CN114480697A - 茶树谷氨酰胺合成酶基因ssr分子标记引物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了茶树谷氨酰胺合成酶基因SSR分子标记(SSR1‑GS、SSR2‑GS)引物及其应用。研究表明，本发明依据具体特定的基因，在茶树全基因组上开发其SSR引物方法可行，所得引物多态性高、重复性好，具有较好的可行性、针对性。据此，发明人开展了茶树种质资源遗传多态性的研究。综上，本发明的研究方法、SSR分子标记及其引物，可广泛应用于茶树品种鉴定、遗传结构和资源多样性分析、遗传图谱构建，功能基因定位及QTL定位、种子纯度鉴定、分子标记辅助选育种研究中，便于进一步研究茶树茶氨酸合成以及茶树遗传多态性，促进深入开发茶树资源。

Description

茶树谷氨酰胺合成酶基因SSR分子标记引物及应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，尤其涉及茶树谷氨酰胺合成酶(GS)基因SSR分子标记引物及应用。
背景技术
茶树是中国重要的木本经济作物，茶氨酸(γ-N-乙基-谷氨酰胺)是茶树中特有的游离氨基酸，不仅是组成蛋白质的基本单位，也是活性肽、酶和其他一些生物活性分子的重要组成成分，是茶叶中生津润甜的主要成分。氨基酸在茶叶加工中参与茶叶香气的香橙，它所转化而成的挥发性醛或者其他产品都是茶叶香气的成分。茶叶氨基酸的组成、含量以及它们的降解产物和转化产物直接影响茶叶品质。
谷氨酰胺合成酶(GS，EC 6.3.1.2)是高等植物氮同化过程中的关键酶，在ATP存在的条件下，它能催化NH4+同化成谷氨酰胺，然后谷氨酰胺在谷氨酸合酶(GOGAT)的作用下，将酰胺基转移给α酮戊二酸，生成谷氨酸。GS/GOGAT途径是高等植物将无机氮转化成有机氮的最主要途径。GS存在多种同工酶，广泛分布在高等植物的种子、果实、叶、根、根瘤等器官中。植物的叶片中存在两种GS同工酶，分别是位于细胞质的胞液胞质型GS1和位于叶绿体的叶绿体型GS2，它们在植物体内有着各自不同的功能。
目前，水稻、大麦、玉米、豌豆等多种植物的GS基因已经被成功克隆。2008年，Rana等分离出1071bp的GS，并对其编码的蛋白进行纯化和鉴定，发现其基因表达量及酶活性在芽叶中较高，老叶其次，茎和根最低。2011年，日本学者Tanaka和Taniguchi克隆了茶树CsGS1；1(AB115183.1)、CsGS1；2(AB115184.1)和CsGS1；3(AB117934.1)基因。2016年，宛晓春等从“舒茶早”中克隆并分析了GS1-1和GS1-2基因。GS1-1基因全长为2532bp，共编码个氨基酸843个氨基酸，与葡萄的基因同源性为81％，与西红柿的同源性为78％，与毛果杨的同源性为78％。GS1-2基因的ORF全长为1071bp，共编码356个氨基酸。安吉白茶等一些茶树的GS基因也已被克隆，但是针对茶树谷氨酰胺合成酶(GS)基因SSR分子标记引物的开发及应用研究还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供茶树谷氨酰胺合成酶(GS)基因SSR分子标记引物及应用，以便于进一步研究茶树茶氨酸合成以及茶树遗传多态性。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
茶树谷氨酰胺合成酶基因SSR分子标记，分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列，标记编号为SSR1-GS、SSR2-GS。
扩增上述茶树谷氨酰胺合成酶基因SSR分子标记的引物，分子标记SSR1-GS、SSR2-GS的引物分别包括具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6的碱基序列。
上述SSR分子标记的制备方法，利用特定引物对茶树总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列；引物包括具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6的碱基序列。
上述SSR分子标记的制备方法，包括以下操作步骤：
<1>提取DNA
采用试剂盒提取茶树的基因组DNA作为模板；
<2>PCR反应
反应体系：反应总体积为20μL，其中2×PCR Mix 10μL，茶树DNA模板1μL，ddH2O 8μL，正向引物和反向引物各1μL；
反应程序：94℃预变性5min，接着每个循环94℃高温变性45s，55～60℃退火时间45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸7min，4℃永久保存；
<3>电泳显色
取5μL PCR产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压200v电泳60min；电泳结束后，凝胶用硝酸银进行染色显影。
正向引物为序列表SEQ.ID.No.3、SEQ.ID.No.5的引物，反向引物为序列表SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.6的引物。
茶树DNA模板为1～50ng，正向引物或反向引物的浓度为10μmol/L。
上述SSR分子标记在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
上述SSR分子标记在茶树茶氨酸的生物合成研究方面的应用。
上述SSR分子标记的引物在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
上述SSR分子标记的引物在茶树茶氨酸的生物合成研究方面的应用。
针对目前茶树的茶氨酸合成途径关键酶研究尚少的问题，发明人在‘云抗10号’大叶茶树全基因组公开报道的基础上，利用分子标记技术研究开发了茶树谷氨酰胺合成酶基因SSR分子标记(SSR1-GS、SSR2-GS)引物及其应用。研究表明，本发明依据具体特定的基因，在茶树全基因组上开发其SSR引物方法可行，所得引物多态性高、重复性好，具有较好的可行性、针对性。据此，发明人开展了茶树种质资源遗传多态性的研究。综上，本发明的研究方法、SSR分子标记及其引物，可广泛应用于茶树品种鉴定、遗传结构和资源多样性分析、遗传图谱构建，功能基因定位及QTL定位、种子纯度鉴定、分子标记辅助选育种研究中，便于进一步研究茶树茶氨酸合成以及茶树遗传多态性，促进深入开发茶树资源。
附图说明
图1是茶树SSR1-GS和SSR2-GS引物扩增片段的聚丙烯酰胺胶电泳图，图中：M：2000bp DNA Marker；各泳道对应茶种质材料分别为：1，7是德保茶；2，8是黄金茶；3，9是紫鹃；4，10是湘波绿；5，11是金牡丹；6，12是罗香2号。各泳道对应引物扩增片段为：泳道1-6为SSR1-GS引物扩增片段；泳道7-12为SSR2-GS引物扩增片段。
具体实施方式
茶树茶氨酸合成途径谷氨酰胺合成酶(GS)基因SSR分子标记研究
(1)从NCBI上下载茶树茶氨酸合成途径谷氨酰胺合成酶(GS)基因(GenBank:JQ925873)基因序列。
(2)下载茶树‘云抗10号’全基因组序列(下载地址：http:// www.plantkingdomgdb.com/tea_tree/dat)。在茶树全基因组中运用SSR search软件寻找其SSR标记，提取SSR序列及其上下游特定长度(默认100bp)的序列。运用primer3进行引物设计，获得引物序列、SSR重复基元和重复长度、预扩增片段长度等。据此合成制备谷氨酰胺合成酶基因相关的50对SSR分子标记引物序列。
(3)采用天根生物有限责任公司生产的试剂盒HYQspin TM CT Plant DNA Kit提取德保茶、紫鹃、黄金茶、湘波绿、金牡丹和罗香2号共6个茶树种质资源的基因组DNA。
(4)从步骤(2)中获得的50对SSR引物中，以步骤(3)提取的6个茶树种质资源基因组DNA为模板开展SSR-PCR反应，并利用聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳及快速银染法检测PCR扩增产物。
PCR反应体系：反应总体积为20μL，其中2×PCR Mix 10μL，茶树DNA模板(1～50ng)1μL，ddH2O 8μL，正向引物(10μmol/L)和反向引物(10μmol/L)各1μL。
PCR反应程序：94℃预变性5min，接着每个循环94℃高温变性45s，55～60℃退火时间45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸7min，4℃永久保存。
电泳显色：取5μL PCR产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压200v电泳60min。电泳结束后，凝胶用硝酸银进行染色显影。
PCR扩增电泳染色部分结果如图1所示，50对SSR引物中，有2对SSR引物(表1)扩增的片段有差异性，其多态性好、主带清晰。其中，1对位于GS基因5’-UTR区域，1对位于基因启动子区域downstream。
表1基于茶树GS基因筛选获得的2对多态性好的SSR分子标记引物信息
Figure BDA0002740890400000041
序列表
<110> 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所）
<120> 茶树谷氨酰胺合成酶基因SSR分子标记引物及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actcatgtcc tctgttaacg gctctgcatt aaaaacacag agagagagag agagagagaa 60
gcagagcgag agagacagag agagccatgt ctttgctatc agatctcatc aacctcaacc 120
tttcggacac tacggagaag gtgattgctg agtac 155
<210> 2
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggaggggt tgaatttatt gtggcgttgg gtgcgatata tatatatata tcatcttcag 60
cagttgtatt atctcgagta gtgttgcttt tccaattcta aaaaacaaag ttgtttttgg 120
agtttcgaaa actgtttccc 140
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actcatgtcc tctgttaacg gctc 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtactcagca atcaccttct ccgt 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaggaggggt tgaatttatt gtgg 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggaaacagt tttcgaaact cca 23

Claims (10)

1.茶树谷氨酰胺合成酶基因SSR分子标记，其特征在于分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列，标记编号为SSR1-GS、SSR2-GS。
2.扩增权利要求1所述茶树谷氨酰胺合成酶基因SSR分子标记的引物，其特征在于分子标记SSR1-GS、SSR2-GS的引物分别包括具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6的碱基序列。
3.权利要求1所述SSR分子标记的制备方法，其特征在于：利用特定引物对茶树总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列；所述引物包括具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6的碱基序列。
4.根据权利要求3所述的SSR分子标记的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
<1>提取DNA
采用试剂盒提取茶树的基因组DNA作为模板；
<2>PCR反应
反应体系：反应总体积为20μL，其中2×PCR Mix 10μL，茶树DNA模板1μL，ddH2O 8μL，正向引物和反向引物各1μL；
反应程序：94℃预变性5min，接着每个循环94℃高温变性45s，55～60℃退火时间45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸7min，4℃永久保存；
<3>电泳显色
取5μL PCR产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压200v电泳60min；电泳结束后，凝胶用硝酸银进行染色显影。
5.根据权利要求4所述的SSR分子标记的制备方法，其特征在于：所述正向引物为序列表SEQ.ID.No.3、SEQ.ID.No.5的引物，反向引物为序列表SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.6的引物。
6.根据权利要求4所述的SSR分子标记的制备方法，其特征在于：所述茶树DNA模板为1～50ng，所述正向引物或反向引物的浓度为10μmol/L。
7.权利要求1所述SSR分子标记在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
8.权利要求1所述SSR分子标记在茶树茶氨酸的生物合成研究方面的应用。
9.权利要求2所述SSR分子标记的引物在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
10.权利要求2所述SSR分子标记的引物在茶树茶氨酸的生物合成研究方面的应用。
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