CN113215265A - 奶牛bta-miRNA29d-3p在奶牛乳腺上皮细胞脂质积累调节过程中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于奶牛育种基因工程领域，具体涉及一个奶牛miRNA基因bta‑miRNA29d‑3p，对该基因的功能验证表明，过表达该基因后，可抑制脂肪酸合成、甘油三酯合成代谢通路的关键基因，同时细胞内甘油三酯含量下调；干扰该基因后，能够上调脂肪酸合成代谢通路的关键基因，以及甘油三酯合成代谢通路的关键基因，显著上调细胞内甘油三酯的含量，且bta‑miRNA29d‑3p直接作用于脂肪酸延长酶ELOVL4基因。基于此技术效果，可为奶牛乳中乳脂含量调节、以及高乳脂品种的培育奠定基础。

Description

奶牛bta-miRNA29d-3p在奶牛乳腺上皮细胞脂质积累调节过 程中的应用

技术领域

本说明书涉及奶牛育种基因工程领域，更具体地说涉及一种奶牛bta-miRNA29d-3p在奶牛乳腺上皮细胞脂质积累调节过程中的应用。

背景技术

牛奶不仅能够提供能量，并且含有优质蛋白质、维生素和钙元素，是国民饮食中重要的营养物质来源。牛奶中总脂肪含量高，含有丰富的脂肪酸，其中不饱和脂肪酸对人类心血管疾病和高血脂等疾病有良好的预防作用。研究表明，牛奶品质也跟脂肪酸组成和含量有着密切的关系。因此，改善牛奶中脂质组成及提高脂质含量对提高牛奶品质尤为重要，提高牛奶中乳脂含量已成为当前奶牛育种工作的重要目标之一。

随着奶牛乳腺转录组测序工作的开展，目前已经对脂肪酸代谢相关基因的功能研究进行了探索和验证，这些基因的功能涉及脂肪酸的合成、转运、去饱和及甘油三酯的合成等多个方面，为解析奶牛乳腺脂代谢奠定了理论基础。

在人类基因组计划完成后，科学家们开始关注非编码RNA的功能和调控机制。miRNAs是一类单链的内源性非编码小RNA分子(约22个核苷酸)，主要结合到靶向mRNA以抑制其翻译并加速其衰变。miRNA在大多数物种中都是保守的，可调节多达30％的基因表达，它的调控作用涉及有机体的各种生命活动，参与机体生长发育、细胞分化与凋亡、脂类蛋白质代谢等多种生理生化反应及新陈代谢过程。

然而，研究表明，miRNA在哺乳动物乳脂合成中也起着重要作用。乳腺组织在泌乳的生理过程中，就有很多miRNAs参与发动和维持泌乳过程。研究报道显示，从奶牛的乳腺组织和脂肪组织中分别鉴定得到96个和133个miRNAs，其中乳腺组织和脂肪中特异性表达miRNAs分别为9个和23个，另外在这两种组织中共表达的miRNAs的拷贝数差异显著，表明miRNAs参与乳腺组织脂肪代谢的特殊性和重要性。Shen等(2016)比较了荷斯坦奶牛(Bostaurus)两种不同乳脂产量之间的miRNA表达模式和丰度，在牛原代乳腺上皮细胞中检测到97种miRNAs，其中miR-181a、miR-130a等已被证实在牛乳腺上皮细胞中下调乳脂合成。

因此，对于奶牛乳腺脂代谢通路中相关非编码RNA的进一步研究，有助于更好地利用功能miRNA调控牛奶的脂肪酸成分，对奶牛产业发展具有重要的应用价值。

发明内容

本说明书克服了现有技术中的不足，提供了一种奶牛bta-miRNA29d-3p在奶牛乳腺上皮细胞脂质积累调节过程中的应用，旨在解决如何调节乳腺细胞中甘油三酯含量的问题。

本说明书的目的通过下述技术方案予以实现。

奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p在甘油三酯代谢调节中的应用，所述bta-miRNA29d-3p基因通过过表达实现降低乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量。

优选地，所述bta-miRNA29d-3p基因的成熟体长度为22bp，如序列1所示。

由上述任一方案优选的是，所述bta-miRNA29d-3p基因的前体RNA序列长度为88bp，如序列2所示。

由上述任一方案优选的是，所述bta-miRNA29d-3p基因的模拟物序列为双链序列，即bta-miRNA29d-3p基因序列和它的互补序列，如序列3、序列4所示。

奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p在甘油三酯代谢调节中的应用，所述bta-miRNA29d-3p基因通过干扰实现提升乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量。

优选地，所述bta-miRNA29d-3p基因的成熟体长度为22bp，如序列1所示。

由上述任一方案优选的是，所述bta-miRNA29d-3p基因的前体RNA序列长度为88bp，如序列2所示。

由上述任一方案优选的是，所述bta-miRNA29d-3p基因的抑制物序列为单链序列，即bta-miRNA29d-3p基因的反向互补序列，如序列5所示。

奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p脂肪酸代谢调节中的应用，所述bta-miRNA29d-3p基因通过结合脂肪酸延长代谢通路ELOVL4基因3’UTR，从而实现降低ELOVL4基因的表达量，ELOVL4基因3’UTR的序列如序列表35所示。

由上述任一方案优选的是，所述bta-miRNA29d-3p的成熟体长度为22bp，如序列1所示。

由上述任一方案优选的是，所述bta-miRNA29d-3p基因的前体RNA序列长度为88bp，如序列2所示。

本说明书的有益效果为：

对奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p的功能验证表明，过表达该基因后，可抑制脂肪酸合成、甘油三酯合成代谢通路的关键基因，同时细胞内甘油三酯含量下调；干扰该基因后，能够上调脂肪酸合成代谢通路的关键基因，以及甘油三酯合成代谢通路的关键基因，显著上调细胞内甘油三酯的含量；对奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p直接作用于脂肪酸延长酶ELOVL4基因。基于此技术效果，可为奶牛乳中乳脂含量调节、以及高乳脂品种的培育奠定基础。

附图说明

图1A是bta-miRNA29d-3p基因在牛乳腺上皮细胞中的表达分析，即转染bta-miRNA29d-3p模拟物及其对照；

图1B是bta-miRNA29d-3p基因在牛乳腺上皮细胞中的表达分析，即转染bta-miRNA29d-3p抑制物及其对照；

图2A是bta-miRNA29d-3p基因过表达对转录因子SREBF1、LXRA表达的影响；

图2B是bta-miRNA29d-3p基因过表达对脂肪酸合成与延长基因ACACA、FASN和ELOVL4的表达的影响；

图2C是bta-miRNA29d-3p基因过表达对甘油三酯合成相关基因DGAT1和GPAM的影响；

图2D是bta-miRNA29d-3p基因过表达对甘油三酯含量的影响；

图3A、图3B、图3C、图3D是bta-miRNA29d-3p基因干扰对牛乳腺上皮细胞脂质合成相关基因表达的影响及甘油三酯含量的影响；

图4A是bta-miRNA29d-3p在不同物种ELOVL43’UTR上的结合位点分析；

图4B是bta-miRNA29d-3p的作用靶位点定点突变结果；

图4C、4D是bta-miRNA29d-3p基因下调牛ELOVL4基因转录的mRNA3’端非翻译区相对荧光素酶报告基因活性。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本说明书的技术方案作进一步的说明。

以下通过实例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

下述实例中所涉及的试验方法或分析方法，除非另有说明，均为常规方法。

在以下试剂中，如无特别说明，均可从商业途径获得。在具体介绍实例前，首先对实例中所涉及的生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况进行介绍：

细胞和质粒来源：

奶牛乳腺上皮细胞为扬州大学动物科学与技术学院陈志老师馈赠；psiCHECK-2Vector由西北农林科技大学罗军教授馈赠。

实验试剂：

RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、限制性内切酶、DMEM/F-12培养基、胎牛血清、表皮生长因子、LipofectamineTMRNAiMAX、组织细胞甘油三酯测定试剂盒、TBE电泳液、LB培养基、氨苄青霉素等，均为分子生物学实验中常用材料。

实验仪器：

本发明主要用到以下仪器：PCR仪，Eppendorf移液器，全功能酶标仪，伯乐荧光定量仪(CFX-96)，凝胶成像系统，电泳仪和二氧化碳培养箱购自北京六一仪器厂。

下面结合具体实施例进一步说明本发明。

实施例1奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p在牛乳腺上皮细胞中的表达水平检测。

由广州锐博生物技术有限公司提供以下化学合成的miRNA及其对照：

(1)bta-miRNA29d-3p mimics(miR-29d)，序列为：

5’-UAGCACCAUUUGAAAUCGAUUA-3’(序列3)

3’-AUCGUGGUAAACUUUAGCUAAU-5’(序列4)

(2)miRNA mimics的阴性对照(ConmiR)，序列为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’

(序列6)；

(3)bta-miRNA29d-3p inhibitor(anti-miR-29d)序列为：

5’-UAAUCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’

(序列5)；

(4)miRNA inhibitor的阴性对照(ConInh)，序列为：5’-CUCCGAACGAACGUGUCACGU-3’(序列7)；

在此基础上，采用LipofectamineTM RNAiMAX转染试剂分别瞬时转染miR-29d，ConmiR，anti-miR-29d，Con Inh至奶牛乳腺上皮细胞中，其终浓度为50nM。孵育48小时后，采用实时荧光定量技术检测细胞中miR-29d-3p的mRNA水平。如图1A、图1B所示结果表明：在乳腺上皮细胞中过表达bta-miRNA29d-3p后，其mRNA显著上调约300倍；在乳腺上皮细胞中干扰bta-miRNA29d-3p后，其mRNA显著下降约80％。

具体操作如下：

1.细胞培养

将奶牛乳腺上皮细胞放置于37℃，含5％CO₂的恒温细胞培养箱中进行培养，其基础培养基包含10％胎牛血清和90％的DMEM/F-12，以及5μg/mL的胰岛素，10ng/mL的表皮生长因子，100U/mL的青霉素/链霉素和1μg/mL的氢化可的松。细胞生长至融合度为90％-100％时进行传代培养，按照1:3进行传代，每天更换新鲜培养基以保证营养充足。

2.细胞转染

采用反式转染法进行试验。转染的具体操作步骤以24孔板为例。首先配制转染复合物，每孔转染复合物的总体积为100μL，转染试剂为1.5μL，siRNA的终浓度为50nM，剩下体积用DMEM/F-12补齐。整个过程都用硅化枪头及离心管，轻柔混匀后置于室温下孵育20min。之后，将乳腺上皮细胞消化为单个悬浮细胞，均匀铺到24孔板中，每孔加入400μL细胞悬浮液，将孵育好的转染复合物逐滴加入培养板中，轻柔水平混匀，防止细胞在中央聚堆，细胞的密度达到90％-100％。转染48小时后进行检测。

3.反转录

反转录包括miRNA反转录和普通反转录，其中bta-miRNA29d-3p反转录引物设计采用茎环法，具体引物序列为：

RT primer：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACUAGCACCA-3’(序列8)

首先去除基因组DNA，按如下成分于冰上配制反应混合液：

5×gDNAEraserBuffer，2.0μL；

gDNAEraser,1.0μL；

TotalRNA,最多1μg；

RNaseFreedH2O加至10μL。

加完后混匀室温反应30分钟。

反转录反应液的配制：

去除基因组DNA步骤的反应液，10.0μL；

PrimerScriptRTEnzymeMixI，1.0μL；

RTPrimerMixormiRNA29d-3pRTprimer，1.0μL；

5×PrimeScriptBuffer2，4.0μL；

RNaseFreedH2O，4.0μL。

反应程序为：37℃，15min；85℃，5sec；4℃，保存。

4.荧光定量PCR

以18s基因为内参基因进行RT-qPCR，20μL体系参考设计如下：

SYBRGreenMix，10.0μL；

PCRForwardPrimer，0.8μL；

PCRReversePrimer，0.8μL；

DNA模板，2.0μL；

灭菌水，6.0μL。

PCR反应程序：95℃预变性30s；95℃5s；60℃30s；40个循环。

具体引物如下表：

RT-primer:

bta-miRNA29d-3p(F:CTGGAGTAGCACCATTTGAAATCGATTA(序列9)

R:GTGCAGGGTCCGAGGT(序列10)

18SrRNAF:GGACATCTAAGGGCATCACAG(序列11)

R:AATTCCGATAACGAACGAGACT(序列12)

实施例2bta-miRNA29d-3p对奶牛乳腺上皮细胞脂代谢基因的表达与甘油三酯含量的影响

1.bta-miRNA29d-3p对奶牛乳腺上皮细胞脂代谢基因的mRNA的检测。

RNA提取、反转录、荧光定量操作同实施例1。所用引物如下表所示：

如图2A、图2B、图2C结果表明：bta-miRNA29d-3p过表达后，转录因子SREBF1的表达量显著下调，LXRA的表达量显著上调；脂肪酸合成与延长基因ACACA、FASN和ELOVL4的表达量显著下调，甘油三酯合成相关基因DGAT1和GPAM的表达量显著下调；bta-miRNA29d-3p干扰后得到相反的结果。

2.乳腺上皮细胞中甘油三酯的检测

细胞转染操作同实施例1。

去除细胞培养液中的培养基，用PBS润洗细胞三次，每孔加入1mL裂解液，在摇床上裂解30min后，使用细胞刮板将细胞刮下。留取适量的裂解液进行BCA法蛋白定量测定。之后将裂解液在70℃条件下加热10min，室温2000rpm离心5min，取上清用于酶学测定。工作液按4:1比例配制，现用现配。将待测样品以10μL起始加样，37℃或25摄氏度反应10min，反应平衡后颜色在60min内稳定。先用蒸馏水和工作也的空白管调零，然后使用酶标仪在550nm波长检测吸光度。最后构建甘油三酯标准曲线，然后确定样品中甘油三酯的浓度，最后以每mg细胞总蛋白浓度校正甘油三酯含量。

图2D结果表明：当bta-miRNA29d-3p过表达后，奶牛乳腺上皮细胞内甘油三酯的含量显著下调；而当干扰bta-miRNA29d-3p后，甘油三酯含量显著上调。

实施例3bta-miRNA29d-3p与牛ELOVL43’UTR靶位点直接作用的验证

1.bta-miRNA29d-3p-靶基因的预测

采用TargetScan7.1(http://www.targetscan.org/vert_71/)预测bta-miRNA29d-3p的下游-靶基因，结果显示与靶基因中与脂肪酸代谢相关的基因为ELOVL4，结果显示bta-miRNA29d-3p在人(Human)和黑猩猩(Chimpanzee)中较为保守(如图4A所示)。

2.psiCHECK-2-ELOVL43’UTR重组质粒的构建

采用PCR技术扩增牛ELOVL43’UTR片段(855bp)(序列33)，酶切后克隆到双荧光素酶报告基因载体psiCHECK-2vector的XhoI/NotI酶切位点，构建成包含野生型牛ELOVL43’UTR序列的双荧光素酶报告基因载体。(序列34)同时，采用定点突变技术构建了包含突变ELOVL43’UTR序列的双荧光素酶表达载体(序列35)，其中bta-miRNA29d-3p的作用靶位点已经定点突变(图4B)。

3.双荧光素酶报告基因分析

乳腺上皮细胞转染48h后，收集细胞，荧光素酶测定方法参照Promega双报告基因检测试剂盒进行，具体步骤如下：

(1)弃去培养基，使用PBS清洗细胞两遍，最后尽量吸出残留液体。将Promega双报告基因检测试剂盒内的5×PLB裂解液用灭菌水稀释至1×，每孔加入65μL裂解液裂解细胞，由于乳腺细胞的贴壁性较好，所以室温下轻柔震荡30min以上。

(2)在避光的条件下配制LARⅡ溶液，将LARⅡbuffer室温融化后加入到LARⅡ底物中，充分混合均匀，分装到干净的离心管中，并用锡箔纸包裹避光保存，放入-80℃冰箱以备后续使用。

(3)准备用锡箔纸包好的离心管，配制1×Stop&Glo溶液，此溶液为现配现用。将Stop&GloBuffer室温融化，吸取已计算好的体积放入离心管中，加入50×Stop&GloSubstrate配制成1×Stop&Glo溶液，充分混匀后避光待用。

(4)于每孔中吸取5μL细胞裂解液加到96孔不透明检测板中，迅速加入25μLLARⅡ，快速轻柔避光混匀后立即于多功能酶标仪上进行检测，参数设置为读数10s，延迟2s，机器读取的数值即为萤火虫荧光素酶活性值(F值)。

(5)读数完成后立即取出96孔检测板，迅速加入25μL 1×Stop&Glo溶液，轻柔混匀防止溅出并立即检测，此时萤火虫荧光素酶活性终止并且激发了内参海肾荧光素酶活性，参数设置同(4)，读数即为海肾荧光素酶活性(R值)。

(6)相对荧光素酶活性＝R值/F值，即为相对转录活性。

结果表明：当ELOVL43’UTR为野生型时，bta-miRNA29d-3p过表达显著降低了双荧光素酶报告基因表达的活性；当ELOVL43’UTR为突变型时，bta-miRNA29d-3p对双荧光素酶报告基因的表达活性没有影响。由此证明，bta-miRNA29d-3p直接作用于牛ELOVL43’UTR靶位点。(如图4C所示)

以上对本说明书的三个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本说明书的较佳实施例，不能被认为用于限定本说明书的实施范围。凡依本说明书申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本说明书的专利涵盖范围之内。

序列表

<110> 天津市农业科学院

<120> 奶牛bta-miRNA29d-3p在奶牛乳腺上皮细胞脂质积累调节过程中的应用

<141> 2021-03-25

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 序列1(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

uagcaccauu ugaaaucgau ua 22

<210> 2

<211> 88

<212> DNA/RNA

<213> 序列2(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

aucucuuaca caggcugacc gauuucuccu gguguucaga gucuguuuuu gucuagcacc 60

auuugaaauc gauuaugaug uaggggga 88

<210> 3

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 序列3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

uagcaccauu ugaaaucgau ua 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 序列4(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

aucgugguaa acuuuagcua au 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 序列5(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

uaaucgauuu caaauggugc ua 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 序列6(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 序列7(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

cuccgaacga acgugucacg u 21

<210> 8

<211> 52

<212> DNA/RNA

<213> 序列8(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacuagcac ca 52

<210> 9

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 序列9(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 9

ctggagtagc accatttgaa atcgatta 28

<210> 10

<211> 16

<212> DNA/RNA

<213> 序列10(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 10

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 11

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 序列11(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 11

ggacatctaa gggcatcaca g 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 序列12(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 12

aattccgata acgaacgaga ct 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 序列13(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 13

tgtggccctt ggatatggtt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 序列14(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 14

ggttgtcgct gagctctgtg 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 序列15(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 15

aggttctctt ttgttggcat cc 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 序列16(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 16

ttggtcagag ccccagaagt 20

<210> 17

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 序列17(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 17

gcaggtttat ccagtatggc att 23

<210> 18

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 序列18(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 18

ggactgatat cttcctgatc atcttg 26

<210> 19

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 序列19(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 19

ccttcaccac cgttgacttc t 21

<210> 20

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 序列20(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 20

gatacaggct ccactttgat tgc 23

<210> 21

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 序列21(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 21

ccactgggac ctgaggtgtc 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 序列22(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 22

gcatcaccac acaccaattc a 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 序列23(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 23

catgcctacg tctccatcca 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 序列24(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 24

tcaccagttt catcagcatc ct 22

<210> 25

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 序列25(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 25

ccagctgaca gctccattga 20

<210> 26

<211> 15

<212> DNA/RNA

<213> 序列26(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 26

tgcgcgccac aagga 15

<210> 27

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 序列27(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 27

acctcgtgaa ggctgtgact ca 22

<210> 28

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 序列28(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 28

tgagtcgagg ccaaggtctg aa 22

<210> 29

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 序列29(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 29

catcttgtcc gaaacgtcga t 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 序列30(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 30

cccttcgaac atacacctcc a 21

<210> 31

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 序列31(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 31

aagtgggttg caggaggac 19

<210> 32

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 序列32(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 32

ggcagtcggt gtaaaggga 19

<210> 33

<211> 855

<212> DNA/RNA

<213> 序列33(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 33

aaggaactgg gccttacctg gggttgacag tgaggaagtt cccacttcat ttaagatttc 60

agggaaaaca gaagcaaatg agggtttgag ggtggggagc aaaaaggcaa atgtgctcta 120

tgtattatta gtaaccttta gattgagtaa agtgttaaat acaacaccca gatgttttat 180

ttatgaagtt tttattttaa actttttttt tatcagcctt gatgttgtca gactaaagca 240

atcatcacgt gactttggag acccttcccc cgcgcccctc cccctgcatt cacatcaaca 300

gtgcatgaga tttttcattt ctcttcatcc ttcagtgtga tgatcacaga aacatggtct 360

ttatgcattt tttttttttt tttagctaaa ttgcaactta agtactgatg aaaatcagtt 420

accttatctt ttctggtccc aaactgaaaa tgcagatatt ttaaaacgtg cacatttgaa 480

ttcatttgct gactggaatg atcaagtctc tccacctgta gtctgaagat acccttttgg 540

ttggaattaa attttaaaaa tctgatgatc tttgtagact cttagaggct ttatgatgat 600

ggtgttggtg aaaatagaat tacagtaaaa tcctgtccag tggctcaaag ttcactgtga 660

cctgcagcac aaatcactgt gggaaacaat ttttgtgatt aaaaggcagc ctttcaatac 720

tcctgttact actagatata tattatgaaa attaagatta ctgtctgatt ggaacatgaa 780

acaatttatg tgtctactag taacatcata aaatagttct acatttatgt gctgttagaa 840

gagaatatgt tgatt 855

<210> 34

<211> 7095

<212> DNA/RNA

<213> 序列34(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 34

agatctgcgg ccgccagcac catggcctga aataacctct gaaagaggaa cttggttagg 60

taccttctga ggcggaaaga accagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc 120

cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag 180

gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 240

gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 300

cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 360

ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 420

caaaaagctt gattcttctg acacaacagt ctcgaactta agctgcagaa gttggtcgtg 480

aggcactggg caggtaagta tcaaggttac aagacaggtt taaggagacc aatagaaact 540

gggcttgtcg agacagagaa gactcttgcg tttctgatag gcacctattg gtcttactga 600

catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag ttcaattaca gctcttaagg 660

ctagagtact taatacgact cactataggc tagccaccat ggcttccaag gtgtacgacc 720

ccgagcaacg caaacgcatg atcactgggc ctcagtggtg ggctcgctgc aagcaaatga 780

acgtgctgga ctccttcatc aactactatg attccgagaa gcacgccgag aacgccgtga 840

tttttctgca tggtaacgct gcctccagct acctgtggag gcacgtcgtg cctcacatcg 900

agcccgtggc tagatgcatc atccctgatc tgatcggaat gggtaagtcc ggcaagagcg 960

ggaatggctc atatcgcctc ctggatcact acaagtacct caccgcttgg ttcgagctgc 1020

tgaaccttcc aaagaaaatc atctttgtgg gccacgactg gggggcttgt ctggcctttc 1080

actactccta cgagcaccaa gacaagatca aggccatcgt ccatgctgag agtgtcgtgg 1140

acgtgatcga gtcctgggac gagtggcctg acatcgagga ggatatcgcc ctgatcaaga 1200

gcgaagaggg cgagaaaatg gtgcttgaga ataacttctt cgtcgagacc atgctcccaa 1260

gcaagatcat gcggaaactg gagcctgagg agttcgctgc ctacctggag ccattcaagg 1320

agaagggcga ggttagacgg cctaccctct cctggcctcg cgagatccct ctcgttaagg 1380

gaggcaagcc cgacgtcgtc cagattgtcc gcaactacaa cgcctacctt cgggccagcg 1440

acgatctgcc taagatgttc atcgagtccg accctgggtt cttttccaac gctattgtcg 1500

agggagctaa gaagttccct aacaccgagt tcgtgaaggt gaagggcctc cacttcagcc 1560

aggaggacgc tccagatgaa atgggtaagt acatcaagag cttcgtggag cgcgtgctga 1620

agaacgagca gtaattctag gcgatcgaag gaactgggcc ttacctgggg ttgacagtga 1680

ggaagttccc acttcattta agatttcagg gaaaacagaa gcaaatgagg gtttgagggt 1740

ggggagcaaa aaggcaaatg tgctctatgt attattagta acctttagat tgagtaaagt 1800

gttaaataca acacccagat gttttattta tgaagttttt attttaaact ttttttttat 1860

cagccttgat gttgtcagac taaagcaatc atcacgtgac tttggagacc cttcccccgc 1920

gcccctcccc ctgcattcac atcaacagtg catgagattt ttcatttctc ttcatccttc 1980

agtgtgatga tcacagaaac atggtcttta tgcatttttt tttttttttt agctaaattg 2040

caacttaagt actgatgaaa atcagttacc ttatcttttc tggtcccaaa ctgaaaatgc 2100

agatatttta aaacgtgcac atttgaattc atttgctgac tggaatgatc aagtctctcc 2160

acctgtagtc tgaagatacc cttttggttg gaattaaatt ttaaaaatct gatgatcttt 2220

gtagactctt agaggcttta tgatgatggt gttggtgaaa atagaattac agtaaaatcc 2280

tgtccagtgg ctcaaagttc actgtgacct gcagcacaaa tcactgtggg aaacaatttt 2340

tgtgattaaa aggcagcctt tcaatactcc tgttactact agatatatat tatgaaaatt 2400

aagattactg tctgattgga acatgaaaca atttatgtgt ctactagtaa catcataaaa 2460

tagttctaca tttatgtgct gttagaagag aatatgttga tttggccgca ataaaatatc 2520

tttattttca ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgag gatctaaatg agtcttcgga 2580

cctcgcgggg gccgcttaag cggtggttag ggtttgtctg acgcgggggg agggggaagg 2640

aacgaaacac tctcattcgg aggcggctcg gggtttggtc ttggtggcca cgggcacgca 2700

gaagagcgcc gcgatcctct taagcacccc cccgccctcc gtggaggcgg gggtttggtc 2760

ggcgggtggt aactggcggg ccgctgactc gggcgggtcg cgcgccccag agtgtgacct 2820

tttcggtctg ctcgcagacc cccgggcggc gccgccgcgg cggcgacggg ctcgctgggt 2880

cctaggctcc atggggaccg tatacgtgga caggctctgg agcatccgca cgactgcggt 2940

gatattaccg gagaccttct gcgggacgag ccgggtcacg cggctgacgc ggagcgtccg 3000

ttgggcgaca aacaccagga cggggcacag gtacactatc ttgtcacccg gaggcgcgag 3060

ggactgcagg agcttcaggg agtggcgcag ctgcttcatc cccgtggccc gttgctcgcg 3120

tttgctggcg gtgtccccgg aagaaatata tttgcatgtc tttagttcta tgatgacaca 3180

aaccccgccc agcgtcttgt cattggcgaa ttcgaacacg cagatgcagt cggggcggcg 3240

cggtcccagg tccacttcgc atattaaggt gacgcgtgtg gcctcgaaca ccgagcgacc 3300

ctgcagcgac ccgcttaaaa gcttggcatt ccggtactgt tggtaaagcc accatggccg 3360

atgctaagaa cattaagaag ggccctgctc ccttctaccc tctggaggat ggcaccgctg 3420

gcgagcagct gcacaaggcc atgaagaggt atgccctggt gcctggcacc attgccttca 3480

ccgatgccca cattgaggtg gacatcacct atgccgagta cttcgagatg tctgtgcgcc 3540

tggccgaggc catgaagagg tacggcctga acaccaacca ccgcatcgtg gtgtgctctg 3600

agaactctct gcagttcttc atgccagtgc tgggcgccct gttcatcgga gtggccgtgg 3660

cccctgctaa cgacatttac aacgagcgcg agctgctgaa cagcatgggc atttctcagc 3720

ctaccgtggt gttcgtgtct aagaagggcc tgcagaagat cctgaacgtg cagaagaagc 3780

tgcctatcat ccagaagatc atcatcatgg actctaagac cgactaccag ggcttccaga 3840

gcatgtacac attcgtgaca tctcatctgc ctcctggctt caacgagtac gacttcgtgc 3900

cagagtcttt cgacagggac aaaaccattg ccctgatcat gaacagctct gggtctaccg 3960

gcctgcctaa gggcgtggcc ctgcctcatc gcaccgcctg tgtgcgcttc tctcacgccc 4020

gcgaccctat tttcggcaac cagatcatcc ccgacaccgc tattctgagc gtggtgccat 4080

tccaccacgg cttcggcatg ttcaccaccc tgggctacct gatttgcggc tttcgggtgg 4140

tgctgatgta ccgcttcgag gaggagctgt tcctgcgcag cctgcaagac tacaaaattc 4200

agtctgccct gctggtgcca accctgttca gcttcttcgc taagagcacc ctgatcgaca 4260

agtacgacct gtctaacctg cacgagattg cctctggcgg cgccccactg tctaaggagg 4320

tgggcgaagc cgtggccaag cgctttcatc tgccaggcat ccgccagggc tacggcctga 4380

ccgagacaac cagcgccatt ctgattaccc cagagggcga cgacaagcct ggcgccgtgg 4440

gcaaggtggt gccattcttc gaggccaagg tggtggacct ggacaccggc aagaccctgg 4500

gagtgaacca gcgcggcgag ctgtgtgtgc gcggccctat gattatgtcc ggctacgtga 4560

ataaccctga ggccacaaac gccctgatcg acaaggacgg ctggctgcac tctggcgaca 4620

ttgcctactg ggacgaggac gagcacttct tcatcgtgga ccgcctgaag tctctgatca 4680

agtacaaggg ctaccaggtg gccccagccg agctggagtc tatcctgctg cagcacccta 4740

acattttcga cgccggagtg gccggcctgc ccgacgacga tgccggcgag ctgcctgccg 4800

ccgtcgtcgt gctggaacac ggcaagacca tgaccgagaa ggagatcgtg gactatgtgg 4860

ccagccaggt gacaaccgcc aagaagctgc gcggcggagt ggtgttcgtg gacgaggtgc 4920

ccaagggcct gaccggcaag ctggacgccc gcaagatccg cgagatcctg atcaaggcta 4980

agaaaggcgg caagatcgcc gtgtaataat tctagagtcg gggcggccgg ccgcttcgag 5040

cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 5100

aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 5160

ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt 5220

gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg taaaatcgat aaggatccag 5280

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 5340

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 5400

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 5460

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 5520

tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 5580

ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 5640

tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 5700

atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 5760

gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 5820

caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 5880

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 5940

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 6000

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 6060

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 6120

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 6180

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 6240

taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 6300

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 6360

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 6420

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 6480

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 6540

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc 6600

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 6660

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 6720

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 6780

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 6840

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 6900

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 6960

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 7020

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 7080

ctcacatggc tcgac 7095

<210> 35

<211> 7095

<212> DNA/RNA

<213> 序列35(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 35

agatctgcgg ccgccagcac catggcctga aataacctct gaaagaggaa cttggttagg 60

taccttctga ggcggaaaga accagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc 120

cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag 180

gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 240

gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 300

cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 360

ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 420

caaaaagctt gattcttctg acacaacagt ctcgaactta agctgcagaa gttggtcgtg 480

aggcactggg caggtaagta tcaaggttac aagacaggtt taaggagacc aatagaaact 540

gggcttgtcg agacagagaa gactcttgcg tttctgatag gcacctattg gtcttactga 600

catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag ttcaattaca gctcttaagg 660

ctagagtact taatacgact cactataggc tagccaccat ggcttccaag gtgtacgacc 720

ccgagcaacg caaacgcatg atcactgggc ctcagtggtg ggctcgctgc aagcaaatga 780

acgtgctgga ctccttcatc aactactatg attccgagaa gcacgccgag aacgccgtga 840

tttttctgca tggtaacgct gcctccagct acctgtggag gcacgtcgtg cctcacatcg 900

agcccgtggc tagatgcatc atccctgatc tgatcggaat gggtaagtcc ggcaagagcg 960

ggaatggctc atatcgcctc ctggatcact acaagtacct caccgcttgg ttcgagctgc 1020

tgaaccttcc aaagaaaatc atctttgtgg gccacgactg gggggcttgt ctggcctttc 1080

actactccta cgagcaccaa gacaagatca aggccatcgt ccatgctgag agtgtcgtgg 1140

acgtgatcga gtcctgggac gagtggcctg acatcgagga ggatatcgcc ctgatcaaga 1200

gcgaagaggg cgagaaaatg gtgcttgaga ataacttctt cgtcgagacc atgctcccaa 1260

gcaagatcat gcggaaactg gagcctgagg agttcgctgc ctacctggag ccattcaagg 1320

agaagggcga ggttagacgg cctaccctct cctggcctcg cgagatccct ctcgttaagg 1380

gaggcaagcc cgacgtcgtc cagattgtcc gcaactacaa cgcctacctt cgggccagcg 1440

acgatctgcc taagatgttc atcgagtccg accctgggtt cttttccaac gctattgtcg 1500

agggagctaa gaagttccct aacaccgagt tcgtgaaggt gaagggcctc cacttcagcc 1560

aggaggacgc tccagatgaa atgggtaagt acatcaagag cttcgtggag cgcgtgctga 1620

agaacgagca gtaattctag gcgatcgaag gaactgggcc ttacctgggg ttgacagtga 1680

ggaagttccc acttcattta agatttcagg gaaaacagaa gcaaatgagg gtttgagggt 1740

ggggagcaaa aaggcaaatg tgctctatgt attattagta acctttagat tgagtaaagt 1800

gttaaataca acacccagat gttttattta tgaagttttt attttaaact ttttttttat 1860

cagccttgat gttgtcagac taaagcaatc atcacgtgac tttggagacc cttcccccgc 1920

gcccctcccc ctgcattcac atcaacagtg catgagattt ttcatttctc ttcatccttc 1980

agtgtgatga tcacagaaac atggtcttta tgcatttttt tttttttttt agctaaattg 2040

caacttaagt actgatgaaa atcagttacc ttatcttttc tggtcccaaa ctgaaaatgc 2100

agatatttta aaacgtgcac atttgaattc atttgctgac tggaatgatc aagtctctcc 2160

acctgtagtc tgaagatacc cttttggttg gaattaaatt ttaaaaatct gatgatcttt 2220

gtagactctt agcaugacgc gagcucguua ugaagtgaaa atagaattac agtaaaatcc 2280

tgtccagtgg ctcaaagttc actgtgacct gcagcacaaa tcactgtggg aaacaatttt 2340

tgtgattaaa aggcagcctt tcaatactcc tgttactact agatatatat tatgaaaatt 2400

aagattactg tctgattgga acatgaaaca atttatgtgt ctactagtaa catcataaaa 2460

tagttctaca tttatgtgct gttagaagag aatatgttga tttggccgca ataaaatatc 2520

tttattttca ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgag gatctaaatg agtcttcgga 2580

cctcgcgggg gccgcttaag cggtggttag ggtttgtctg acgcgggggg agggggaagg 2640

aacgaaacac tctcattcgg aggcggctcg gggtttggtc ttggtggcca cgggcacgca 2700

gaagagcgcc gcgatcctct taagcacccc cccgccctcc gtggaggcgg gggtttggtc 2760

ggcgggtggt aactggcggg ccgctgactc gggcgggtcg cgcgccccag agtgtgacct 2820

tttcggtctg ctcgcagacc cccgggcggc gccgccgcgg cggcgacggg ctcgctgggt 2880

cctaggctcc atggggaccg tatacgtgga caggctctgg agcatccgca cgactgcggt 2940

gatattaccg gagaccttct gcgggacgag ccgggtcacg cggctgacgc ggagcgtccg 3000

ttgggcgaca aacaccagga cggggcacag gtacactatc ttgtcacccg gaggcgcgag 3060

ggactgcagg agcttcaggg agtggcgcag ctgcttcatc cccgtggccc gttgctcgcg 3120

tttgctggcg gtgtccccgg aagaaatata tttgcatgtc tttagttcta tgatgacaca 3180

aaccccgccc agcgtcttgt cattggcgaa ttcgaacacg cagatgcagt cggggcggcg 3240

cggtcccagg tccacttcgc atattaaggt gacgcgtgtg gcctcgaaca ccgagcgacc 3300

ctgcagcgac ccgcttaaaa gcttggcatt ccggtactgt tggtaaagcc accatggccg 3360

atgctaagaa cattaagaag ggccctgctc ccttctaccc tctggaggat ggcaccgctg 3420

gcgagcagct gcacaaggcc atgaagaggt atgccctggt gcctggcacc attgccttca 3480

ccgatgccca cattgaggtg gacatcacct atgccgagta cttcgagatg tctgtgcgcc 3540

tggccgaggc catgaagagg tacggcctga acaccaacca ccgcatcgtg gtgtgctctg 3600

agaactctct gcagttcttc atgccagtgc tgggcgccct gttcatcgga gtggccgtgg 3660

cccctgctaa cgacatttac aacgagcgcg agctgctgaa cagcatgggc atttctcagc 3720

ctaccgtggt gttcgtgtct aagaagggcc tgcagaagat cctgaacgtg cagaagaagc 3780

tgcctatcat ccagaagatc atcatcatgg actctaagac cgactaccag ggcttccaga 3840

gcatgtacac attcgtgaca tctcatctgc ctcctggctt caacgagtac gacttcgtgc 3900

cagagtcttt cgacagggac aaaaccattg ccctgatcat gaacagctct gggtctaccg 3960

gcctgcctaa gggcgtggcc ctgcctcatc gcaccgcctg tgtgcgcttc tctcacgccc 4020

gcgaccctat tttcggcaac cagatcatcc ccgacaccgc tattctgagc gtggtgccat 4080

tccaccacgg cttcggcatg ttcaccaccc tgggctacct gatttgcggc tttcgggtgg 4140

tgctgatgta ccgcttcgag gaggagctgt tcctgcgcag cctgcaagac tacaaaattc 4200

agtctgccct gctggtgcca accctgttca gcttcttcgc taagagcacc ctgatcgaca 4260

agtacgacct gtctaacctg cacgagattg cctctggcgg cgccccactg tctaaggagg 4320

tgggcgaagc cgtggccaag cgctttcatc tgccaggcat ccgccagggc tacggcctga 4380

ccgagacaac cagcgccatt ctgattaccc cagagggcga cgacaagcct ggcgccgtgg 4440

gcaaggtggt gccattcttc gaggccaagg tggtggacct ggacaccggc aagaccctgg 4500

gagtgaacca gcgcggcgag ctgtgtgtgc gcggccctat gattatgtcc ggctacgtga 4560

ataaccctga ggccacaaac gccctgatcg acaaggacgg ctggctgcac tctggcgaca 4620

ttgcctactg ggacgaggac gagcacttct tcatcgtgga ccgcctgaag tctctgatca 4680

agtacaaggg ctaccaggtg gccccagccg agctggagtc tatcctgctg cagcacccta 4740

acattttcga cgccggagtg gccggcctgc ccgacgacga tgccggcgag ctgcctgccg 4800

ccgtcgtcgt gctggaacac ggcaagacca tgaccgagaa ggagatcgtg gactatgtgg 4860

ccagccaggt gacaaccgcc aagaagctgc gcggcggagt ggtgttcgtg gacgaggtgc 4920

ccaagggcct gaccggcaag ctggacgccc gcaagatccg cgagatcctg atcaaggcta 4980

agaaaggcgg caagatcgcc gtgtaataat tctagagtcg gggcggccgg ccgcttcgag 5040

cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 5100

aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 5160

ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt 5220

gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg taaaatcgat aaggatccag 5280

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 5340

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 5400

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 5460

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 5520

tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 5580

ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 5640

tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 5700

atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 5760

gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 5820

caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 5880

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 5940

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 6000

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 6060

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 6120

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 6180

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 6240

taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 6300

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 6360

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 6420

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 6480

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 6540

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc 6600

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 6660

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 6720

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 6780

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 6840

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 6900

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 6960

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 7020

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 7080

ctcacatggc tcgac 7095

Claims (9)

1.奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p在甘油三酯代谢调节中的应用，其特征在于：所述bta-miRNA29d-3p基因通过过表达实现降低乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量。

2.奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p在甘油三酯代谢调节中的应用，其特征在于：所述bta-miRNA29d-3p基因通过干扰实现提升乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量。

3.根据权利要求1或权利要求2中所述的奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p在甘油三酯代谢调节中的应用，其特征在于：所述bta-miRNA29d-3p基因的成熟体长度为22bp，如序列1所示。

4.根据权利要求3中所述的奶牛bta-miRNA29d-3p在甘油三酯代谢调节中的应用，其特征在于：所述bta-miRNA29d-3p基因的前体RNA序列长度为88bp，如序列2所示。

5.根据权利要求4中所述的奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p在甘油三酯代谢调节中的应用，其特征在于：所述bta-miRNA29d-3p基因的模拟物序列为双链序列，即bta-miRNA29d-3p基因序列和它的互补序列，如序列3、序列4所示。

6.根据权利要求4中所述的奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p在甘油三酯代谢调节中的应用，其特征在于：所述bta-miRNA29d-3p基因的抑制物序列为单链序列，即bta-miRNA29d-3p基因的反向互补序列，如序列5所示。

7.奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p脂肪酸代谢调节中的应用，其特征在于：所述bta-miRNA29d-3p基因通过结合脂肪酸延长代谢通路ELOVL4基因3’UTR，从而实现降低ELOVL4基因的表达量，ELOVL4基因3’UTR的序列如序列表35所示。

8.根据权利要求7中所述的奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p脂肪酸代谢调节中的应用，其特征在于：所述bta-miRNA29d-3p基因的成熟体长度为22bp，如序列1所示。

9.根据权利要求8中所述的奶牛miRNA基因bta-miRNA29d-3p在甘油三酯代谢调节中的应用，其特征在于：所述bta-miRNA29d-3p基因的前体RNA序列长度为88bp，如序列2所示。

Images