中筛选出来的南极低温菌株QP7接种活化；②将①活化后的种子液以质量比5%的量接种于麸皮产酶培养基中，在低温摇床上150rpm，14-16℃培养3-5天；③将②培养好的QP7产酶培养基进行高速离心，离心液即作为低温纤维素酶的粗酶液，并测定酶活；

进一步，所述的麸皮产酶培养基的组成为(NH4)₂SO₄0.5%（g/ml），MgSO₄0.02%（g/ml），麸皮3%（g/ml）。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1）本发明实现了碱蓬杆资源化的利用，进一步丰富了生物质原料的来源，高效获得了生物乙醇这一能源产品，且具有工艺简单，生产周期短特点；

2)针对当前生物乙醇同步发酵技术中的酵母与常温纤维素酶温度不匹配，所取折中温度导致两者作用效果均下降的这一突出难点，本发明将筛选的南极低温菌株QP7产生的低温纤维素酶在碱蓬同步发酵中进行了应用尝试，所产低温纤维素酶最适酶活力温度35℃-40℃，酿酒酵母的最适活力温度是32℃-38℃，常温纤维素酶的最适活力温度为50℃-55℃，本发明同时利用酿酒酵母和低温菌株QP7产生的低温纤维素酶对碱蓬原料进行发酵，取得了较好的效果，尤其是该低温酶与常温酶联合应用时，乙醇产量大幅度提高。这是因为纤维素酶是多组分酶系，当某一组分酶相对量较少时，会产生木桶效应；而低温纤维素酶的添加能够弥补短板，提高整体酶活力。另外低温纤维素酶的最适酶活温度与同步糖化发酵温度抑制，能发挥最大酶活力，提高降解效率。特别是该低温酶的最适作用温度（38℃左右）与酵母发酵的温度相匹配，这对解决同步发酵中的这一难点具有重要的突破意义，并为最终规模化的应用及大幅度提高同步糖化发酵效率奠定了重要基础，对相关领域的发展提供了有益的启示。

附图说明

图1为碱蓬杆制取生物乙醇的工艺流程图；

图2为发酵液蒸馏前乙醇含量；

南极低温菌株QP7，分类命名verticillium longisporum sp.QP7（phy），该菌株保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO:M2012257，保藏日期2012年6月28日。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案做进一步的解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1常温纤维素酶的应用

一种以碱蓬为原料制备生物乙醇的方法，具体步骤如下：

（1）碱蓬杆的前处理：①收集碱蓬枯杆，并除去杂质；②将①除杂后的碱蓬杆进行干燥；③将②处理后的碱蓬杆进行粉碎处理，粉碎至粒径为0.45—0.9mm；

（2）碱蓬杆的预处理：将（1）处理后的碱蓬杆800g与浓度为0.7%（w/w）的氢氧化钠溶液以1:15（g/ml）的料液比，在110℃处理10min；

（3）碱蓬杆发酵培养基的制备：将（2）预处理后的碱蓬杆料液pH值调为5.0，并添加至终浓度(w/v)为0.3%的酵母粉,0.5%的蛋白胨，0.02%的尿素，0.4%的硫酸镁，0.01%磷酸氢二铵；

（4）同步糖化发酵制备乙醇：在（3）制备好的发酵培养基中接入质量比8%的高活性酿酒酵母，即市售安琪酵母，以25u/g量添加市售常温纤维素酶，在34℃，120rpm发酵36h，也可发酵48h；

（5）检测（4）获得的发酵液中乙醇含量，将发酵液进行蒸馏得到生物乙醇70.4g。

经检测发酵36h与发酵38h发酵液中乙醇的浓度差异不大，在发酵36h时发酵液中乙醇的浓度为0.35%，蒸馏所得该生物乙醇纯度达到95.5%以上。

实施例2南极低温纤维素酶的应用

一种以碱蓬为原料制备生物乙醇的方法，具体步骤如下：

（1）碱蓬杆的前处理：①收集蓬枯杆，并除去杂质；②将①除杂后的碱蓬杆进行干燥；③将②处理后的碱蓬杆进行粉碎处理，粉碎至粒径为0.45—0.9mm；

（3）南极低温酶的制备：①将实验室保存的从南极土样中筛选出来的南极低温菌株QP7接种活化；②将①活化后的种子液以质量比5%的量接种于麸皮产酶培养基中，该培养基组成为(NH4)₂SO₄0.5%（g/ml），MgSO₄0.02%（g/ml），麸皮3%（g/ml），在低温摇床上150rpm，15℃培养4天；③将②培养好的QP7产酶培养基进行高速离心，离心液即作为低温纤维素酶的粗酶液，并测定酶活；

（4）碱蓬杆发酵培养基的制备：将（2）预处理后的碱蓬杆料液pH值调为5.0，并添加至终浓度(w/v)为0.3%的酵母粉,0.5%的蛋白胨，0.02%的尿素，0.4%的硫酸镁，0.01%磷酸氢二铵；

（5）同步糖化发酵制备乙醇：在（4）制备好的发酵培养基中接入质量比8%的高活性酿酒酵母，即市售安琪酵母，以25u/g量添加步骤（3）制备的低温纤维素酶的粗酶液，在34℃，120rpm发酵36h，也可发酵48h；

（6）检测（5）获得的发酵液中乙醇含量，将发酵液进行蒸馏得到生物乙醇34.0g。

经检测发酵36h与发酵38h发酵液中乙醇的浓度差异不大，在发酵36h时发酵液中乙醇的浓度为0.73%，蒸馏所得该生物乙醇纯度达到95.5%以上。

实施例3低温纤维素酶与常温纤维素酶联合复配应用

一种以碱蓬为原料制备生物乙醇的方法，其工艺流程见图1，具体步骤如下：

（1）碱蓬杆的前处理：①收集枯杆，并除去杂质；②将①除杂后的碱蓬杆进行干燥；③将②处理后的碱蓬杆进行粉碎处理，粉碎至粒径为0.45—0.9mm；

（3）南极低温纤维素酶的制备：①将实验室保存的从南极土样中筛选出来的南极低温菌株QP7接种活化；②将①活化后的种子液以质量比5%量接种于麸皮产酶培养基中，该培养基组成为(NH4)₂SO₄0.5%（g/ml），MgSO₄0.02%（g/ml），麸皮3%（g/ml），在低温摇床上150rpm，15℃培养4天；③将②培养好的QP7产酶培养基进行高速离心，离心液即作为低温纤维素酶的粗酶液，并测定酶活；

（5）同步糖化发酵制备乙醇：在（4）制备好的发酵培养基中接入质量比8%的高活性酿酒酵母，即市售的安琪酵母，以酶活总量为25u/g添加常温纤维素酶和上述步骤（3）制备的低温纤维素酶粗酶液，其中常温纤维素酶与步骤（3）制备的低温纤维素酶分别以酶活量2:1比例添加，在34℃，120rpm发酵36h，也可发酵48h；

（6）检测步骤（5）中获得的发酵液中乙醇含量，并将发酵液进行蒸馏得到生物乙醇113.1g。

经检测发酵36h与发酵38h发酵液中乙醇的浓度差异不大，在发酵36h时发酵液中乙醇的浓度为1.21%，蒸馏所得该生物乙醇纯度达到95.5%以上。

通过图2发酵液中乙醇的浓度和各实施例最后蒸馏得到生物乙醇的量进行对比，说明高活性酿酒酵母、常温纤维素酶与步骤（3）制备的低温纤维素酶三者结合对碱蓬原料进行同步糖化发酵处理，得到最佳效果。

Claims

1.一种以碱蓬为原料制备生物乙醇的方法，其特征在于具体步骤如下：

（4）同步糖化发酵制备乙醇：

或②应用低温纤维素酶在步骤（3）制备好的发酵培养基中接入质量比8%的高活性酿酒酵母，以15u/g～25u/g量添加低温纤维素酶的粗酶液，在34±2℃、110～150rpm发酵24～72h；

2.根据权利要求3所述的一种以碱蓬为原料制备生物乙醇的方法，其特征在于所述的步骤（4）中低温酶与常温酶联合复配应用时常温纤维素酶和上述方法制备的低温纤维素酶的粗酶液分别以酶活量2:1比例添加。

3.根据权利要求1或2所述的一种以碱蓬为原料制备生物乙醇的方法，其特征在于所述的低温纤维素酶粗酶液的制备方法为①将实验室保存的从南极土样中筛选出来的南极低温菌株QP7接种活化，②将①活化后的种子液以质量比5%的量接种于麸皮产酶培养基中，在低温摇床上150rpm，14-16℃培养3-5天；③将②培养好的QP7产酶培养基进行高速离心，离心液即作为低温纤维素酶的粗酶液，并测定酶活。

4.根据权利要求3所述的一种以碱蓬为原料制备生物乙醇的方法，其特征在于步骤②所述的麸皮产酶培养基的组成为(NH4)₂SO₄0.5%（g/ml），MgSO₄0.02%（g/ml），麸皮3%（g/ml）。