CN101993830A - 一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，属于微生物技术领域，其制备方法是：将离心管和新型制备液放入-20℃8-14小时，取菌株接种于LB平板，倒置37℃培养12-16小时；挑取单菌落接种于5mlLB液体培养基中，37℃摇床生长，取2ml培养物转种于200ml新鲜LB培养液中继续生长至菌液OD600为0.3-0.5；将菌液分装于冰冻的离心管中冰浴5min，4℃，离心5min，回收细胞；弃尽上清液，加入预冷的新型制备液重悬沉淀分装。有益效果是：获得了较高的转化率，对分子克隆实验意义重大。该方法操作简单，重复性好，转化效率高，具有极高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域。
背景技术
转化是将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。这是现代分子生物学最基本的操作技术。转化效率直接影响前后试验的进展和工作效率，而感受态细胞的状态是影响转化效率最直接、关键的因素之一。通常有两种方法获得感受态细胞，一种是购于商业公司，这种感受态通常有较高的转化效率，每微克质粒DNA产生108个转化克隆的转化效率，但价格比较昂贵。另一种方法是实验室自己制备。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法。RbCl/KCl法的感受态细胞转化效率较高，但需要特殊的试剂RbCl，CaCl2法简便易行，但转化效率较低。除上述两种方法外，还有制备超级感受态细胞的Inoue法和电穿孔法，Inoue法细菌的培养条件是18℃，一般的实验室很难达到。电穿孔法要求电穿孔仪，一般实验室不具有该设备。因而，研究一种转化效率高，重复性好，操作简单适用于普通实验室的感受态制备方法对与分子生物学的研究尤为必要，对分子克隆实验具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是：提供一种大肠杆菌感受态细胞(E.coliCompetent Cells)的制备方法，它是一种转化效率高、方便、快捷、重复性好的感受态细胞制备和质粒转化方法。
本发明的制备方法是：
1)材料
LB液体培养基：蛋白胨8-12，酵母膏4-6，NaCl 8-12，蒸馏水定容900-1100，PH7.0，121℃灭菌20min。上述材料均为重量单位。
新型制备液：0.06M-0.1M的氯化钙溶液中PEG3350占体积比6-12％，甘油占体积比10-15％，加超纯水定容，121℃灭菌20min。
2)方法
预先将灭菌的离心管和新型制备液放入-20℃冰箱8-14小时，待制备感受态细胞时备用。所有的操作均要在冰上执行。
取菌株分区划线接种于LB平板，倒置37℃培养12-16小时；挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃摇床生长，取2ml培养物转种于200ml新鲜LB培养液中继续生长至菌液OD600为0.3-0.5；将菌液分装于冰冻的离心管中冰浴5min，4℃，离心5min，回收细胞；弃尽上清，将细菌沉淀重新悬浮于预冷的新型制备液中，冰浴5min；4℃离心5min；弃尽上清液将细菌沉淀重新悬浮于预冷的新型制备液，于4℃离心5min；弃尽上清液，加入预冷的新型制备液重悬沉淀，分装。
本发明的有益效果是：将氯化钙，甘油，PEG3350有机的按照一定的比例混在一起，制备感受态细胞，获得了较高的转化率，对分子克隆实验意义重大。该方法操作简单，重复性好，转化效率高，不但能满足常规的分子实验要求，还能够满足构建文库等复杂实验对转化效率的要求，是一项较为实用的新技术，具有极高的应用价值。
表1三种方法制备感受态转化效率比较
由表可知，我们的转化效率是传统氯化钙法的10-15倍，与商业公司的产品转化效率相当。
具体实施方式
实施例1、大肠杆菌JM109感受态细胞的制备及转化效率测定
本实施例中所用的材料和试剂如下：
材料：受体菌E.coli JM109由本实验室保存；pUC19(0.1μg)购自天根生物有限公司(北京)
试剂：LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水定容1L，PH7.0，121℃灭菌20min。新型制备液：0.07M的氯化钙溶液中PEG3350占体积比9％，甘油占体积比12％，加超纯水定容至1000毫升，121℃灭菌20min。
感受态细胞的制备：取菌株分区划线接种于LB平板，倒置37℃培养12-16小时。挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃培养12-16小时，取2ml培养物转种于200ml新鲜LB培养液中继续生长至菌液OD600为0.3-0.5；将菌液分装于50ml冰冻的离心管中冰浴5min；4℃1500g离心5min，回收细胞；弃尽上清，将细菌沉淀重新悬浮于20ml预冷的新型制备液中，冰浴5min；4℃，1500g离心5min；弃尽上清液，将细菌沉淀重新悬浮于20ml预冷的新型制备液，于4℃，1500g离心5min；弃尽上清液，加入4ml预冷的新型制备液重悬沉淀，分装，每管100ul。
转化效率的测定：取1μl PUC19质粒DNA加入100μl感受态细胞中；轻轻混合后，冰浴10min；42℃，热休克90sec，然后迅速置于冰浴冷却5min；加入900μl LB培养基，37℃振荡培养45min(转速：150rpm)，使宿主菌复苏并表达抗性蛋白。取100μl稀释1000倍后取100μl涂布于相应的LB琼脂培养基。37℃倒置培养12～16h，待菌落长出后，菌落记数，计算转化效率。将该实验重复三次，每次做3个转化，计算平均值，确定转化效率。
实施例2、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化效率测定
本实施例中所用的材料和试剂如下：
材料：受体菌E.coli DH5α，由本实验室保存；pUC19(0.1μg)购自天根生物有限公司(北京)
试剂：LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水定容1L，PH7.0，121℃灭菌20min。新型制备液：0.08M的氯化钙溶液中PEG3350占体积比8％，甘油占体积比11％，加超纯水定容至1000毫升，121℃灭菌20min。
感受态细胞的制备：取菌株分区划线接种于LB平板，倒置37℃培养12-16小时。挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃培养12-16小时，取2ml培养物转种于200ml新鲜LB培养液中继续生长至菌液OD600为0.3-0.5；将菌液分装于50ml冰冻的离心管中冰浴5min；4℃1200g离心5min，回收细胞；弃尽上清，将细菌沉淀重新悬浮于20ml预冷的新型制备液中，冰浴5min；4℃，1200g离心5min；弃尽上清液，将细菌沉淀重新悬浮于20ml预冷的新型制备液，于4℃，1200g离心5min；弃尽上清液，加入4ml预冷的新型制备液重悬沉淀，分装，每管100ul。
转化效率的测定：取1μl PUC19质粒DNA加入100μl感受态细胞中；轻轻混合后，冰浴10min；42℃，热休克90sec，然后迅速置于冰浴冷却5min；加入900μl LB培养基，37℃振荡培养45min(转速：150rpm)，使宿主菌复苏并表达抗性蛋白。取100μl稀释1000倍后取100μl涂布于相应的LB琼脂培养基。37℃倒置培养12～16h，待菌落长出后，菌落记数，计算转化效率。将该实验重复三次，每次做3个转化，计算平均值，确定转化效率。
实施例3、大肠杆菌TOP10感受态细胞的制备及转化效率测定
本实施例中所用的材料和试剂如下：
材料：受体菌E.coli TOP10，由本实验室保存；pUC19(0.1μg)购自天根生物有限公司(北京)
试剂：LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水定容1L，PH7.0，121℃灭菌20min。新型制备液：0.075M的氯化钙溶液中PEG3350占体积比12％，甘油占体积比15％，加超纯水定容至1000毫升，121℃灭菌20min。
感受态细胞的制备：取菌株分区划线接种于LB平板，倒置37℃培养12-16小时。挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃培养12-16小时，取2ml培养物转种于200ml新鲜LB培养液中继续生长至菌液OD600为0.32-0.45；将菌液分装于50ml冰冻的离心管中冰浴5min；4℃1100g离心5min，回收细胞；弃尽上清，将细菌沉淀重新悬浮于20ml预冷的新型制备液中，冰浴5min；4℃，1100g离心5min；弃尽上清液，将细菌沉淀重新悬浮于20ml预冷的新型制备液，于4℃，1100g离心5min；弃尽上清液，加入4ml预冷的新型制备液重悬沉淀，分装，每管100ul。
转化效率的测定：取1μl PUC19质粒DNA加入100μl感受态细胞中；轻轻混合后，冰浴10min；42℃，热休克90sec，然后迅速置于冰浴冷却5min；加入900μl LB培养基，37℃振荡培养45min(转速：150rpm)，使宿主菌复苏并表达抗性蛋白。取100μl稀释1000倍后取100μl涂布于相应的LB琼脂培养基。37℃倒置培养12～16h，待菌落长出后，菌落记数，计算转化效率。将该实验重复三次，每次做3个转化，计算平均值，确定转化效率。
Claims (1)
1.一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其制备方法是：
a、材料
LB液体培养基：蛋白胨8-12，酵母膏4-6，NaCl 8-12，蒸馏水定容900-1100，PH7.0，121℃灭菌20min；上述材料均为重量单位；
新型制备液：0.06M-0.1M的氯化钙溶液中PEG3350占体积比6-12％，甘油占体积比10-15％，加超纯水定容，121℃灭菌20min；
b、方法
预先将灭菌的离心管和新型制备液放入-20℃冰箱8-14小时，待制备感受态细胞时备用，所有的操作均要在冰上执行；
取菌株分区划线接种于LB平板，倒置37℃培养12-16小时；挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃摇床生长，取2ml培养物转种于200ml新鲜LB培养液中继续生长至菌液OD600为0.3-0.5；将菌液分装于冰冻的离心管中冰浴5min，4℃，离心5min，回收细胞；弃尽上清，将细菌沉淀重新悬浮于预冷的新型制备液中，冰浴5min；4℃离心5min；弃尽上清液，将细菌沉淀重新悬浮于预冷的新型制备液，于4℃离心5min；弃尽上清液，加入预冷的新型制备液重悬沉淀，分装。
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| CN113430157A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-09-24 | 山东大学 | 一株适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株及其应用 |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Application publication date: 20110330 |