CN110777106A - 一种电感受态细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用细菌分子遗传学技术领域，提供一种电感受态细胞的制备方法，包括：将菌种活化后，在培养基中进行8~24h培养；将所述菌种转接到预备含有所述培养基的发酵罐中，培养至OD值不低于2；将所述发酵罐中的菌液进行10~60min低温处理；将所述菌液转移到离心杯中，于温度为3~5℃、3000~8000rpm转速下离心，并倾去上清液；将沉淀重悬于冰预冷的溶液中，于温度为3~5℃、3000~8000rpm转速下离心，并倾去上清液，重复3~8次后，即得。本发明通过发酵罐中初始培养基体积的提高，带来的高密度培养环境，使细胞总数轻易的提高50倍以上，转化效率可达1010转化子/ug闭环DNA，使电感受态细胞的产业化发展成为可能，并显著降低了成本。

Description

一种电感受态细胞的制备方法
技术领域
本发明属于细菌分子遗传学技术领域，尤其涉及一种电感受态细胞的制备方法。
背景技术
使带有遗传信息的DNA分子进入宿主细胞的过程即所谓的“转化”。而用理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，即称为“感受态细胞”。在分子生物学领域、遗产工程、基因工程的基本实验中，为了使宿主细胞进行特定的DNA或蛋白质的复制或表达，获得易于转化且高转化效率的感受态细胞成了不可或缺的步骤。
非感受态细胞可以通过化学方法或者电穿孔而成为感受态以获取外源基因。例如，大肠杆菌可以在冰浴下通过二价阳离子Ca清洗而成为感受态的。相比之下，电穿孔是向细胞施加电场脉冲以引起细胞膜的结构重组，高电压引起细胞膜瞬时通透，从而允许外源基因进入细胞，转化率最高能达到109-1010转化子/ug闭环DNA。在传统的制备方法中，一般以摇瓶的方法制备感受态细胞，且在OD600较低(0.4左右)的时候收集，通常在一个装液量为200mL的摇瓶，最后仅可以制备成最多1mL的电感受态细胞，制备效率较低；比如传统的大肠杆菌感受态细胞制备量仍然停留在实验室级别，用摇瓶培养，其细胞的总获取量非常有限，所以当用量大时，需要经常制备，造成大量人力物力的消耗。
现有的电感受态细胞的制备方法存在产量低、耗时长以及造成大量人力物力的消耗问题。
发明内容
本发明实施例提供一种电感受态细胞的制备方法，旨在解决现有的电感受态细胞的制备方法存在产量低、耗时长以及造成大量人力物力的消耗问题。
本发明实施例是这样实现的，一种电感受态细胞的制备方法，包括：
将菌种活化后，在培养基中进行8～24h培养；
将所述菌种转接到预备含有所述培养基的发酵罐中，培养至OD值不低于2；将所述发酵罐中的菌液进行10～60min低温处理；
将所述菌液转移到离心杯中，于温度为3～5℃、3000～8000rpm转速下离心，并倾去上清液；
将沉淀重悬于预冷的溶液中，于温度为3～5℃、3000～8000rpm转速下离心，并倾去上清液，重复3～8次后，即得。
本发明实施例提供的电感受态细胞的制备方法，创新性利用发酵罐培养大肠杆菌细胞，使大肠杆菌在短时间内得以迅速生长、繁殖，可在较高的OD600下收集，是传统方法的5倍以上；即通过发酵罐中初始培养基体积的提高，带来的高密度培养环境，可一次获取大量的细胞，较比传统的摇瓶在细胞培养的效率上获得了大幅的提升，使细胞总数轻易的提高50倍以上，转化效率可达109-1010转化子/ug闭环DNA，使电感受态细胞的产业化发展成为可能，并显著降低了成本。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供的电感受态细胞的制备方法，创新性利用发酵罐放大培养大肠杆菌细胞，使大肠杆菌在短时间内得以迅速生长、繁殖，可在较高的OD600下收集，是传统方法的5倍以上；即通过发酵罐中初始培养基体积的提高(10倍以上)，带来的高密度培养环境，可一次获取大量的细胞，较比传统的摇瓶在细胞培养的效率上获得了大幅的提升，使细胞总数轻易的提高50倍以上，转化效率可达109-1010转化子/ug闭环DNA，使电感受态细胞的产业化发展成为可能，并显著降低了成本。
值得注意的是，发酵罐通常为发酵菌体，以获得代谢产物所用。本发明实施例创新性利用发酵罐放大培养大肠杆菌细胞，可在较高的OD下收集菌体，有效提高感受态的制备效率，并且在提高制备效率的同时，仍然达到较高转化效率。
在本发明实施例中，该电感受态细胞的制备方法，包括以下步骤：
将菌种活化后，在培养基中进行8～24h培养；
将所述菌种转接到预备含有所述培养基的发酵罐中，培养至OD值不低于2；将所述发酵罐中的菌液进行10～60min低温处理；
将所述菌液转移到离心杯中，于温度为3～5℃、3000～8000rpm转速下离心，并倾去上清液；
将沉淀重悬于预冷的溶液中，于温度为3～5℃、3000～8000rpm转速下离心，并倾去上清液，重复3～8次后，即得。
其中，所述培养基为LB培养基、TB培养基、2×YT培养基中的一种。
其中，所述LB培养基的制备方法包括：
将0.08～0.12g胰蛋白胨、0.05～0.07g酵母粉、0.08～0.12g氯化钠溶于8～12mL去离子水中，并装于离心管内，进行117～125℃灭菌15～25min，即得。
其中，所述预备含有所述培养基的发酵罐，具体为：
将4～6g胰蛋白胨、2～3g酵母粉、4～6g氯化钠溶于450～550mL去离子水中，并装于发酵罐内；
在所述发酵罐中插入pH电极与溶氧电极；
将所述发酵罐放入灭菌篮中，进行117～125℃灭菌25～35min；
灭菌完成后，将所述发酵罐迅速放入底座，接上通气，通气值为0.3～0.5L/min，安装尾气半导体冷凝装置，DO电极，搅拌电机，插入温度电极，即得。
其中，所述低温处理为冰浴、冰水浴、冰盐浴等处理手段中的一种。
其中，所述溶液为浓度10％～25％的甘油、浓度5％～15％的DMSO中的一种。
其中，所述菌种为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
在本发明实施例中，所述发酵罐为市面上购买所得，为迪比尔T&J-Minskid 1L*4。
在本发明一个优选实施例中，上述将菌种活化后，在培养基中进行8～24h培养的步骤，具体包括：
在紫外灭菌20～40min后的超净台内，取出-80℃保存的菌种，并解冻；
用接种环挑取单克隆的菌种到培养基中，于温度为35～39℃下，200～300rpm摇床中培养过夜，培养时间为16～18h。
在本发明一个优选实施例中，上述将所述菌种转接到预备含有所述培养基的发酵罐中，培养至OD值不低于2的步骤，具体包括：
在超净工作台中，以无菌针管吸取菌种；
在对所述无菌针管的针头进行酒精消毒后，通过预备含有所述培养基的发酵罐上端接种口将菌种垂直打入；
对所述发酵罐的发酵参数进行设置，于温度为35～39℃下培养3～5h。
其中，所述发酵参数包括转速参数、通气参数；其中，所述转速参数设定为：DO40％、最大转数1300rmp、最小转数200rmp、加减步值50rmp以及周期60s；所述通气参数设定为：最大流量4L/h、最小流量0.2L/h、加减步值0.2L/h以及周期60s。
本发明实施例还对上述获得的电感受态细胞进行转化率的验证，方案具体为：取上述电感受态80uL置于电转杯中，加入一定量的质粒，点击转化，计算转化率。
以下通过具体实施例对本发明的电感受态细胞的制备方法的技术效果做进一步的说明。
实施例1
准备工作：
LB培养基配备：0.1g胰蛋白胨、0.05g酵母粉、0.1g氯化钠溶于10mL去离子水中，并装于50mL离心管，121℃灭菌20min。
LB固体培养基配备：称取20g LB琼脂溶于500mL纯水，于500mL橙盖瓶，121℃灭菌20min。待培养基温度降至60℃左右，铺平板，每块平板25mL培养基。
氨苄抗性LB固体培养基配备：称取20g LB琼脂溶于500mL纯水，于500mL橙盖瓶，121℃灭菌20min。待培养基温度降至60℃左右，加入0.5mL100mg/mL的氨苄，铺平板，每块平板25mL培养基。
第一天：
1、紫外灭菌，菌种(BL21(DE3))解冻：超净台提前酒精消毒表面，紫外灭菌30min后，开启通风模式，取出-80℃保存的菌种，在超净台内解冻，等到菌种管表面的水被风干后才能使用；
2、划平板：取一块LB固体培养基平板，用一次性接种环划线，要有单克隆；
3、过夜培养：37℃培养箱过夜培养20h。
第二天：
过夜培养：超净台灭菌，用接种环挑取单克隆菌种(单菌落)到10mL LB培养基中，37℃，250rpm摇床培养过夜，16-18h；
发酵罐准备：5g胰蛋白胨、2.5g酵母粉、5g氯化钠溶于500ml去离子水中，并装于1L发酵罐内，组装完成，发酵罐插入pH电极与溶氧电极，将发酵罐放入灭菌篮，121℃，灭菌30min。
灭菌完成后迅速放入底座，接上通气，通气值为0.4L/min，安装尾气半导体冷凝装置，DO电极，搅拌电机，插入温度电极。设置200rmp，37℃过夜。
第三天：
1.转接
准备10mL无菌针管，在超净工作台吸取种子液5mL，于发酵罐上端接种口将种子液垂直打入。37℃培养4h左右，使OD为2。
2.参数控制
a)转速控制：设定DO”(40％)；最大转数(1300rmp)，最小转数(200rmp)、加减步值(50rmp)、周期(60s)；
b)DO控制：维持DO30％以上；
c)通气控制：设定DO”(30％)；最大流量(4L/h)、最小流量(0.2L/h)、加减步值(0.2L/h)、周期(60s)。
3.检测OD：空白对照LB培养基1mL，取样菌液1mL到一次性比色皿，OD600检测，为2.012；
4.立即停止培养，将发酵罐中的菌液用泵转移至无菌玻璃瓶后，放在冰上冰浴20min；
5.离心：在超净台内将500mL菌体转移到离心杯中，4000rpm，3℃离心10min(第1次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬至500mL，4000rpm，3℃离心10min(第2次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬至500mL，4000rpm，3℃离心10min(第3次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬至500mL，4000rpm，3℃离心10min(第4次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬转移至50mL离心管，加入预冷10％甘油至45mL，4000rpm，3℃离心10min(第5次)；
立即弃上清液，用20mL预冷的10％甘油悬浮菌体；
6.分装：快速
在最后一次离心时，将灭菌好的1.5mL EP管插在干冰上，等悬浮好菌体后立即分装。
对上述实施例所获得的电感受态细胞进行转化率的计算，具体实验步骤为：
1)取出制备好的电感受态细胞，放在冰上融化；
2)在预冷的洁净的大电转杯中加入80μL电感受态细胞，一个加入1μL 0.1ng/μL puc19(质粒)，置于冰上1分钟使其混合均匀；
3)将电转杯外部擦干后放入电转仪中，按-电转-按钮；
4)加入1mL 37℃SOC培养基到电转杯中；其中，SOC培养基组份浓度：2％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast Extract，0.05％(W/V)NaCl，2.5mM KCl 10mM MgCl2，20mMglucose；
5)将菌体转移至无菌透气管中，37℃，250rpm培养1h；
6)梯度稀释1000倍，取100μL涂布到氨苄抗性LB固体培养基平板上；
7)在温度为37℃下培养过夜，观察结果，平板上有500颗单菌落；
8)计算转化率：
公式：转化子总数＝菌落数*稀释倍数*转化原总体积/涂板菌液体积按照上述公式，用上述操作中的数据代入即得，其中，：
转化频率(转化子总数/每μg粒DNA)＝转化子总数/质粒DNA加入量＝500*1000*1080*10000/100＝5.4*1010。
实施例2
准备工作：
LB培养基配备：0.1g胰蛋白胨、0.05g酵母粉、0.1g氯化钠溶于10mL去离子水中，并装于50mL离心管，121℃灭菌20min。
LB固体培养基配备：称取20g LB琼脂溶于500mL纯水，于500mL橙盖瓶，121℃灭菌20min。待培养基温度降至60℃左右，铺平板，每块平板25mL培养基。
氨苄抗性LB固体培养基配备：称取20g LB琼脂溶于500mL纯水，于500mL橙盖瓶，121℃灭菌20min。待培养基温度降至60℃左右，加入0.5mL100mg/mL的氨苄，铺平板，每块平板25mL培养基。
第一天：
1、紫外灭菌，菌种(BL21(DE3))解冻：超净台提前酒精消毒表面，紫外灭菌30min后，开启通风模式，取出-80℃保存的菌种，在超净台内解冻，等到菌种管表面的水被风干后才能使用；
2、划平板：取一块LB固体培养基平板，用一次性接种环划线，要有单克隆；
3、过夜培养：37℃培养箱过夜培养20h。
第二天：
过夜培养：超净台灭菌，用接种环挑取单克隆菌种(单菌落)到10mL LB培养基中，30℃，250rpm摇床培养过夜，16-18h；
发酵罐准备：5g胰蛋白胨、2.5g酵母粉、5g氯化钠溶于500mL去离子水中，并装于1L发酵罐内，组装完成，发酵罐插入pH电极与溶氧电极，将发酵罐放入灭菌篮，121℃，灭菌30min。
灭菌完成后迅速放入底座，接上通气，通气值为0.4L/min，安装尾气半导体冷凝装置，DO电极，搅拌电机，插入温度电极。设置200rmp，37℃过夜。
第三天：
1.转接
准备10mL无菌针管，在超净工作台吸取种子液5mL，于发酵罐上端接种口将种子液垂直打入。30℃培养4h左右，使OD为2。
2.参数控制
a)转速控制：设定DO”(40％)；最大转数(1300rmp)，最小转数(200rmp)、加减步值(50rmp)、周期(60s)；
b)DO控制：维持DO30％以上；
c)通气控制：设定DO”(30％)；最大流量(4L/h)、最小流量(0.2L/h)、加减步值(0.2L/h)、周期(60s)。
3.检测OD：空白对照LB培养基1mL，取样菌液1mL到一次性比色皿，OD600检测，为2.015；
4.立即停止培养，将发酵罐中的菌液用泵转移至无菌玻璃瓶后，放在冰上冰浴20min；
冰浴准备：至少提前3小时将10％甘油、离心杯以及需用到的枪头放到-20℃冰箱预冷。
5.离心：在超净台内将500mL菌体转移到离心杯中，4000rpm，3℃离心10min(第1次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬至500mL，4000rpm，3℃离心10min(第2次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬至500mL，4000rpm，3℃离心10min(第3次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬至500mL，4000rpm，3℃离心10min(第4次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬转移至50mL离心管，加入预冷10％甘油至45mL，4000rpm，3℃离心10min(第5次)；
立即弃上清液，用20m L预冷的10％甘油悬浮菌体；
6.分装：快速
在最后一次离心时，将灭菌好的1.5mL EP管插在干冰上，等悬浮好菌体后立即分装。
对上述实施例所获得的电感受态细胞进行转化率的计算，具体实验步骤为：
1)取出制备好的电感受态细胞，放在冰上融化；
2)在预冷的洁净的大电转杯中加入80μL电感受态细胞，一个加入1μL 0.1ng/μL puc19(质粒)，置于冰上1分钟使其混合均匀；
3)将电转杯外部擦干后放入电转仪，按-电转-按钮；
4)加入1mL 37℃SOC培养基到电转杯中；其中，SOC培养基组份浓度：2％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast Extract，0.05％(W/V)NaCl，2.5mM KCl 10mM MgCl2，20mMglucose；
5)将菌体转移至无菌透气管中，37℃，250rpm培养1h：
6)梯度稀释1000倍，取100μL涂布到氨苄抗性LB固体培养基平板上；
7)在温度为37℃下培养过夜，观察结果，平板上有460颗单菌落；
8)计算转化率：
公式：转化子总数＝菌落数*稀释倍数*转化原总体积/涂板菌液体积
按照上述公式，用上述操作中的数据代入即得，其中，：
转化频率(转化子总数/每μg粒DNA)＝转化子总数/质粒DNA加入量＝460*1000*1080*10000/100＝5.0*1010。
实施例3
准备工作：
LB培养基配备：0.1g胰蛋白胨、0.05g酵母粉、0.1g氯化钠溶于10mL去离子水中，并装于50mL离心管，121℃灭菌20min。
LB固体培养基配备：称取20g LB琼脂溶于500mL纯水，于500mL橙盖瓶，121℃灭菌20min。待培养基温度降至60℃左右，铺平板，每块平板25mL培养基。
氨苄抗性LB固体培养基配备：称取20g LB琼脂溶于500mL纯水，于500mL橙盖瓶，121℃灭菌20min。待培养基温度降至60℃左右，加入0.5mL100mg/mL的氨苄，铺平板，每块平板25mL培养基。
第一天：
1、紫外灭菌，菌种(BL21(DE3))解冻：超净台提前酒精消毒表面，紫外灭菌30min后，开启通风模式，取出-80℃保存的菌种，在超净台内解冻，等到菌种管表面的水被风干后才能使用；
2、划平板：取一块LB固体培养基平板，用一次性接种环划线，要有单克隆；
3、过夜培养：37℃培养箱过夜培养20h。
第二天：
过夜培养：超净台灭菌，用接种环挑取单克隆菌种(单菌落)到10mL LB培养基中，37℃，250rpm摇床培养过夜，16-18h；
发酵罐准备：20g胰蛋白胨、10g酵母粉、20g氯化钠溶于2L去离子水中，并装于5L发酵罐内，组装完成，发酵罐插入pH电极与溶氧电极，将发酵罐放入灭菌篮，121℃，灭菌30min。
灭菌完成后迅速放入底座，接上通气，通气值为0.4L/min，安装尾气半导体冷凝装置，DO电极，搅拌电机，插入温度电极。设置200rmp，37℃过夜。
第三天：
1.转接
将上述培养过夜的菌种10mL接入发酵罐中。37℃培养4.5h左右，使OD为2。
2.参数控制
a)转速控制：设定DO”(40％)；最大转数(1300rmp)，最小转数(200rmp)、加减步值(50rmp)、周期(60s)；
b)DO控制：维持DO30％以上；
c)通气控制：设定DO”(30％)；最大流量(4L/h)、最小流量(0.2L/h)、加减步值(0.2L/h)、周期(60s)。
3.检测OD：空白对照LB培养基1mL，取样菌液1mL到一次性比色皿，OD600检测，为2.101；
4.立即停止培养，将发酵罐中的菌液用泵转移至无菌玻璃瓶后，放在冰上冰浴20min；
冰浴准备：至少提前3小时将10％甘油、离心杯以及需用到的枪头放到-20℃冰箱预冷。
5.离心：在超净台内将500mL菌体转移到离心杯中，4000rpm，3℃离心10min(第1次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬至500mL，4000rpm，3℃离心10min(第2次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬至500mL，4000rpm，3℃离心10min(第3次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬至500mL，4000rpm，3℃离心10min(第4次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬转移至50mL离心管，加入预冷10％甘油至45mL，4000rpm，3℃离心10min(第5次)；
立即弃上清液，用20mL预冷的10％甘油悬浮菌体；
6.分装：快速
在最后一次离心时，将灭菌好的1.5ml EP管插在干冰上，等悬浮好菌体后立即分装。
对上述实施例所获得的电感受态细胞进行转化率的计算，具体实验步骤为：
1)取出制备好的电感受态细胞，放在冰上融化；
2)在预冷的洁净的大电转杯中加入80μL电感受态细胞，一个加入1μL 0.1ng/μL puc19(质粒)，置于冰上1分钟使其混合均匀；
3)将电转杯外部擦干后放入电转仪，按-电转-按钮；
4)立即加入1mL 37℃SOC培养基到电转杯中；其中，SOC培养基组份浓度：2％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast Extract，0.05％(W/V)NaCl，2.5mM KCl10mM MgCl2，20mMglucose；
5)将菌体转移至无菌透气管中，37℃，250rpm培养1h；
6)梯度稀释1000倍，取100μL涂布到氨苄抗性LB固体培养基平板上；
7)在温度为37℃下培养过夜，观察结果，平板上有544颗单菌落；
8)计算转化率：
公式：转化子总数＝菌落数*稀释倍数*转化原总体积/涂板菌液体积
按照上述公式，用上述操作中的数据代入即得，其中，：
转化频率(转化子总数/每μg粒DNA)＝转化子总数/质粒DNA加入量＝544*1000*1080*10000/100＝5.9*1010。
综上，本发明实施例1-3提供的电感受态细胞的制备方法，创新性利用发酵罐培养大肠杆菌细胞，使大肠杆菌在短时间内得以迅速生长、繁殖，可在较高的OD600下收集，是传统方法的5倍以上；即通过发酵罐中初始培养基体积的提高，带来的高密度培养环境，可一次获取大量的细胞，较比传统的摇瓶在细胞培养的效率上获得了大幅的提升，使细胞总数轻易的提高50倍以上，转化效率可达1010转化子/ug闭环DNA，另外，实施例3利用5L发酵罐培养细胞仍然实现成功一次性获取大量的细胞，使电感受态细胞的产业化发展成为可能，并显著降低了成本。
值得注意的是，感受态细胞转化效率的高低和细胞的菌龄有着密切的关系，因为不同生长阶段的细胞，其细胞膜的通透能力是不同的，而细胞在发酵罐里的生长情况与摇瓶完全不同，不但比摇瓶中生长速度快，而且细胞密度可以是摇瓶的10倍以上，因此，本发明进一步研究了发酵罐中生长制备感受态细胞的最佳生长期，即利用发酵罐具有高效培养大肠杆菌细胞的特性，使大肠杆菌在短时间内迅速生长、繁殖，比传统的摇瓶在细胞培养的效率上获得了大幅的提升。在此基础上，本发明通过实验对比不同培养时间获取的大肠杆菌细胞，找到最佳的制备电感受态细胞的时间，具体如下：
准备工作：
LB培养基配备：0.1g胰蛋白胨、0.05g酵母粉、0.1g氯化钠溶于10mL去离子水中，并装于50mL离心管，121℃灭菌20min。
LB固体培养基配备：称取20g LB琼脂溶于500mL纯水，于500mL橙盖瓶，121℃灭菌20min。待培养基温度降至60℃左右，铺平板，每块平板25mL培养基。
氨苄抗性LB固体培养基配备：称取20g LB琼脂溶于500mL纯水，于500mL橙盖瓶，121℃灭菌20min。待培养基温度降至60℃左右，加入0.5mL100mg/mL的氨苄，铺平板，每块平板25mL培养基。
第一天：
1、紫外灭菌，菌种(BL21(DE3))解冻：超净台提前酒精消毒表面，紫外灭菌30min后，开启通风模式，取出-80℃保存的菌种，在超净台内解冻，等到菌种管表面的水被风干后才能使用；
2、划平板：取一块LB固体培养基平板，用一次性接种环划线，要有单克隆；
3、过夜培养：37℃培养箱过夜培养20h。
第二天：
过夜培养：超净台灭菌，用接种环挑取单克隆菌种(单菌落)到10mL LB培养基中，37℃，250rpm摇床培养过夜，16-18h；
发酵罐准备：5g胰蛋白胨、2.5g酵母粉、5g氯化钠溶于500mL去离子水中，并装于1L发酵罐内，组装完成，发酵罐插入pH电极与溶氧电极，将发酵罐放入灭菌篮，121℃，灭菌30min。
灭菌完成后迅速放入底座，接上通气，通气值为0.4L/min，安装尾气半导体冷凝装置，DO电极，搅拌电机，插入温度电极。设置200rmp，37℃过夜。
第三天：
1.转接
准备10mL无菌针管，在超净工作台吸取种子液5mL，于发酵罐上端接种口将种子液垂直打入。37℃培养4h左右，使OD为2。
2.参数控制
a)转速控制：设定DO”(40％)；最大转数(1300rmp)，最小转数(200rmp)、加减步值(50rmp)、周期(60s)；
b)DO控制：维持DO30％以上；
c)通气控制：设定DO”(30％)；最大流量(4L/h)、最小流量(0.2L/h)、加减步值(0.2L/h)、周期(60s)。
3.检测OD：空白对照LB培养基1mL，取样菌液1mL到一次性比色皿，OD600检测，在不同时间段分别取50mL的菌液，使他们的OD分别为0.4、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5(对应实验1-8)；
4.立即停止培养，将发酵罐中的菌液用泵转移至无菌玻璃瓶后，放在冰上冰浴20min；
冰浴准备：至少提前3小时将10％甘油、离心杯以及需用到的枪头放到-20℃冰箱预冷。
5.离心：在超净台内将500mL菌体转移到离心杯中，4000rpm，3℃离心10min(第1次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬至500mL，4000rpm，3℃离心10min(第2次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬至500mL，4000rpm，3℃离心10min(第3次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬至500mL，4000rpm，3℃离心10min(第4次)；
弃上清液，用预冷10％甘油重悬转移至50mL离心管，加入预冷10％甘油至45mL，4000rpm，3℃离心10min(第5次)；
立即弃上清液，OD为0.4、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5分别用0.4、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5mL预冷的10％甘油轻轻悬浮菌体；
6.分装：快速
在最后一次离心时，将灭菌好的1.5ml EP管插在干冰上，等悬浮好菌体后立即分装。
对上述实施例所获得的电感受态细胞进行转化率的计算，具体实验步骤为：
1)取出制备好的电感受态细胞，放在冰上融化；
2)在预冷的洁净的大电转杯中加入80μL电感受态细胞，一个加入1μL 0.1ng/μL puc19(质粒)，置于冰上1分钟使其混合均匀；
3)将电转杯外部擦干后放入电转仪，按-电转-按钮；
4)加入1mL 37℃SOC培养基到电转杯中；其中，SOC培养基组份浓度：2％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast Extract，0.05％(W/V)NaCl，2.5mM KCl 10mM MgCl2，20mMglucose；
5)将菌体转移至无菌透气管中，37℃，250rpm培养1h；
6)梯度稀释1000倍，取100μL涂布到氨苄抗性LB固体培养基平板上；
7)在温度为37℃下培养过夜，观察结果为：当OD分别为0.4、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5时，对应平板上分别有534、199、456、169、230、260、544、109颗单菌落；
8)计算转化率(公式：转化子总数＝菌落数*稀释倍数*转化原总体积/涂板菌液体积)，计算结果如表1所示：
表1
Figure BDA0002296299190000141
综上，从表1可知，由于制备量与收集时的OD成正相关关系，在OD值较低的时候，虽然效率高，但是单次可制备的量很少；而从实验7、8中可知，本发明实施例提供的电感受态细胞的制备方法成功实现了在不降低效率(1010)的情况下提高制备量；而实验1-8的效率值虽然规律性不一，数值波动大，这主要是受细胞生长的状态、细胞量的多少、制备的操作、环境的温度等多方面的影响，但并不影响其所达到的数量级。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种电感受态细胞的制备方法，其特征在于，包括：
将菌种活化后，在培养基中进行8~24h培养；
将所述菌种转接到预备含有所述培养基的发酵罐中，培养至OD值不低于2；
将所述发酵罐中的菌液进行10~60min低温处理；
将所述菌液转移到离心杯中，于温度为3~5℃、3000~8000rpm转速下离心，并倾去上清液；
将沉淀重悬于预冷的溶液中，于温度为3~5℃、3000~8000rpm转速下离心，并倾去上清液，重复3~8次后，即得。
2.根据权利要求1所述的电感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述将菌种活化后，在培养基中进行8~24h培养的步骤，具体包括：
在紫外灭菌20~40min后的超净台内，取出-80℃保存的菌种，并解冻；
用接种环挑取单克隆的菌种到培养基中，于温度为35~39℃下，200~300rpm摇床中培养过夜，培养时间为16~18h。
3.根据权利要求1所述的电感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述培养基为LB培养基、TB培养基、2×YT培养基中的一种。
4.根据权利要求3所述的电感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述LB培养基的制备方法包括：
将0.08~0.12g胰蛋白胨、0.05~0.07g酵母粉、0.08~0.12g氯化钠溶于8~12mL去离子水中，并装于离心管内， 进行117~125℃灭菌15~25min，即得。
5.根据权利要求1所述的电感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述预备含有所述培养基的发酵罐，具体为：
将4~6g胰蛋白胨、 2~3g酵母粉、 4~6g 氯化钠溶于450~550ml去离子水中，并装于发酵罐内；
在所述发酵罐中插入pH电极与溶氧电极；
将所述发酵罐放入灭菌篮中，进行117~125℃灭菌25~35min；
灭菌完成后，将所述发酵罐迅速放入底座，接上通气，通气值为0.3~0.5L/min，安装尾气半导体冷凝装置，DO电极，搅拌电机，插入温度电极，即得。
6.根据权利要求1所述的电感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述将所述菌种转接到预备含有所述培养基的发酵罐中，培养至OD值不低于2的步骤，具体包括：
在超净工作台中，以无菌针管吸取菌种；
在对所述无菌针管的针头进行酒精消毒后，通过预备含有所述培养基的发酵罐上端接种口将菌种垂直打入；
对所述发酵罐的发酵参数进行设置，于温度为35~39℃下培养3~5h。
7.根据权利要求6所述的电感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述发酵参数包括转速参数、通气参数。
8.根据权利要求7所述的电感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述转速参数设定为：DO40%、最大转数1300rmp、最小转数200rmp、加减步值50rmp以及周期60s。
9.根据权利要求7所述的电感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述通气参数设定为：最大流量4L/h、最小流量0.2L/h、加减步值0.2L/h以及周期60s。
10.根据权利要求1所述的电感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述溶液为浓度10%~25%的甘油、 浓度5%~15%的DMSO中的一种。
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