CN104031850B - 一种蛹虫草Rhf1基因失活的工程菌以及蛹虫草Rhf1基因的应用 - Google Patents
一种蛹虫草Rhf1基因失活的工程菌以及蛹虫草Rhf1基因的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种蛹虫草Rhf1基因失活的工程菌以及蛹虫草Rhf1基因的应用。本发明筛选得到一株菌丝分支繁多、菌球生物量增多、原基分化提前、子实体粗壮、子实体收获时间缩短以及子实体干重增加的蛹虫草突变子g38。经过实验发现，其是由于菌丝分裂蛋白基因插入失活，进一步，本发明证实，菌丝分裂蛋白基因与菌丝分枝、分生孢子梗分化、原基分化速度、子实体的粗细或子实体产量相关。因此，本发明为在蛹虫草的栽培过程中，缩短栽培时间、提高子实体产量等提供了一条解决途径。
Description
技术领域：
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及一种蛹虫草Rhf1基因失活的工程菌以及蛹虫草Rhf1基因的应用。
背景技术：
冬虫夏草(Cordycepssinensis)是中国传统的珍贵中药，需求量大且价格高昂。但是，冬虫夏草产量急剧下降，而且到目前为止仍不能人工培养。蛹虫草(Cordycepsmilitaris)具有冬虫夏草类似的功效，成为冬虫夏草的首选代用品。在蛹虫草人工商业栽培过程中，如何解决菌种退化、缩短栽培时间、提高子实体产量和活性成份含量以及增强蛹虫草感染昆虫能力等，是核心技术问题。
作为传统的中草药，蛹虫草的基因组DNA中没有含任何已知对人体有害的真菌毒素基因，这为蛹虫草安全性提供了基因水平的证据。蛹虫草比较重要的药理活性物质是虫草素、虫草酸、多糖和甾醇。虫草中所含一系列的药用活性物质，都被很好的研究。
2011年蛹虫草的基因组DNA已经测序完成，2014年在NCBI中可以查到各基因的DNA序列，为蛹虫草的深入研究及应用提供了基因水平的支持。和粗糙脉饱菌相似的是，蛹虫草基因组DNA中含有完整的RNAi途径所需要的各种元件。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种菌丝分裂蛋白基因(Rhf1)失活的蛹虫草工程菌。
本发明以蛹虫草JM4为材料，利用根癌农杆菌介导转化(ATMT)方法，将载体pKHt-gfp导入到蛹虫草JM4的分生孢子中，构建蛹虫草真菌的突变子库，筛选和测定影响蛹虫草生长性状的突变株。从中筛选出一株菌丝分支繁多、菌球生物量增多、原基分化提前、子实体粗壮、子实体收获时间缩短以及子实体干重增加的蛹虫草突变子g38。其在固体PPDA平板培养时，蛹虫草突变子g38只是扁平贴在培养基上生长，不像野生型蛹虫草JM4那样可以蓬松的向上生长；在固体培养过程中可以看到蛹虫草突变子g38向外扩增速度极慢，生长圈很小。液体PPDA培养7天后，在显微镜下可以看到蛹虫草突变子g38菌丝分枝增多、有二极分枝形成；液体培养的菌球紧实、轮廓清晰、菌液澄清偏黄色；经过冷冻干燥，发现相同处理培养的菌球生物量比野生型的高。
蛹虫草突变子g38在子实体培养过程中发现：g38的原基分化比野生型提早2周左右、子实体粗壮、子实体收获也相应提前2周；子实体产量也较高、含水量相对野生型的低约1％。
Tail-RCR获得突变子g38的突变基因为菌丝分裂蛋白基因(Rhf1)。该菌丝分裂蛋白基因(Rhf1)，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其genbank登录号为SequenceID:ref|XM_006667964.1("GeneID:18164839)，在genbank中其的描述是CordycepsmilitarisCM01filamentationprotein(Rhf1),putative，其是应用生物信息学对其进行预测的，并没有确切的证据证明其功能的。qRT-PCR检测显示g38菌株的Rhf1基因转录水平仅为野生型的30％-40％。Rhf1基因总长为4495bp，含5个内含子和6个外显子，cDNA长为3969bp，蛋白大小为1322aa。Southernblot显示Rhf1在蛹虫草基因组中以单拷贝形式存在。
为了验证Rhf1的功能，构建了Rhf1基因的RNAi质粒(带双元反向启动子gpd和ptrpC)和Rhf1(只带gpd启动子)的过表达载体。
以ATMT方法，构建了蛹虫草Rhf1基因过表达突变子、蛹虫草Rhf1基因RNAi突变子和ΔRhf1突变子g38的恢复突变子库。利用qRT-RCR筛选到合适的转化子，进行后续研究。结果发现：
在野生型蛹虫草JM4中，Rhf1基因表达被干扰时，突变子会出现菌丝分枝变多、原基诱发时间提前和子实体粗短的现象。
在野生型蛹虫草JM4中，过表达Rhf1基因时，突变子会出现菌隔变短、分生孢子梗高度分化的现象；当分生孢子梗成熟时可分裂出大量孢子，产孢量是野生型的10倍以上；但是相对的，孢子形成会延迟3天以上。在JM-OERhf1转化子进行子实体培养时，其原基诱发时间推迟或者没有原基形成，无法形成子实体。
补偿g38突变子的Rhf1基因表达时，气生菌丝有不同程度的恢复，分枝变少。同时，在38-OERhf1转化子进行子实体培养时，其原基诱发时间比g38有所推迟，推迟的程度与Rhf1基因补偿的程度成正比，但子实体与g38的收获时间相差不多。补偿Rhf1基因的g38突变子，其生长形态介于野生型和g38之间。
结果证明：Rhf1基因参与蛹虫草的菌丝分枝、分生孢子梗分化、原基分化及子实体形态建成等功能。在蛹虫草中，Rhf1基因表达量与菌丝分枝成负相关，表达量越低分枝越多；Rhf1基因表达量与分生孢子梗分化成正相关，表达量提高使梗的分化变复杂，延迟分生孢子的形成；Rhf1基因表达量与原基分化速度成负相关，Rhf1基因表达量越小蛹虫草的原基分化越快；Rhf1基因表达量与子实体的粗细成负相关，表达量越小子实体越粗壮。
因此，本发明的第一个目的是提供一种菌丝分裂蛋白基因(Rhf1)失活的蛹虫草工程菌，失活菌丝分裂蛋白基因(Rhf1)能够使菌丝分支繁多、菌球生物量增多、原基分化提前、子实体粗壮，从而使子实体收获时间缩短以及子实体产量增加。
所述的菌丝分裂蛋白基因(Rhf1)失活的蛹虫草工程菌可以是本发明的蛹虫草突变子g38，其Rhf1基因的第684bp后面插入T-DNA，并且其Rhf1基因的第685-723bp缺失。本发明的第二个目的是提供核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的菌丝分裂蛋白基因在控制菌丝分枝、分生孢子梗分化、原基分化速度、子实体的粗细、缩短栽培时间和/或提高子实体产量中的应用。
本发明筛选得到一株菌丝分支繁多、菌球生物量增多、原基分化提前、子实体粗壮、子实体收获时间缩短以及子实体干重增加的蛹虫草突变子g38。经过实验发现，其是由于菌丝分裂蛋白基因插入失活，进一步，本发明证实，菌丝分裂蛋白基因与菌丝分枝、分生孢子梗分化、原基分化速度、子实体的粗细或子实体产量相关。因此，本发明为在蛹虫草的栽培过程中，缩短栽培时间、提高子实体产量等提供了一条解决途径。
附图说明：
图1是菌丝生长图；A：JM4生长4周；B：g38生长4周；
图2是菌丝生长速度JM4和g38生长4周的菌丝直径柱形图；柱形图上不同字母表示差异显著(p<0.001)；
图3是液体培养的菌球图，A：液体PPDA培养的菌球；B：液体培养的菌球形状；C：冷冻干燥后菌球形状；
图4是液体培养的菌球干重图，JM4和g38的菌球干重，柱形图上不同字母表示差异显著(p<0.05)；
图5是PPDA液体培养7天的菌丝图，液体培养7天的蛹虫草JM4和g38的菌丝，标尺＝50μm；
图6是液体培养7天的孢子浓度JM4和g38孢子浓度柱形图，柱形图上不同字母表示差异显著(p<0.001)；
图7是蛹虫草JM4和g38原基分化和子实体生长的差异图，A：接种14天后，JM4完全没有原基诱发，而g38原基分化完成；B：接种21天后，JM4没有原基诱发，而g38已经有子实体生长接种后，22℃黑暗的条件下培养7天完成菌丝生长，然后在12：12小时光暗条件下进行子实体生长；
图8是蛹虫草JM4和g38的子实体图,g38的子实体比野生型JM4的粗壮；
图9是蛹虫草JM4和g38的产量图，相同处理条件下，g38的子实体产量稍高于JM4；柱形图上不同字母表示差异显著(p<0.05)；
图10是蛹虫草JM4和g38子实体含水量图，相同条件下，野生型JM4子实体的含水量高于g38；柱形图上不同字母表示差异显著(p<0.05)；
图11是TAIL-PCR扩增g38转化子的侧翼序列，M：WideRangeDNAMarker(100-6000)；M1：DL2000DNAMarker；L1-L3：左边界第一、二、三轮TAIL-PCR反应产物；R1-R3：第一次右边界的第一、二、三轮TAIL-PCR反应产物；R4-R6：第二次右边界的第一、二、三轮TAIL-PCR反应产物；
图12是蛹虫草JM4中Rhf1基因的southernblot鉴定；探针：DIG-标记的Rhf1-NG片段；C：阳性对照19T-Rhf1-NG质粒；1-3：分别为XbaⅠ,SalⅠ,BglⅡ酶切的JM4基因组DNA产物；
图13是RT-PCR分析不同培养时间的野生型JM4和g38中Rhf1基因的表达情况，JM4-7：野生型JM4培养7后Rhf1基因的表达；g38-7：g38培养7天后Rhf1基因的表达；JM4-14：野生型JM4培养14后Rhf1基因的表达；g38-14：g38培养14天后Rhf1基因的表达；
图14是过表达质粒图谱；
图15是OE载体双酶切鉴定；M：WideRangeDNAMarker(100-6000)；1-4：BamHI和EcoRI双酶切OE载体的结果；
图16是XbaI酶切OE载体和Rhf1基因，M：WideRangeDNAMarker(100-6000)，1-2：Rhf1片段和OE载体的XbaI酶切结果；
图17是OERhf1重组质粒酶切鉴定；M：WideRangeDNAMarker(100-6000)，1-4：XbaI酶切鉴定OERhf1重组质粒；
图18是RNAi表达质粒图谱；
图19是RNAi载体双酶切鉴定；M：WideRangeDNAMarker(100-6000)，1-6：KpnⅠ和PstⅠ双酶切鉴定RNAi载体；
图20是KpnⅠ和XbaI酶切Rhf1-5片段和RNAi载体，M：WideRangeDNAMarker(100-6000)，1-2：KpnⅠ和XbaI双酶切Rhf1-5片段和RNAi载体；
图21是iRhf1重组质粒酶切鉴定，M：WideRangeDNAMarker(100-6000)，1-5：KpnⅠ和XbaI酶切鉴定iRhf1重组质粒；
图22是JM-iRhf1突变子的筛选，1-10：JM-iRhf1突变子；
图23是JM-OERhf1突变子的筛选，1-10：JM-OERhf1突变子；
图24是38-OERhf1突变子的筛选，1-10：38-OERhf1突变子；
图25是JM4,g38和JM-iRhf1突变子的菌丝形状；
图26是JM-iRhf1突变子的原基分化，JM-iRhf突变子的原基分化比野生型JM4早，比g38的晚；
图27是JM-iRhf1突变子的子实体培养，JM-iRhf突变子的子实体比野生型的粗短；
图28是JM-iRhf1突变子的子实体形状；
图29是液体培养7天后，JM4和JM-OERhf1突变子的菌丝生长；
图30是液体培养10天后，JM-OERhf1的分生孢子梗成熟，分裂成分生孢子，A：成熟的分生孢子梗从菌丝脱落；B：分生孢子梗分裂出分生孢子(bar＝20μm)；
图31是液体培养10天后，JM-OERhf1的菌丝；
图32是JM4和JM-OERhf1的液体培养7天后的产孢情况(bar＝5μm)；
图33是JM4和JM-OERhf1的液体培养10天后的产孢情况(bar＝5μm)；
图34是JM-OERhf1突变子的原基分化，JM-OERhf突变子的原基分化比野生型JM4迟而且少；
图35是JM-OERhf1突变子的子实体培养，JM-OERhf突变子只有徒长的菌丝和极少的原基；
图36是JM-OERhf1突变子的子实体，JM-OERhf1突变子没有子实体形成；
图37是JM4,g38和38-OERhf1突变子的菌丝形状；
图38是38-OERhf1突变子的原基分化；38-OERhf突变子的原基分化时间处于野生型JM4和g38突变子之间；
图39是38-OERhf1突变子的子实体培养；随着Rhf1基因补偿程度越高，38-OERhf突变子的子实体越细长；
图40是38-OERhf1突变子的子实体形状。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本发明中如无特殊说明，JM4指的是蛹虫草JM4；g38指的是蛹虫草突变子g38。
实施例1：
一、实验材料和方法
1.菌株培养
农杆菌AGL-1培养：LB培养基，28℃黑暗培养。
E.coliDH5α培养：LB培养基，37℃下黑暗培养。
蛹虫草培养：PPDA培养基，22-23℃温度下培养。
2.基因组DNA的小量提取(E.Z.N.AHPFungalDNAKit)
3.蛹虫草总RNA提取
用TRizol法提取总RNA，
4.蛹虫草菌的农杆菌介导(ATMT)转化
5.蛹虫草菌JM4和蛹虫草突变子g38分生孢子的收集
野生型的蛹虫草JM4和突变子g38蛹虫草菌分生孢子的收集：以接种针直接挑取菌丝体涂板于固体PPDA培养基中，于23℃黑暗培养，7-10天后以10mL无菌超纯水从平板中洗下分生孢子，三层无菌擦镜纸过滤后2次。以血球计数板计数，并用无菌水稀释孢子浓度为105个/mL。
6.农杆菌的预培养和菌液浓度的测定
1)从LB固体平板(含50μg/mL卡那霉素)上挑选一个新鲜培养的农杆菌AGL-1单菌接种于5mLLB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，200rpm，28℃过夜培养；
2)第二天将200μL培养液转移到5mL含50μg/mL卡那霉素的IM诱导液体培养基中，28℃培养5-6h使OD600达到0.5-0.6。其中IM培养基不含乙酰丁香酮(AS)。
7.农杆菌和分生孢子的共培养
取100μL诱导好的农杆菌AGL-1菌液和100μL稀释好(105个/mL)的蛹虫草菌分生孢子悬浮液混合，混合液(200μL)均匀涂于铺在CO-IM培养基平板上的硝酸纤维素膜(121℃高压消毒30min)表面，CO-IM平板含200μmo1/L乙酰丁香酮(AS)。23℃共培养2天。
蛹虫草突变子g38已经带有hyg基因，在Rhf1恢复突变时不能以潮霉素抗性筛选。因些在恢复试验中，共培养的蛹虫草突变子g38孢子浓度稀释为103个/mL，每次取混合液100μL涂板，平均每个平板可以长50个菌落。根据菌落的生长情况进行第一次筛选。
8.潮霉素抗性选择培养
将上面的硝酸纤维素膜转移到含潮霉素与抗生素的PPDA固体平板上，平板含1000μg/mL潮霉素(hygromycinB)，200μg/mL头孢霉素(cefotaxime)，60μg/mL链霉素(streptomycin)，将培养皿置于23℃环境下培养2天，直到转化子出现。
9.转化子的挑取和保存
一般2天后，选择平板上可长出单孢子菌落的转化子，用无菌镊子将转化子接种至含有200μg/mL头孢霉素和60μg/mL链霉素PPDA固体培养基的24孔板内。24孔板在23℃培养5-7天后，挑取转化子的菌丝体保存在40％甘油的PPDA液体培养基，充分混匀，贮藏于-80℃冰箱。
10.TAIL-PCR
TAIL-PCR扩增蛹虫草突变子g38中T-DNA插入位置，以AD1为兼并引物，参照Mullins等(2001)发表的文章，扩增T-DNA左右边界的序列。左右边界扩增的序列拼接出来的基因长度有2841bp包括从N端开始的937个氨基酸序列，但是并没有完全包括该基因的全长。从已知的序列设计出Rhf1-G1，Rhf1-GSP1，Rhf1-NGSP1引物，以AD1为兼并引物，继续TAIL-PCR扩增C端的约407个氨基酸序列。
TAIL-PCR所用引物如下：
| AD1 | WAGTGNAGWANCANAGA |
| RB1 | GGCACTGGCCGTCGTTTTACAACG |
| RB2 | AACGTCGTGACTGGGAAAACCCTG |
| RB3 | CCCTTCCCAACAGTTGCGCAG |
| LB1 | AGGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATG |
| LB2 | CATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCT |
| LB3 | CGAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT |
| Rhf1-G1 | CAACCCAACCAGCCACGCACCCTCC |
| Rhf1-GSP1 | GAGAAATCGCGGGCGCTGTCGAGGC |
| Rhf1-NGSP1 | GAGACTCCGCGACCACCGACATCCAG |
11.Southernblot分析
参照DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitⅠ。
12.蛹虫草RNAi干扰质粒和过表达质粒(OE)构建
高保真酶从pKHt质粒中PCR扩增ptrpC+hyg片段Phyg和启动子ptrpC引物如下：
13.Rhf1基因的RNAi干扰质粒和过表达质粒(OE)构建
Rhf1基因的RNAi干扰质粒和过表达质粒，都是在gpd启动子后面的多克隆位点插入目的基因产生的。RNAi干扰的Rhf1质粒，取该基因的最后位置633bp，合为iF5。
过表达质粒(OE)所用的Rhf1基因为全长。先用JM4基因组DNA为模板，以融合PCR的方法分三段扩增前面1587bp片段；再以cDNA第一链为模板扩增该基因后面第四个片段2846bp片段。这两个片段有437bp是重合的，以Rhf1基因的头尾引物可以扩增得到全长。引物下划线表示是限制性内切酶。
14.qRT-PCR检测野生型JM4和几个转化子Rhf1基因表达情况
qRT-PCR引物
荧光定量PCR检测是以蛹虫草的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(Gongetal.，2009)(GAPDH)为内参。按NCBI的primerdesign软件进行设计，GAPDH的qPCR片段长为278bp，Rhf1的为217bp，所设计的qPCR引物如下：
15.固体培养
各转化子或野生型JM4的孢子接菌至PPDA平板或接菌环划板，23℃黑暗培养1-4周，每周观察菌落的形态和生长速率，记录各种性状。
16.液体培养
加20mL液体PPDA到50mL三角瓶中(或50mL液体PPDA到250mL三角瓶中)，然后把不同菌种分别接到液体培养基中，每个接3瓶，写标签，做好标记。菌种制备：在无菌超净台上，无菌超纯水洗脱孢子，并过滤。血球计数并稀释孢子浓度到105个/mL，每瓶接种200μL(或500μL)。23℃，120rpm培养7d。
17.子实体培养
1)制备米饭培养基，高压灭菌后搬到接种室进行接菌。
2)接种：把每瓶液体培养的菌液以灭菌超纯水稀释3倍，每瓶接15mL菌液，每个菌种接5瓶。把接完菌的培养瓶搬到培养室，22℃完全黑暗培养。
3)菌丝生长阶段：培养室避光培养7天，等到菌丝长满面料，根扎到瓶底。
4)转色阶段：长满菌丝的培养瓶搬到培养箱，每天光照12h，此生长期可不用特意通风和加湿。
5)原基诱发：每天光照12h，抽风机通气1h，保持80％湿度。
6)子实体培养阶段：保持培养室的温度为20-23℃，每天光照12h，每天抽风机通气1h(上午半小时，下午半小时)，保持80％湿度。
7)采收：子实体长到端部开始膨大时，可进行采收。采收时，先用勺子将整个培养基从瓶中挖出，然后把子实体全部拔起，清除饭粒和杂质。
8)记录子实体生长过程的具体情况，拍照。
2.3.24菌球干重和子实体干重
1)菌球干重：收集23℃，150rpm培养8天的20mLJM4和g38菌球液，弃培养液。无菌超纯水清洗3次，9000rpm离心15min收集菌球。每个样品三个重复，冷冻干燥直到恒重。记录重量值。
2)子实体干重：收集3瓶JM4和g38子实体的鲜重，记录重量值。收集JM4和g38的子实体，称10克左右到50mL离心管中。每个样品三个重复，冷冻干燥直到恒重。记录重量值。
结果与分析
2.4.1一株性状特异的转基因蛹虫草g38
以野生型的蛹虫草(Cordycepsmilitaris)JM4(该菌株公开于文献：ZhengZ,HuangC,CaoL,XieC,HanR.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationasatoolforinsertionalmutagenesisinmedicinalfungusCordycepsmilitaris.FungalBiol.2011Mar；115(3):265-74，该菌株本申请人也持有，可以本申请申请日起20年内向公众提供)为材料，参考文献(ZhengZ,HuangC,CaoL,XieC,HanR.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationasatoolforinsertionalmutagenesisinmedicinalfungusCordycepsmilitaris.FungalBiol.2011Mar；115(3):265-74)中公开的农杆菌介导(ATMT)方法，以ATMT方法把载体pKHt-gfp(一般是将gfp基因直接插入到载体pKHt的XbaⅠ酶切位点处，本发明为了强启动gfp基因，在gfp基因的前面加上gpd启动子，基因后面加上trpc终止子，再插入到载体pKHt中，具体的插入片段是HindⅢ酶切位点+gpd启动子+XbaⅠ酶切位点+gfp+XbaⅠ酶切位点+trpc终止子+pstⅠ酶切位点)导入到蛹虫草JM4的分生孢子中，构建蛹虫草JM4突变子库，经过筛选发现一株生长性状特异的转化子，命名为蛹虫草突变子g38。
2.4.1.1菌丝生长速度缓慢
从图1可以看出：野生型蛹虫草JM4的菌丝蓬松，气生菌丝多，生长较快，可以看到菌落的生长圈有很多新菌丝。而蛹虫草突变子g38紧贴在培养基表面上的生长，基本没有气生菌丝，生长速度极慢，菌落周围的轮廓清晰。
以无菌超纯水从固体PPDA平板上洗下野生型蛹虫草JM4和蛹虫草突变子g38的分生孢子，三层无菌擦镜纸过滤2次后,以血球计数板计数，并用无菌水稀释孢子浓度为105个/ml。在每个固体PPDA平板的中央滴加5μL的菌液，自然吸干在直径为6mm的圆圈内。每个菌株重复3次，实验重复3次。23℃培养，每7天以十字交叉法测量菌落的直径。图2是培养4周的菌丝，蛹虫草JM4直径的平均值为8.05cm，蛹虫草突变子g38的平均值为3.92cm，在p<0.001水平上差异显著。
2.4.1.2液体PPDA培养的菌球生长
蛹虫草JM4和蛹虫草突变子g38经液体PPDA培养7天后，取出拍照。结果如图3所示，蛹虫草JM4的菌球比较松散，颗粒较大，轮廓不清晰，菌球边缘有菌丝，菌液也比较混浊。而蛹虫草突变子g38的菌球紧密颗粒小，轮廓清晰，菌球边缘菌丝极少，菌液澄清。
一般来说，菌球紧密，颗粒均匀细密的特征，是生产上优质蛹虫草菌株的选择标准。这说明蛹虫草突变子g38是一个在生产上可以利用的菌种。蛹虫草突变子g38培养的PPDA液体比较澄清，但是菌液相比野生型的偏黄，在黑暗中培养后的菌球也偏黄金色。
2.4.1.3液体PPDA培养的菌球干重
取20mLPPDA液体于50mL三角瓶中，分别加入蛹虫草JM4和蛹虫草突变子g38的孢子液200ul(105个/ml)，25℃，120rpm，黑暗培养7天。每瓶菌球无菌超纯水洗2次，离心后冷冻干燥。每个处理重复3次，平行实验重复2次。冷冻干燥后，平均每瓶的蛹虫草JM4菌球干重是0.246g，平均每瓶的蛹虫草突变子g38干重是0.297，p<0.05水平上差异显著(图4)。
2.4.1.4液体PPDA培养的菌丝生长和孢子产量
蛹虫草JM4和蛹虫草突变子g38的孢子液在PPDA液体培养液中正常生长7天，取出菌球显微镜检。从图5可以看到：蛹虫草JM4只有一级分枝，分枝之间的距离较远，一般都相距100nm以上；蛹虫草JM4没有二级分枝，一级分枝不断伸长；培养7天的蛹虫草JM4一级分枝长度多在500nm以上；蛹虫草突变子g38有一级分枝，分枝间的距离较近，大多数间距在10-100nm之间；蛹虫草突变子g38的一级分枝上有二级分枝，培养7天的一级分枝长度在300nm以内，二级分枝一般都在100nm以内。
在液体培养7天左右，蛹虫草突变子g38的孢子量已经很大达到3.85×105个/mL孢子，是蛹虫草JM4(1.18X105个/mL)的3倍以上(图6)。可能因为蛹虫草突变子g38的分枝多，在每个分枝上都能产孢。
蛹虫草JM4和蛹虫草突变子g38孢子浓度实验，每个处理重复3次，平行实验重复2次。在p<0.0001水平上差异显著。
2.4.1.5原基分化情况
一般地，菌丝黑暗培养7天后，菌株在12小时光照条件下进行原基分化和子实体生长。野生型蛹虫草JM4的转化和原基分化一般需要18-21天才能完成，而蛹虫草突变子g38在7天内就能完成转色和原基分化。蛹虫草突变子g38的原基分化后，子实体生长很迅速，大约再5周就可以收获。蛹虫草突变子g38因原基分化所用时间少，所以子实体收获时间也相应提前2周左右(图7)。
2.4.1.6子实体的形态和产量
同时进行子实体培养，蛹虫草突变子g38可以提前收获。相较于野生型蛹虫草JM4的子实体，蛹虫草突变子g38的更粗壮(图8)，每瓶的子实体产也有所提高。冷冻干燥后，野生型蛹虫草JM4的子实体含水量也稍高于蛹虫草突变子g38。
蛹虫草JM4和蛹虫草突变子g38的子实体培养，每个菌株重复5次，平行实验重复2次。每瓶野生型蛹虫草JM4的子实体产量平均17.93g，而蛹虫草突变子g38的产量是20.84g，在P<0.05水平下差异显著(图9)。
蛹虫草JM4和蛹虫草突变子g38的子实体含水量测定中，每个菌株重复6次。新鲜的子实体分装在50mL的离心管里，每管10g，冷冻干燥直到恒重后计算含水量。野生型JM4的子实体含水量为87.25％，而g38的是86.12％，在P<0.05水平下差异显著(图10)。
2.4.2Tail-PCR扩增突变子g38的T-DNA侧翼序列
首先，利用pKHt已知的LB和RB序列(Mullinsetal.，2001)以及兼并引物AD1相配对，扩增蛹虫草突变子g38的T-DNA左右边界。对Tail-PCR的第三轮产物进行回收、克隆和测序。通过NCBI的blastx发现序列是蛹虫草CM01菌株的filamentationprotein(Rhf1)基因(ID:XP_006668027.1|，本节中的序列表所示的序列)，其蛋白质全长是1322aa(SequenceID:ref|XP_006668027.1|)，cDNA全长为3969bp(SequenceID:ref|XM_006667964.1|，具体序列如SEQIDNO.1所示)。
第一次Tail-PCR左边界产物只包含1-90aa，那么T-DNA是插入到Rhf1基因的第91个氨基酸位置(即在Rhf1基因的第684bp后面插入T-DNA)，打断了Rhf1基因的正常表达。第一次右边界的产物只得到104aa-947aa的Rhf1基因DNA序列。这说明在T-DNA插入的同时，还造成Rhf1基因从91-103aa(即Rhf1基因的第685-723bp，CAAGCCCGCCCGACACCCTTTCTCCTGACGCGAGCACTG)的丢失。T-DNA插入导致基因缺失的情况，是ATMT方法的特点(Meng等，2007；Choi等，2007)。
2013年时，NCBI上还没有filamentationprotein的DNA或cDNA序列，根据已知的947aa序列设计3个正向引物(Rhf1-G1、Rhf1-GSP1和Rhf1-NGSP1)，再一次Tail-PCR扩增剩下的375aa序列。
蛹虫草JM4的Rhf1基因序列与蛹虫草CM01的Rhf1基因序列相同。
蛹虫草Rhf1基因的全长如下，其中灰体字母+边框为内含子。
ATGAGGTACACTGGGCAACAGCACATGAAGAATTCC GAAAAATTAGTTACACAAAAGCCTGAATGGAAACAAAAAACCCAAGTACCTACACATGTCCACGCCTTCCCTCGCTCCAGCGCTCTTCCGGGGCCGAGGCTCGCTGCTGTCACGGACCTGACCTAAGGGAGTTAGCCCAGCCAGGTACCTCCGAGACCCCTCAGCTACCAGTCAAGTCACCCCGGCTCTCCGCCTTGCAGATGCCATTGCGTGCAT GTCGTCACCCAAAGCAAGCAAGCCCGCCCGACACCCTTTCTCCTGACGCGAGCACTGCATAATAAGCAAGCTGCGTTTGCGCTTCCCAGTCTCTTGCGTCGGAGTCTCTGCGCAAACATGACGCTAACTGACAGCGCCTCCCTCCAGACCAAAGCCGCCAACTACATTGAGCAGCTCGACAATGCCCGCTGTCGAGGCGATTGGGCTGCTGTCCCTGAGCTCGTCCGCAAAGTCCGCAAGCACGCTCCCCAGAGAGAATGTATACCATCAACCTATCCTCAGCTGCCTTTACGAGCATTTGCTAATCTGCTCCTTTCTCCAGGCCTCACCCTGACCGCTGAAACCGAATGTGCCATTTCCAGTGCGACAACGGGTTCCGAGCGCCCCTCTATAGCCGCCATCGTCGAGAAGCTCAATGTTGACGCCATCATACCCAAGCTGCAGGCTGCCATCGACGGTGAGACGGCCAGCAGGCAGGATCCCTTTCAGGCTCGTGTGTGTGTCGGCTGGATGTACTGGGTCGTGGCTGAATATACTCTCGCCCTCGACCACCTTCCCGCTGGCCTCGCCGAAGCTGCCCAGGATGCCCGTGATACTCTGACCGAGTGGACCAGCGTCTGCGCCATGAAGTCCGCCTACCTCAGAGCCAATTGCCTCATGCGCGACAACGAGCGCCAGTTGGCCCTCGCCGCCTTTCAGTCCGGTCTGCCCTCCCTCGACCGCGTCTGGGGCGGCCAGCCTGTCCACTCCCAGCTCAAGTACTGGTCCGAGCTCTACCTGACCGAGTACTGCATCTTGACGAGTGAATCGATCCGCCAAGGAGACGTCACATTCGGCCAGCAAAACTCCATTTCTTGCTTCCGCGCCTGGGCTCGATACTGGGAGGCCATGTCGGCTCCCGTCACCGGTGGCTTTGGCTTCAAGGGCTCCGCCACATCCGTCCCCCGACGCTCAATATGGAACGAGTACTACCAGGGGCTCTCCAAGCATCTTCTCAATGACGACACATTTCCTCCTGCCAACCTTGGTAACGTCTCCGCCGACACACCTGCTCGGACTCAACTACGAATGGAGCTCAAGCGCGTTGAGGCCTCCTACGAAAAGCTTCTCCTGTCTGAGACGACATTTCCTCGAGCTGACGAGCATCGTGCCGAGGTAGAGCAGTTTGTGAAGCAAGTTATGGACAATTGGGCTATTCTCTGTGGCCGTGGCTGGAGCGAAGGGGACCTTGGCCAGAGCGGTCGTGCCGGCATCACCCACGGCGTCCTCGAAACATTGTACAGCGCTGCAACGAAAACCTATCATTCTACACTCATTCTTCGATCACTATTCAGCGCCCACGTCGCCGTCGCTGAATTCGACCCTGCCTTCAAAGCGCTAGACTCATATCTTGAAATCGTAAACAAGGGGAAAGCCCGAGTCGCCAAAACCGGCATTCCCGAGCCTAGCTTGGACAGCGATGCTACTGTTTTGGAAACGATTTCTCAGGCTATCATGACCCTTTGCCGCTACGGCCACCACAAATCTGCAGAAAAGGCTCGCCAGCTTGGTGCTGAGCTCGAAGACTGGCTTGCCAGACTATCTCAGAACCAGTCTGGCACCGAATCCAGCAGTTTCGTCCCACCCCGCGTCATTGCGCTTGCTTGGCAAGCTATCGGCTTGTCCCATGCTCATTGGTCTCGCTCAACTTACGAAGCAGCGTCCCGAACTGAGATTCAGTCAAAGGCTATTCGCTGTCTACGGAAGTCGCTTTCTTCTGAATACGGCAGGTCAAAGGATACTCGCAGCATCTTTGCCCTCGGCGTGCTCCTTGCCGAACGCAAAGAACTCTCTTCAGCCCTCGAGATCGTCCGAGCTACGCTCATGTCTACTAAACGTGATGAAAGCAGTATCAACGATGAGCTCTACAGTGGCCCGTATTGGCAAGAGAGATCACTCATTTCCATGTGGCATCTCTTAGCGCTCCTGCTGAGCGCTCGTCAGGACTATGCCATGGCTAACAGAGCTTGCGATGGCGCCGTCGAACAATTTAAGGACCCATCTATTCTATTTGGGAAGACGGAAAACTTCAAGAGCGAGCATCTCAATGACGCGGAAGCAAAGAGCATCTCCACAGAAGTGCAAGGTGGGCTGGTTGATGAGATGGACGACTTCGAAAAGGAAGAGCTCCTCGAAGTCAAAATGACGCAACTGGCCCTCATCGAACTACAAGATGGCCCTAATGCAGCAGTCAACGCTAGCTACGAGCTTCTCTCGCTATTTACACGTCTGTTTGGCAACCTTTCAACCCAACCAGCCACGCACCCTCCGTCTGACGCTGGTTCCAAGACGGCGTCCGGTCGGAGCAGTCTGCGCGGCAGCATCTTTGCGTCCAAGGAGAAATCGCGGGCGCTGTCGAGGCAGTCGGACGAGGCTTTGAGAGATAGGGGCGCGGCACTCCCTATTAGACCTCCCACCTCTCAGACAGTGGCACCCTCCATTCAGGTAACAGACGAGACTCCGCGACCACCGACATCCAGCCGCGCTAGCCTTGGGCCCGGTGACGCCCCTCGACGCAACAGTCTGAAGAAGAGAAATCGCAGCCAGAGCAGAGGACAAACGACCACCAACGGCACACACATTGACGGCGAACCCTTCTTCACGCCCAACGGTGACGGCAGCCAGCCCAACACTCCAAGAGGCCCACCAGTCGCCATGTCGTCCTCGTTCCTCACACGCGAAAAGACAGTCTCTTCAATCAACTCGCGCGGCTCCATCATGTCCAAGGGCACAGAATTTTCAGAACTCTCTTTGGAAATGACACATGTACCATCACACCTGCTGCCGCTGGTGCAGTTCTCCAAGGACAAGGAGAGGTCCAGACGCACGGCTGTCCTGGTCAAGGTCTGGACAATGATTGCCGGCTTCTACCGTCGTGCACATATGCTTGACGAGTGCAAAGCTGCCATTACAGAGGCGCAAAAACTAGTACAGGGTTTGGAAACAGAGGCGAGTCGCGATCCTTCGGTCACTGGGGCCGCAAGGTCTAGCGTCTGGGCCGAAAAGAAGAGTATCGAGGCTCTGTGGGCTGATATTTCCTCGGAG CTTGGTTTACTCTCAATTGCCCGAGGCAAGCCTTTTGAAGCCCGGGCCGAATTCGAGAACGCTCTGACGCATTATCCCGACCACCCCGCCGCAACCATTGGCTTGTCTAATATTCTCCTTGATATCTACAGCGAGCTGCTTCTTCCCGAACCCGCCATCCCAGCGCTGACCAACAGCGAGGTGGCTTCCGACCCTGCCAGTGTTGCGCTGCACGAGCATGCCCGCAAAGCCGCTTGCGCCGCCGCGGGCTCCCTGCCATCTGTCGCGCTTGGCTTGGGGCCGTTGACCACGATTGAGGACGAGCCGGCTCTGGCTCCGGGCGCGAAACCGACTCCCGTTTTCAGCCGTGCTAGAGACAGCAGTGACAGCCTCCCTGCGCCCTACAAGACGACAAGCCTGCCACTGTCCGATCGCCTGGCTGCCCGCGACCGCGCCTACACGCTGCTCTCGGGGCTCACACGGCTGGGCACGGCGTGGGACTCATCGGAGGCGTGGTTTGCGCTCGCCCGTGCCTACGAGGAAAGCGGACAGCCTGATAAGGCCAAGGAGGTGCTCTGGTGGTGCGTGGAGCTGGAAGAATCGAGCGGCGTGCGGAGTTGGCGTAACGTTGCTGCCAACGGCTACATTGTTTAA
2.4.3Southernblot分析Rhf1基因在JM4基因组中的拷贝数
DNAman软件分析Rhf1基因的DNA序列，发现序列中没有限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ位点；在第64个碱基位置有一个XbaⅠ位点。设计引物如下：
Rhf1-NG：GAGACTCCGCGACCACCGACATCCAG
Rhf1-R:TGCCAACGGCTACATTGTTTAA
可以扩增Rhf1基因末端的1279bp(2.4.2中序列表中最末的1279个bp碱基)序列，命名为Rhf1-NG。PCR片段回收纯化后再克隆至载体pMD-19T中，酶切后可作为Southernblot阳性对照。从图12的Southernblot结果可以看到：3种酶切JM4基因组的结果都是一条带，所以可以认为Rhf1基因在野生型蛹虫草JM4中只有一个拷贝。
2.4.4Rhf1基因在野生型蛹虫草JM4和蛹虫草突变子g38中的表达情况
液体PPDA培养蛹虫草JM4和ΔRhf1基因的蛹虫草突变子g38，22℃120rp黑暗培养，分别在7天和14天取样。样品洗涤后提取的总RNA并去除gDNA。各个总RNA反转录第一链后，取适量用于荧光定量PCR检测Rhf1的转录情况。
从图13不同培养时间Rhf1基因的表达情况看：在野生型蛹虫草JM4中，Rhf1基因在7天和14天的mRNA表达量差异不多。说明在一定的时间内，Rhf1基因的表达情况比较稳定。蛹虫草突变子g38的Rhf1基因表达量也比较稳定，约是野生型表达量的30％，在P<0.001水平下，表达量差异显著。说明T-DNA插入Rhf1基因导致g38突变子的Rhf1基因表达显著下降。
2.4.5在蛹虫草中表达Rhf1基因的质粒构建(OERhf1)
2.4.5.1表达质粒(OE)构建
为了构建能在蛹虫草中表达目的基因Rhf1基因的表达质粒OE，OE载体所包括的原件：原核生物复制子基因和氯酶素抗性基因(2.2Kb)、潮霉素抗性和启动子基因(1.4Kb)、一个真菌常用的构巢曲霉的启动子基因(gpd约2.2Kb)、多克隆位点和一个真菌常用的构巢曲霉终止子基因(trpC约0.75Kb)。原核生物复制子和氯酶素抗性基因使表达质粒在原核状态时可以进行护筛选和大量复制；潮霉素抗性基因使蛹虫草突变子也可以使用潮霉素B抗性筛选。单个gpd启动子基因使连接在后面的目的基因在蛹虫草中可以大量表达。具体的OE载体图如图14所示。
BamHI和EcoRI双酶切OE载体，理论上应该得到一个原核生物复制子基因和氯酶素抗性基因(2.2Kb)以及构巢曲霉终止子基因(trpC约0.75Kb)的片段，大小约为3Kb；剩下的载体大小为3.7Kb。从图15可以看到，所有6个克隆的双酶切结果都和理论是一致。
2.4.5.2Rhf1基因的表达质粒(OERhf1)构建
XbaI酶切OE载体和Rhf1基因图如图16所示
Rhf1基因全长基因的引物如下：
XbaⅠ-Rhf1-F:GCTCTAGAATGAGGTACACTGGGCAACAGC
XbaⅠ-Rhf1-R:CCCTCTAGATTAAACAATGTAGCCGTTGGCAG
按照上述实验材料与方法中步骤13中的方法，应用上述引物，扩增Rhf1基因全长(其序列如SEQIDNO.1所示)，然后再将其插入OE载体中。
OE载体经XbaⅠ单酶切后，胶回收纯化并CIAP处理，防止载体自连接。取适量经处理的载体片段和Rhf1全长基因相连接，转化并测序检验克隆子，由此得到Rhf1基因插入OE载体中的正确OERhf1质粒，该含有Rhf1基因的表达质粒(OERhf1)载体的序列如SEQIDNO.2所示。
理论上XbaI限制性内切酶可以把OERhf1载体切成载体(6.6Kb)和Rhf1基因(约4Kb)两个部分。从图17看OERhf1重组质粒的单酶切结果，4个克隆的酶切结果都与预期一致，说明OERhf1质粒构建成功。
2.4.6在蛹虫草中RNA干扰Rhf1基因的质粒构建(iRhf1)
2.4.6.1RNA干扰质粒(RNAi)的构建
为使RNA干扰质粒能在蛹虫草中使用，所构建的载体包括：原核生物复制子基因和氯酶素抗性基因(约2.2Kb)、潮霉素抗性基因和启动子(约1.4Kb)、一个真菌常用的构巢曲霉启动子基因gpd(约2.2Kb)，多克隆位点(MCS)和另一个真菌常用的启动子基因ptrpC(约0.37Kb)。gpd和ptrpC这两个启动子基因是反向连接的，中间以多克隆位点间隔，这样才能使插入其中的目的基因产生反向重复的mRNA，对基因组中的目的基因产生RNAi干扰的效果。
RNA干扰质粒是以OE质粒为基础进行改造的，因为gpd基因中含有PstⅠ酶切位点，所以不能直接用PstⅠ和KpnⅠ双酶切除去trpC，换上ptrpC。首先只能先用一个不带PstⅠ位点X基因来替换gpd。这时就能以ptrpC替换trpC，然后再把X基因切去，连接上带多克隆位点的gpd基因。这样RNAi质粒构建完成。具体的RNA干扰质粒(RNAi)图谱如图18所示。
理论上KpnⅠ和PstⅠ可以把RNA干扰质粒切成两个条带：大片段载体(约5.9Kb)和小片段ptrpC基因(约0.3Kb)。从图19，至少有4个克隆子的双酶切结果和预期一致，说明RNA干扰质粒构建成功。
2.4.6.2Rhf1基因RNA干扰质粒(iRhf1)的构建
iRhf1质粒中的Rhf1基因干扰片段，是用该基因C端的633bp碱基(2.4.2的序列表中的最后633bp)，命名为Rhf1-5。
扩增Rhf1-5片段的引物如下：
KpnI-Rhf1-5F：GGGGTACCCTTGGTTTACTCTCAATTGCCCG
XbaⅠ-Rhf1-5R：CCCTCTAGATTAAACAATGTAGCCGTTGGCAG
以蛹虫草JM4基因组作为模板，扩增Rhf1-5片段。
图20是分别用KpnⅠ和XbaI双酶切Rhf1-5片段和RNAi载体图。
利用KpnⅠ和XbaI分别双酶切RNA干扰质粒和Rhf1-5，然后将酶切片段连接，使Rhf1-5片段插入到RNA干扰质粒中，由此得到iRhf1干扰质粒，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
理论上KpnⅠ和XbaI可以把iRhf1干扰质粒切成两个条带：载体(约6.2Kb)和633bp的Rhf1-5片段。从图21看，5个克隆子中有3个的双酶切结果(泳道3、4和5)和预期一致，说明iRhf1干扰质粒构建成功。
2.4.7蛹虫草Rhf1基因的RNA干扰、过表达和恢复突变的转化子构建
2.4.7.1Rhf1干扰的突变子库构建
以ATMT法，将iRhf1干扰质粒转入野生型蛹虫草JM4孢子中，构建突变子库，转化子命名为JM-iRhf1。以转RNAi空载体为对照，突变子命名为JM-RNAi。按常规保存及进行后续实验。
2.4..7.2Rhf1过表达的突变子库构建
以ATMT法，将OERhf1质粒转入野生型蛹虫草JM4孢子中，构建突变子库，转化子命名为JM-OERhf1。以转OE空载体为对照，突变子命名为JM-OE。按常规保存及进行后续实验。
2.4.7.3Rhf1恢复突变的转化子库构建
以ATMT法，将OERhf1质粒转入蛹虫草突变子g38孢子中，构建突变子库，转化子命名为38-OERhf1。以转OE空载体为对照，突变子命名为38-OE。按常规保存及进行后续实验。
2.4.8qRT-PCR筛选Rhf1的3个突变子库
分别对Rhf1的3个突变子库，各选择10个突变子提取总RNA，经相应处理后以qRT-PCR的方法筛选合适的转化子进入下一步实验。
2.4.8.1qRT-PCR筛选JM-iRhf1突变子
以JM4和JM-RNAi为对照，选择10株JM-iRhf1突变子进行qRT-PCR检测Rhf1的表达。
从图22的Rhf1基因干扰实验可以看出：iRhf1确实可以干扰野生型JM4中Rhf1基因的表达，说明所构建的载体是有效的，但是是干扰效果并不一致。从Rhf1干扰的qRCR图可以看出，RNAi空质粒转入JM4(JM4-RNAi)并不能影响Rhf1的表达。g38是Rhf1基因被破坏的菌株，它的Rhf1仍有一定表达，大约是野生型JM4的0.3倍。标号1、3、4(分别是JM-iRhf1-1、26、29突变子)的干扰效果最佳，比g38的相对表达量还小；标号5、7、9的效果较差，Rhf1相对表达量都在0.7以上；其他突变子Rhf1相对表达量和g38的接近。参照g38的Rhf1表达量，选择3个Rhf1的表达量最低(JM-iRhf1-1、26、29突变子)的突变子进入后续实验。
2.4.8.2qRT-PCR筛选JM-OERhf1突变子
以JM4和JM-OE为对照，选择10株JM-OERhf1突变子进行qRT-PCR检测Rhf1的表达。
从图23JM4过表达Rhf1基因的结果可以发现：OE空载体(JM4-OE)并不影响Rhf1的表达；过表达Rhf1基因的蛹虫草转化子中有2个没有变化，可能没有转化成功。其他8个突变子Rhf1基因的表达都有不同程度的提高，提高的效果变化很大。其中标号2和5的转化子中，Rhf1基因并没有提高；标号8(JM-OERhf1-59)和9(JM-OERhf1-60)转化子的Rhf1基因表达量是JM4对照的4倍左右；标号6(JM-OERhf1-44)和10(JM-OERhf1-66)甚至达到了5倍以上。
以上结果说明过表达Rhf1基因的方法在蛹虫草中是可行和有效的。参照JM4的Rhf1表达量，选择3个Rhf1基因表达量最高的(JM-OERhf1-44、60、66)突变子进入后续实验。
2.4.8.3qRT-PCR筛选38-OERhf1突变子
以g38和38-OE为对照，选择10株38-OERhf1突变子进行qRT-PCR检测Rhf1的表达。
从图24看，只转入表达载体的38-OE突变子与对照的Rhf1基因并没有明显变化。突变子g38转入Rhf1表达质粒后，各个转化子的Rhf1基因恢复情况并不一样。其中，1和3号38-OERhf1转化子的Rhf1基因相对表达量是JM4三倍以上，10号的表达是JM4的1.2倍左右，而6、7、8号转化子的表达水平处于g38和野生型JM4的Rhf1表达水平之间。参照JM4的Rhf1表达量，选择Rhf1的基因恢复的最好的3个(38-OERhf1-1、3、10，分别对应1、3和10号)突变子进入后续实验。
2.4.9JM-iRhf1各转化子的生长情况
根据qRT-PCR的结果选择JM-iRhf1-1、JM-iRhf1-26、JM-iRhf1-29等3个RNA干扰突变子进行液体培养和子实体培养，观察突变子的生长情况。实验以野生型JM4、JM4-OE和g38为对照。
2.4.9.1菌丝形成
取20mL液体PPDA于50mL三角瓶中，分别加入200ul(105个/ml)JM4和相关菌株的孢子液，25℃，120rpm，黑暗培养7-10天。在第七天取出菌球，双蒸水清洗3次，离心弃上清。沉淀用DAPI染色4℃过夜，清水洗3次后在荧光显微镜下拍照。
结果如图25所示，液体PPDA培养一周后的菌丝中，JM4(蛹虫草JM4)的分枝不多，没有次极分枝；大多数分枝间的距离都是100μm以上；JM4的菌隔间距约20-25μm；而g38(蛹虫草突变子g38)的分枝多，有次极分枝；分枝之间的距离多在10-50μm之间。所以JM4的固体PPDA平板都显示出蓬松的菌丝特征，而g38呈现紧密和扁平的状态。JM-iRhf1突变子的菌丝分枝比JM4多，多数分枝的距离在100μm以内；菌隔的间距在15-20μm之间。
2.4.9.2原基分化
在图26中，可以发现JM-iRhf1突变子的原基分化比野生型JM4早，但是比g38的晚。在各菌株接种14天ΔRhf1突变子g38的原基已经完全分化完成，接下来的一周它的子实体可以长1cm左右(第三周)。接种后第三周的JM-iRhf1也基本原基分化完成，此时的JM4的才开始分化。这个结果也说明，蛹虫草的原基分化与Rhf1的表达水平成负相关。
4.9.3子实体形态
从图27和28看，JM-iRhf1突变子的子实体确实比野生型蛹虫草粗壮，基座膨大的子实体非常常见。在JM-iRhf1突变子中，Rhf1的基因表达被抑制，所以出现和g38类似的特征。
2.4.10JM-OERhf1各转化子的生长情况
根据qRT-PCR的结果选择JM-OERhf1-44、JM-OERhf1-60、JM-OERhf1-66等3个过表达突变子进行液体培养和子实体培养，观察突变子的生长情况。
2.4.10.1菌丝形成
取20mL液体PPDA于50mL三角瓶中，加入200ul(105个/ml)JM4和JM-OERhf1的孢子液，25℃，120rpm，黑暗培养7-10天。在第七天和第10天取出菌球，双蒸水清洗3次，DAPI染色，显微镜下拍照。
液体培养7天的菌丝生长情况：
如图29，JM-OERhf1突变子的菌丝上有很多短的分枝，而且短分枝上不断再进行次极分枝。实际上这种分枝并不是菌丝，而是分生孢子梗高度分化的结构。孢子梗不断的分化，此时并不释放出孢子，所以在培养7天左右的培养液里含有的孢子很少。
液体培养10天的菌丝生长情况，具体如图30和31所示：
继续液体培养3天，高度分化的分生孢子梗成熟后从JM-OERhf1突变子的菌丝上脱落，然后才分裂出分生孢子。一般来说，菌隔间距小于5μm的菌丝，实际上是分化的分生孢子梗结构不是菌丝，它在成熟后会脱落然后分裂形成分生孢子。JM-OERhf1的菌丝隔的距离都比JM4小很多，多数落在5-15μm之间。
实验结果说明，Rhf1影响蛹虫草的分生孢子梗的分化程度，从影响分生孢子的形成速度；Rhf1也影响菌隔间的距离，Rhf1表达量增加而菌隔间的距离变小，说明他们是负相关。
2.4.10.2孢子产量
取20mL液体PPDA于50mL三角瓶中，加入200ul(105个/ml)JM4和JM-OERhf1的孢子液，25℃，120rpm，黑暗培养7-10天。在第七天和第10天混匀菌球液，取PPDA液体，血板计数，显微镜下拍照。
在液体培养7天后，JM-OERhf1突变子的孢子产量极少。但是在培养10后，JM-OERhf1的孢子产量迅猛增加。原因是在野生型JM4过表达Rhf1基因，促使分生孢子梗分化非常复杂，延迟产孢。具有复杂结果的分生孢子梗成熟后，可以分裂成数量巨大的孢子。这种复杂的分生孢子梗只在JM-OERhf1突变子里可见到的结构，而且数量很多。
液体PPDA培养7天时，孢子生长如图32所示。
液体PPDA培养10天时，孢子生长如图33所示。
2.4.10.3原基分化
在JM4中过表达Rhf1基因，使JM-OERhf1突变子的原基分化延迟。从图34看，蛹虫草接种3周后，野生型JM4开始出现原基分化，而JM-OERhf1没有任何原基出现。随后的培养中，JM-OERhf1突变子有出现少量的原基，但是也不能继续生长成正常的子实体。
2.4.10.4子实体形态
从图35和36可以看出，在其他菌株收获子实体时，JM-OERhf1突变子只有徒长的菌丝和矮小的不能长成子实体的原基。这个结果也再一次证明，Rhf1基因的表达和蛹虫草子实体的原基分化成负相关。
2.4.1138-OERhf1恢复突变的转化子生长情况
根据qRT-PCR的结果选择38-OERhf1-1、38-OERhf1-3、38-OERhf1-10等3个过表达突变子进行液体培养和子实体培养，观察突变子的生长情况。
2.4.11.1菌丝形成
从图37可以看到38-OERhf1突变子的分枝间距变大，分枝比g38少。
2.4.11.238-OERhf1原基分化
从图38可以看出，在ΔRhf1突变子g38中补偿表达了Rhf1基因，各个转化子的原基分化都有所推迟。而且随着补偿程度越高，38-OERhf1突变子的原基分化原晚。38-OERhf1的1、3、10号突变子，Rhf1基因的补偿程度是按顺序减少的。从38-OERhf1原基分化图可以看到：补偿最多的1号突变子，原基分化最晚。接种后培养14天，野生型JM4和38-OERhf1-1没有原基出现，而g38和38-OE的原基分化已经完成。Rhf1补偿程度较低的3号和10号转化子，它们已经出现少数的原基部分分化。这个结果说明Rhf1的表达确实影响蛹虫草原基分化，呈负相关的关系。
2.4.11.3子实体形态
从图39和40可以看出，随着Rhf1基因的补偿程度越高，38-OERhf1突变子性状越像野生型JM4，反之更像g38。38-OERhf1的1、3、10号突变子，Rhf1基因的补偿程度是按顺序减少的。其中1号突变子形态更像野生型JM4，子实体比较细长。10号突变子的补偿程度最低，它的子实体更像g38，比较粗壮。38-OERhf1子实体粗细程度介于野生型JM4和g38之间。
Claims (3)
1.一种蛹虫草(Cordycepsmilitaris)工程菌，其特征在于，其是将蛹虫草的菌丝分裂蛋白基因失活后获得的工程菌。
2.根据权利要求1所述的蛹虫草工程菌，其特征在于，所述的蛹虫草工程菌是在其菌丝分裂蛋白基因的第684bp后面插入了T-DNA序列，并且其菌丝分裂蛋白基因的第685-723bp缺失。
3.核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的菌丝分裂蛋白基因在控制菌丝分枝、分生孢子梗分化、原基分化速度、子实体的粗细、缩短蛹虫草栽培时间和/或提高蛹虫草子实体产量中的应用。
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Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111349648A (zh) * | 2020-02-28 | 2020-06-30 | 浙江工业大学 | 一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法 |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102657032A (zh) * | 2012-05-25 | 2012-09-12 | 广东省微生物研究所 | 一种提高蛹虫草子实体产量的方法 |
| CN103609331A (zh) * | 2013-11-18 | 2014-03-05 | 安徽农业大学 | 利用交配型对蛹虫草菌株复壮和提高子实体产量的方法 |
-
2014
- 2014-05-21 CN CN201410217012.XA patent/CN104031850B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
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| CN102657032A (zh) * | 2012-05-25 | 2012-09-12 | 广东省微生物研究所 | 一种提高蛹虫草子实体产量的方法 |
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation as a tool for insertional mutagenesis in medicinal fungus Cordyceps militaris;Zhuangli Zheng等;《Fungal Biology》;20110331;第115卷(第3期);265-274 * |
| Cordyceps militaris CM01 filamentation protein (Rhf1), putative (CCM_02812), partial mRNA;Zheng, P.等;《GenBank Database》;20140114;Accession No. XM_006667964 * |
| 原生质体紫外诱变选育蛹虫草新菌种的研究;车振明等;《食品与发酵工业》;20040830;第30卷(第08期);35-38 * |
| 蛹虫草国内外研究的新进展;郑壮丽等;《环境昆虫学报》;20110615;第33卷(第2期);225-233 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104031850A (zh) | 2014-09-10 |
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