CN111334526A - 一种trv2病毒载体及其在突变基因文库中的应用 - Google Patents

一种trv2病毒载体及其在突变基因文库中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111334526A
CN111334526A CN202010217452.0A CN202010217452A CN111334526A CN 111334526 A CN111334526 A CN 111334526A CN 202010217452 A CN202010217452 A CN 202010217452A CN 111334526 A CN111334526 A CN 111334526A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vector
trv2
tomato
als1
library
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010217452.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111334526B (zh
Inventor
刘超超
王琼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu University of Science and Technology
Original Assignee
Jiangsu University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu University of Science and Technology filed Critical Jiangsu University of Science and Technology
Priority to CN202010217452.0A priority Critical patent/CN111334526B/zh
Publication of CN111334526A publication Critical patent/CN111334526A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111334526B publication Critical patent/CN111334526B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8203—Virus mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y202/00—Transferases transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
    • C12Y202/01006—Acetolactate synthase (2.2.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种TRV2病毒载体及其在突变基因文库中的应用，涉及植物蛋白和植物抗除草剂领域；本发明利用TRV2病毒载体构建得到了突变基因文库，同时结合除草剂筛选和病毒侵染两种高效的方式，获得突变体的效率更高。本发明所述突变文库具有更大的灵活性和目标性，也更易于鉴定突变体的突变位点。本发明利用ALS突变型蛋白易于用除草剂筛选的特点，进行突变植株的筛选，将收获的种子催芽、播种后，喷洒除草剂，发生CCA→CTT形式基因突变的幼苗具有除草剂耐受性，可以存活，并且其文库gRNA的靶标基因也以相同的概率发生了突变；收获有除草剂耐受性植株的种子，并自交进行基因型分离，可获得大量的番茄纯合突变体。

Description

一种TRV2病毒载体及其在突变基因文库中的应用
技术领域
本发明属于植物蛋白和植物抗除草剂领域，具体涉及一种TRV2病毒载体及其在突变基因文库中的应用。
背景技术
传统获得突变文库的方法如EMS诱变、辐射诱变等，这些方法在基因组上的突变位点具有极大的不确定性，并且突变效率不高、有益突变太少，使得突变体筛选效率低下、功能基因高效克隆困难大,无法实现真正意义上的定向诱变育种；现代方法的通过遗传转化sgRNA文库等方式，为获得大量的突变体，需要做大量的遗传转化工作，费时费力，且适用范围十分有限，只有在目前已建立完善的遗传转化体系的物种中才能进行，如水稻等。TRV病毒宿主范围广，侵染操作简单方便，结合CRISPR技术使其能实现定向突变，目标性极强，同时结合除草剂筛选方式，极大提高了突变体筛选效率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种TRV2病毒载体及其在突变基因文库中的应用，获得抗除草剂植物突变体效率更高，且更易于鉴定。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种TRV2病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将SEQ ID NO.11所示序列插入到TRV2载体的多克隆位点EcoRI和BamHI之间，得到载体TRV2-GT2；
(2)以Gateway系统的载体pGWB419为模板，扩增得到自杀基因ccdB表达模块，以同源重组方式将ccdB表达模块插入到上述TRV2-GT2载体的BsaI位点处，得到载体TRV2-GT2-ccdB。
优选的，步骤(2)所述扩增的引物包括ccdB-F5和ccdB-R5，其中ccdB-F5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，ccdB-R5的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供了所述构建方法得到的TRV2病毒载体在构建番茄基因敲除文库中的应用。
本发明还提供了一种基于TRV2病毒载体的番茄基因敲除文库的构建方法，，包括以下步骤：人工合成多条靶标gRNA，各靶标gRNA退火为双链后，将全部靶标gRNA等摩尔量混合，形成靶标gRNA文库，将此gRNA文库与经过BsaI酶切过的TRV2-GT2-ccdB载体在T4 DNA连接酶体系中进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5а,涂布LB平板后，收集LB平板的菌落，扩繁并提取质粒，最终获得构建于TRV2载体的基因敲除文库。
本发明还提供了所述构建方法得到的番茄基因敲除文库在获得突变番茄植株中的应用。
本发明还提供了一种获得突变番茄植株的方法，包括以下步骤：利用所述番茄基因敲除文库的农杆菌侵染转基因番茄植株的幼苗。
优选的，所述转基因番茄植株的制备方法，包括以下步骤：(1)扩增番茄抗除草剂基因ALS1，利用点突变的方法将其编码蛋白的第186位氨基酸Pro的编码序列CCA突变为CT，得ALS1CCA→CT；
(2)将所述ALS1CCA→CT与Cas9基因共同构建于双元载体pCAMBIA1300；
(3)将所述双元载体pCAMBIA1300转化至番茄中，得同时过量表达Cas9和ALS1CCA→CT的转基因番茄植株。
优选的，编码所述番茄抗除草剂蛋白ALS1的核苷酸序列为Solyc03g044330
优选的，步骤(1)所述点突变为修改1个碱基同时删除一个碱基A，被删除的碱基A位于一个PAM位点前方第四个碱基处。
优选的，步骤(2)所述双元载体pCAMBIA1300中Cas9由拟南芥pAtUBQ启动子驱动表达，ALS1CCA→CT由35S启动子驱动表达。
本发明提供了一种TRV2病毒载体的构建方法，并基于该病毒载体，创制番茄突变体库，为了筛选到发生突变的植株，利用ALS突变型蛋白易于用除草剂筛选的特点，进行突变植株的筛选。在本发明中使作物具有除草剂抗性的ALS突变型蛋白，将所述ALS突变型蛋白在植物中表达后，可表达蛋白ALS1186Pro→Leu，此蛋白对除草剂具有耐受性，同一载体上的另一条靶向其他番茄基因的文库gRNA则使其靶标基因同时发生相似频率的突变，这些DNA突变通过细胞有丝分裂的方式，传递到生殖细胞，进而传到下一代种子。本发明将收获的种子催芽、播种后，喷洒除草剂，没有发生基因突变的幼苗由于不抗除草剂而枯死，而发生CCA→CTT形式基因突变的幼苗具有除草剂耐受性，因此可以存活，并且其文库gRNA的靶标基因也以相同的概率发生了突变；收获有除草剂耐受性植株的种子，并自交进行基因型分离，可获得大量的番茄纯合突变体。相比于传统的EMS诱变技术，本发明所述方法同时结合除草剂筛选和病毒侵染两种高效的方式，获得突变体的效率更高；同时，还可以构建靶向不同范围的gRNA文库，如特异的靶向某个基因家族、lncRNA或者某个代谢链的全部基因，具有更大的灵活性和目标性，也更易于鉴定突变体的突变位点。
具体实施方式
本发明提供了本发明提供了一种TRV2病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将SEQ ID NO.11所示序列插入到TRV2载体的多克隆位点EcoRI和BamHI之间，得到载体TRV2-GT2；
(2)以Gateway系统的载体pGWB419为模板，扩增得到自杀基因ccdB表达模块，以同源重组方式将ccdB表达模块插入到上述TRV2-GT2载体的BsaI位点处，得到载体TRV2-GT2-ccdB。
本发明步骤(2)所述扩增的引物优选包括ccdB-F5和ccdB-R5，其中ccdB-F5的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.9所示，ccdB-R5的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供了所述构建方法得到的TRV2病毒载体在构建番茄基因敲除文库中的应用。
本发明还提供了一种基于TRV2病毒载体的番茄基因敲除文库的构建方法，包括以下步骤：人工合成多条靶标gRNA，各靶标gRNA退火为双链后，将全部靶标gRNA等摩尔量混合，形成靶标gRNA文库，将此gRNA文库与经过BsaI酶切过的TRV2-GT2-ccdB载体在T4 DNA连接酶体系中进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5а,涂布LB平板后，收集LB平板的菌落，扩繁并提取质粒，最终获得构建于TRV2载体的基因敲除文库。
本发明中，转化入TRV2-GT2-ccdB空载体的大肠杆菌将因为ccdB基因的表达而无法生长(ccdB蛋白对DH5а菌株有毒性，可致死)，而连接了文库sgRNA的载体，由于文库sgRNA替换掉了ccdB模块，即删除掉了载体上的ccdB,使得转化入此重组载体的大肠杆菌能正常生长成菌落，也就是说，LB平板上生长起来的菌落，其细胞内带的都是连接了文库sgRNA的重组载体。
本发明还提供了所述构建方法得到的番茄基因敲除文库在获得突变番茄植株中的应用。
本发明还提供了一种获得突变番茄植株的方法，包括以下步骤：利用所述番茄基因敲除文库的农杆菌侵染转基因番茄植株的幼苗。
本发明所述转基因番茄植株的制备方法，优选包括以下步骤：(1)扩增番茄抗除草剂基因ALS1，利用点突变的方法将其编码蛋白的第186位氨基酸Pro的编码序列CCA突变为CT，得ALS1CCA→CT；
(2)将所述ALS1CCA→CT与Cas9基因共同构建于双元载体pCAMBIA1300；
(3)将所述双元载体pCAMBIA1300转化至番茄中，得同时过量表达Cas9和ALS1CCA→CT的转基因番茄植株。
在本发明中，编码所述番茄抗除草剂蛋白ALS1的核苷酸序列优选为Solyc03g044330。且在步骤(1)中所述点突变为修改1个碱基同时删除一个碱基A，被删除的碱基A位于一个PAM位点前方第四个碱基处。
本发明步骤(2)所述双元载体pCAMBIA1300中Cas9由拟南芥pAtUBQ启动子驱动表达，ALS1CCA→CT由35S启动子驱动表达。
本发明对所述番茄抗除草剂基因ALS1的扩增方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方案设计引物后PCR即可。本发明所述点突变优选为修改1个碱基同时删除一个碱基A，被删除的碱基A位于一个PAM位点前方第四个碱基处。本发明所述PAM位点的序列优选为AGG。
本发明将所述ALS1CCA→CT与Cas9基因共同构建于双元载体pCAMBIA1300。本发明对所述双元载体pCAMBIA1300的构建方法并没有特殊限定，优选的所述双元载体pCAMBIA1300中Cas9由拟南芥pAtUBQ启动子驱动表达，ALS1CCA→CT由35S启动子驱动表达。
本发明将所述双元载体pCAMBIA1300转化至番茄中，得同时过量表达Cas9和ALS1CCA→CT的转基因番茄植株。本发明对所述双元载体pCAMBIA1300的遗传转化方法并没有特殊限定。
本发明构建基于TRV2病毒载体的番茄基因敲除文库，利用所述番茄基因敲除文库的农杆菌侵染所述转基因番茄植株的幼苗，表达ALS突变型蛋白ALS1186Pro→Leu。本发明构建了基于TRV2病毒载体的番茄基因敲除文库，该载体同时表达一条靶向ALS1CCA→CT编码186Pro的gRNA和一条靶向其他番茄基因的文库gRNA，用此TRV2基因敲除文库的农杆菌侵染上述转基因番茄植株的幼苗，幼苗被侵染后，靶向ALS1CCA→CT编码186Pro的gRNA使此无义序列发生碱基插入或缺失等突变，在其PAM位点前第三和第四个碱基之间插入一个碱基T的突变将使ALS1CCA→CT变为ALS1CCA→CTT的有义序列，即186位发生氨基酸替换，成为ALS1186Pro→Leu，此蛋白对除草剂具有耐受性，同一载体上的另一条靶向其他番茄基因的文库gRNA则使其靶标基因同时发生相似频率的突变，这些DNA突变通过细胞有丝分裂的方式，传递到生殖细胞，进而传到下一代种子。
在本发明中，优选将上述得到的种子催芽、播种后，喷洒除草剂，没有发生基因突变的幼苗由于不抗除草剂而枯死，而发生CCA→CTT形式基因突变的幼苗具有除草剂耐受性，因此可以存活，并且其文库gRNA的靶标基因也以相同的概率发生了突变；收获有除草剂耐受性植株的种子，并自交进行基因型分离，可获得大量的番茄纯合突变体。
下面结合实施例对本发明提供的使作物具有除草剂抗性的ALS突变型蛋白及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
以番茄叶片cDNA为模板，用引物ALS1-F(SEQ ID NO.1，ATGGCGGCTGCTGCCTCACC)和ALS1-R(SEQ ID NO.2，TCAATAGGAACATCTCCCATCG)扩增得到番茄抗除草剂基因ALS1(Solyc03g044330)的编码区全长序列，将此片段构建于pMD19-T中间载体(Takara公司,货号D102A),获得载体pMD19-T-ALS1WT；设计一对引入碱基点突变的引物ALS1-Fm(SEQ IDNO.3，TGCTAGGAGGATGATTGGTACTG)和ALS1-Rm(SEQ ID NO.4，CTAGCACTTGACCTGTAATAGCAAC),以质粒pMD19-T-ALS1WT为模板进行PCR扩增，得到环化DNA产物,用DpnI酶消化掉模板质粒后，转化大肠杆菌，Sanger测序验证得到ALS1点突变的载体pMD19-T-ALS1CCA→CT,从而将控制ALS1蛋白功能的第186位氨基酸Pro的编码序列CCA突变为CT(ALS1CCA→CT)，即修改1个碱基并删除一个碱基A，被删除的碱基A位于一个PAM位点(AGG)前方第四个碱基处。
设计引物ALS1-F3(SEQ ID NO.5，ATTTGGAGAGGACAGGGTACCATGGCGGCTGCTGCCTCACC)和ALS1-R3(SEQ ID NO.6，GTCCTTGTAGTCCATGTCGACTCAATAGGAACATCTCCCATCG),以pMD19-T-ALS1CCA→CT为模板，扩增得到点突变的ALS1CCA→CT序列，以同源重组方式插入到载体pCAMBIA1300的35S启动子后面；得到1300-35S::ALS1CCA→CT-terE9,在该载体转录终止子terE9后面紧跟着一个HindIII酶切位点；在我们已有的另一个载体psg-Cas9-At上面，有一段pAtUBQ::SpCas9-tUBQ模块，设计引物Cas9-F4(SEQ ID NO.7，AGGAGTAAAACACTAAGCTTATATTTCACAAATTGAACATAG)和Cas9-R4(SEQ ID NO.8，ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTACATAAACGGTCATTATTTCAC)，扩增此片段，以同源重组方式插入到1300-35S::ALS1CCA→CT-terE9后面的HindIII位点处，形成35S::ALS1CCA→CT-terE9--pAtUBQ::SpCas9-tUBQ串联片段的载体，由此，我们得到了一个由拟南芥pAtUBQ启动子驱动Cas9表达、35S启动子驱动ALS1CCA→CT表达的双元载体，命名为pAC001，然后通过农杆菌介导的叶盘法遗传转化，即通过农杆菌侵染番茄子叶、诱导愈伤分化和再分化成芽的步骤，获得同时过量表达Cas9和ALS1CCA→CT的转基因番茄植株。
构建基于TRV2病毒载体的番茄基因敲除文库。首先，人工合成一段tRNA-sgRNAALS1-tRNA-BsaI-gRNA(SEQ ID NO.11，acGAATTCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAATTACAGGTCAAGTGCTAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAGAGACCATCTAGACGGTCTCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTGGATCCgg)的串联序列，将此序列插入到TRV2载体的多克隆位点EcoRI和BamHI之间，得到载体TRV2-GT2；设计引物ccdB-F5(SEQ ID NO.9，GTTCGATTCCCGGCTGGTGCAGAGACCTCTAGAGTTATCAACA)和ccdB-R5(SEQ ID NO.10，TGCTATTTCTAGCTCTAAAACAGAGACCaattaacccgctgttatcaac),两条引物的5’端各引入一个BsaI酶切位点，以Gateway系统的载体pGWB419为模板，扩增得到自杀基因ccdB表达模块，以同源重组方式将ccdB表达模块插入到上述TRV2-GT2载体的BsaI位点处，得到载体TRV2-GT2-ccdB；人工合成多条(几十至几千条)靶标gRNA(其中正向引物5’端加接头GTGCA，反向引物5’端加接头AAAC),各靶标gRNA退火为双链后，将全部靶标gRNA等摩尔量混合，形成靶标gRNA文库，将此gRNA文库与经过BsaI酶切过的TRV2-GT2-ccdB载体在T4 DNA连接酶体系中进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5а,涂布LB平板后，转化入TRV2-GT2-ccdB空载体的大肠杆菌将因ccdB自杀基因的存在而死亡，因此，LB平板上长出的菌落绝大多数都是连接了靶标gRNA的重组载体，收集LB平板的菌落，扩繁并提取质粒，最终获得构建于TRV2载体的基因敲除文库。在上述T4连接酶体系中，理论上每一条文库gRNA都将以相同的概率连接到TRV2-GT2-ccdB上，因此我们获得的TRV2载体的基因敲除文库可覆盖全部的靶标gRNA。
上述构建好的该载体同时表达一条靶向ALS1CCA→CT编码186Pro的sgRNAALS1和一条靶向其他番茄基因的文库gRNA，用此TRV2基因敲除文库的农杆菌侵染上述转基因番茄植株的幼苗，幼苗被侵染后，靶向ALS1CCA→CT编码186Pro的sgRNAALS1使此无义序列发生碱基插入或缺失等突变，在其PAM位点前第三和第四个碱基之间插入一个碱基T的突变将使ALS1CCA→CT变为ALS1CCA→CTT的有义序列，即186位发生氨基酸替换，成为ALS1186Pro→Leu，此蛋白对除草剂具有耐受性，同一载体上的另一条靶向其他番茄基因的文库gRNA则使其靶标基因同时发生相似频率的突变，这些DNA突变通过细胞有丝分裂的方式，传递到生殖细胞，进而传到下一代种子。
将收获的种子催芽、播种后，喷洒除草剂，没有发生基因突变的幼苗由于不抗除草剂而枯死，而发生CCA→CTT形式基因突变的幼苗具有除草剂耐受性，因此可以存活，并且其文库gRNA的靶标基因也以相同的概率发生了突变；收获有除草剂耐受性植株的种子，并自交进行基因型分离，可获得大量的番茄纯合突变体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure BDA0002424861050000091
Figure BDA0002424861050000101
Figure BDA0002424861050000111
Figure BDA0002424861050000121
Figure BDA0002424861050000131

Claims (10)

1.一种TRV2病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将SEQ ID NO.11所示序列插入到TRV2载体的多克隆位点EcoRI和BamHI之间，得到载体TRV2-GT2；
(2)以Gateway系统的载体pGWB419为模板，扩增得到自杀基因ccdB表达模块，以同源重组方式将ccdB表达模块插入到上述TRV2-GT2载体的BsaI位点处，得到载体TRV2-GT2-ccdB。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增的引物包括ccdB-F5和ccdB-R5，其中ccdB-F5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，ccdB-R5的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。
3.权利要求1或2所述构建方法得到的TRV2病毒载体在构建番茄基因敲除文库中的应用。
4.一种基于TRV2病毒载体的番茄基因敲除文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：人工合成多条靶标gRNA，各靶标gRNA退火为双链后，将全部靶标gRNA等摩尔量混合，形成靶标gRNA文库，将此gRNA文库与经过BsaI酶切过的TRV2-GT2-ccdB载体在T4 DNA连接酶体系中进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5а,涂布LB平板后，收集LB平板的菌落，扩繁并提取质粒，最终获得构建于TRV2载体的基因敲除文库。
5.权利要求4所述构建方法得到的番茄基因敲除文库在获得突变番茄植株中的应用。
6.一种获得突变番茄植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用所述番茄基因敲除文库的农杆菌侵染转基因番茄植株的幼苗。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述转基因番茄植株的制备方法，包括以下步骤：(1)扩增番茄抗除草剂基因ALS1，利用点突变的方法将其编码蛋白的第186位氨基酸Pro的编码序列CCA突变为CT，得ALS1CCA→CT；
(2)将所述ALS1CCA→CT与Cas9基因共同构建于双元载体pCAMBIA1300；
(3)将所述双元载体pCAMBIA1300转化至番茄中，得同时过量表达Cas9和ALS1CCA→CT的转基因番茄植株。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，编码所述番茄抗除草剂蛋白ALS1的核苷酸序列为Solyc03g044330。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤(1)所述点突变为修改1个碱基同时删除一个碱基A，被删除的碱基A位于一个PAM位点前方第四个碱基处。
10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤(2)所述双元载体pCAMBIA1300中Cas9由拟南芥pAtUBQ启动子驱动表达，ALS1CCA→CT由35S启动子驱动表达。
CN202010217452.0A 2020-03-25 2020-03-25 一种trv2病毒载体及其在突变基因文库中的应用 Active CN111334526B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010217452.0A CN111334526B (zh) 2020-03-25 2020-03-25 一种trv2病毒载体及其在突变基因文库中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010217452.0A CN111334526B (zh) 2020-03-25 2020-03-25 一种trv2病毒载体及其在突变基因文库中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111334526A true CN111334526A (zh) 2020-06-26
CN111334526B CN111334526B (zh) 2022-09-30

Family

ID=71179198

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010217452.0A Active CN111334526B (zh) 2020-03-25 2020-03-25 一种trv2病毒载体及其在突变基因文库中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111334526B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004768A (zh) * 2014-05-07 2014-08-27 合肥工业大学 一种能够提高番茄果实营养品质的猕猴桃基因及其应用
CN106434689A (zh) * 2016-08-02 2017-02-22 周口师范学院 一种植物抗病必需基因ShORR‑1及其应用
CN107365793A (zh) * 2017-06-19 2017-11-21 百格基因科技（江苏）有限公司 一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法
CN107475256A (zh) * 2017-08-01 2017-12-15 西南大学 一种基于内源tRNA加工系统的多靶序列sgRNA表达载体及其在植物基因编辑中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004768A (zh) * 2014-05-07 2014-08-27 合肥工业大学 一种能够提高番茄果实营养品质的猕猴桃基因及其应用
CN106434689A (zh) * 2016-08-02 2017-02-22 周口师范学院 一种植物抗病必需基因ShORR‑1及其应用
CN107365793A (zh) * 2017-06-19 2017-11-21 百格基因科技（江苏）有限公司 一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法
CN107475256A (zh) * 2017-08-01 2017-12-15 西南大学 一种基于内源tRNA加工系统的多靶序列sgRNA表达载体及其在植物基因编辑中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SUNG UN HUH: "Nicotiana tabacum Tsip1-Interacting Ferredoxin 1 Affects Biotic and Abiotic Stress Resistance", 《MOLECULES AND CELLS》 *
肖素勤: "用于通路（Gateway）克隆技术的植物表达载体研究进展", 《植物科学学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111334526B (zh) 2022-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lu et al. Precise editing of a target base in the rice genome using a modified CRISPR/Cas9 system
CN110157726B (zh) 植物基因组定点替换的方法
US10487336B2 (en) Methods for selecting plants after genome editing
US11767536B2 (en) Method for obtaining glyphosate-resistant rice by site-directed nucleotide substitution
WO2018098935A1 (zh) 一种用于植物基因组定点碱基替换的载体
CN110951743B (zh) 一种提高植物基因替换效率的方法
Li et al. Development of an Agrobacterium-mediated CRISPR/Cas9 system in pea (Pisum sativum L.)
CN113396818B (zh) 一种利用多倍体杂种优势的植物育种方法
CN108026540A (zh) 抗白粉病的小麦植物
Santoso et al. Targeted mutation of GA20ox-2 gene using CRISPR/Cas9 system generated semi-dwarf phenotype in rice
CN111100852B (zh) OsALS1的定向突变及农作物内源基因定向进化的方法
US20200216856A1 (en) Plant germplasm resistant to rna viruses
CN116179589B (zh) SlPRMT5基因及其蛋白在调控番茄果实产量中的应用
CN108676812B (zh) 一种利用CRISPR/Cas9系统突变OsHXK1获得产量提高植株的方法
CN111334526B (zh) 一种trv2病毒载体及其在突变基因文库中的应用
US20230265447A1 (en) Delivery of developmental regulators to plants for the induction of meristematic tissue with genetic alterations
Li et al. Creating large chromosomal deletions in rice using CRISPR/Cas9
US20200340009A1 (en) Cenh3 deletion mutants
CN114438056B (zh) CasF2蛋白、CRISPR/Cas基因编辑系统及其在植物基因编辑中的应用
CN113817033B (zh) ZmELF3.1蛋白及其功能缺失突变体在调控作物气生根数目或层数的应用
CN110951742B (zh) 一种不产生dna双链断裂的实现植物基因替换的方法
CN112195187B (zh) 一种水稻分蘖角度调控基因及其编码的蛋白和应用
CN110951772B (zh) 水稻OsPPR2-1基因在构建自然条件下育性提高的植株中的应用
US20210348177A1 (en) Generation of heritably gene-edited plants without tissue culture
WO2023129099A1 (en) Developing orobanche (orobanche spp., phelipanche spp.) resistance in tomato (solanum lycopersicum), using gene editing technology (crispr)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant