CN101691570A - 北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子 - Google Patents

Abstract

一种基因工程技术领域的北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，该启动子具有SEQ ID NO.1中第1-2515位所示的核苷酸序列或在高严谨条件下与SEQ ID NO.1中第1-2515位所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子可启动报告基因gusA基因在真菌的菌丝体和子实体中高效表达，特别是在北冬虫夏草的菌丝体和子实体中有较高的活性。

Description

北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子

技术领域

本发明涉及一种基因工程技术领域的基因启动子，具体是一种北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子。

背景技术

虫草属真菌是药用真菌中的一个大类，属真菌门(Eumycota)，子囊菌亚门(Ascmycotina)，核菌纲(Pyenomycetes)、壳菌目(Sphaerides)，麦角菌科(Clavicipiracese)，虫草属(Cordyceps)。此属现报道的已有350余种，国内发现有30余种，国内具有药用价值的虫草真菌种类包括：冬虫夏草(Cordycepssineusis)，简称虫草；蛹虫草(C.militaris)，又称北冬虫夏草；亚香棒虫草(C.hauntessi)，又称霍克斯虫草；凉山虫草(C.liangshanensis Zhang，Liuet Hu)；香棒虫草(C.barnesii(Berk))；蝉花(C.cicaelioola)又名茧草；甘肃虫草(C.gansueasis Zhang.Wang et Yan sp.nov)；新毅虫草(C.gracilis(Gray)Dur.Et Mont)；巴西虫草(C.brasihexisis Henn)；蔗峨虫草(Phragnwtoecia hiibner)；金针虫草(C.agriota)；山西虫草(G.shanxeensis1.iu Rong et Jin，sp.nov)；分枝虫草(C.ramosa Teng)；大囊团虫草(C.ophiogl(ossoides))，又名大团囊草；阳平珊瑚虫草(C.marlialis)；古尼虫草[C.gunaii(Berk)]。冬虫夏草是我国三大名贵中药材之一，具有提高免疫功能及抗肿瘤作用，同时对慢性支气管炎、高脂血症、心血管疾病、男性性功能障碍等有很好的疗效。天然的冬虫夏草主要产于四川西藏、云南、青海等省(区)的海拔3000m以上的寒冷地带，由于其生长条件的限制及过度采挖，产量很低，所以价格昂贵。因此，为弥补天然虫草资源的不足，国内外学者纷纷开展人工培养虫草如冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.、蝉花C.sobolifera(Hill.)Berk.et Br.、蛹虫草C.militaris(L)Link和大团囊虫草C.ophioglossoides(Ehr.ex Fr.)Link等的研究，其中尤以北冬虫夏草的研究和应用最多。国内早在上世纪50年代徐家忠在吉林地区采集报道，故而称为：东北虫草，北冬虫夏草，简称北虫草。从20世纪80年代开始系统研究，并且在人工栽培化学成分、药理等方面做了大量的研究。

目前虽然天然北冬虫夏草资源匮乏，但人工栽培已经成功，主要包括三个方面内容：一是模拟常见食药用菌的栽培方法进行人工栽培；二是采用液体深层发酵培养北冬虫夏草菌丝体；三是是将北冬虫夏草菌接种在柞蚕活蛹体内进行子实体的培养。无论采用哪种方式生产北冬虫夏草，高效、稳定、优质的菌种是进行规模化生产的前提和基础。而采用基因工程的方法进行优良品种的培育是目前最有潜力和最具有竞争力的方法之一。在基因工程育种中，采用转基因技术是常用的方法，通常把与虫草活性成分(虫草素、虫草酸、虫草多糖等)相关的基因转入北冬虫夏草菌丝体内，目前已经克隆了许多与活性成分代谢相关的基因，这些基因大多数由异源组成型启动子(如CaMV 35 S)驱动在真菌菌丝体中组成型表达，这样的表达有些可以达到预期的效果，但也常有一些不表达的情况发生，因为丝状真菌启动子具有种属特异性。因此，用强的启动子能增加外源基因在丝状真菌中的表达产量，而这些强的启动子均来自高效表达的丝状真菌基因(裴凌鹏等.丝状真菌表达系统在thaumatin基因工程中的优化.北京联合大学学报(自然科学版).2003，17(3)：75-77)。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPD，EC 1.2.1.12)是生物体内糖酵解和糖异生过程中的关键酶，其生理功能是在NAD⁺和无机磷酸存在的条件下催化甘油醛-3-磷酸氧化磷酸化，生成1，3-二磷酸甘油酸，是维持生命活动最基本的酶之一。真菌中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶是一个由四个相同的亚基组成的四聚体蛋白，并且在真核细胞中高效表达，如在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中其含量可达细胞内可溶性蛋白的5％，在酵母中其mRNA的量占总mRNA量的2-5％。如此高的mRNA表达量以及蛋白积累说明甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子非常活跃，这一结果已在酿酒酵母(S.cerevisiae)，毕赤酵母(Pichia pastoris)，香菇(Lentinula edodes)，卷枝毛霉(Mucor circinelloides)和金针菇(Flammulinavelutipes)中得到了证实。在真菌的遗传转化载体构建中，gpd启动子通常被认为是表达异源基因的理想候选启动子；虽然使用异源甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子构建表达载体非常普遍，但是载体上的基因在某些真菌受体中也有不表达的情况发生。因此，人们希望使用内源启动子以期载体上的基因在受体中高效表达。

经对现有技术的文献检索发现，Moralejo，F.J.等在《Applied andEnvironmental Microbiology》(应用环境微生物)1999年第3期1168-1174页发表了题为《Thaumatin production in Aspergilus awamori by use ofexpression cassettes with strong fungal promoters and high gene dosage》(利用强的真菌启动子和高拷贝基因在泡盛曲霉中进行甜味蛋白的生产)一文，文中评述，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的pcbC启动子或产黄头孢霉(Acremonium chrysogenum)的B2启动子构建不同的表达盒在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中表达时，表达产量分别为7.7mg/L和1.6mg/L，相反，如果换用泡盛曲霉的启动子时，表达产量能达到11mg/L。这表明，同种特异性的启动子具有更好的启动表达效果。目前还未见与北冬虫夏草基因启动子有关的报道，因此有必要选择北冬虫夏草基因内源启动子以期实现基因特定载体中的高效表达。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子。本发明的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子可启动报告基因gusA基因在真菌的菌丝体和子实体中高效表达，特别是在北冬虫夏草的菌丝体和子实体中有较高的活性。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明涉及一种北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，该启动子具有SEQ ID NO.1中第1-2515位所示的核苷酸序列或在高严谨条件下与SEQ ID NO.1中第1-2515位所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用1×SSC、0.1％SDS溶液在65℃下洗膜。

本发明具有如下的有益效果：本发明的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子可启动报告基因gusA基因在真菌菌丝体和子实体中高效表达，特别是在北冬虫夏草的菌丝体和子实体中有较高的活性，比CaMV 35S启动子还强；本发明的启动子能用于真菌基因工程，特别是用于北冬虫夏草中表达特定的目的基因，从根本上改变冬虫夏草资源匮乏、种群危机之现状；本发明的启动子在提高真菌营养品质的中发挥重要作用。

本发明涉及的北冬虫夏草菌株已在《杨宣华；不同氮源对北冬虫夏草生长影响的研究，佛山科学技术学院学报(自然科学版)，2008，26(3)：52-54》文献中公开，可购自于中国农业科学院菌种保藏中心。

本发明涉及的大肠杆菌DH5α菌株已在《刘静华，包英华，陈燕飞；大肠杆菌DH5α感受态细胞转化率的改进，韶关学院学报，2008，29(03)：87-90》文献中公开。大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞可通过供应商宝生物工程(大连)有限公司购买，货号D9027。

本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

步骤一，北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的克隆

1、北冬虫夏草的培养

将保藏在试管斜面上的北冬虫夏草菌株(Cordyceps militaris编号：51534，来源于中国农业科学院菌种保藏中心)放至28℃活化24h，挑取试管斜面菌株的菌丝接至含有马铃薯综合培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)平板上，28℃恒温培养7天。将1cm²左右的生长在PDA平板上的菌种接至PDA液体培养基，在28℃、120rpm条件下培养5天。

2、北冬虫夏草DNA的分离

采用高盐低pH法提取基因组DNA，包括以下步骤：

(1)将1g左右经液氮研磨的样品放入65℃预热的提取缓冲液，放入65℃水浴保温30min，缓慢振摇，25℃下10,000×g离心10min；

(2)吸取上清液，并在试管中加入约为上清液体积2/3毫升的2.5mol/L的KAc高盐溶液，混匀后置于0℃保持30min沉淀蛋白质；

(3)在4℃下10,000×g离心10min，弃蛋白质沉淀。上清液加入由氯仿和异戊醇按照24∶1的体积比配成的等体积的氯仿和异戊醇的混合物抽提，在6,000×g离心10min，取出水相转入另一离心管，如果中间层仍有白色沉淀，则再用由氯仿和异戊醇按照24∶1的体积比配成的氯仿和异戊醇的混合物抽提一次；

(4)在上清液中加入约为上清液体积2/3毫升的预冷异丙醇，混匀后置于-20℃静置30min，以沉淀核酸，重复一次，用体积比为70％乙醇清洗沉淀，在空气中干燥50min，将DNA沉淀溶解在TE缓冲液中，分装存放于-20℃或4℃冰箱中保存。

3、北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因核心片断的克隆

在分析已报道的肉座菌目(hypocreales)丝状真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的氨基酸序列(已公开：GenBank：XP_386433；AAT80324；ABQ42571；AAR22391；Q00584)的基础上，根据保守的氨基酸序列设计简并引物：

gpd-F：5-ATCAACGGNTTCGGNCGNATTGG-3为正向引物

和gpd-R：5-CATNACGTACATGGGNGCATC-3为反向引物，以北冬虫夏草基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：预变性94℃ 5min，循环设定：94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为657bp。然后按常规方法对PCR扩增产物进行克隆、测序。测序结果使用NCBI的BLAST软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列与已知的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)(已公开：GenBank：AY679162)等的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的同源性很高，故初步认为它是一个gpd基因。

4、北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的克隆

采用热不对称交错PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)反应技术扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶核心片段的启动子序列。即从前人的研究中选取6个随机简并引物，再根据核心片断序列末端边界200-300区间内分别向外依次设计TAIL-PCR所需的3条特异性巢式引物。6个随机简并引物与已设计的TAIL-PCR的3条特异性巢式引物配对进行三轮TAIL-PCR反应，同时电泳检测三轮PCR扩增产物。理想的结果是第二轮中存在目的条带，第三轮中会出现略小于它的特异条带，第三轮中这条略小的条带即为目的条带。挑选TAIL-PCR第三轮中的特异条带进行克隆、测序。

将所得的北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子序列和核心片段序列比对后进行拼接，得到全长序列3193bp，生物信息学分析表明甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码框的第一个起始密码子在(2516-2518bp)处，第一个起始密码子ATG前的2515个碱基为甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的5’侧翼序列，命名为CmGDP1P，另外的677bp序列为CmGDP基因序列。将3193bp的序列提交GenBank中进行比对，其中3’端的300bp(2894-3193bp)序列与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因编码区(已公开：GenBank：AY679162)的同源性为91％。在5’端的序列中只有三段序列与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子区有一定的同源性，一段在414-797bp处，同源性为78％，一段在1692-1775bp处，同源性为85％，另一段在2185-2669bp处，同源性为81％，其余区段未发现任何同源序列。说明所得到的2515bp序列确定为CmGDP基因的5’侧翼序列，并且是新发现的序列。

步骤二，北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的gusA基因的烟草转化

1、北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的克隆

根据北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的全长序列，设计能扩增出到起始密码子ATG(SEQ ID NO.1中第2516-2518位核苷酸)为止的5’侧翼序列的引物，在保证双元表达载体(如pCAMBIA 1301)中gusA报告基因阅读框架正确的前提下，在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定，如选用载体pCAMBIA 1301则上游可用BamH I和下游可用Bgl II)，以便构建表达载体。以北冬虫夏草基因组DNA为模板，经PCR扩增后，将北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因5’侧翼序列克隆至中间载体(如pMD 18-Tvector)，测序结果与所得的2515bp CmGDP1P的5’侧翼序列比较，一致性为100％，表明扩增没有出现错配。

2、真核表达载体的构建

根据引物两端设计的酶切位点，用双酶切(pCAMBIA 1301载体则可用BamHI和Bgl II)将CmGDP1P片断从pMD 18-T vector上切下，把酶切后回收的CmGDP1P片断与经同样的酶(pCAMBIA 1301载体则可用BamH I和Bgl II)酶切的载体片断相连。将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株中，提取质粒DNA，用双酶切鉴定。将构建好的载体命名为：P1301-CmGDP1P。大量提取构建的表达载体(p1301-CmGDP1P)的质粒DNA，取20uL(约1ug)转化农杆菌EHA105感受态细胞，在28℃、YEB培养基(含卡那霉素100ug/ml，链霉素125ug/ml)上培养两天。各挑选两个克隆做菌液PCR鉴定，均扩增出目标条带。

3、农杆菌转化烟草叶片

(1)挑取LB选择平板(40mg/L利福平，25mg/L链霉素，75mg/L卡那霉素)上的阳性单菌落，接种于2ml LB液体培养基(40mg/L利福平，25mg/L链霉素，75mg/L卡那霉素)，28℃，200rpm振荡培养24-36小时；

(2)取1ml以上培养物，加入50ml LB液体培养基(40mg/L利福平，25mg/L链霉素，75mg/L卡那霉素)中，28℃，200rpm振荡培养至OD₂₆₀＝0.6-1.0；

(3)将培养物5000rpm离心10分钟，收集菌体；

(4)用MMA培养基(MS，30g/L蔗糖，200uM乙酰丁香酮，10mM MES，pH＝5.8)重悬，使OD₂₆₀＝2.4，28℃ 180rpm振荡培养1小时；

(5)取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；

(6)将大约200片叶盘放入两瓶200ml农杆菌培养液中，28℃，190rpm振荡培养10分钟；

(7)将叶片平铺在MS(MS粉，30g/L蔗糖，2.5mg/L植物凝胶)培养基平板上，28℃暗培养3天；

(8)三天后转入MS筛选培养基(含3mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，含卡那霉素100μg/L，噻孢霉素250μg/L，pH5.8)中，28℃光照培养，每日光照12-16小时。每2周继代一次，每次将变黄的叶片或愈伤组织丢掉，大的愈伤组织切割成小块，经2-3次继代后，培养的愈伤组织陆续分化出苗。将幼苗转移入罐头瓶装的MS固体培养基(含卡那霉素100μg/L，链霉素125μg/L，pH5.8)中，28℃光照培养，待其根系发育完全后，移栽到温室中。

步骤三，烟草转基因后代的分子检测及CmGDP1P启动子活性的检测

1、烟草转基因后代的分子检测

(1)烟草总DNA 小量提取 取烟草幼嫩叶片150mg左右于1.5ml离心管中，研成粉末。加800μl 65℃预热的SDS裂解缓冲液(0.1M Tris-HCI，0.05MEDTA，0.5M NaCl，1％SDS)，振荡混匀。65℃水浴20分钟，加入250μl 5M KAc，冰浴5分钟，4℃、12000rpm离心10分钟。取上清于另一1.5ml离心管中，4℃、12000rpm再离心5分钟。将上清转入另一干净离心管，加入600μl异丙醇，充分混匀，4℃ 12000rpm离心15分钟。最后用体积比为70％乙醇清洗沉淀2次，真空干燥后，加80μl灭菌重蒸水溶解DNA；

(2)PCR检测 根据gusA基因的序列设计一对引物GuS-F和GuS-R，用这对引物检测用SDS法提取的转基因烟草DNA。其中，PCR反应体系组成如下：10×缓冲液2.5μl，dNTP混合物(每种10mM)0.5μl，GUSF(浓度为10μM)0.5μl，GUSR(浓度为10μM)0.5μL，Taq酶(浓度为5U/1μL)0.5μL，转基因烟草总DNA(浓度为20ng/μL)1μL，灭菌水定容至25μL。PCR检测结果表明阳性烟草植株与待检测烟草植株的株数比为80％。

2、CmGDP1P启动子活性的检测

将PCR检测结果为阳性的烟草植株，提取其6-8片叶小苗的根，茎、茎基和叶，花的萼片、花瓣、花柄、雌蕊和雄蕊，完全伸张开的成熟叶片，开花后20天的未成熟种子和成熟种子的总蛋白，定量检测gusA基因编码蛋白β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)的活性，分析CmGDP1P的组织特异性驱动活性。

具体步骤如下：

(1)标准曲线的制作  用反应终止液(0.2M Na₂CO₃)将4-MU(4-甲基伞形酮)配制成0.00、6.25、12.50、50.00、100.00、250.00、500.00、1000.00pM的系列标准浓度，通过测定它们的荧光强度，作出一条标准曲线。

(2)总蛋白提取与蛋白浓度的测定

①取0.1g材料于1.5ml离心管中，加入液氮，研成粉末；

②加600uL酶提取液(0.05M pH7.0磷酸缓冲液，0.1％SDS，0.01M pH8.0EDTA，20％甲醇，0.1％ Triton X-100，0.1％巯基乙醇)，在13000rpm 4℃离心10min，取上清于新的离心管中，-20℃保存备用；

③取上清，用考马斯亮蓝G250法测定蛋白的含量。

(3)β-葡萄糖苷酸酶的酶促反应及其荧光定量

①取50uL含GUS的上清，加入到450uL 37℃预热的检测液(2mM 4-MUG溶液)中，迅速充分混匀；

②立刻取出50uL加入到950uL反应终止液(0.2M Na₂CO₃)，将该管作为酶促反应的0点；

③分别在10分钟、20分钟、30分钟、45分钟和60分钟从反应液中取出50uL，转入950uL的反应终止液中；

④酶促反应结束后，用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，测定不同时间点的荧光值；

⑤根据测定的荧光值以及参与反应的总蛋白，求出GUS活性。GUS活性＝单位时间内反应生成的MU/蛋白量(单位：nM 4-MU.min^-1.mg^-1蛋白)。

β-葡萄糖苷酸酶基因启动子驱动的β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)活性测定结果表明：CmGDP基因起始密码子ATG上游2515bp的序列(CmGDP1P)足以启动报告基因gusA在烟草的不同组织中表达。

步骤四，北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子驱动的gusA在北冬虫夏草中的表达

将北冬虫夏草CmGDP1P中5’端侧翼序列(位于SEQ ID NO.1中第1-2515bp)构建入双元载体(如pCAMBIA 1300)之中，利用农杆菌介导转化北冬虫夏草菌丝体，最后得到具有抗性的菌株。

1、北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的克隆

根据北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的全长序列，设计扩增出5’端侧翼序列的引物，在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定，如选用载体pCAMBIA 1300则上游可用Xma I和下游可用Pst I)，以便构建表达载体。以北冬虫夏草基因组DNA为模板，经PCR扩增后，将北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因5’端侧翼序列克隆至中间载体(如pMD 18-Tvector)，测序结果与所得的2515bp CmGDP1P的5’侧翼序列比较，一致性为100％，表明扩增没有出现错配。

2、真核表达载体的构建

根据引物两端设计的酶切位点，用双酶切(pCAMBIA 1300载体则可用XmaI和Pst I)将CmGDP1P片断从pMD 18-T vector上切下，把酶切后回收的CmGDP1P片断与经同样的酶(pCAMBIA 1300载体则可用Xma I和Pst I)酶切的载体片断相连。将连接产物转化DH5α菌株中，提取质粒DNA，用双酶切鉴定。将构建好的载体命名为：P1301-CmGDP1P。

大量提取构建的表达载体(p1300-CmGDP1P)的质粒DNA，取20uL(约1ug)转化农杆菌EHA105感受态细胞，在28℃、YEB培养基(含卡那霉素100ug/ml，链霉素125ug/ml)上培养两天。各挑选两个克隆做菌液PCR鉴定，均扩增出目标条带。

3、农杆菌介导的北冬虫夏草转化

(1)挑取LB选择平板(40mg/L利福平，25mg/L链霉素，75mg/L卡那霉素)上的阳性农杆菌单菌落，接种于2ml LB液体培养基(40mg/L利福平，25mg/L链霉素，75mg/L卡那霉素)，28℃，200rpm振荡培养24-36小时；

(2)取1ml以上培养物，加入50ml LB液体培养基(40mg/L利福平，25mg/L链霉素，75mg/L卡那霉素)中，28℃，200rpm振荡培养至OD₂₆₀＝0.6-1.0；

(3)将培养物5000rpm离心10分钟，收集菌体；

(4)用IM培养液(10mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，2.5mM NaCl，2mM MgSO₄，0.45mM CaCl₂，9uM FeSO4，4mM(NH₄)₂SO₄，10mM葡萄糖，40mM 2-吗啉乙磺酸，0.5％甘油，200μM乙酰丁香酮)重悬，使OD₂₆₀＝0.15，28℃ 200rpm振荡培养3-6小时；

(5)5000rpm离心收集北冬虫夏草菌丝，用研磨杵磨碎，用10倍体积的PDA培养液悬浮备用；

(6)将刚在IM培养液中培养完的农杆菌菌液与北冬虫夏草菌丝PDA悬浮液按1∶1(v/v)混匀，图布于上层铺有滤纸(Whatman 3MM)的CM培养基(与IM培养基相同，除10mM葡萄糖改为5mM葡萄糖，加1.5％凝胶)平板上，23℃共培养3天。

(7)揭下CM平板上的滤纸，将滤纸反铺到PDA筛选培养基(潮霉素，500μg/mL头孢霉素)平板上，28℃暗培养2天；

(8)揭去PDA筛选平板上的滤纸，28℃再暗培养5天，每天检查新的单菌落，挑出单菌落接种于新的筛选PDA培养基。

4、北冬虫夏草转化子的验证

(1)PCR检测阳性北冬虫夏草转化子

①采用高盐低pH法提取5个北冬虫夏草转化子的基因组DNA，同步骤一；

②在北冬虫夏草gpd启动子和双元载体中抗性基因(如pCAMBIA 1300的潮霉素抗性基因)序列中，分别设计一个上游引物和一个下游引物，以此达到能同时扩增两者部分序列的目的；

③以北冬虫夏草转化子基因组DNA为模板，以设计的引物进行PCR检测。

结果表明所选5个转化子皆能扩增出包含抗性基因和北冬虫夏草启动子的片断，从而证明以北冬虫夏草gpd启动子构建的双元载体可以通过农杆菌介导转化北冬虫夏草菌丝体。

(2)Southern blot检测阳性北冬虫夏草转化子

①采用高盐低pH法提取5个北冬虫夏草转化子的基因组DNA，同步骤一；

②选取CmGpd1p启动子和载体上抗性基因中不具有识别位点的限制性内切酶对北冬虫夏草转化子基因组DNA进行37℃酶切24小时以上，酶切后进行电泳验证，直至确认酶切已彻底；

③配置0.8％琼脂糖凝胶，向每管DNA酶切产物中加入6×loading buffer，点样，常温下于1V/cm电泳12小时左右，至溴酚蓝迁移至凝胶的3/5距离处；

④Southern凝胶转膜和固定，按照Amershan Biosciences公司的Hybond-N+中的说明书进行；

⑤以载体上包含抗性基因和北冬虫夏草gpd启动子的片段设计一对探针引物；

⑥探针的标记，杂交，用1×SSC、0.1％SDS的溶液在65℃下进行杂交后的洗膜，操作步骤按照Amershan Biosciences公司的ALkphos Direct labelingand Detection System试剂盒说明书进行，其中1×SSC和0.1％SDS溶液的配置可参照试剂盒说明书进行；

⑦使用CDP-Star Detection Kit(Amershan Biosciences公司)检测杂交信号，然后进行放射自显影，操作过程都按照使用说明书进行。

结果表明5个转化子都产生单一的清晰条带，表明带有北冬虫夏草gpd启动子的抗性基因已经转化进入北冬虫夏草。再次证明以北冬虫夏草gpd启动子构建的双元载体可以通过农杆菌介导转化北冬虫夏草菌丝体。

5、北冬虫夏草中gusA活性的验证

选PCR检测结果为阳性的北冬虫夏草菌丝提取其总蛋白，定量检测gusA基因编码蛋白β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)的活性，分析CmGDP1P的在北冬虫夏草菌丝中的活性。具体步骤如下：

(1)标准曲线的制作(同步骤三)；

(2)总蛋白提取与蛋白浓度的测定(同步骤三)；

(3)β-葡萄糖苷酸酶的酶促反应及其荧光定量(同步骤三)；

β-葡萄糖苷酸酶基因启动子驱动的β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)活性测定结果表明：CmGDP基因起始密码子ATG上游2515bp的序列(CmGDP1P)足以启动报告基因gusA在北冬虫夏草的菌丝中表达。

实施例2

步骤一，缺失启动子片断的PCR扩增

(1)引物的合成

根据北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的全长序列，设计能扩增出2000bp长短的启动子区的一段序列(SEQ ID NO.1中第501-2515位核苷酸)。引物序列为：上游引物：5’-AGACGGCTTTGGGCGGCTGCTTGC-3’；下游引物为：5’-TGTTCTTGATTAGAAAAGTGAGGTG-3’；

(2)PCR扩增

以北冬虫夏草基因组DNA为模板，使用步骤(1)中所述的引物，经PCR扩增后，将北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因5’侧翼的部分序列(约2000bp)克隆至中间载体(如pMD 18-T vector)，测序结果与所得的2515bp CmGDP1P的5’侧翼序列比较，与SEQ ID NO.1中第501-2515位核苷酸一致性为100％，表明扩增没有出现错配。

步骤二，探针的制备

以SEQ ID NO.1中第1-2515位核苷酸为探针，探针标记的操作步骤按照Amershan Biosciences公司的ALkphos Direct labeling and Detection System试剂盒说明书进行。

步骤三，Southern blot

(1)缺失的启动子的序列的扩增

按步骤一的方法扩增出有缺失的启动子的序列(SEQ ID NO.1中第501-2515位核苷酸)；

(2)电泳

配置0.8％琼脂糖凝胶，向每管DNA片断中加入6×loading buffer，点样，常温下于1V/cm电泳12小时左右，至溴酚蓝迁移至凝胶的3/5距离处；

(3)转膜和固定

Southern凝胶转膜和固定，按照Amershan Biosciences公司的Hybond-N+中的说明书进行；

(4)杂交

用1×SSC、0.1％SDS的溶液在65℃下进行杂交后的洗膜，操作步骤按照Amershan Biosciences公司的ALkphos Direct labeling and Detection System试剂盒说明书进行，其中1×SSC和0.1％SDS溶液的配置可参照试剂盒说明书进行；

(5)检测

使用CDP-Star Detection Kit(Amershan Biosciences公司)检测杂交信号，然后进行放射自显影，操作过程都按照使用说明书进行。

结果表明缺失的启动子与探针杂交后能产生单一的清晰条带，即得到在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1中限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表

<110>上海交通大学

<120>北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>3193

<212>DNA

<213>北冬虫夏草(Cordyceps militaris)

<220>

<221>Promoter

<222>(1)…(2515)

<400>1

agtgtagtat cataggccaa ggacgtagag ttgaggctct tcagatcaat ggagacgccc   60

ttgtcgatgt tattgaaccc aggattggga ttatggcctc cagatttgac tgagaactgg  120

cagtaattgg ttgtgagaag ctcgacaatg acagacatgt ctcgggacga tgagggcgtc  180

actacacatc cgggatgctg catggaagtg gtggccgcgg atctcggagc tcgggttcac  240

ggcgagcacg ccgaggaaac aacagaactc ttgaagatga ggagaatcga gcagggaagg  300

gcccaagcca ttccactcaa cacacgagct tgtgccaact agagcggaac aggatccttg  360

ccacgactgc attctagaat gccgaattgg agccctgggg tagttagtgg gaatcgagac  420

cgttgtctac gccccgggtt cttcccccag gaaagcggct cgcttgctgg tccaatcttc  480

tgccgagcag ggccggggcc agacggcttt gggcggctgc ttgctctggg ccggacaagg  540

aaggaggaca agccaaagca acgcacccgt tctgctccgg ccctggggcg gaagaagtgg  600

aacaagacgg gcagcgcagc cctgcggtta tcgtgatgcg cccgaacttt gccgcgtcta  660

agtgggacag agcgtgccat tatatagtaa caggaaacca aaggacgaaa atgcagcacc  720

tggttccgat gcttgtgtaa agagcaaaat catagaggtt tgcgcacgac gccgtgctgg  780

cctccccaca cctgcgatgg ttatgcaatt acaagagatt tgatccctct ccccctcttc  840

taccggaatt tgctatgagt gatttttcca ttggcagcgc gctgttttca ctgacctggt  900

tcttatcggc ggctgcgcag cggagtgcac tgtactggcc tagcgctgtt gcagatacag  960

gatgaacagg gacgacgggg gtacttgagg agtactgagc ttggtgtgca acaaaggcag 1020

gcaaccgggt cgaatcggag ggcagatgct ggtacctcag aggttcccca caccggaccg 1080

gcctcagaaa gcgatttaat tttagcattt tcgcagggcg tcaaacagtg aagggcaaag 1140

agaagaaaaa aagtggcgat atacgtaggt aattatttca agacccgctc ccaaaaaaga 1200

cgcagtgcag tgccaacagg gtgcgttgac gctgccgcat gctgaggctg gtgaatatga 1260

ctagccggag acattgctat tcgggccttg tctgttatcg attcggtgcc caggcgcata 1320

ttacggcgtg agtgtgtaat gggaatggag tcagccggcg ccagatcgga ggacgctgaa  1380

tgaggaccaa gagtgtactt ttcccggcgc ggccggacta agacggtttc actaatacgc  1440

catggaatca tggatgggag ccttgtcgtg tcatcttggt ggccaatttg tctattctgg  1500

tagttccgcc gtggccaact tgacggttca ctggttttgt gtcttgatga ctgacaaaga  1560

gggccagaga tgagacgacg agctgccggt tgcaccatca gccaaccgtt cgcagaaatc  1620

atcagttgcg ctacagtcaa catagcgggt ggtcaaagtt tgcgtgggca cgggttgccg  1680

cacgagttgg aacgtcagta aagtggggga ggggaagcaa ccagaacgag gccaattgaa  1740

tgggatgaag gcgtctggga gggaagcacg agcgtgaatg aatggacggt tgcgtgactc  1800

tggtctcgcg atttcgatcg agtcaaggaa cccgtatggt tgcctcttgt cttggagagc  1860

tcgtcgaggc ccaagctgcg agtatatggt tggtgatgcg ctgggcattt gcccctctct  1920

gcccctccat ggacggacct gcagctcttg ggctggcaag gtgttgcgct acgtcgagat  1980

gcggttaggt aagctggcat aagctggcat aaggttggct gttcttgaga aatcaggcca  2040

gcagtcttgc acctctctgg ctacaggctc tccagcggtc agccaccgcc actccagcgc  2100

ctgtttttca ctgacgatgg ccttgttttt ttgttgctct ggcagctggc aagctgggtc  2160

ccggcagctg ccacggccaa gccacccagg actacaaaac catttgccca cccctcctct  2220

tcgccgtgcg tctcttcttt ttctcccctc cattacacct cattcttcag ttcaaaggaa  2280

caaaagtgag ttttccatcc gtcccacacc tggctccatc atctcgagct tcattgcttc  2340

ttgaccatct accacgctct accctccaac agcttcgctc acccaagagc tgcctgcttt  2400

tcccctcctc tccacgaccc cgccatccac cacttaacct aaagttaccc ctcgctaacc  2460

gccaaacgtc ccaacaggtt tttcttctct cacctcactt ttctaatcaa gaacaatggc  2520

tcccgtcaag gttggcatca acggcttcgg ccgcattggc cgcattgtct tccgcaacgc  2580

cgtcgagcac aacgacatcg acgttgttgc cgtcaacgac ccctttgttg aggtcaagta  2640

cgccgtgagt ttcaccaccc gcaccgaata aagctatacc cttgcctgca ccccgacaca  2700

gccttgctgt tatggctgtg gctgtggctg tggctgtgac gtggtaggat tgtcaatttt  2760

ggcaacccgc tcaaacagct atcaggccac gctgccgctg cttgtgacca ggttatggtt  2820

tggttggtaa agcgaaccaa acctcataat cgctctacta gtgccaaagg cgaacactcg  2880

tcaacctcat ttgccaataa gctgctaacc attcatcgcg caggcctaca tgctcaagta  2940

tgactcctcc cacggtgttt tcaagggcga gattgccatt gacggcaacg atctcgtcgt  3000

caacggcaag aagattcgct tctacggcga gcgcgacccc gccgccattc cctggaagga  3060

gaccgccgcc gagtacgttg tcgagtccac tggtgtcttc accaccatcg acaaggccaa  3120

ggctcacttg cagggtggtg ccaagaaggt catcatctcg gccccctctg ccgacgcccc  3180

tatgtacgtg atg                                                     3193

Claims (2)

1.一种北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，其特征在于，具有SEQ ID NO.1中第1-2515位所示的核苷酸序列或在高严谨条件下与SEQ ID NO.1中第1-2515位所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的北冬虫夏草甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，其特征是，所述高严谨条件为用1×SSC、0.1％SDS溶液在65℃下洗膜。