CN108411022A - 基于国槐转录组序列开发的est-ssr标记引物与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子标记技术开发及应用领域，具体涉及国槐EST‑SSR标记引物组。所述引物组包括1号～10号引物对。本发明引物组具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富等优点，可有效用于国槐种质资源遗传多样性分析、高密度图谱的构建、品种纯度和真实性鉴定、分子标记辅助育种等研究领域。

Description

基于国槐转录组序列开发的EST-SSR标记引物与应用
技术领域
本发明属于分子标记技术开发及应用领域，具体涉及国槐EST(expressedsequence tags，ESTs)微卫星标记引物组(EST-SSR)。
背景技术
国槐Sophora japonica L.又名家槐、中国槐、槐米树等，属于豆科Leguminosaesp.槐属Sophora L.，落叶乔木，树高可达到25米。原产我国北方，在我国有着深远的栽培历史，早在秦汉时期，就已经有关于通道上夹路植槐的记载。国槐属于阳性树种，稍耐荫，对土壤的要求并不严格，根系发达、生长快、移栽成活率高、适应能力强，此外还具有抗污染，耐烟尘，抗风等特点，能够极好的适应城市街道环境。国槐对氯化氢、氯气、二氧化硫等许多有毒气体都有着较强的吸收及富集作用。国槐枝叶繁茂，夏秋可观花观叶，这也使其能够成为城市良好的遮荫树种和行道树。
国槐是我国北方重要的乡土树种，具有较高的观赏价值，在材用、药用、食用等方面也具有重要的作用。目前关于国槐的研究还主要集中于繁殖技术、遗传转化以及种子表型性状的变异等方面。针对国槐的分子方面的研究开展的较少，尤其是国槐遗传多样性分析还鲜有报道，严重影响了国槐种质资源的创新研究和利用。从分子层面对生物的遗传结构及遗传多样性等方面进行分析研究，可以综合反映出物种在基因流、遗传漂变以及自然选择等方面对群体遗传变异所起到的作用。
简单重复序列(SSR)广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，由于SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。与其它分子标记技术相比，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，被认为是可靠性最高的分子标记类型之一。但是使用该技术的前提是要有相应的SSR引物。SSR标记可分为基因组SSR(gSSR)和转录组SSR(EST‐SSR)，与gSSR标记相比，从EST数据库中获得SSR建立EST‐SSR标记更经济，效率更高。EST‐SSR标记来源于DNA的转录区域，相比于gSSR标记，EST-SSR种间通用性更高，即基于一种材料开发的EST-SSR引物，往往在一个属内甚至属间均能适用。更重要的是，该标记能直接和功能基因相关，在分子标记辅助育种的相关研究如遗传连锁图构建、重要性状相关标记关联分析、分离和鉴定新基因等中都有极高的应用价值。
近年来随着第二代测序技术的成熟，使得通过转录组数据获得EST-SSR成为可能。但目前还未有相关利用国槐转录组序列开发EST-SSR标记引物的报道。因此，利用第二代高通量测序技术获得国槐转录组序列信息，批量开发EST-SSR引物，将会对其重要性状基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种和比较基因组学研究等起重要推动作用。
发明内容
本发明的目的是针对国槐目前尚无SSR标记引物，提供基于国槐转录组序列开发的EST-SSR标记引物组。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明目的之一，提供基于国槐转录组序列开发的EST-SSR标记引物组，所述引物组包括1号～10号引物对；所述1号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；所述2号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示；所述3号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.6所示；所述4号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.8所示；所述5号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.10所示；所述6号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.11所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.12所示；所述7号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.13所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.14所示；所述8号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.15所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.16所示；所述9号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.17所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.18所示；所述10号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.19所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.20所示。
在本发明优选的技术方案中，所述引物组通过以下步骤得到：
(1)获取国槐转录组EST序列；
(2)采用SSR软件MicroSAtellite对步骤(1)获得的EST序列进行SSR位点的筛选；
(3)国槐EST-SSR引物的设计：依据上述步骤(2)筛选的EST-SSR位点，采用MicroSAtellite软件进行SSR引物设计出国槐EST-SSR标记引物，得到引物组。
本发明目的之二，提供所述基于国槐转录组序列开发的EST-SSR标记引物组在国槐遗传多样性分析中的应用。
在本发明优选的技术方案中，所述应用步骤如下：
S1.国槐华箭基因组DNA提取；
S2.对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；
S3.将上述PCR扩增产物进行毛细管电泳、自动荧光检测；
S4.进行遗传多样性分析和国槐种质的聚类分析。
进一步，步骤S1国槐基因组DNA提取的方法为：
(1)65℃预热改良的2×CTAB抽提液；
(2)称取0.5g幼嫩叶片，装入2mL离心管中，加入直径约为2mm的钢珠两粒，放入装有液氮的盒子中冷冻约15秒，研磨约1.5min，至叶片呈细粉末状，向每个离心管中迅速加入预热的改良的CTAB抽提液700μL，然后放入65℃水浴锅中水浴30min左右，水浴过程中翻转离心管2-3次；
(3)水浴后冷却至室温，加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，充分混合均匀，室温12000rpm离心10min；
(4)吸取步骤(3)中上清液转入新的离心管中，加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，充分混合均匀，室温12000rpm离心10min；
(5)吸取步骤(4)上清液于新的离心管中，并加入2倍体积、-20℃预冷的的异丙醇或无水乙醇，于-20℃静放30min-1h；
(6)用枪头或者牙签挑取出每个样品中的絮状DNA沉淀，用1mL 75％的乙醇和无水乙醇洗涤2-3次，置于通风处吹干；
(7)加60μLddH2O溶解DNA，-20℃保存待用。
进一步，步骤S1国槐基因组DNA提取方法中所用改良的CTAB抽提液由以下成分及其含量组成：
100mM Tris-HCl，1.4mM NaCl，50Mm EDTA，2％CTAB 700μL，β-巯基乙醇20μL，和10％聚乙烯吡咯烷酮140μL。
进一步，步骤S2中PCR反应体系为：10×Taq Buffer 1μL，2.5mM dNTPs 0.2μL，25mM Mg2+1μL，ExTaq0.05μL，正向引物0.25μL，反向引物0.25μL，DNA模板1μL，ddH2O 6.25μL。
进一步，步骤S2中PCR反应程序为：94℃5min；94℃15s，66.5℃15s，72℃30s，19个循环，每循环-0.5℃；94℃15s，57℃15s，72℃30s，15个循环；72℃，10min。
进一步，步骤S3方法为：采用四重荧光毛细管电泳技术对权利要求1所述引物组进行扩增；在96孔上样板的每个孔中分别加0.3μL纯化的PCR产物，9.5μL甲酰胺和0.5μLGS-500LIZ分子量内标，离心，95℃变性5min，4℃冷却后离心，进行自动荧光检测，并利用Gene-Maker2.2.0软件读取结果，并记录每个位点片段大小。
进一步，步骤S4遗传多样性分析和国槐种质的聚类分析方法为：观察荧光定量PCR扩增的结果，统计扩增出的条带，用PopGen32软件处理所得数据；利用软件NTSYSpc2.1对所有材料的遗传相似系数矩阵进行聚类。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明基于国槐转录组序列高效地完成对国槐SSR标记引物开发的技术，获得的转录组序列，极大地增加了引物开发所用的原始数据；
(2)本发明引物组具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富等优点，可有效用于国槐种质资源遗传多样性分析、高密度图谱的构建、品种纯度和真实性鉴定、分子标记辅助育种等研究领域。
附图说明
图1，部分材料DNA检测图，
图2，引物2号对国槐8个样品的扩增产物银染结果。
图3，引物4号对国槐8个样品的扩增产物银染结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
1试验材料和试剂
1.1国槐材料
本研究的实验材料为233份国槐古树种质(表1)，主要来自山东潍坊、泰安、东营、临沂、菏泽、烟台、滨州、德州、淄博、济宁、日照、聊城、枣庄的国槐古树。所有国槐古树种质均为2012年从原生地采集整理后嫁接保存于山东省林业科学研究院饮马泉苗圃及章丘实验基地。本研究采用的国槐古树种质材料基本涉及山东省内各市、县、乡的国槐古树。
表1供试的233份国槐古树种质
1.2引物获得
利用高通量测序平台Illumina HiSeq 2000进行国槐转录组测序，测得7Gbp数据，进行数据denovo组装，共获得68,846个uigene，使用SSR软件MicroSAtellite(MISA)寻找所有的SSR位点，对所有SSR重复单元在Unigene上前后序列的长度进行筛选,得到8,718条包含SSR位点的序列，共含有10,236个SSR位点，设计完成6,611条引物。从中选出100对引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成，每对引物5OD，分装两管，-20℃冰箱保存备用。
1.3试剂和仪器
Acrylamide、Bis-Acrylamide、EDTA、Tris-HCl、TEMED、过硫酸铵等试剂均购自上海生工,为分装产品，银染所用药品乙醇、冰醋酸、甲醛、硝酸银、氢氧化钠等常规试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。DYY-12型电泳仪(北京市六一仪器厂)，HY-2多用调速振荡器(金坛市医疗仪器厂)，电子天平，台式离心机，X线胶片观察灯。
实施例2
2.1国槐基因组DNA提取
国槐基因组DNA的提取采用改良的CTAB法，以国槐的幼嫩叶为材料进行提取。并根据国槐体内含有酚类和蛋白较多等特点加以改良。
1、65℃预热DNA提取缓冲液2×CTAB(100mM Tris-HCl(PH8.0),1.4mM NaCl,50MmEDTA(PH8.0),2％CTAB)700μL,β-巯基乙醇20μL(现加现用)，L，充分混匀。
2、称取0.5g幼嫩国槐叶片，装入2mL离心管中，加入直径约为2mm的钢珠两粒，放入装有液氮的盒子中冷冻约15秒，用retsch混合型研磨仪研磨约1.5min，至国槐叶片呈细粉末状，向每个离心管中迅速加入预热的L，然后放入65℃水浴锅中水浴30min左右，水浴过程中要注意轻微翻转离心管2-3次。
3、水浴后冷却至室温，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，v/v/v)，温和翻转至充分混合均匀，室温12000rpm离心10min。
4、吸取上清液转入新的离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1,v/v)，温和翻转至充分混合均匀，室温12000rpm离心10min。
5、吸取上清液于新的离心管中，并加入2倍体积(约1mL)-20℃预冷的的异丙醇或无水乙醇，于-20℃静放30min-1h。
6、用枪头或者牙签挑取出每个样品中的絮状DNA沉淀，用1mL 75％的乙醇和无水乙醇洗涤2-3次，置于通风处吹干。
7、加60μLddH2O溶解DNA，-20℃保存待用。
2.2 SSR-PCR反应体系
通过正交设计试验结合单因素试验的方法，确定国槐SSR-PCR的最终反应体系为ExTaq酶0.05μL、Mg2+(25mmol/L)1.0μL、dNTPs(2.5mmol/L)0.2μL、引物(mol/L)0.5μL、DNA模板(L)1.0μL、10×PCR Buffer 1.0μL、ddH2O 6.25μL补齐至10μL
2.3 PCR扩增反应程序(采用touch-down程序)
表2 PCR扩增反应程序
2.4 8％非变形聚丙烯酰胺凝胶配方(见表3)
30％丙烯酰胺：Acr:Bis(29:1)＝丙烯酞胺29g，N’-甲叉双丙烯酞胺1g，去离子水定容至100mL；
5×TBE(电泳缓冲液)：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA(PH8.0)20mL，去离子水定容至1L；做电泳液时稀释为1×TBE
10％AP：过硫酸铵1g，加离子水定容至10mL，4℃保存。
表3 8％非变性聚丙烯酰胺凝胶配方
注：10％AP和TEMED在灌胶前现用现加
2.5胶板的制备
将玻璃板清洗干净，用双蒸水冲洗两遍后，自然晾干。用无水乙醇擦拭长短板，之后用L亲和硅烷加L无水乙醇均匀擦拭长玻璃板，短玻璃板用剥离硅烷均匀擦拭。5-10min之后，将玻璃般的凹面向内组装玻璃板，用2％的琼脂糖溶液将玻璃板的底部封住，待到琼脂糖溶液凝固后，将胶缓慢灌入玻璃胶室，待胶室灌满后，将梳子插入胶室，室温下聚合30min以上。
2.6银染配方
1、固定：电泳结束后，将两个胶板放入0.5％的冰醋酸(900mL超纯水+100mL无水乙醇+5mL冰醋酸)中震荡12min。
2、银染：固定结束后，用ddH2O冲洗胶板两面，加入硝酸银染色液(800mL超纯水+1.6gAgNO3)轻轻摇动染色12min。染色结束后，硝酸银染色液回收。
3、漂洗：染色结束后，加入硫代硫酸钠溶液(800mL超纯水+192mLNa2SO3)漂洗30s，之后再用800mL超纯水进行二次漂洗，漂洗30s。
4、显色：加入显影液(800mL超纯水+12gNaOH+6.4mL甲醛)轻摇至条带清晰。显影液回收。
5、条带显示清晰后，用800mL超纯水清洗30s。放在胶片观察灯上观察，拍照，保存。
2.7毛细管电泳结果
用16对荧光标记引物对233份国槐种质进行检测，采用四重荧光毛细管电泳技术，同时完成对4对引物扩增条带的检测，检测的效率得到显著提高。
扩增产物采用毛细管电泳、自动荧光检测：在96孔上样板的每个孔中分别加0.3μL纯化的PCR产物，9.5μL甲酰胺和0.5μLGS-500LIZ分子量内标，离心，95℃变性5min，4℃冷却后离心，利用DNA测序仪ABI3730xl DNA analyzer(Applied biosystems,Foster City,USA)进行自动荧光检测。利用Gene-Maker2.2.0软件(Soft Genetics LLC,USAS)读取结果，并记录每个位点片段大小。
2.8遗传多样性评价参数及聚类方法
观察荧光定量PCR扩增的结果，统计扩增出的条带。按照大写英文字母的顺序进行记录，即同一位点的最大等位基因可记为A，其余的等位基因依次记为B、C、D、E等，如果在某一位点上只扩增出一条带，则按照纯合基因型来处理。用PopGen32软件处理所得数据，计算各位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannon多样性指数(I)、Nei遗传多样性指数(H)、固定指数(F)等，这些是反应群体遗传多样性的基础指标。利用软件NTSYSpc2.1对所有材料的遗传相似系数矩阵进行聚类，并得到聚类图。
平均等位基因数(Na):Na＝∑ai/n，ai为第i个位点上的等位基因数，n为测定位点总数；
平均有效等位基因数(Ne)：Ne＝∑ne/n,ne＝1/∑pi 2,ne为单个位点上有效等位基因数，pi为单个位点上第i个等位基因频率，n为测定位点总数；
平均观察杂合度(Ho):实际观察到的杂合个体数占全部个体总数的比率；
平均期望杂合度(He):He＝∑he/n，he＝1-∑pi 2,he为单个位点上的杂合度，pi为单个位点上第i个等位基因频率，n为检测位点总数；
固定指数(F)：F＝1-Ho/He,Ho为实际观察杂合度，He为平均期望杂合度。当群体中纯合体过量时F＞0，当杂合体过量时F＜0。
实施例3
3.1国槐基因组DNA浓度与纯度检测
高质量的DNA是保证PCR扩增成功的重要前提，国槐叶片内含酚类、多糖等次生物质，这些物质对Ex Taq酶的活性有抑制作用，在DNA提取时要尽量去除。本研究在DNA提取液力加入了PVP和β-巯基乙醇，采用改良CTAB法提取，所提取的DNA经紫外分光光度计检测后，其结果显示DNA的OD260/OD280的值在1.7-2.0之间。DNA经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，从图上可以看出提取的DNA琼脂糖凝胶电泳电泳后均显示为清晰完整的条带，且无明显的拖尾。这说明提取的DNA样品浓度和纯度较高，足以满足后续试验的要求。将DNA于-20℃冰箱保存备用。
3.2 SSR引物的筛选与确定
随机选取1个样品，对100对国槐SSR引物进行PCR扩增，通过8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,初步筛选出80对条带清晰，主带明显的引物，再随机选出8个DNA样品，对引物进行复筛(图2、3)，8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，筛选出16对条带清晰，多态性好，扩增结果稳定的引物(表4)用于国槐遗传多样性的分析。
表4 16对国槐SSR引物序列
3.3国槐遗传多样性分析
3.3.1群体内遗传多样性分析
16对SSR引物对山东省内采集的233份国槐古树种质进行毛细管电泳，共扩增出136个等位基因，扩增产物长度介于80-250bp之间，每对引物扩增出的等位基因数4-13个不等，平均每对引物扩增出8.5000个，多态性位点检出率为100％。等位基因数最少的为引物2541和1527，扩增出4条多态性谱带，等位基因数最多的为引物2844，扩增出13条谱带。233份国槐种质的有效等位基因数最大值为2128引物的5.4373，最小值为1820引物的2.5177，平均有效等位基因数为3.8945。从表5中可以看出，不同位点的Shannon多样性参数差距不是特别大，最大值为位点2844的1.9088，位点1527的Shannon多样性指数值最小为1.1535，平均Shannon多样性指数(I)为1.5347，表明国槐的遗传多样性较高。国槐不同位点间的Shannon多样性指数从1.1535-1.9088不等，说明不同位点对国槐基因多样性程度的贡献不同。
有效等位基因数(Ne)和杂合度(H)是目前较为广泛使用的遗传多样性分析指数，杂合度同时也反应群体中等位基因的丰富和均匀程度。从表5、6中可以看出，国槐233份种质在16个位点上的有效等位基因数(Ne)在2.5177-5.4373之间，观察杂合度(Ho)在0.1682-0.8112之间，期望杂合度(He)在0.6041-0.8178之间，Nei遗传多样性指数在0.6028-0.8161之间，说明国槐种质的遗传多样性较高，但各位点对多样性的贡献差距不大。
表5 SSR位点的遗传多样性参数
观察杂合度(Ho)的最大值是0.8112，处于2128位点上，最小值是756位点的0.1682，平均观察杂合度为0.6176；期望杂合度(He)的最大值是2128位点的0.8178，最小值是1820位点的0.6041，平均期望杂合度为0.7301。固定指数F＝1-Ho/He，当F＞0时，国槐种质在该位点的纯合体过量，当F＜0时，国槐种质在该位点的杂合体过量。由表6所示，国槐种质在16个位点上的固定指数均大于0，756位点上的最大固定指数最大，为0.7757，2128位点的固定指数最小，为0.0081，16个位点的平均固定指数为0.1417，总体表明，233份国槐个体在16个位点上的杂合度不足。
表6 16个位点的杂合度和固定指数
3.3.2种源地间遗传多样性分析
对国槐古树种质进行种源地间遗传多样性分析，表7是各种源地国槐在16个位点上的平均值。从表中可以看出菏泽国槐的等位基因数最大，为6.1250，其次为东营种源，为6.0000，枣庄种源的等位基因数最小为3.1875；种源间Nei遗传多样性指数在0.5037-0.7459之间，其中潍坊种源的Nei遗传多样性指数的数值最高，为0.7459，其次为临沂种源，0.7171，枣庄种源数值最小，为0.5037；Shannon多样性指数(I)在0.8894-1.4892之间，潍坊种源最高，为1.4892，其次为临沂种源的1.4510，枣庄种源数值最小，为0.8894。说明各种源地内国槐种质的遗传多样性较高，但种源间的差距并不明显。
表7各种源地的遗传多样性分析
3.3.3国槐种质的聚类分析
通过NTSYS软件，对233份国槐种质SSR标记数据进行遗传相似系数统计，遗传相似系数越高，表明他们之间的遗传基础越接近，相反，遗传相似系数最小值，表明它们之间的遗传差异性越大。
在遗传相似系数0.53处，可将国槐种质分为4大类，分别以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ命名。四个类群中，第Ⅰ类与其他三个类群的遗传关系最远。其中第Ⅳ类种质数量最多，包含219份种质，占全部种质的94％，为了能够更加清楚的揭示样品间的遗传关系，把第Ⅳ类在遗传相似系数为0.60处又分为10类，分别用A、B、C、D、E、F、G、H、I、J命名。在0.65处又可将D类分为4类，分别用a，b，c，d命名，具体分类见表8。在这4个类群中，233份种质并没有按照地区的不同进行聚类,互相之间有交叉，更进一步说明，山东省内国槐种质的遗传多样性与地理位置并无较大关联，国槐种质的遗传多样性较高，但各种群间的差距并不明显。
表8 233份国槐古树种质类群信息表
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省林业科学研究院
<120> 基于国槐转录组序列开发的EST- SSR标记引物与应用
<130>
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aatgttgaat ggaatttgga cac 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctctctgaa tatctcttcc ccc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acctttcact cagctgacac agt 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaaaggaacg agaaaaccaa aat 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaaccctcag gacttctcac aac 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaagtccttc acgaagacga aac 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggttcagaat cagaagcaaa aga 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gagtggaaaa cagagtggag aga 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aaaagaatag aatggaaggc cag 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcataatttg aacaaggcac agt 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttatttctag cgaaatcgga cac 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcgctcactt actcacactc aaa 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggccttgtta ggaatttgtc ttt 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aaaacataag tgccaattca tcc 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cttccatttt ccctcacttt ctc 23
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acatcgttcc tcacgtcgta gt 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aatctaaagc cagctcaacg ag 22
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
agtaatggtg gtggacagag aaa 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ctccatggtt gaggagtttg tta 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cagtccaaga aaaggacaag aaa 23

Claims (10)

1.基于国槐转录组序列开发的EST-SSR标记引物组，其特征在于，所述引物组包括1号～10号引物对；所述1号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQID NO.2所示；所述2号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQID NO.4所示；所述3号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的序列如SEQID NO.6所示；所述4号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物的序列如SEQID NO.8所示；所述5号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物的序列如SEQID NO.10所示；所述6号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.11所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.12所示；所述7号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.13所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.14所示；所述8号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.15所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.16所示；所述9号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.17所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.18所示；所述10号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.19所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.20所示。
2.根据权利要求1所述的榨菜EST-SSR标记引物组，其特征在于，所述引物组通过以下步骤得到：
(1)获取国槐转录组EST序列；
(2)采用SSR软件MicroSAtellite对步骤(1)获得的EST序列进行SSR位点的筛选；
(3)国槐EST-SSR引物的设计：依据上述步骤(2)筛选的EST-SSR位点，采用MicroSAtellite软件进行SSR引物设计出国槐EST-SSR标记引物，得到引物组。
3.如权利要求1所述基于国槐转录组序列开发的EST-SSR标记引物组在国槐遗传多样性分析中的应用。
4.根据权利要求3所述的的应用，其特征在于，步骤如下：
S1.国槐华箭基因组DNA提取；
S2.对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；
S3.将上述PCR扩增产物进行毛细管电泳、自动荧光检测；
S4.进行遗传多样性分析和国槐种质的聚类分析。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤S1国槐基因组DNA提取的方法为：
(1)65℃预热改良的2×CTAB抽提液；
(2)称取0.5g幼嫩叶片，装入2mL离心管中，加入直径约为2mm的钢珠两粒，放入装有液氮的盒子中冷冻约15秒，研磨约1.5min，至叶片呈细粉末状，向每个离心管中迅速加入预热的改良的CTAB抽提液700μL，然后放入65℃水浴锅中水浴30min左右，水浴过程中翻转离心管2-3次；
(3)水浴后冷却至室温，加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，充分混合均匀，室温12000rpm离心10min；
(4)吸取步骤(3)中上清液转入新的离心管中，加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，充分混合均匀，室温12000rpm离心10min；
(5)吸取步骤(4)上清液于新的离心管中，并加入2倍体积、-20℃预冷的的异丙醇或无水乙醇，于-20℃静放30min-1h；
(6)用枪头或者牙签挑取出每个样品中的絮状DNA沉淀，用1mL 75％的乙醇和无水乙醇洗涤2-3次，置于通风处吹干；
(7)加60μLddH2O溶解DNA，-20℃保存待用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤S1国槐基因组DNA提取方法中所用改良的CTAB抽提液由以下成分及其含量组成：
100mM Tris-HCl，1.4mM NaCl，50Mm EDTA，2％CTAB 700μL，β-巯基乙醇20μL，和10％聚乙烯吡咯烷酮140μL。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤S2中PCR反应体系为：10×Taq Buffer1μL，2.5mM dNTPs 0.2μL，25mM Mg2+1μL，ExTaq0.05μL，正向引物0.25μL，反向引物0.25μL，DNA模板1μL，ddH2O 6.25μL。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤S2中PCR反应程序为：94℃5min；94℃15s，66.5℃15s，72℃30s，19个循环，每循环-0.5℃；94℃15s，57℃15s，72℃30s，15个循环；72℃，10min。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤S3方法为：采用四重荧光毛细管电泳技术对权利要求1所述引物组进行扩增；在96孔上样板的每个孔中分别加0.3μL纯化的PCR产物，9.5μL甲酰胺和0.5μLGS-500LIZ分子量内标，离心，95℃变性5min，4℃冷却后离心，进行自动荧光检测，并利用Gene-Maker2.2.0软件读取结果，并记录每个位点片段大小。
10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤S4遗传多样性分析和国槐种质的聚类分析方法为：观察荧光定量PCR扩增的结果，统计扩增出的条带，用PopGen32软件处理所得数据；利用软件NTSYSpc2.1对所有材料的遗传相似系数矩阵进行聚类。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114480697A (zh) * 2020-10-23 2022-05-13 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） 茶树谷氨酰胺合成酶基因ssr分子标记引物及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106868119A (zh) * 2017-02-14 2017-06-20 山东农业大学 一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的ssr标记引物组及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106868119A (zh) * 2017-02-14 2017-06-20 山东农业大学 一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的ssr标记引物组及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张双等: "刺槐群体引种试验及遗传多样性分析", 《园艺学报》 *
符亚茹等: "西藏砂生槐EST-SSR引物开发及多态性检测", 《江苏农业科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114480697A (zh) * 2020-10-23 2022-05-13 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） 茶树谷氨酰胺合成酶基因ssr分子标记引物及应用
CN114480697B (zh) * 2020-10-23 2023-10-03 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） 茶树谷氨酰胺合成酶基因ssr分子标记引物及应用

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