CN111187854B - 苔草分子鉴定的ssr引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物分子生物学检测领域，特别涉及苔草分子鉴定的SSR引物及应用。本发明基于二代高通量测序技术，对四个苔草品种进行10x基因组覆盖RAD测序，通过对其基因组特征分析，开发和构建SSR图谱，本专利对苔草品种和种质资源鉴别有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学检测领域，特别涉及苔草分子鉴定的SSR引物及应用。
背景技术
我国草坪地被植物种质资源极为丰富，其中的苔草属就是值得重视的一种。苔草属(Carex.L)为莎草科中最为重要的一个属，其分布范围广，形态生态类型丰富多样，加之抗逆性好，根系发达，耐践踏，富集繁殖能力强等，使其成为有重大经济价值，但由于品种之间外观形态差别较小，辨别需要较高专业度，使得目前应用的苔草品种名目比较混乱。因此建立基于全基因组序列的分子鉴定系统对研究苔草遗传多样性，评价苔草种质资源以及规范苔草在园林绿化中的使用具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明基于二代高通量测序技术，对四个苔草品种进行10x基因组覆盖RAD测序，通过对其基因组特征分析，开发和构建SSR图谱，本发明对苔草品种和种质资源鉴别有重要意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了苔草SSR引物组，包括(1)～(17)任一组或任几组引物：
(1)、上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；
(2)、上游引物的序列如SEQ ID No.3所示；下游引物的序列如SEQ ID No.4所示；
(3)、上游引物的序列如SEQ ID No.5所示；下游引物的序列如SEQ ID No.6所示；
(4)、上游引物的序列如SEQ ID No.7所示；下游引物的序列如SEQ ID No.8所示；
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(14)、上游引物的序列如SEQ ID No.27所示；下游引物的序列如SEQ ID No.28所示；
(15)、上游引物的序列如SEQ ID No.29所示；下游引物的序列如SEQ ID No.30所示；
(16)、上游引物的序列如SEQ ID No.31所示；下游引物的序列如SEQ ID No.32所示；
(17)、上游引物的序列如SEQ ID No.33所示；下游引物的序列如SEQ ID No.34所示。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的苔草SSR引物组在苔草种质资源遗传多样性分析、苔草高密度图谱的构建、苔草品种鉴定和/或分子标记辅助育种中的应用。
此外，本发明还提供了试剂盒，包括所述的苔草SSR引物组以及可接受的试剂。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的试剂盒在苔草种质资源遗传多样性分析、苔草高密度图谱的构建、苔草品种鉴定和/或分子标记辅助育种中的应用。
此外，本发明还提供了苔草种质资源遗传多样性分析的方法，利用所述的苔草SSR引物组对苔草待测样本进行扩增，电泳检测，获得基因型数据；
所述基因型数据读取标准为：同一组引物对不同苔草待测样本扩增，电泳检测结果中，将同一大小的片段标记为1，不同的大小的标记用别的数据标记，没有的相同大小PCR产物的标记为0，这样每一个材料的SSR标记基因型形成一个数据矩阵；根据“0”“1”矩阵数据转换成基因型矩阵，利用Popgene32软件进行多态性分析，获得苔草种质资源遗传多样性结果。
此外，本发明还提供了苔草品种鉴定的方法，利用所述的苔草SSR引物组对苔草待测样本进行扩增，电泳检测，获得基因型数据；
所述基因型数据读取标准为：同一组引物对不同苔草待测样本扩增，电泳检测结果中，将同一大小的片段标记为1，不同的大小的标记用别的数据标记，没有的相同大小PCR产物的标记为0，这样每一个材料的SSR标记基因型形成一个数据矩阵；根据“0”“1”矩阵数据转换成基因型矩阵，利用Popgene32软件进行多态性分析，获得亚麻品种鉴定结果。
此外，本发明还提供了苔草种质聚类图的获得方法，利用所述的引物组对苔草待测样本进行扩增，电泳检测，获得基因型数据；
所述基因型数据读取标准为：同一组引物对不同苔草待测样本扩增，电泳检测结果中，将同一大小的片段标记为1，不同的大小的标记用别的数据标记，没有的相同大小PCR产物的标记为0；获得每组引物的遗传距离，基于所述遗传距离对苔草种质资源进行聚类分析。
本发明基于二代高通量测序技术，对四个苔草品种进行10x基因组覆盖RAD测序，通过对其基因组特征分析，开发和构建SSR图谱，本专利对苔草品种和种质资源鉴别有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示RAD测序中Cluster长度的分布统计；
图2示18SSR标记的扩增情况；
图3示用聚丙烯胺凝胶电泳检测SSR；
图4示以引物P356的扩增电泳图为基础，用Quantity one软件绘制电泳模式图；
图5示依据遗传相似系数进行聚类分析，聚类方式:UPGMA；
图6～图14示第一次筛选结果；
图15～图16示第二次筛选结果；
图17～图24示第三次筛选结果。
具体实施方式
本发明公开了苔草分子鉴定的SSR引物及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的苔草分子鉴定的SSR引物及应用中所用原料及试剂可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1四个苔草材料的RAD测序
RAD测序(Restriction-site associated DNA sequencing)方法用于进行苔草基因组测序。
本目的所述的实验基本步骤为：
(1)用CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)法提取捞浴-2(C11)，青绿-2(C12)、批针-2(C13)和脚-2(C15)4个材料叶片的的基因组DNA苔草的总DNA。
(2)以步骤(1)得到的苔草物种总DNA为模板，构建二代测序文库，基本步骤为：
1)取DNA模板100ul(共200ng)，放在1.5ml标准EP管中。
2)使用限制性内切酶EcoR I对4个材料的基因组DNA37℃酶切30分钟。，将其整体破碎打断为300-500bp的段片段。
3)使用AMpure试剂来补平DNA片段末端，使用1.8x体积的磁珠对样本纯化。
4)将修复后的末端使用T4连接酶加P接头和A尾。
5)使用1.0x体积的磁珠对多余接头进行回收纯化。
6)对纯化后的文库，使用Aglient2100检测其片段分布，并使用荧光定量qPCR测定文库浓度。
待第6)步检测合格后，所构建好的文库利用Illumina HiSeqTM Illumina PE150平台测序。每个材料做三个生物学重复，进行RAD测序。
实施例2 RAD测序结果分析
方法
1将12个材料数据，分别单独组装，得到各样本大于500bp的contig片段。
2将片段集合，使用CD-HIT进行聚类(90％)水平。将序列按相似度进行cluster分类。
3将得到的cluster分类，进行筛选，规则为：至少5个样本都含有的cluster。否则认为该cluster只出现在单独材料中，不具有代表性，删掉。
4将筛选出来的cluster，选取序列最长的作为代表序列。并查看序列长度分布。
5对代表序列，删掉开头和结尾各50bp，之后扩增其序列的约260～320bp大概中间位置，优化产物扩增长度为300bp左右。进行引物设计。
6利用Primer3引物设计软件进行引物设计。
结果分析
RAD测序数据使用fastp软件分析。，规则默认。通过RAD(restriction-siteassociated DNA)测序，总共获得了16.03G的数据量，平均每个样品1.34G数据.有92.62％的测序数据达到Q30标准(表3)。十二个材料的平均净reads为4,388,585。各样本n50大约为450～470bp，约6～10万条contig。所有contig共聚类为567833条cluster。
表1 RAD测序结果统计
为了增加SSR引物设计的成功率，筛选那些同时在5个以上样本测序结果中存在的cluster，共得到5906条cluster，作为基本可用的序列集合(图1)可知，大部分在400～500bp作为最终选择模板长度。比之前<150bp明显较好，利于扩增测序。
实施例3 SSR标记的筛选
所有苔草材料的基因组DNA均为CTAB法提取。PCR反应体系为20.0μl，包括0.3μl的上下游SSR引物(20μM)，0.4μl(25mM)of dNTP,10.0μl 2×GC Buffer II,0.2μl LA Taq(Takara,Japan),1.0μl(50ng/μl)of DNA模板和4.8μl ddH2O。
PCR反应程序包括94℃，5min预变性；35循环的94℃，30s；54℃，30s，72℃延伸2min；at 72℃最后延伸10min.PCR产物随后经1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。之后用溴化乙锭染胶(Tiangen,China)，用凝胶成像系统进行检测(BioRad,USA)。
表2苔草种质资源鉴定系统的17对SSR引物。
我们基于至少在5个材料出现的5906个clusters进行SSR标记设计。之后随机挑选了400个SSR标记进行测试。首先我们挑选了C1(涝峪-1)、C2(青绿-1)、C4(脚苔草-1)这三个样品来检测400个SSR标记的扩增情况。最终确定了17对引物在三个材料中能够扩增出预期大小的SSR扩增片段，并利用Sanger测序的方法验证了扩增片段(图2和3)。
实施例4 SSR鉴定系统的鉴定
根据SSR标记扩增的片段的大小，我们将同一大小的片段标记为1，不同的大小的标记用别的数据标记，没有的相同大小PCR产物的标记为0。这样每一个材料的SSR标记基因型形成一个数据矩阵。根据“0”“1”矩阵数据转换成基因型矩阵，利用Popgene32软件进行各SSR标记的多态性分析。17对引物共得到173个等位基因(Na)，平均每对引物为10.18，不同引物扩增出来的等位基因数存在较大差异，最多的有16个(P35)，最少的是5个(P261)。主要等位基因频率在0.0192～0.6666之间，平均值为0.0983；每对引物的多态信息含量(PIC)在0.2698(RM205)-0.8596(RM163)之间，平均值0.7898，17对引物中除P261(0.4829)为多态信息含量(PIC)在0.25～0.5之间的中度多态，其它所有引物的多态信息含量(PIC)均为>0.5的高度多态，以上参数表明本实验中所选择的17对引物具有较好的多态性，并且样品本身遗传差异比较大。
表3 01数据汇总表(部分)
根据PCR扩增结果，以引物P356的扩增电泳图为基础，用Quantity one软件绘制电泳模式图(见图4)。
表5 26个苔草材料的SSR体系的基因型统计。
备注：na：SSR等位变异数目；ne：有效的等位变异属木[Kimura and Crow(1964)]；h：SSR位点的遗传多样性Nei's(1973)；I：Shannon's信息指数[Lewontin(1972)]。
实施例5利用SSR鉴定系统对苔草材料进行系统分类
根据基因型矩阵数据，利用Popgene32软件分别计算26个供试材料(见表5)的遗传相似系数及遗传距离矩阵。个体为单位，遗传相似系数值(GS)最大为1，数值越大，表明亲缘关系越近，GS值越小，表明亲缘关系越远。本实验中除了相似系数最大的C13号披针-2与C14号矮丛-2这一组(其值为1)外，基上其他组合的相似系数值都偏小，最小为0的就有C15号与C37、C38号，C35与C40，C37与C41、C42等15个样品组合。根据GS值矩阵，利用UPGMA法对26份供试材料的SSR数据的结果进行聚类分析，得到树状聚类图(见图5)。在平均遗传相似系数为0.1796处，26份样品大致倍分为三大类群。
表6基于SSR标记的26个样品的相似系数矩阵(截选)
实施例6 SSR引物的筛选
表7待筛选引物
表8引物筛选结果(较好引物和待定引物)
表9第一次筛选结果
见图6～图14。
表10第二次筛选结果
| 多态引物 | 待定引物 |
| P241 | P270 |
| P246 | P275 |
| P249 | |
| P261 | |
| P264 | |
| P273 | |
| P276 | |
| P280 | |
| P294 |
见图15、图16。
表11第三次筛选结果
| 较好引物 | 待定 |
| P305 | P313 |
| P318 | P334 |
| P337 | P343 |
| P346 | P345 |
| P350 | P381 |
| P356 | P385 |
| P392 | |
| P394 |
综合上述扩增结果，得到本发明提供的17对SSR引物，见图17～图24。
序列表
<110> 申请人
<120> 苔草分子鉴定的SSR引物及应用
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcagattcta attgattcat tgcttca 27
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 21
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<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<400> 10
tctcaaacaa aatgatgatg gtga 24
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
accaatcaga tccatgatct cca 23
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcccattttt gttgttttct tctttt 26
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aggcgaaaag aaaaccccaa 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gggttttgag agctcagaga ga 22
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcacggaagg aaggattttt atttt 25
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggattgcttg attaacagag cca 23
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgttccactt gccaattgtc c 21
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tctcttttgg tccaattgat tatgaa 26
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acatctgctg aaatctccat cca 23
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggaaccctgt aattaatctt catcct 26
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcataacttc ccaacacgct 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcgataggca tgcatggtga 20
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcttgaaaag ttgaaatgct tgaca 25
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
accccacatg aagaagggat 20
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcacatttta ttgcaaaata ctcgca 26
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgaaaccaa caacttcttt tgt 23
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cccgttttgc ccatcaggta 20
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
catcaaacag aggatatgaa catagt 26
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcggttgata ccaagtgttc a 21
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgcatcatca tctctctctc ttgg 24
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tctagctaga attattgcga aagaaa 26
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
accctccatc ttcagttgtg a 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tccgtcaaaa ccctagtgct c 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tccgcctctt tcgctttcat 20
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tcagtgaact agagataaca aatgga 26
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tgaacatcaa agcaagccct 20
Claims (7)
1.苔草SSR引物组，其特征在于，包括(1)～(17)所示的引物：
(1)、上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；
(2)、上游引物的序列如SEQ ID No.3所示；下游引物的序列如SEQ ID No.4所示；
(3)、上游引物的序列如SEQ ID No.5所示；下游引物的序列如SEQ ID No.6所示；
(4)、上游引物的序列如SEQ ID No.7所示；下游引物的序列如SEQ ID No.8所示；
(5)、上游引物的序列如SEQ ID No.9所示；下游引物的序列如SEQ ID No.10所示；
(6)、上游引物的序列如SEQ ID No.11所示；下游引物的序列如SEQ ID No.12所示；
(7)、上游引物的序列如SEQ ID No.13所示；下游引物的序列如SEQ ID No.14所示；
(8)、上游引物的序列如SEQ ID No.15所示；下游引物的序列如SEQ ID No.16所示；
(9)、上游引物的序列如SEQ ID No.17所示；下游引物的序列如SEQ ID No.18所示；
(10)、上游引物的序列如SEQ ID No.19所示；下游引物的序列如SEQ ID No.20所示；
(11)、上游引物的序列如SEQ ID No.21所示；下游引物的序列如SEQ ID No.22所示；
(12)、上游引物的序列如SEQ ID No.23所示；下游引物的序列如SEQ ID No.24所示；
(13)、上游引物的序列如SEQ ID No.25所示；下游引物的序列如SEQ ID No.26所示；
(14)、上游引物的序列如SEQ ID No.27所示；下游引物的序列如SEQ ID No.28所示；
(15)、上游引物的序列如SEQ ID No.29所示；下游引物的序列如SEQ ID No.30所示；
(16)、上游引物的序列如SEQ ID No.31所示；下游引物的序列如SEQ ID No.32所示；
(17)、上游引物的序列如SEQ ID No.33所示；下游引物的序列如SEQ ID No.34所示。
2.如权利要求1所述的苔草SSR引物组在苔草种质资源遗传多样性分析、苔草高密度图谱的构建、苔草品种鉴定和/或分子标记辅助育种中的应用。
3.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的苔草SSR引物组以及可接受的试剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒在苔草种质资源遗传多样性分析、苔草高密度图谱的构建、苔草品种鉴定和/或分子标记辅助育种中的应用。
5.苔草种质资源遗传多样性分析的方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的苔草SSR引物组对苔草待测样本进行扩增，电泳检测，获得基因型数据；
所述基因型数据读取标准为：同一组引物对不同苔草待测样本扩增，电泳检测结果中，将同一大小的片段标记为1，不同的大小的标记用别的数据标记，没有的相同大小PCR产物的标记为0，这样每一个材料的SSR标记基因型形成一个数据矩阵；根据“0”“1”矩阵数据转换成基因型矩阵，利用Popgene32软件进行多态性分析，获得苔草种质资源遗传多样性结果。
6.苔草品种鉴定的方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的苔草SSR引物组对苔草待测样本进行扩增，电泳检测，获得基因型数据；
所述基因型数据读取标准为：同一组引物对不同苔草待测样本扩增，电泳检测结果中，将同一大小的片段标记为1，不同的大小的标记用别的数据标记，没有的相同大小PCR产物的标记为0，这样每一个材料的SSR标记基因型形成一个数据矩阵；根据“0”“1”矩阵数据转换成基因型矩阵，利用Popgene32软件进行多态性分析，获得亚麻品种鉴定结果。
7.苔草种质聚类图的获得方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的引物组对苔草待测样本进行扩增，电泳检测，获得基因型数据；
所述基因型数据读取标准为：同一组引物对不同苔草待测样本扩增，电泳检测结果中，将同一大小的片段标记为1，不同的大小的标记用别的数据标记，没有的相同大小PCR产物的标记为0；获得每组引物的遗传距离，基于所述遗传距离对苔草种质资源进行聚类分析。
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