CN103571840A - 启动子PgpdP及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种启动子，特别是一种扩展青霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子以及所述启动子的用途。本发明所述启动子具有SEQID NO：1所示的核苷酸序列，或其具有启动子功能的变体。本发明还涉及含有所述启动子的核酸构建体、载体、重组细胞和转基因工程菌。本发明还涉及所述启动子用于调控真菌中目的基因表达的用途。本发明的启动子可启动目的基因在真菌菌丝体中高效表达，特别是在扩展青霉菌丝体中有较高的活性。

Description

启动子PgpdP及其用途

技术领域

本发明涉及一种启动子，特别是涉及一种来源于扩展青霉的启动子PgpdP及其在调控真菌中目的基因表达中的应用。

背景技术

近年来，脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)在工业应用方面取得了很大进展。碱性脂肪酶具有对底物水解效率高、反应温和、无毒、能在一定条件下水解脂肪等优点，已经在洗涤剂、造纸、制革、食品、纺织及轻工业等领域得到广泛的应用，并已经成为全世界酶制剂市场上重要的品种。脂肪酶可以从动物、植物提取，也可以由多种微生物产生。由于微生物脂肪酶种类多，来源广，周期短，具有比动物、植物脂肪酶更广的pH、作用温度，更多的专一性类型底物，便于工业化生产和提纯，所以在酶的理论研究和实际应用中有更重要的作用。基于微生物脂肪酶的众多优点，人们一直期望获得产脂肪酶能力强的微生物菌株。在现有的技术中，通过对大量的微生物菌种进行选育，已经获得了一种产碱性脂肪酶能力较强的扩展青霉(P.expansium)菌株，并经过多年的诱变育种和发酵工艺改进，其产脂肪酶的能力已经得到大幅度的提高。但是，传统的菌株育种方法主要依靠随机的理化诱变，目标不明确，费时费力，而且收效不明显，目前通过采用这些方法来提高该菌株产脂肪酶的能力已经非常困难。因此，基于同源表达技术之上的遗传工程改良将是进一步提高扩展青霉产脂肪酶能力的高效手段。

启动子是基因转录单元的一个组成部分，通常位于结构基因5′端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的的一段DNA序列。启动子能够指导RNA聚合酶全酶同模板正确结合，启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。选择高效的启动子是进一步提高扩展青霉产脂肪酶能力的有效手段。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPD，EC1.2.1.12)是生物体内糖酵解和糖异生过程中的关键酶，其生理功能是在NAD⁺和无机磷酸存在的条件下催化甘油醛-3-磷酸氧化磷酸化，生成1，3-二磷酸甘油酸，是维持生命活动最基本的酶之一。真菌中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶是一个由四个相同的亚基组成的四聚体蛋白，并且在真核细胞中高效表达，如在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中其含量可达细胞内可溶性蛋白的5％，在酵母中其mRNA的量占总RNA量的2～5％，如此高的mRNA表达量以及蛋白积累说明甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子非常活跃，这一结果已在酿酒酵母(S.cerevisiae)，毕赤酵母(Pichia Pastoris)，卷枝毛霉(Mucor circinelloides)和金针菇(Flammulian velutipes)中得到了证实。在真菌的遗传转化载体构建中，gpd启动子通常被认为是表达异源基因的理想候选启动子；虽然使用异源甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子构建表达载体非常普遍，但是载体上的基因在某些真菌受体中也有不表达的情况发生。因此，人们希望使用内源启动子以期载体上的基因在受体中高效表达。

经过对现有技术的文献检索发现，Moralejo，F.J.等在《Applied andEnvironmental Microbiology》1999年第3期1168-1174页发表了题为《Thaumatin production in Aspergilus awamori by use of expressioncassettes with strong fungal promoters and high gene dosage》一文，文中评述，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的pcbC启动子或产黄头孢霉(Acremonium chrysogenum)的B2启动子构建不同的表达盒在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中表达时，表达产量分别为7.7mg/L和1.6mg/L，相反，如果换用泡盛曲霉自身的启动子时，表达产量能达到11mg/L。这表明，同种特异性的启动子具有更好的启动表达效果。

由上所述，发明一种同源启动子是提高扩展青霉产脂肪酶能力的高效手段，但是，到目前为止，扩展青霉菌中并未有相关的高效启动子的报道，这让同源表达技术难以在该菌株的遗传改良中得以应用。

发明内容

本发明针对现有扩展青霉中无高效启动子的情况，提供一种启动子，特别是一种扩展青霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子以及所述启动子的用途，所述启动子可启动目的基因在真菌菌丝体中高效表达，特别是在扩展青霉菌丝体中有较高的活性。

本发明的一个方面涉及一种能够高效启动目的基因表达的启动子，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：

a、SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

b、与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列；

c、在严格条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；所述SEQ ID NO：1的序列如下：GTCGACGCGTCTTCGAGGGGCAGTTTTCATCGAGTAACTCATCGCTCGTATCGCATGACCACTCTCGCACGAGATGATTTCTAAGCCAGCAATGAGAGGAGTCATAATCCCACTAACCTGCAGACCAGCCTTTGCGCTGTGAGACTTTTGCGCCTTCCCCG CAG CATCACCCTTTCCGCCCTTTCCACCGATAGACTTTCCCTTTCCGCCAGGCATTGCGAAATAAATGTGCGAAGACGGTCGCAGAAGTAGATATAGCAGATAGAAACAGAAACCAAGACGATTTGGTAGTGGTGTGGATGTGGAGACGATTCAGGGTGCGGAAGATACGCGTGTTGTTGATGGATGGAGAAGTCAGAATGTGCCTGGCGCCGGGTGTGCCAAAAAGACACTTGGCGCTAGTCCCAAAATGGAAGCGTCCTTTCTCACAGCGTTGGGGGTTCTTGGCTGTATATACGGCCACCCGCAGGACCATTGGGATCATCTAGAAATTAGTTGCTGCAGAGGTTATCAATTTATTTCGTTTCTTTCTCTTTCGTTCTCTTCCTGAAAAAAAATAGAGAAGACATGGTTAGTTGTGGCATGCGAGGAGACCATGACGGAAGCCAGTGCGCCTTCAGCTGGCTGGAGGGAATGGATGCCTCCGGCATCTATGGCTAGGATTCATATATGAAGCTCCTGTAGTTGCCATAATACACACCATTGTGCAGCTTCAAGTTAAAATGCAAGTCCACTGATGTGGTGGTTGCTG ACCTTTTGCACAATAAGCTGGTCTGGTTTGAAGCTGGACCATCACAGTTCCCAGCTATGACCAACGGGGAGGTCACATGATCTGTTGCCTCAAAGGTCAGGCGACAAACCCCTAACGCCTCAGACGACCAGATGGCGAATAGATAGCGCCGGAATATCATTTTATCCGGATCCCTGACCTTCCAGAAATGCCAGGTGGCCCGCGACTTTCAAGTTTCGTTCGCGTTGTACTCCCCCATACTCAACGATTTCTCCATATCGAATAGTATCCGGCAAAATGGTGTCTCCTCAAATGTATGCTTGATGGAAAAATTTTCTGATTTCAAATACAAACTCTATCGTTTACGGAAACTGACAATGGTCGCACAGTACCAACCTCGCCATCATCTTGGTGATGATGCAGCTGGCCAAGAAGGTTCCTTTTGAGGATCCTCAGGTCCTGATGTTGGTGCGCGGATGCTACATCTTGTCCAATGTCCTCATCCTGGCTGTCCACCTATACACCCAGTTTAAGATCAACCAAAAGAAGGGTATGTCGATCGCGTGCTCTCTCCCCACAATAGCCAAAAACTAACTGCGATACCCTCTAGACATGACAACCCTCAAGTACGTTGAGCCCGCCGCGATGGGTAGCACCGAGGAGCCCAAGCCCGTGACCACCACCAACATGGACTACGACAAGGCTCAGCTGCGCCAGCTGCTCCGCAGCCAGCTTATGGGTGTCGGCATGATGGGTGTGATGCACCTGTACTTCCAGTACACCAACCCCCTCCTCATCCAGTCGATCATCCCCCTCAAGGGCGCCTTCGAGTCCAACCTGGCCAAGATCCACGTCTTCGGAAAGCCCGCTACTGGTGATCTCGCTCGTCCCTTCAAGGCCGCTGGTGGCTTCATGTCCCAGGGTGGACCCAAGAGCGACAAGGCCTCCATTGAGGCTGCCGAGAAGAACTGGCGTGGTGGTGTTAAGGAGGAATAAATGCAAATGCCGGGTTGCTCTAGGCCATCAATTGATATTTCCCCTCATGGGTCATCGATGGCCGATTTGAATGATAGCACGCTGTTCATTTCTCCCCTTTGTACCATAATCCATAATTCATCCTATCAAGTCCAGACCGTCCATCCTTTCTGGGTAAGGTCTGAACTATATTGTTAATCTGTGTGAAATCCCTCTGGTCATGCCATTTCCCCTATATTGTATGATCTAACTCCTGTACAAAAGGACGTTCAGTCATGGCACCTCTCTGGAGATTGCGCCACTGATATGTCGGCTCCGAGATGCATGCTGATATGGCCTGATGAGAGGTCTCATAGATAACCTAGCTCAGGGATTATCCATGAGGTTCATGTAGGGGGTGTTCGTGATTCGTCCATGAGTGCCGTTGAGGCAAAACAAAGGATTGATAATCCAGTCCTCGAGCCCTGGTAGGGCTTCCAAGGTTAGAATATTGGGGACCCCAGTACTTTAAACCCCTCAAAAGCACGACTAATTCGAATAATTCCCAAACAGAAAAATCCAATAAAACCCCCCCAAAAAAGTCTGCCAGATCCCGTGGTCCCATGTTGAGATACCGGTGACTCCTTTGAGGGCGGGAGCCACCAAGCTATATCACCCATACTCAATCCGTCCACCGCAGGGGTTTGAACAACACGGTTGGCCCGCATAAGTGGAGGAATACAGCATGTTATGTACAAAGTAGTTAGAAGGTCAATAAATCAAATGGTTTATATTAATTCTATCATTTTTAACTGGATGATTTTTTTGCCTGCACCTGCTCCATAATACCCAAGGTACATAGCCCTCCAGAGCTGGTATGTTTTGCCCCTCCATATTGCCCCTCCAAAACTACATCATAGTTCTTTTAGTCAACCACCTCGGGAATCATTTCAATTCCGTACCTCAGATTATCGTGATCATCTCCGTTGTACCCGAGTAGACACCGAATAGGCAAAATATTCAAGAGAAAGCTCCGAAGAAGAGTAACAACCCGAGCAGTTGGAGTTTAGTGGATTCCTATTGGTAGACGGGAGCTACCGAGGGGCAGAGGAAGGCCCCAATATCGTGACTCTTCCTGATTTCCCCGGTGTATGAAACCGGAAATGCGTTGCCGGGCAGATGTACGAGCGGCAACAGTCGGGAAATCTAGTTCGGTCTGTGTGCTGTAGAGTGCACGAAAGAGAATATGTGAGAGTCCCCGTCCGTCTCTTCGGTGAGGGGTGATCTGTCCATTGCGTCAGTCATCCATTCATTAATCCTCCCCCTCCCCCAGATCTTCTTTTTTTTTTCTTCTCTTCTTTCTCCATCCCAATTCTCCCCTTTCATCAATTACTTCACTATTACAGTAAGTTGATCATCCTCTTATCATCCATCACTTTTTAACACAAGCTAACAGCTTCCAGTAAACCGCAATC(SEQ ID NO：1)。

本发明中，将SEQ ID NO：1所示的启动子称为启动子PgpdP。

带有该启动子和β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因的扩展青霉菌经GUS染色后，所述扩展青霉菌变为蓝色。

典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5～10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10～20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20～25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验手册，Cold Spring HaborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

本发明中，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适条件为：在6×SSC、0.5％SDS溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。

本发明中，所述在严格条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

本发明中，所述的对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5′端和/或3′端，和/或序列内部进行例如不超过2～45个，或者不超过2～30个，或者不超过3～20个，或者不超过4～15个、或者不超过5～10个，或者不超过6～8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。

本发明中，所述的对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行上述一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQ IDNO：1的参考核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指：在SEQ ID NO：1的参考核苷酸序列之每100个核苷酸序列中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多于参考序列之总核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5％。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5′或3′的末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。

本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心(NC BI)为公众所获得。

本发明中，所述与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：1所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本发明所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90％序列同一性、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。

本发明中，所述与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

本发明的另一方面还涉及一种核酸构建体，其包含本发明所述的启动子，与启动子可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。本发明的一个实施方案中，所述基因为GUS基因。

本发明的另一方面还涉及一种载体，所述载体含有本发明所述的核苷酸序列或核酸构建体，所述载体可以通过例如将上述核苷酸序列或核酸构建体插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。

本发明的实施方案中，所述载体为本发明的启动子或启动子与GUS基因可操作连接的核酸构建体与pMD18-T 或pCHAMBIA2302::Ppel-GUS-TtrpC质粒经重组得到的重组载体pMD 18-T::PgpdP或pCHAMBIA2302::PgpdP-GUS-TtrpC。

本发明的另一方面还涉及一种含有本发明所述载体的重组细胞，所述重组细胞可以通过将含有本发明所述的载体转化至宿主细胞而得到。

适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如：大肠杆菌细胞、根癌农杆菌细胞EHA105等。

本发明的一个实施方案中，所述重组细胞为重组农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105-PgpdP。

本发明的一方面还涉及一种转基因工程真菌，所述转基因工程真菌转化有本发明的启动子和/或核酸构建体和/或载体和/或感染本发明的重组细胞。

本发明的一个实施方案中，所述转基因工程菌为转基因工程扩展青霉菌。

本发明的一方面还涉及用于扩增本发明所述启动子的引物对，所述引物对的两条引物分别含有序列CAGCGTAGTGAGTCTCAATGA(SEQID NO：4)和CGTTGACAGCGACAACCTC(SEQ ID NO：5)，或者分别含有序列GATGGCCTAGAGCAACCCGGCATTTGC(SEQ ID NO：6)和TCCTCCTTAACACCACCACGCCAGTTC(SEQ ID NO：7)，或者分别含有序列GTCGACGCGTCTTCGAGGGGCAGTTTT(SEQ ID NO：8)和ACTAGTGATTGCGGTTTACTGGAAGCT(SEQ ID NO：9)。

本发明的一方面还涉及制备SEQ ID NO：1所示的启动子的方法，包括以扩展青霉基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在扩展青霉基因组DNA中的序列分别针对首尾进行设计，例如为本发明所述的引物对。

本发明一方面还涉及一种调控真菌中目的基因表达的方法，所述方法包括将本发明所述的启动子或核酸构建体或载体或重组细胞导入真菌的步骤。

本发明的一个实施方案中，所述目的基因为GUS基因，所述真菌为扩展青霉。

本发明的一个实施方案中，将含有重组载体的pCHAMBIA2302::PgpdP-GUS-TtrpC的重组农杆菌EHA105-PgPdP转化入扩展青霉菌中，扩展青霉菌株经GUS染色证明GUS基因已表达。

为实现上述调控目的基因的表达，本发明所述启动子可以以单拷贝和/或多拷贝的形式应用，也可以与现有技术中已知的启动子联用。

本发明中，可采用农杆菌介导转化法将目的基因导入真菌中。基因转化后，采用通用的方法来筛选整合有表达单元的菌株。

本发明一方面还涉及一种制备转基因工程菌的方法，包括在有效条件下培养本发明的转基因工程真菌。

本发明一方面还涉及本发明的启动子或核酸构建体或载体在调控真菌中目的基因的表达中的用途；所述目的基因为GUS基因，所述真菌为扩展青霉。

本发明的有益效果是：区别于现有扩展青霉中无高效启动子的情况，本发明的启动子可启动目的基因在真菌菌丝体中高效表达，特别是在扩展青霉菌丝体中有较高的活性。

附图说明

图1是获得本发明启动子的示意图；

图2是启动子和部分基因的序列示意图；

图3是pCHAMBIA2302::Ppel-GUS-TtrpC表达载体示意图；

图4是经转化的扩展青霉菌株的GUS染色结果；其中，重组农杆菌EHA105-pCHAMBIA2302::PgPdP-GUS-TtrpC转化的扩展青霉菌株(图4B)经GUS染色后呈现蓝色；野生型扩展青霉菌株(图4A)经GUS染色后颜色未发生变化。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但是并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

扩展青霉菌株从中国药用微生物菌种保藏管理中心购买(Center forculture collection of pharmaceutical microorganisms，CPCC)，保藏编号为CPCC460013。购买后，接种在PDA斜面培养基上，在26℃条件下培养20天，然后保存于4℃冰箱。

大肠杆菌DH5α菌株已在《刘静华，包英华，陈燕飞；大肠杆菌DH5α感受态细胞转化率的改进，韶关学院学报，2008，29(03)：87-90》文献中公开。大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞可通过供应商天根生化科技(北京)有限公司购买，货号CB101-03。

根癌农杆菌EH A105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心Biovector Science Lab购得，货号为Biovector-375。

实施例一：PgpdP启动子的片段的扩增

1、扩展青霉的培养

将保藏在试管斜面上的扩展青霉放至28℃活化24h，挑取试管斜面菌株的菌丝体至含有马铃薯综合培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)平板上，28℃恒温培养7天。将1cm²左右的生长在PDA平板上的菌种接至PDA液体培养基，在28℃，250rpm条件下培养3天，然后12000rpm/min离心收集菌丝体。

2、扩展青霉DNA的分离

采用高盐低pH法提取基因组DNA，包括以下步骤：

1)将1g左右的经液氮研磨的样品放入65℃预热的提取缓冲液(100mmol/L NaAc，pH4.8；50mmol/LEDTA-Na₂，pH8.0；500mmol/L NaCl；2％PVP；2％SDS；调节最终pH至5.5)，放入65℃水浴保温30min，缓慢振摇，25℃下，10000×g离心10min；

2)吸取上清液，并在试管中加入约为上清液体积2/3的2.5mol/L的KAc高盐溶液，混匀后置于0℃保持30min沉淀蛋白质；

3)在4℃下10000×g离心10min，弃蛋白质沉淀。上清液加入由氯仿和异戊醇按照24∶1的体积比配成的等体积的氯仿和异戊醇的混合物抽提，在6000×g离心10min，取出水相转入另一离心管，如果中间层仍有白色沉淀，则再用由氯仿和异戊醇按照24∶1的体积比配成的氯仿和异戊醇的混合物抽提一次；

4)在上清液中加入约为上清液体积2/3的预冷异丙醇，混匀后置于-20℃静置30min，以沉淀核酸，重复一次，用体积比为70％乙醇清洗沉淀，在空气中干燥50min，将DNA沉淀溶解在TE缓冲液中，分装存放于-20℃或者4℃冰箱中保存。

3、扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gpd)的克隆

在分析已报道的丝状真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的氨基酸序列(XP_002568470.1，AE199245.1，AEI99245.1)的基础上，根据保守的氨基酸序列设计简并引物：gpd-F：5′-3′为正向引物：GTYGTCGCTGTCAACGACCCC  Y(C/T)(SEQ ID NO：2)；gpd-R：5′-3′为反向引物：GACVAGCTTGATGAAGTTGG  V(A/G/C)(SEQ IDNO：3)，以扩展青霉基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：预变性94℃5min，循环设定：94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为850bp。然后按照常规方法对PCR扩增产物进行克隆、测序。测序结果使用NCBI的BLAST软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，结果显示其核酸序列与已知的菌等的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的同源性很高，因此证明它是一个gpd基因。

4、扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的克隆

利用染色体步移技术克隆甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子，具体使用的试剂盒是Universal GenomeWalkerTM Kit(Clontech，USA)，其操作包括基因组步移文库的构建及巢式PCR扩增。

4.1基因组步移文库的构建。

1)将基因组DNA稀释到0.1μg/μL，按照如下体系酶切基因组DNA：

25μL扩展青霉基因组DNA

8μL内切酶(10U/μL)Dra I或EcoR V或Pvu I或Stu I

10μL 10×buffer

57μL ddH₂O

2)先轻柔混匀，放置在37℃，2小时，之后再充分混匀一次，37℃过夜酶切；

3)在1％的琼脂糖胶上跑5μL看酶切效果；

4)每管中加入95μL酚，混匀10s；

5)12000 rpm，1min，室温；

6)小心吸上清至新的1.5rmL管子中，再加入95μL氯仿，混匀10s；

7)12000 rpm 1min，室温；

8)小心吸上清至新的1.5mL管子中，每管中加入190μL冰冷的95％乙醇，9.5μL 3M NaAc  (pH 5.2)，及2μL glycogen(10ug/μL)；

9)混匀后14000rpm离心15min，4℃；

10)弃上清，并用100μL冰冷的80％乙醇洗沉淀；

11)14000rpm，离心10min；

12)弃上清并干燥沉淀；

13)加入20μL TE(10/0.1，pH7.5)；

14)振荡使DNA悬浮起来；

15)配制如下连接体系：

4μL酶切好的DNA

1.9μL GenomeWalker Adaptor(25μM)

1.6mL 10×ligase buffer

1.71μL T4DNA 连接酶(6U/μL)

16)16℃连接过夜；

17)70℃5min终止连接；

18)每管加入72μL TE(10/0.1，pH 7.5)；

19)混匀储存在-20℃备用。

4.2巢式PCR扩增启动子片段

本实施例使用Advantage 2 Polymerase Mix Kit(Clontech)扩增扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子序列：第一轮PCR体系：40μL双蒸水，5μL 10×Advantage 2 PCR Buffer，1μL dNTP  (10mM each)，1μL AP 1(10μM)，1μL Advantage 2Polymerase Mix  (50×)，1μL基因特异引物GSP1：5′-CAGCGTAGTGAGTCTCAATGA-3′(SEQ IDNO：4)10μM，1μL DNA library，总体积为50μL。PCR程序：7个循环94℃ 25s 72℃3min，32个循环94℃25s  67℃ 3min，1个循环67℃ 7min。第一轮PCR反应的产物取2μL，稀释到98μL水中，然后取1μL作为第二轮PCR扩增的底物。第二轮PCR体系：40μL的双蒸水，5μL 10×Advantage 2PCR Buffer，1μL dNTP(10mM each)，1μLAP2(10μM)，1μL Advantage 2 Polymerase Mix(50×)，1μL基因特异引物GSP2：5′CGTTGACAGCGACAACCTC-3′(SEQ ID NO：5)10μM，1μL第一轮PCR产物，总体积为50μL。PCR程序：7个循环94℃ 25s 72℃ 3min，27个循环94℃ 25s 67℃3min，一个循环67℃7min。扩增到的片段回收并测序，获得一个1700 bp的DNA片段F1。在F1片段的5′端设计基因特异引物GSP3：5′-GATGGCCTAGAGCAACCCGGCATTTGC-3′(SEQ ID NO：6)和GSP4：5′-TCCTCCTTAACACCACCACGCCAGTTC-3′(SEQ ID NO：7)，利用上述的染色体步移技术进一步克隆扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子的5′侧翼序列。将扩增片段回收并测序，获得另外一个1700 bp的片段F2。

将F1和F2的序列进行对比和拼接，得到长度为3384bp的5′侧翼片段，对该序列进行分析，鉴定出基因的起始密码子ATG，去除结构基因的部分，获得基因的5′端调控序列F3。F1、F2和F3的发现流程，请参见图1。F3和部分基因序列见图2。

在拼接的启动子序列两端设计特异引物组合：PgPdPF/PgPdPR。PgpdPF：5′-GTCGACGCGTCTTCGAGGGGCAGTTTT-3′(SEQ  IDNO：8)；PgpdPR：5′-ACTAGTGATTGCGGTTTACTGGAAGCT-3′(SEQID NO：9)，利用扩展青霉基因组DNA为模板，用PgPdPF/PgpdPR进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接到质粒pMD18-T(宝生物工程有限公司，D103A)上，并进行测序验证。结果表明，PCR产物的长度为3158bp，如SEQ ID NO：1所示。将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列命名为PgpdP。

将获得的3158bp的启动子序列提交GenBank，进行BALST对比分析，没有发现任何的同源序列，说明所得到启动子是新发现的DNA分子。

实施例二：重组载体pMD18-T::PgpdP的构建

1、连接

用pMD-18T载体试剂盒将PgpdP连接pMD-18T载体。连接反应体系见表1。

表1 连接反应体系

成分	体积
		PgpdP片段	4μL
pMD-18T载体	1μL
		Solution I	5μL
总共	10μL

将各成分按照上述条件加在一起，混匀至于4℃条件下过夜连接。

2、转化大肠杆菌DH5α

(1)将5～10μL DNA的连接物加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30分种；42℃水浴中热激90s，迅速取出立即放于冰上放置2min；

(2)加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃ 180rpm培养1～2h左右至菌复苏；

(3)复苏后取200μL的菌液涂布于含氨苄抗生素(100μg/mL)的LB固体培养基，置于37℃恒温培养箱倒置培养12～18h，等待转化子长出。

3、大肠杆菌转化子的PCR检测

对长出的转化子进行PCR鉴定。随机挑选几株转化子，以M13+(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，SFQ ID NO：10)作为正向引物；以M13-(GAGCGGATAACAATTTCACACAGG，SEQ ID NO：11)作为反向引物，对挑选的菌株进行PCR鉴定，选PCR检测阳性的菌株送上海Invitrogen公司测序。

4、质粒pMD18-T::PgpdP的获得。选择测序正确的菌株进行进一步的扩繁，抽提质粒，所得的质粒即为pMD18-T::PgpdP。

实施例三：重组载体pCHAMBIA2302::PgpdP-GUS-TtrpC的构建

1、在37℃条件下用限制性内切酶Sal I和Spe I酶切实施例二制备的pMD18-T::PgpdP，回收酶切产物(PgpdP)；

2、在37℃条件下用限制性内切酶Sal I和Spe I酶切表达载体pCHAMBIA2302::Ppel-GUS-TtrpC，获得去除Ppel  序列的pCHAMBIA2302::GUS-TtrpC载体骨架，pCHAMBIA2302::Ppel-GUS-TtrpC表达载体示意图请参见图3。

3、将步骤1酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到最终载体，进行测序验证，测序结果表明，得到的最终载体pCHAMBIA2302::PgpdP-GUS-TtrpC(用SEQ ID NO：1所示的PgpdP取代了pCHAMBIA2302::Ppel-GUS-TtrpC的Sal I和Spe I酶切识别位点间的片段)。

实施例四：重组农杆菌EHA105-pCHAMBIA2302::PgpdP-GUS-TtrpC细胞的制备

1、对实施例三获得的最终载体pCHAMBIA2302::PgpdP-GUS-TtrpC的菌进行扩大培养，并抽提质粒，取10μL质粒pCHAMBIA2302::PgpdP-GUS-TtrpC，加入到EHA105感受态细胞中，冰浴30min，然后至于液氮中放置5min，之后转移至37℃溶解，加入1mL的LB培养基，在28℃，180rpm条件下复苏4h，然后涂布含三种抗生素的LB固体平板(利福平30μg/mL，链霉素100μg/mL，卡那霉素100μg/mL)，放置在28℃的恒温培养箱中，大概2～3天，转化子长出。

2、对长出的转化子进行PCR鉴定。随机挑选几株转化子，以(CCTCCATTGAGGCTGCCGAGAAG，SEQ ID NO：12)作为正向引物；以(GATTGCGGTTTACTGGAAGCTGTT，SEQ ID NO：13)作为反向引物，以载体pMD18-T::PgpdP为阳性对照，空EHA105为阴性对照，对所挑选的株菌进行PCR鉴定，鉴定为阳性的菌株即为正确的重组农杆菌EHA105-pCHAMBIA2302::PgpdP-GUS-TtrpC，可进一步进行后续的实验。

实施五：扩展青霉基因工程菌的制备

1、转化扩展青霉

1)挑取分离纯化后的野生型扩展青霉接种于PDA平板上，于28℃培养20天左右，用无菌水洗下成熟孢子。

2)将实施例四中含最终载体pCHAMBIA2302::PgpdP-GUS-TtrpC的工程农杆菌EHA105接种于含有链霉素(100μg/mL)、卡那霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中28℃，200rpm过夜培养，用含有链霉素(100μg/mL)和卡那霉素(100μg/mL)的MM培养基重新活化，28℃，220rpm培养48h；吸取适量的培养物5000rpm离心去上清，并用IM培养基洗涤，最后用IM培养基稀释至OD₆₀₀＝0.15，然后在28℃，220rpm的条件下培养6～8小时，至OD₆₀₀＝0.5～0.6。

3)将步骤1)得到的新鲜孢子配制成1×10⁷个/mL浓度的悬浮液。随后取上述孢子悬液与步骤2)中的工程农杆菌等体积混合，取200μL均匀涂布到铺有玻璃纸的CM培养基(含AS 200μg/mL)之上，28℃共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有潮霉素(100μg/mL转化选择抗生素)、头孢菌素(500μg/mL，抑制农杆菌生长抗生素)的PDA培养基上28℃培养2天，揭下玻璃纸，在28℃条件下培养1～3天，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，即是所述的扩展青霉基因工程菌。

MM培养基：1M K₂HPO4-KH₂PO4(pH7.0)10mL，M-N(MgSO₄·7H₂O30g/L，NaCl 15g/L)20mL，1％CaCl₂·2H₂O 1mL，20％葡萄糖10mL，0.01％FeSO₄ 10mL，Spore element(ZnSO₄·7H₂O 100mg/L，CuSO₄·5H₂O100mg/L，H₃BO₃ 100mg/L，MnSO₄·H₂O 100mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O100mg/L)5mL，20％NH₄NO₃2.5mL，无菌水941.5mL。

IM培养基：1M K-buffer(pH7.0)10mL，M-N(MgSO₄·7H₂O 30g/L，NaCl 15g/L)20mL，1％CaCl₂·2H₂O 1mL，20％葡萄糖10mL，0.01％FeSO₄10mL，Spore element  (ZnSO₄·7H₂O 100mg/L，CuSO₄·5H₂O100mg/L，H₃BO₃ 100mg/L，MnSO₄·H₂O  100mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O100mg/L)5mL，20％NH₄NO₃ 2.5mL，50％甘油10mL，1M MES(pH5.5)40mL，100mM  AS(乙酰丁香酮)2mL，无菌水898.7mL。

CM培养基：加一半IM培养基的葡萄糖量，外加1.5％琼脂，其它成份同IM培养基。

实施例六：启动子的功能验证

启动子的活性检测通过GUS染色实验进行，实验方法如下：将实施例五得到扩展青霉基因工程菌和野生型扩展青霉的菌丝体分别切割一块下来，各自放入一个eppendorf管中，加入GUS染液(100mM NaPO₄pH7.0，2mM X-Gluc，0.5％Triton X-100，2mM K₃[Fe(CN)₆]，2mMK₄[Fe(CN)₆])，37℃培养过夜，第二天观察菌丝体的染色情况。请参见图4，图4显示转入了pCHAMBIA2302::PgpdP-GUS-TtrpC的扩展青霉基因工程菌呈现显著的蓝色(图4B)，而野生型的扩展青霉菌株却并未染上颜色(图4A)，结果表明PgpdP启动子具有高效启动基因转录的活性。

本实施例的实验重复进行三次，都得到同样的结果。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种启动子，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：

a、SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

b、与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列；

c、在严格条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；

e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。

2.一种核酸构建体，其包含权利要求1的启动子，与启动子可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的启动子或权利要求2的核酸构建体，所述载体为权利要求1的启动子或权利要求2的核酸构建体与pMD18-T或pCHAMBIA2302质粒经重组得到的重组质粒。

4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求1的启动子或权利要求2的核酸构建体或权利要求3的载体，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。

5.一种含有权利要求1的启动子或权利要求2的核酸构建体或权利要求3的载体或权利要求4的重组细胞的真菌，所述真菌为扩展青霉菌。

6.一组引物对，所述引物对用于扩增得到权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述引物对的两条引物分别含有SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5所示的序列，或者分别含有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的序列，或者分别含有SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的序列。

7.制备SEQ ID NO：1所示的启动子的方法，包括：

以扩展青霉基因组DNA为模板，使用权利要求6所述的一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在扩展青霉基因组DNA中的序列分别针对首尾进行设计。

8.一种调控真菌中目的基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括：

将权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3所述的载体或权利要求4所述的重组细胞导入真菌，所述真菌为扩展青霉。

9.一种制备转基因工程菌的方法，其特征在于，培养权利要求5所述的真菌。

10.权利要求1的启动子或权利要求2的核酸构建体或权利要求3的载体或权利要求4的重组细胞在调控真菌中目的基因表达中的用途；所述真菌为扩展青霉，所述目的基因为GUS基因。

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