WO2021039884A1 - 細胞膜透過性ベシクル - Google Patents

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WO2021039884A1
WO2021039884A1 PCT/JP2020/032306 JP2020032306W WO2021039884A1 WO 2021039884 A1 WO2021039884 A1 WO 2021039884A1 JP 2020032306 W JP2020032306 W JP 2020032306W WO 2021039884 A1 WO2021039884 A1 WO 2021039884A1
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cell
vesicle
cell membrane
penetrating
plant
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PCT/JP2020/032306
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圭司 沼田
康佑 土屋
聖矢 藤田
陸 河▲崎▼
健太 渡邊
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国立研究開発法人理化学研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof

Definitions

  • the present invention relates to a cell membrane penetrating vesicle, a method for introducing a functional molecule into a cell, and a method for producing a mutant plant.
  • a method of directly delivering a functional molecule such as a protein to a plant cell in order to modify a plant trait without genetic modification such as gene recombination For example, a carrier peptide that delivers a protein of interest into a plant cell has been devised, and a fusion peptide that combines a cell membrane penetrating sequence and a polycation sequence has been proposed (Patent Document 1).
  • Non-Patent Documents 1 and 2 have succeeded in introducing the enzyme into plant cells by complexing the cell membrane penetrating peptide (CPP) and the enzyme by ionic interaction.
  • CPP cell membrane penetrating peptide
  • Non-Patent Documents 1 and 2 since the enzyme is degraded by intracellular proteases, it has been difficult to express its function over a long period of time.
  • a technique for imparting traits to plants and enabling long-term functional expression there is a demand for a technique for imparting traits to plants and enabling long-term functional expression.
  • An object of the present invention is to provide a novel vesicle useful for introducing a functional molecule into a plant cell.
  • PICsome Polyion complex vesicles
  • PICsome Polyion complex vesicles
  • PICsome has a semipermeable property and has a property of being highly permeable to small molecules such as substrates, while being low in permeable to molecules having a relatively large molecular weight such as proteins.
  • the present inventors prepared a cell membrane-permeable vesicle in which a cell-penetrating peptide was presented on the surface of PICsome, and by encapsulating the protein in the vesicle, the protein became a plant tissue and We have found that it is delivered to plant cells and reaches the plant genome, that the protein actually functions there, that genome editing is possible, and that novel characterization based on the protein is achieved.
  • the present invention is based on the above-mentioned new findings, and provides the following (1) to (15) and [1] to [7].
  • the polyion complex vesicle is composed of the following (c) and (d). , (1).
  • the cationic segment contains 3 or more and 30 or less cationic amino acid residues.
  • (6) The cell membrane penetrating vesicle according to any one of (1) to (5), which contains one or more functional molecules.
  • the method comprising the step of applying a physical stimulus to the contacted cells.
  • a method for introducing a mutation into a target gene in a cell in which the cell is brought into contact with the cell membrane-permeable vesicle according to (8), and the cell in contact with the cell membrane-permeable vesicle is physically contacted.
  • the method comprising the step of applying a stimulus.
  • (12) The method according to (10) or (11), wherein the cell is a plant cell.
  • a method for producing a mutant plant which is a step of contacting a plant cell with the cell membrane-permeable vesicle according to (8), and imparting a physical stimulus to the plant cell in contact with the cell membrane-permeable vesicle.
  • the method comprising the step of introducing the cell membrane-permeable vesicle into the plant cell to introduce a mutation into the target gene, and the step of obtaining an individual plant from the plant cell into which the mutation has been introduced in the step.
  • a method for preparing a cell membrane-permeable vesicle containing one or more functional molecules A polyion containing the functional molecules by mixing a polymer and a block copolymer in the presence of the functional molecules.
  • the polymer and the block copolymer include (a) a polymer containing a cationic segment and (b) a step of constructing a complex vesicle and presenting a cell membrane permeable peptide on the surface of the polyion complex vesicle. From a combination of a block copolymer containing an anionic segment and an uncharged hydrophilic segment, or (c) a polymer containing an anionic segment, and (d) a block copolymer containing a cationic segment and an uncharged hydrophilic segment. The above method.
  • vesicle according to [1] or [2], which contains at least one protein.
  • a composition containing a vesicle preferably a polyion complex vesicle containing a protein and having a peptide containing a cell membrane penetrating sequence on at least a part of the surface thereof.
  • a composition containing a vesicle preferably a polyion complex vesicle containing a protein and having a reactive group on at least a part of the surface.
  • the peptide has 3 or more (3 or more and 30 or less, 3 or more 20) of cationic amino acids (including both natural and non-natural cationic amino acids) having a cationic group (for example, an amino group) in the side chain.
  • a cationic component containing at least one oligo or polypeptide hereinafter, may be referred to as “cionic segment”) of 3 or more and 15 or less or 3 or more and 10 or less, and an anionic group (for example, carboxyl) in the side chain.
  • a method for introducing a protein into a plant cell which comprises contacting the plant cell with the vesicle according to [3] or the composition according to [4].
  • FIG. B It is a figure which shows the result of having introduced the rhodamine-labeled NPT II contained in the cell membrane penetrating vesicle into the root hair of Arabidopsis thaliana and observing it with a confocal laser scanning microscope. Arrows indicate red fluorescence derived from rhodamine.
  • the images (a and b) shown on the upper and right sides of the panel show the cross section of the root hair at the position indicated by the arrowhead.
  • “PAM” indicates the motif adjacent to the protospacer
  • target sequence indicates the position of the sequence recognized by the guide RNA.
  • the first aspect of the present invention is a cell membrane penetrating vesicle.
  • the cell membrane permeable vesicle of the present invention contains a polyion complex vesicle and a cell membrane penetrating peptide presented on the surface thereof, and can contain one or more functional molecules.
  • a functional molecule can be introduced into a cell and made to function.
  • polyion complex vesicle is an aggregate formed by self-assembly of charged block copolymers, polymers, and the like.
  • the polyion complex vesicle can enclose a functional molecule inside as a capsule-like aggregate.
  • cell permeating Peptide refers to a peptide having the property of penetrating a cell membrane.
  • cell-penetrating peptides include BP100 (Appl Environ Microbiol 72 (5), 3302, 2006), HIV Tat (Journal Biological Chemistry, 272, pp.16010-16017, 1997), and Tat 2 (Biochim Biophys Acta 1768 (Biochim Biophys Acta 1768).
  • cell-permeable sequence examples include the following sequences: KKLFKKILKYL (SEQ ID NO: 1), RKKRRQRRRRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2), RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 3), PLSSIFSRIGDP (SEQ ID NO: 4), PISSIFSRTGDP (SEQ ID NO: 5), AISSILSKTGDP (SEQ ID NO: 6), PILSIFSKIGDL (SEQ ID NO: 7), PLSSIFSKIGDP (SEQ ID NO: 8), PLSSIFSHIGDP (SEQ ID NO: 9), PLSSIFSSIGDP (SEQ ID NO: 10), RCIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 11), DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13), AAVLLPVLLAAP (SEQ ID NO: 14), VTVLALGALAGVGVG (SEQ ID NO: 15), GALFLGWLG
  • peptide sequences in which one to several amino acid residues contained in these peptide sequences are substituted, inserted, and / or deleted and have cell permeability can be preferably used.
  • "several pieces” means, for example, 10 pieces or less, 9 pieces or less, 8 pieces or less, 7 pieces or less, 6 pieces or less, preferably 5 pieces or less or 4 pieces or less, and more preferably 3 pieces or less. Means 2 or less.
  • the cell permeable sequence is substituted with an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 72, or one to several amino acid residues contained in these amino acid sequences. , Inserted and / or deleted, and contains sequences that are cell permeable.
  • the cell permeable sequence is substituted, inserted, and / or deleted from the amino acid sequence of Tat (SEQ ID NO: 33), or one to several amino acid residues contained in the amino acid sequence. Contains sequences with cell permeability.
  • cell-permeable peptide two or more types of cell-permeable peptides may be used in combination. Cell-permeable peptides specific for a particular cell of interest can also be selected.
  • cell membrane permeable vesicle refers to a vesicle having the property of being able to penetrate the cell membrane.
  • a vesicle in which a cell membrane penetrating peptide is presented on the surface of the vesicle can be mentioned.
  • block copolymer means a polymer containing a chain in which two or more different polymers are covalently linked.
  • cationic segment or “cationic segment” refers to a positively charged segment.
  • anionic segment or “anionic segment” means a negatively charged segment.
  • uncharged hydrophilic segment refers to an uncharged, hydrophilic segment.
  • cationic amino acid refers to a positively charged side chain (cationic side chain), for example, an amino acid having a side chain having an amino group or a guanidino group.
  • the cationic amino acid may be a basic amino acid. Further, the cationic amino acid may be either a natural type or a non-natural type cationic amino acid.
  • Specific examples of cationic amino acids include lysine (Lys / K), arginine (Arg / R), succinyl lysine, malonyl lysine, glutalyl lysine, ornithine and the like.
  • anionic amino acid residue refers to a negatively charged side chain (anionic side chain), for example, an amino acid having a side chain having a carboxyl group.
  • the anionic amino acid may be an acidic amino acid.
  • the anionic amino acid may be either a natural type or a non-natural type anionic amino acid.
  • Specific examples of anionic amino acids include aspartic acid (Asp / D), glutamic acid (Glu / E), cysteic acid, phosphoserine, and carboxylated lysine.
  • the term "peptide” refers to an amino acid polymer having one or more peptide bonds.
  • the "peptide” is not limited by the number of amino acid residues contained in the peptide. Therefore, the “peptide” includes oligopeptides containing two or more to several amino acid residues such as dipeptides and tripeptides, and polypeptides containing a large number of amino acid residues. Therefore, not only so-called proteins, but also fragmented ones and those in which other peptides are linked by peptide bonds are included.
  • the "genome editing protein” means a protein used for genome editing. In particular, it refers to a site-specific nuclease used for genome editing. Examples include restriction enzymes, zinc finger nucleases (ZFNs), TALE nucleases (TALEN), CRISPR / Cas9, and CRISPR / Cpf1 (Cas12a).
  • the Cas9 protein is not limited, but spCas9 protein derived from Streptococcus pyogenes, saCas9 protein derived from Staphylococcus aureus, and the like can be used.
  • guideRNA refers to RNA that guides Cas9 protein, Cpf1 protein, etc. to a target DNA sequence on the genome in genome editing using CRISPR.
  • Cas9 gRNA consists of crRNA (CRISPRRNA) that recognizes the target DNA sequence of about 20 bases (in the case of Cpf1 protein, only crRNA functions as gRNA), binding of crRNA to Cas9
  • CRISPRRNA crRNA
  • tracrRNA trans-activating crRNA
  • sgRNA single guide RNA
  • the cell membrane permeable vesicle of the present invention contains a polyion complex vesicle (PICsome) as an essential component and a cell membrane penetrating peptide presented on the surface thereof, and can contain one or more functional molecules as a selective component. ..
  • PICsome polyion complex vesicle
  • PICsome Polyion complex vesicle
  • the type of PICsome contained in the cell membrane penetrating vesicle of the present invention is not limited.
  • the PICsome contained in the cell membrane penetrating vesicle of the present invention is It may contain (a) polymers containing cationic segments, and (b) block copolymers containing anionic and uncharged hydrophilic segments.
  • the PICsome contained in the cell membrane penetrating vesicles of the present invention may include (c) a polymer containing anionic segments, and (d) a block copolymer containing a cationic segment and an uncharged hydrophilic segment. Good.
  • the PICsome contained in the cell membrane permeable vesicles of the present invention comprises (b) block copolymers containing anionic and uncharged hydrophilic segments, and (d) cationic and uncharged hydrophilic segments. It may contain a block copolymer containing.
  • the cationic segment is not limited. For example, 3 or more cationic amino acid residues, 3 or more and 30 or less, 3 or more and 20 or less, 3 or more and 15 or less, or 3 or more and 10 or less, for example, 3, 4, 5 It may be connected by 1, 6, 7, or 8 pieces.
  • the anionic segment is not limited. For example, 3 or more, 3 or more and 30 or less anionic amino acid residues, 3 or more and 20 or less, 3 or more and 15 or less, or 3 or more and 10 or less, for example, 3, 4, 5 It may be connected by 1, 6, 7, or 8 pieces.
  • the combination of the number of cationic amino acid residues in the cationic segment and the number of anionic amino acid residues in the anionic segment may be any combination in the above range.
  • a cationic segment consists of 3 or more and 30 or less cationic amino acid residues
  • / or an anionic segment consists of 3 or more and 30 or less anionic amino acid residues. There may be.
  • Examples of (a), (b), (c), and (d) above are, but are not limited to, (a) polylysine (PolyLys or P (Lys)), (b) Alkyne-TEG-bP ( Lys (COOH))-OMe, (c) P (Lys (COOH)), (d) Alkyne-TEG-bP (Lys) -OMe and the like.
  • the uncharged hydrophilic segment is not limited.
  • the uncharged hydrophilic segment may contain a residue of ethylene glycol.
  • the number of residues of polyethylene glycol contained in the uncharged hydrophilic segment is preferably 2 or more, 2 or more and 10 or less, or 2 or more and 6 or less. From the viewpoint of vesicle stability, the molecular weight of the uncharged hydrophilic segment is preferably 1,000 or less.
  • the polyethylene glycol is tetraethylene glycol (TEG).
  • Cell-penetrating peptide The type of cell-penetrating peptide contained in the cell-penetrating vesicle of the present invention is not limited, and any cell-penetrating peptide can be used.
  • BP100 peptide, BP100 (KH) 9 peptide, BP100CH7 peptide, KAibA peptide and the like may be used.
  • the mode of presentation of the cell membrane penetrating peptide on the surface of PICsome is not limited.
  • the cell membrane penetrating peptide may be bound to any component constituting PICsome.
  • the "bond" referred to here is not limited, and may be, for example, a covalent bond or a supramolecular interaction.
  • the covalent bond is not limited, and includes, for example, a peptide bond, a disulfide bond, a triazole ring-mediated bond formed by a click reaction, and a succinimide-mediated bond formed by a thiol-maleimide reaction.
  • the "supermolecular interaction” is not limited as long as it is a non-covalent interaction between molecules, for example, hydrogen bond, hydrophobic interaction or hydrophobic bond, electrostatic interaction or ionic bond, salt bridge. , Coordination bonds and the like are exemplified.
  • cell membrane permeable peptides include polymers containing cationic segments, block copolymers containing anionic and uncharged hydrophilic segments, polymers containing anionic segments, and / or cationic and uncharged hydrophilic segments. It may be bonded to any of the block copolymers containing.
  • the position where the cell-penetrating peptide binds to these molecules is not limited, but it may bind to the end of the molecule, for example, one end or both ends.
  • the number of cell-penetrating peptides to which they bind is not limited, but for example, one cell-penetrating peptide may be bound to each molecule.
  • the functional molecule contained in the cell membrane penetrating vesicle is not limited.
  • it may be a peptide, a polysaccharide, a nucleic acid, a compound, or a mixture thereof.
  • the functional molecule is a functional peptide and / or a functional nucleic acid.
  • the "functional peptide” refers to a peptide having a specific biological function in vivo or in vitro, or intracellularly or extracellularly.
  • the term "specific biological function” is not limited as long as it is a function that can have an arbitrary effect on biomolecules such as proteins and nucleic acids, cells, tissues or individuals.
  • Specific biological functions include, for example, cell adhesion function, signal transduction function, binding function, linking function, labeling function, metabolic function and the like.
  • the linking function corresponds to, for example, the function of linking a biomolecule such as another peptide or nucleic acid having a specific biological function, a low molecular weight compound, or a metal ion.
  • Examples include a function of mediating antigen-antibody binding or receptor-ligand interaction, a function of binding biomolecules such as RNA and / or DNA, and a function of binding nickel ions, copper ions, and the like.
  • the labeling function corresponds to the function of labeling biomolecules such as proteins and nucleic acids, cells, tissues and individuals. For example, fluorescent labeling and epitope labeling can be mentioned.
  • Metabolic functions include genome editing functions such as nuclease activity. The functional peptide can be appropriately selected depending on the intended use.
  • the "functional peptide” in the present invention include enzymes, binding proteins, marker proteins, artificial peptides, and peptide fragments thereof.
  • the “enzyme” may be, but is not limited to, a genome editing protein, such as a nucleose such as the Cas9 protein.
  • a "binding protein” is a protein that specifically binds to a specific molecule. For example, but not limited to, antibodies or antibody fragments or antigens that mediate antigen-antibody binding, (strept) avidin, maltose-binding protein (MBP), receptors or ligands that mediate receptor-ligand interactions, DNA-binding proteins, RNA. Bound proteins and the like can be mentioned.
  • the "marker protein” is a protein that can serve as a marker when detecting cells, proteins, or the like.
  • a polypeptide capable of determining the expression or presence / absence of a target protein based on its activity is applicable. Examples include, but are not limited to, fluorescent proteins such as GFP, photoproteins such as luciferin or aequorin, enzymes such as horseradish peroxidase (HRP), or alkaline phosphatase (AP).
  • HRP horseradish peroxidase
  • AP alkaline phosphatase
  • the "artificial peptide” is also called a tag peptide, and is an oligopeptide composed of artificially synthesized several to a dozen amino acids.
  • the "functional nucleic acid” may be any of a guide RNA molecule, an antisense nucleic acid (ASO), siRNA, miRNA, and an aptamer.
  • ASO antisense nucleic acid
  • siRNA siRNA
  • miRNA miRNA
  • aptamer an aptamer of a guide RNA molecule
  • the nucleic acid constituting the functional nucleic acid may be either a natural type or a non-natural type.
  • the functional molecule may be a Cas9 protein and a guide RNA molecule for the target gene.
  • the mixing ratio of the cationic segment and the anionic segment can be mixed at a ratio that can be formed.
  • it may be a mixture in which positive and negative charges are offset.
  • the cationic segment and the anionic segment are peptides containing or consisting of a natural or unnatural amino acid residue having a monovalent cation group and an anion group in the side chain, respectively, and the average degree of polymerization of each is high. May be mixed so that the molar ratio is 1: 1.
  • crosslinks may be formed between the anionic segments, between the anionic segments, and / or between the anionic and cationic segments forming the PICsome.
  • Cross-linking may be formed by a side chain cross-linking reaction using, for example, carbodiimides such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) as a cross-linking agent.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • a functional molecule such as a protein can be delivered into a cell such as a plant cell, and a novel trait can be imparted to an individual such as a plant.
  • mutations can be introduced by delivering genome-editing proteins to cells and allowing them to function in the nucleus.
  • the functional molecule contained in the cell-penetrating vesicle of the present invention is protected from protease and the like while being contained in the cell-penetrating vesicle after the cell-penetrating vesicle is transferred into the cell for a long period of time. It can function stably.
  • the functional molecule contained in the cell membrane permeable vesicle of the present invention can function in a state where a part or all of the cell membrane permeable vesicle is released from the cell membrane permeable vesicle after the cell membrane permeable vesicle is transferred into the cell. ..
  • the functional molecule is a genome-editing protein
  • the genome-editing protein can be released from the cell membrane-permeable vesicle and recognize the target gene sequence on the genome.
  • the functional molecule is a functional nucleic acid such as siRNA or miRNA
  • the functional nucleic acid is released from the cell membrane-permeable vesicle and induces degradation or translational repression of the target mRNA by RNAi (RNA interference).
  • RNAi RNA interference
  • the uncharged hydrophilic segment is arranged at the end of only one of the cationic segment and the anionic segment, the stability of PICsome is improved.
  • composition containing the cell membrane permeable vesicle of the present invention is also provided.
  • a second aspect of the present invention is a plant, plant tissue, or plant cell containing the cell membrane permeable vesicle of the present invention.
  • the plant, plant tissue, or plant cell of this embodiment has a novel trait based on a functional molecule contained in a cell membrane penetrating vesicle.
  • composition (1) Cell-penetrating vesicle
  • the cell-penetrating vesicle contained in the plant, plant tissue, or plant cell of this embodiment contains one or more functional molecules. Since the composition of the cell membrane penetrating vesicle and the functional molecule has already been described in detail in the first aspect, the specific description thereof will be omitted here.
  • Plant, plant tissue, or plant cell The type of plant, plant tissue, or plant cell in this embodiment is not limited.
  • the plant is not particularly limited and may be either angiosperms or gymnosperms.
  • angiosperms include both dicotyledonous and monocotyledonous plants. Typical examples include crop plants such as grains, flowers, vegetables and fruits that are important in agriculture, especially in the seedling industry and the floriculture industry.
  • Solanaceae eg, cabbage, daikon, asteraceae, abrana
  • species belonging to the family Leguminosae eg, soybean, peanut, pea, green beans, azuki, solanaceae, sweet pea
  • Solanaceae eg, tomatoes, eggplants, potatoes, tobacco, peppers, capsicum, petunia
  • Rosaceae eg, strawberries, roses, apples, pears, peaches, loquats, almonds, peaches, ume , Sakura
  • species belonging to the family Rosaceae eg, symbidium, phalaenopsis, cattleya, dendrobium
  • species belonging to the family Asteraceae eg, lilies, tulips, hyacinth, muscari, green onions, onions, garlic
  • family of citrus eg, citrus
  • the plant tissue is not particularly limited, and specifically, any organ (for example, root, root hair, stem, leaf, flower, epidermis, or a combination thereof, or pollen, sprout, egg cell, seed, etc.) Including), may be a tissue consisting of a morphologically and / or functionally differentiated cell group or a part thereof.
  • any cell type contained in the above-mentioned plant tissue can be used.
  • a third aspect of the present invention is a method for introducing a functional molecule into a cell.
  • the method of this embodiment includes a step of contacting a cell with a cell membrane permeable vesicle (contact step) and a step of applying a physical stimulus to the cell in contact with the cell membrane permeable vesicle (physical stimulation step).
  • the cell membrane permeable vesicle that has come into contact with the cell by the contact step promotes the permeation of the cell membrane and the translocation into the cell by the physical stimulation step, and delivers a functional molecule such as a peptide into the cell. Can be done.
  • the method of this embodiment includes a step of contacting a cell with a cell membrane permeable vesicle (contact step) and a step of applying a physical stimulus to a cell in contact with the cell membrane permeable vesicle (physical stimulation step).
  • the cells to which the functional molecule is introduced by the cell membrane penetrating vesicle of the present invention are not particularly limited. Any cell of eukaryote, bacterium, or archaea is targeted.
  • the eukaryote may be a unicellular organism or a multicellular organism, and may be an animal cell or a plant cell. Preferably, animal cells or plant cells are targeted.
  • the plant cell may be any cell of the plant species described in the second aspect, or may be any cell of the plant tissue described in the second aspect.
  • the plant cell may be a callus or true leaf plant cell. Examples of animal cells include cells other than humans, cells derived from humans and outside the human body (for example, cells isolated from humans) and the like.
  • the cell membrane penetrating vesicle introduced into the cell in this embodiment contains one or more functional molecules. Since the composition of the cell membrane penetrating vesicle and the functional molecule has already been described in detail in the first aspect, the specific description thereof will be omitted here.
  • Step (1) Contact step is not particularly limited as long as it is a step in which cells and cell membrane-permeable vesicles can be brought into contact with each other.
  • it may be a step of spraying, applying, or administering to an individual containing cells.
  • the physical stimulation step is not limited as long as it can promote the permeation of the cell membrane and the translocation into the cell of the cell membrane permeable vesicle in contact with the cell by the contact step.
  • the physical stimulus is preferably a stimulus that can increase the permeability of the cell membrane.
  • pressure change of pressurization and / or depressurization, temperature change of temperature rise and / or temperature drop, temperature stimulus such as freezing and / or thawing, heat shock, drying, cutting, UV irradiation and X-ray irradiation, ultrasonic irradiation, Microwave irradiation, osmotic pressure change, etc. can be used.
  • a fourth aspect of the present invention is a method for introducing a mutation into a target gene in a cell.
  • the method of this embodiment includes a step of contacting a cell with a cell membrane permeable vesicle (contact step) and a step of applying a physical stimulus to the cell in contact with the cell membrane permeable vesicle (physical stimulation step).
  • the cell membrane penetrating vesicle used in this embodiment contains a functional peptide and / or a functional nucleic acid as a functional molecule. More specifically, in this embodiment, the functional molecule is a genome editing tool such as a genome editing protein. For example, a guide RNA molecule for the Cas9 protein and target genes.
  • the composition of the other cell membrane penetrating vesicles conforms to the first aspect.
  • the configuration of the target cell, contact step, and physical stimulation step is the same as that described in the third aspect.
  • the cell membrane permeable vesicle that has come into contact with the cell by the contact step promotes the permeation of the cell membrane and the translocation into the cell by the physical stimulation step, and the Cas9 protein and the guide RNA molecule for the target gene, etc.
  • Genome editing tools can be delivered intracellularly to generate mutations.
  • a fifth aspect of the present invention is a method for producing a mutant plant.
  • the method of this embodiment is a step of contacting a cell with a cell membrane permeable vesicle (contact step), and by applying a physical stimulus to a plant cell in contact with the cell membrane permeable vesicle, the cell membrane permeable vesicle is introduced into the plant cell. It includes a step of introducing and introducing a mutation into a target gene (mutation introduction step), and a step of obtaining an individual plant from the plant cell into which the mutation has been introduced.
  • the composition of the cell membrane penetrating vesicle used in this embodiment, the target cells, and the contacting step conform to the fourth aspect.
  • the mutation introduction step of this aspect includes the physical stimulation step of the fourth aspect.
  • Preferred functional molecules contained in the cell membrane-permeable vesicle introduced into the cell in this embodiment are a genome editing protein, a Cas9 protein, a guide RNA molecule for a target gene, and the like.
  • the process of obtaining an individual plant is not particularly limited.
  • seeds can be obtained from an individual containing cells into which the mutation has been introduced in the mutation introduction step to regenerate the plant.
  • dedifferentiation induction eg, callus induction
  • tissues containing cells, or individuals containing cells, in part or all of them is induced.
  • dedifferentiated cells for example, callus cells
  • the plant body can be regenerated.
  • any method known in the art can be used as the method for the dedifferentiation induction treatment.
  • plant hormones, temperature stimuli such as heat shock, injuries such as cutting treatment, and viral and bacterial infections
  • the method for inducing redifferentiation is not limited, and examples thereof include a method using a plant hormone.
  • the cell membrane permeable vesicle that has come into contact with the cell by the contact step is promoted to permeate the cell membrane and translocate into the cell by the mutation introduction step, and the genome such as the Cas9 protein and the guide RNA molecule for the target gene is promoted.
  • Editing tools can be delivered intracellularly to mutate target genes on the genome to produce mutant plants.
  • a sixth aspect of the present invention is a method for preparing a cell membrane penetrating vesicle. According to the method of this aspect, a vesicle containing one or more functional molecules and having a cell membrane penetrating peptide presented on the surface thereof can be prepared.
  • the method of this aspect is a method for preparing a cell membrane penetrating vesicle containing one or more functional molecules.
  • a polyion complex vesicle containing a functional molecule is constructed by mixing a polymer and / or a block copolymer in the presence of the functional molecule (PICsome construction step).
  • the step of presenting the cell membrane permeable peptide on the surface of the polyion complex vesicle (cell membrane permeable peptide presentation step) is included, and as a selective step, a step of cross-linking PICsome (crosslinking step) is included.
  • the composition of the functional molecule and the cell membrane penetrating peptide in this embodiment conforms to the first aspect.
  • Step (1) PICsome construction step
  • the combination of the polymer and / or the block copolymer mixed in the presence of the functional molecule in the PICsome construction step is as follows (1) to (3): A combination of (1) a polymer containing a cationic segment and (b) a block copolymer containing an anionic segment and an uncharged hydrophilic segment.
  • (2) A combination of (c) a polymer containing an anionic segment and a block copolymer containing (d) a cationic segment and an uncharged hydrophilic segment, or (3) (b) an anionic segment and an uncharged hydrophilic segment. It is selected from any combination of block copolymers containing sex segments and (d) block copolymers containing cationic and uncharged hydrophilic segments.
  • the configuration of the cationic segment, the anionic segment, and the uncharged hydrophilic segment conforms to the first aspect.
  • These segments can be synthesized, for example, by an enzymatic polymerization method using papain.
  • the mixing ratio of the cationic segment and the anionic segment can be mixed at a ratio that can be formed.
  • it may be a mixture in which positive and negative charges are offset.
  • the cationic segment and the anionic segment are peptides containing or consisting of a natural or unnatural amino acid residue having a monovalent cation group and an anion group in the side chain, respectively, and the average degree of polymerization of each is high. May be mixed so that the molar ratio is 1: 1.
  • the polymer and / or block copolymer mixed in this step preferably has a modifying group capable of binding the cell-penetrating peptide presented in the cell-penetrating peptide presentation step.
  • the polymer and / or block copolymer can contain as a modifying group an alkyne or azide capable of binding a cell-penetrating peptide by click chemistry.
  • the cell-penetrating peptide presented in this step has a modifying group capable of binding to PICsome constructed in the PICsome construction step, for example, a modifying group capable of binding to a polymer and / or a block copolymer contained in PICsome. Is preferable.
  • the modifying group may be an alkyne or azide that can be attached to the polymer and / or block copolymer by click chemistry.
  • the cell membrane penetrating peptide may have an azide group, and the polymer and / or block copolymer contained in PICsome may have an alkynyl group.
  • the cell membrane penetrating peptide may have an alkynyl group, and the polymer and / or block copolymer contained in PICsome may have an azide group.
  • the cell-penetrating peptide can be bound to the polymer and / or block copolymer by forming a triazole ring between the alkyne and the azide using a click reaction.
  • any known conditions can be used as the conditions for the click reaction in which the cell membrane penetrating peptide is bound to the polymer and / or the block copolymer.
  • the cross-linking step of cross-linking PICsome is a step of cross-linking between some or all the constituents contained in PICsome. This step is a selection step and can be performed between the PICsome construction step and the cell-penetrating peptide presentation step, after the cell-penetrating peptide presentation step, and / or at the same time as the cell-penetrating peptide presentation step.
  • the method for cross-linking PICsome is not limited as long as it can cross-link the components constituting PICsome.
  • carbodiimides such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) can be used as a cross-linking agent to carry out the condensation reaction of the polymer side chains.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • Cross-linking in this step can be performed between the polymers contained in PICsome, between the block copolymers, and / or between the polymers and the block copolymers.
  • it can be formed between anionic segments, between cationic segments, and / or between anionic and cationic segments.
  • Alkyne-TEG-bP (Lys- (COOH))-OMe which is a block copolymer with alkyne
  • PolyLys without Alkyne-TEG-bP (Lys) -OMe or TEG are mixed to bring alkyne to the surface.
  • the proteins are mixed when or after the PICsome is constructed.
  • An aqueous solvent can be used for mixing. This makes it possible to obtain PICsome containing a protein.
  • a cell-penetrating peptide (N 3- BP-100) having an azide group is prepared and reacted with an alkynyl group on the surface of the vesicle by click chemistry to permeate the cell membrane having the cell-penetrating sequence BP-100 on the surface.
  • a sex vesicle is obtained.
  • the cell membrane penetrating vesicle thus obtained can be introduced into cells (Fig. 1).
  • Example 1 Preparation of an aggregate composed of Alkyne-TEG-bP (Lys) -OMe and Alkyne-TEG-bP (Lys (COOH))-OMe> (Purpose) An aggregate composed of Alkyne-TEG-bP (Lys) -OMe and Alkyne-TEG-bP (Lys (COOH))-OMe is prepared.
  • Alkyne-TEG-bP (Lys- (Boc))-OMe was synthesized by linking this with tetraethylene glycol (TEG) having an alkyne using succinic anhydride. After deprotecting the Boc group of the side chain of this block copolymer with TFA, TEA is added and dialyzed to obtain the cationic block copolymer Alkyne-TEG-bP (Lys) -OMe and the cationic polymer PolyLys. Obtained.
  • the morphology of the aggregate was evaluated using a field emission scanning electron microscope. As a result, it was found that the aggregate had a spherical morphology (Fig. 3, left photo). Furthermore, as a result of the destruction of the surface of the spherical aggregate by electron beam irradiation during electron microscope observation, it was confirmed that the inside was hollow (Fig. 3, right photo).
  • Example 2 Preparation and cross-linking of an aggregate composed of PolyLys and Alkyne-TEG-bP (Lys (COOH))-OMe> (Purpose) PolyLys having no TEG chain is used as the cationic polymer used in preparing PICsome, and an aggregate composed of PolyLys and Alkyne-TEG-bP (Lys (COOH))-OMe is prepared.
  • the particle size of this polymer increased slightly up to about 3 hours after preparation, but did not increase after that, and maintained a particle size of about 200 nm even after 12 hours (Fig. 4). It was considered that this was a result of the removal of the TEG chain from the cationic polymer, which reduced steric hindrance and formed PICsome with high particle stability.
  • NPTII neomycin phospho-transferase II
  • RhB-NPTII rhodamine
  • NPTII is an enzyme that has the activity of transferring the phosphate group of ATP to the antibiotic kanamycin, and the activity inactivates kanamycin.
  • RhB-NPTII By constructing PICsome in the presence of RhB-NPTII, RhB-NPTII was included in PICsome.
  • PICsome PICsome composed of PolyLys and Alkyne-TEG-bP (Lys (COOH))-OMe was used, and preparation and cross-linking of PICsome were carried out according to the method of Example 2.
  • RhB-NPTII which was not included in PICsome, was removed by dialysis.
  • RhB-NPTII fluorescence correlation spectroscopy
  • RhB-NPTII not included in PICsome the diffusion time was measured using fluorescence correlation spectroscopy. As a result, the diffusion time of RhB-NPTII not included in PICsome was 0.243 ms.
  • RhB-NPTII the diffusion time of RhB-NPTII contained in PICsome was measured using fluorescence correlation spectroscopy.
  • the diffusion time of RhB-NPTII contained in PICsome was 4.86 ms, and the diffusion time was longer than that of RhB-NPTII not contained in PICsome. From this result, it was shown that RhB-NPTII is included in PICsome.
  • RhB-NPTII encapsulated in PICsome was electrophoresed and then silver-stained to quantify the protein. As a result, it was confirmed that about 8% of RhB-NPTII was incorporated into PICsome. From the above results, it was considered that RhB-NPTII was successfully included in PICsome.
  • Example 4 Introduction of cell membrane penetrating vesicle into plant tissue> (Purpose) A cell-penetrating vesicle containing RhB-NPTII is introduced into the root hair of the seedlings of Arabidopsis thaliana.
  • RhB-NPTII RhB-NPTII
  • RhB-NPTII a cell membrane-permeable vesicle containing RhB-NPTII was introduced into the seedlings of Arabidopsis thaliana.
  • red fluorescence derived from RhB was observed from the inside of the root hair of the seedling (Fig. 5, arrow on the right side).
  • RhB-NPTII introduction of RhB-NPTII into the root hair was successful by using the cell membrane penetrating vesicle.
  • Example 5 Genome editing using a cell membrane penetrating vesicle> (Purpose) The Cas9-guide RNA complex is encapsulated in a cell-penetrating vesicle, introduced into the hypocotyl-derived callus of Arabidopsis thaliana, and genome editing is performed.
  • RNP Ribonucleoprotein
  • SEQ ID NO: 77 The base sequence of the guide RNA (SEQ ID NO: 77) was designed to specifically recognize and target the base sequence of the phytoene desaturase (PDS) gene.
  • PDS phytoene desaturase
  • the 1st to 20th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 77 correspond to the recognition sequence for the target sequence (FIG. 6, "target sequence”).
  • RNP which is a Cas9-guide RNA complex, is obtained by mixing Cas9 protein (Alt-R® Sp.
  • PICsome was crosslinked by a condensation reaction of polymer side chains using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC). ..
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • the alkyne presented on the surface of this PICsome is modified by a click reaction of N 3- (Lys-Aib-Ala) 3 (SEQ ID NO: 78), which is a cell membrane penetrating peptide (CPP) having an azide, and RNP.
  • CPP cell membrane penetrating peptide
  • a PICsome (hereinafter referred to as "cell membrane permeable peptide”) was obtained, which contained the above-mentioned substance and presented CPP on the surface.
  • This cell membrane penetrating vesicle was introduced into the hypocotyl-derived callus or true leaf of Arabidopsis thaliana, and genome editing was performed. Specifically, when curls are used, the curls are placed in an aqueous solution containing cell membrane-permeable vesicles (concentration of each component of cell membrane-permeable vesicles: cationic block copolymer 250 ⁇ M and anionic polymer 500 ⁇ M). Immerse and depressurize at -0.08 MPa using a vacuum pump (ulvac GLD-051) and a vacuum desiccator (Shinko Kasei V-1), and a compact air pump (asone 1-361-02) and a stainless steel pressurized container.
  • a vacuum pump ulvac GLD-051
  • a vacuum desiccator Shinko Kasei V-1
  • a compact air pump asone 1-361-02
  • the number of mutant reads / total number of reads in 3 trials using untreated callus not treated with cell membrane permeable vesicles was 0 / 102,764 read, 0 / 97,757 read, and 0 / 84,929 read, respectively. , No mutations were detected.
  • the Cas9 protein was expressed by inserting a foreign gene encoding the Cas9 protein into the genomic DNA using the Agrobacterium method or the particle gun method.
  • the foreign gene introduced into the genomic DNA becomes unnecessary after the genome is edited. Therefore, since it is necessary to obtain a null segrigant from a later generation, the procedure becomes complicated and it takes a long time to complete a series of procedures.
  • the cell-penetrating vesicle of the present invention actually penetrated the cell membrane and migrated into the cell to reach the intracellular genome, and the delivered functional molecule was intracellular or intracellular. It was proved that it actually works. From this result, it is shown that not only genome editing tools but also functional molecules containing functional peptides such as enzymes can be delivered intracellularly by the cell membrane penetrating vesicle of the present invention and can function intracellularly or in the nucleus. was done.

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Abstract

機能性分子の植物細胞への導入に有用な新規なベシクルを提供することである。　ポリイオンコンプレックスベシクル、及びその表面に提示される細胞膜透過性ペプチドを含む、細胞膜透過性ベシクルを提供する。

Description

細胞膜透過性ベシクル
　本発明は、細胞膜透過性ベシクル、機能性分子を細胞内に導入する方法、及び変異体植物を作製する方法に関する。
　近年、医薬品やバイオプラスチックなどの有用物質の生産を目的として、植物へ新規形質を付与する技術が注目されている。
　植物へ新規形質を付与する従来技術として、遺伝子組換えなどの遺伝子改変技術が使用されてきた。しかし、環境に対する影響の懸念などから遺伝子組換え植物の利用には依然として大きな制約がある。それ故、遺伝子組換え技術を使用せずに、植物の形質を改変する技術が求められている。
　遺伝子組換えなどの遺伝子改変によらず植物の形質を改変するために、タンパク質などの機能性分子を植物細胞に直接送達する方法がある。例えば、目的のタンパク質を植物細胞内へ送達するキャリアペプチドが考案されており、細胞膜透過性配列とポリカチオン配列とを組み合わせた融合ペプチドなどが提案されている（特許文献１）。
　本発明者は、細胞膜透過性ペプチド(CPP)と酵素とをイオン性相互作用により複合化させることで、植物細胞への酵素の導入に成功している（非特許文献１、２）。しかし、酵素が細胞内のプロテアーゼにより分解されるため、長期間にわたる機能発現は困難であった。このような背景のもと、植物に形質を付与し、かつ長期的な機能発現を可能にする技術が求められている。
国際公開第2017/126604号
Ng K.K., et al. PLoS One, 2016, 11(4), e0154081. Numata K., et al. Plant Biotechnol (Tokyo), 2016, 33(5), 403-407.
　本発明の目的は、植物細胞への機能性分子の導入に有用な新規なベシクルを提供することである。
　医療用の薬物送達などを目的として開発されているポリイオンコンプレックスベシクル(PICsome)は、ブロック共重合体やポリマーなどの自己集合によって形成されるカプセル状集合体であり、その内部に機能性分子を封入することができる（Anraku Y., et al., J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 1631-1636.）。PICsomeは半透性を有し、基質などの小分子に対しては透過性が高い一方で、タンパク質のような分子量の比較的大きな分子に対しては透過性が低いという性質を有する。したがって、酵素分子をPICsome内部に保持した状態で生体内に導入すれば、プロテアーゼなどによる酵素の分解を抑制しながら酵素機能を発現することができるという利点がある（Anraku Y., et al., J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 1631-1636.）。それ故、PICsomeは、ミセル状の複合体などと比較して、タンパク質を長期的に機能発現させるための輸送キャリアとして優れた性質を有することが知られている。その一方で、PICsomeを細胞内に移行させる技術や、細胞内で機能させる技術は確立されていない。
　本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、細胞膜透過性ペプチドをPICsome表面上に提示させた細胞膜透過性ベシクルを作製し、当該ベシクル中にタンパク質を内包させることによって、当該タンパク質が植物組織及び植物細胞に送達され、植物ゲノムにまで到達すること、当該タンパク質が実際にそこで機能し、ゲノム編集が可能であること、及び当該タンパク質に基づく新規形質付与が達成されることを見出した。本発明は上記新たな知見に基づくもので、以下の（１）～（１５）及び［１］～［７］を提供する。
（１）ポリイオンコンプレックスベシクル、及びその表面に提示される細胞膜透過性ペプチドを含む、細胞膜透過性ベシクル。
（２）前記ポリイオンコンプレックスベシクルが以下の(a)及び(b)を含む、（１）に記載の細胞膜透過性ベシクル。
　(a)カチオン性セグメントを含むポリマー、及び
　(b)アニオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体
（３）前記ポリイオンコンプレックスベシクルが以下の(c)及び(d)から構成される、（１）に記載の細胞膜透過性ベシクル。
　(c)アニオン性セグメントを含むポリマー、及び
　(d)カチオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体
（４）前記カチオン性セグメントが、カチオン性アミノ酸残基を3個以上30個以下で連結してなり、及び／又は前記アニオン性セグメントが、アニオン性アミノ酸残基を3個以上30個以下で連結してなる、（２）又は（３）に記載の細胞膜透過性ベシクル。
（５）前記細胞膜透過性ペプチドが、前記ブロック共重合体に連結されている、（２）～（４）のいずれかに記載の細胞膜透過性ベシクル。
（６）一以上の機能性分子を内包する、（１）～（５）のいずれかに記載の細胞膜透過性ベシクル。
（７）前記機能性分子が機能性ペプチド及び／又は機能性核酸である、（６）に記載の細胞膜透過性ベシクル。
（８）前記機能性分子が、Cas9タンパク質及び標的遺伝子に対するガイドRNA分子である、（６）に記載の細胞膜透過性ベシクル。
（９）（６）～（８）のいずれかに記載の細胞膜透過性ベシクルを含む植物、植物組織、又は植物細胞。
（１０）機能性分子を細胞内に導入する方法であって、前記細胞と（６）～（８）のいずれかに記載の細胞膜透過性ベシクルとを接触させる工程、及び前記細胞膜透過性ベシクルと接触した前記細胞に物理的刺激を付与する工程を含む、前記方法。
（１１）細胞において標的遺伝子に変異を導入する方法であって、前記細胞と（８）に記載の細胞膜透過性ベシクルとを接触させる工程、及び前記細胞膜透過性ベシクルと接触した前記細胞に物理的刺激を付与する工程を含む、前記方法。
（１２）前記細胞が植物細胞である、（１０）又は（１１）に記載の方法。
（１３）前記植物細胞が、カルス又は本葉の植物細胞である、（１２）に記載の方法。
（１４）変異体植物を作製する方法であって、植物細胞と（８）に記載の細胞膜透過性ベシクルとを接触させる工程、前記細胞膜透過性ベシクルと接触した前記植物細胞に物理的刺激を付与することによって、前記細胞膜透過性ベシクルを前記植物細胞内に導入し、標的遺伝子に変異を導入する工程、及び前記工程で変異が導入された植物細胞から植物個体を得る工程を含む、前記方法。
（１５）一以上の機能性分子を内包する細胞膜透過性ベシクルの調製方法であって、ポリマー及びブロック共重合体を機能性分子の存在下で混合することによって、前記機能性分子を内包するポリイオンコンプレックスベシクルを構築する工程、並びに細胞膜透過性ペプチドを前記ポリイオンコンプレックスベシクル表面上に提示する工程を含み、前記ポリマー及び前記ブロック共重合体は、(a)カチオン性セグメントを含むポリマー、及び(b)アニオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体、又は(c)アニオン性セグメントを含むポリマー、及び(d)のカチオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体の組合せからなる、前記方法。
［１］正イオンに荷電した荷電性セグメントを有するポリマーと、非イオン性の非荷電親水性セグメントと負イオンに荷電した荷電性セグメントとを有するブロック共重合体とにより形成されるベシクルであって、細胞膜透過性配列を含むぺプチドをその膜上に有するベシクル。
［２］負イオンに荷電した荷電性セグメントを有するポリマーと、非イオン性の非荷電親水性セグメントと正イオンに荷電した荷電性セグメントとを有するブロック共重合体とにより形成されるベシクルであって、細胞膜透過性配列を含むぺプチドをその膜上に有するベシクル。
［３］少なくとも１種のタンパク質を内包する［１］又は［２］に記載のベシクル。
［４］タンパク質を内包するとともに、表面の少なくとも一部に細胞膜透過性配列を含むペプチドを有するベシクル（好ましくはポリイオンコンプレックスベシクル）を含む組成物。
［５］タンパク質を内包するとともに、表面の少なくとも一部に反応性基を有するベシクル（好ましくはポリイオンコンプレックスベシクル）を含む組成物。
［６］前記ベシクルが、側鎖にカチオン性基（例えばアミノ基）を有するカチオン性アミノ酸（天然及び非天然のカチオン性アミノ酸のいずれも含まれる）の３以上（３以上３０以下、３以上２０以下、３以上１５以下又は３以上１０以下）のオリゴもしくはポリペプチド（以下、「カチオニックセグメント」という場合がある）の少なくとも１種を含むカチオン性成分と、側鎖にアニオン性基（例えばカルボキシル基、）を有するアニオン性アミノ酸（天然及び非天然のカチオン性アミノ酸のいずれも含まれる）の３以上（３以上３０以下、３以上２０以下、３以上１５以下又は３以上１０以下）のオリゴもしくはポリペプチドの少なくとも１種を含むアニオン性成分とのポリイオンコンプレックスベシクルである、［１］～［４］のいずれかのベシクル又は組成物。
［７］植物細胞と、［３］に記載のベシクル又は［４］に記載の組成物とを接触させることを含む、植物細胞へのタンパク質の導入方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる米国特許出願第62/892,775号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、植物細胞への機能性分子の導入に有用な新規なベシクルを提供することができる。
表面に細胞膜透過性を提示させたPICsomeの導入による、植物への新規形質付与を示す模式図である。図中、「PolyLys」については、ユニットとなるリジン（Lys）の構造を示す。 カチオン性ブロック共重合体Alkyne-TEG-b-P(Lys)-OMe及びアニオン性ブロック共重合体Alkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMeから構成される集合体の粒径が、時間とともに増大した結果を示す図である。 カチオン性ブロック共重合体Alkyne-TEG-b-P(Lys)-OMe及びアニオン性ブロック共重合体Alkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMeから構成される集合体を電界放出形走査型電子顕微鏡(FE-SEM)を用いて観察した結果を示す図である。集合体は球状の形態を示したが（左側）、電子線照射を行ったところ、球状集合体の表面が破壊され、内部の空洞が確認された（右側）。 カチオン性ポリマーPolyLys及びアニオン性ブロック共重合体Alkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMeから構成される集合体の粒径が安定して維持された結果を示す図である。 (A)細胞膜透過性ベシクルに内包されていないローダミン標識NPT IIをシロイヌナズナの根毛に導入し、共焦点レーザー顕微鏡（CLSM）で観察した結果を示す図である。(B)細胞膜透過性ベシクルに内包されたローダミン標識NPT IIをシロイヌナズナの根毛に導入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す図である。矢印はローダミンに由来する赤色蛍光を示す。パネル上側と右側に示す画像（a及びb）は、矢頭で示す位置における根毛の断面を示す。 Cas9-ガイドRNA複合体をシロイヌナズナの胚軸由来カルスに導入することによって、標的切断部位に生じた変異の例(a)～(c)を示す図である。図中、「PAM」はプロトスペーサー隣接モチーフを示し、「標的配列」はガイドRNAによって認識される配列の位置を示す。
１．細胞膜透過性ベシクル
１－１．概要
　本発明の第１の態様は、細胞膜透過性ベシクルである。本発明の細胞膜透過性ベシクルは、ポリイオンコンプレックスベシクル、及びその表面に提示される細胞膜透過性ペプチドを含み、一以上の機能性分子を内包することができる。本発明の細胞膜透過性ベシクルによれば、機能性分子を細胞内に導入し、機能させることができる。
１－２．用語の定義
　本明細書において頻用する用語について以下で定義する。
　本明細書において「ポリイオンコンプレックスベシクル（PICsome）」とは、荷電したブロック共重合体やポリマーなどの自己集合によって形成される集合体である。ポリイオンコンプレックスベシクルは、カプセル状集合体として、その内部に機能性分子を封入することができる。
　本明細書において「細胞膜透過性ペプチド（Cell Permeating Peptide; CPP）」とは、細胞膜を透過する性質を有するペプチドをいう。細胞透過性ペプチドとしては、例えば、BP100（Appl Environ Microbiol 72 (5), 3302, 2006）、HIV Tat (Journal Biological Chemistry, 272, pp.16010-16017, 1997)、Tat2（Biochim Biophys Acta 1768 (3), 419, 2007）、Penetratin、pVEC、pAntp(Journal Biological Chemistry, 269, pp.10444-10450, 1994)、HSV-1 VP22(Cell, 88, pp.223-233, 1997)、MAP(Model amphiphilic peptide)（Biochimica Biophysica Acta, 1414, pp.127-139, 1998）、Transportan（FEBS Journal, 12, pp.67-77, 1998）、R7（Nature Medicine, 6, pp.1253-1257, 2000）、MPG（Nucleic Acid Research 25, pp.2730-2736, 1997）、及びPep-1（Nature Biotechnology, 19, pp.1173-1176, 2001）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞透過性配列の具体例としては、例えば以下の配列：KKLFKKILKYL(配列番号1)、RKKRRQRRRRKKRRQRRR(配列番号2)、RKKRRQRRR(配列番号3)、PLSSIFSRIGDP(配列番号4)、PISSIFSRTGDP(配列番号5)、AISSILSKTGDP(配列番号6)、PILSIFSKIGDL(配列番号7)、PLSSIFSKIGDP(配列番号8)、PLSSIFSHIGDP(配列番号9)、PLSSIFSSIGDP(配列番号10)、RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号11)、DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD(配列番号12)、AAVALLPAVLLALLAP(配列番号13)、AAVLLPVLLAAP(配列番号14)、VTVLALGALAGVGVG(配列番号15)、GALFLGWLGAAGSTMGA(配列番号16)、MGLGLHLLVLAAALQGA(配列番号17)、LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP(配列番号18)、GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL(配列番号19)、KLALKLALKALKAALKLA(配列番号20)、及び(Lys-Aib-Ala)3（Aibは2-アミノイソ酪酸を示す）(配列番号78)を挙げることができる。これらのペプチド配列に含まれる１個から数個のアミノ酸残基が置換、挿入、及び/又は欠失し、かつ細胞透過性を有するペプチド配列を好適に使用できる場合もある。本明細書において、「数個」とは、例えば10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、好ましくは5個以下又は4個以下、さらに好ましくは3個以下又2個以下を意味する。
　上記の配列に加えて、使用可能な細胞透過性配列の例を以下の表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　表1に記載の参考文献の詳細は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　一実施形態において、細胞透過性配列は、配列番号1～72で示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列に含まれる１個から数個のアミノ酸残基が置換、挿入、及び/又は欠失し、かつ細胞透過性を有する配列を含む。
　一実施形態において、細胞透過性配列は、Tatのアミノ酸配列（配列番号33）、又は該アミノ酸配列に含まれる1個から数個のアミノ酸残基が置換、挿入、及び/又は欠失し、かつ細胞透過性を有する配列を含む。
　細胞透過性ペプチドとして、2種以上の細胞透過性ペプチドを組み合わせて用いてもよい。目的の特定の細胞に対して特異的な細胞透過性ペプチドを選択することもできる。
　本明細書において「細胞膜透過性ベシクル」とは、細胞膜を透過し得る性質を有するベシクルをいう。例えば、ベシクルの表面に細胞膜透過性ペプチドが提示されたベシクルなどが挙げられる。
　本明細書において「ブロック共重合体」とは、2種類以上の異なるポリマーが共有結合で連結された鎖を含むポリマーを意味する。
　本明細書において「カチオン性セグメント」又は「カチオニックセグメント」とは、正に荷電したセグメントをいう。
　本明細書において「アニオン性セグメント」又は「アニオニックセグメント」とは、負に荷電したセグメントをいう。
　本明細書において「非荷電親水性セグメント」とは、荷電していない、親水性のセグメントをいう。
　本明細書において「カチオン性アミノ酸」とは、正に荷電した側鎖（カチオン性側鎖）、例えばアミノ基やグアニジノ基を有する側鎖を有するアミノ酸をいう。カチオン性アミノ酸は、塩基性アミノ酸であってもよい。また、カチオン性アミノ酸は、天然型及び非天然型のカチオン性アミノ酸のいずれであってもよい。カチオン性アミノ酸の具体例としては、リジン（Lys/K）、アルギニン（Arg/R）、スクシニルリジン、マロニルリジン、グルタリルリジン、及びオルニチンなどが挙げられる。
　本明細書において「アニオン性アミノ酸残基」とは、負に荷電した側鎖（アニオン性側鎖）、例えばカルボキシル基を有する側鎖を有するアミノ酸をいう。アニオン性アミノ酸は、酸性アミノ酸であってもよい。また、アニオン性アミノ酸は、天然型及び非天然型のアニオン性アミノ酸のいずれであってもよい。アニオン性アミノ酸の具体例としては、アスパラギン酸（Asp/D）、グルタミン酸（Glu/E）、システイン酸、ホスホセリン、及びカルボキシル化リジンなどが挙げられる。
　本明細書において「ペプチド」とは、1つ以上のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーをいう。「ペプチド」は、ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数によって限定されない。したがって、「ペプチド」には、ジペプチドやトリペプチドなどの2個以上～数個のアミノ酸残基を含むオリゴペプチドから、多数のアミノ酸残基を含むポリペプチドまでが包含される。したがって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含される。
　本明細書において「ゲノム編集タンパク質」とは、ゲノム編集に使用されるタンパク質をいう。特に、ゲノム編集に使用される部位特異的ヌクレアーゼをいう。例えば、制限酵素、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALEヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Cas9、及びCRISPR/Cpf1（Cas12a）などが挙げられる。Cas9タンパク質としては、限定しないが、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来のspCas9タンパク質や黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のsaCas9タンパク質などを使用することができる。
　本明細書において「ガイドRNA（guideRNA；gRNA）」とは、CRISPRを用いたゲノム編集において、Cas9タンパク質やCpf1タンパク質タンパク質などをゲノム上の標的DNA配列に導くRNAをいう。具体的には、Cas9のgRNAは約20塩基の標的DNA配列を認識するcrRNA（CRISPR RNA）からなる場合（Cpf1タンパク質の場合には、crRNAのみでgRNAとして機能する）、crRNAとCas9への結合の足場となるtracrRNA（trans-activating crRNA）との2種のRNA分子からなる場合、これらを結合して1つにしたsgRNA（single guide RNA）が例示される。
１－３．構成
　以下、本発明の細胞膜透過性ベシクルについて具体的に説明をする。
　本発明の細胞膜透過性ベシクルは、必須構成成分としてポリイオンコンプレックスベシクル（PICsome）、及びその表面に提示される細胞膜透過性ペプチドを含み、選択的成分として一以上の機能性分子を内包することができる。
（１）ポリイオンコンプレックスベシクル（PICsome）
　本発明の細胞膜透過性ベシクルに含まれるPICsomeの種類は限定しない。
　一実施形態において、本発明の細胞膜透過性ベシクルに含まれるPICsomeは、
　(a)カチオン性セグメントを含むポリマー、並びに
　(b)アニオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体
を含んでもよい。
　別の実施形態では、本発明の細胞膜透過性ベシクルに含まれるPICsomeは
　(c)アニオン性セグメントを含むポリマー、並びに
　(d)カチオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体
を含んでもよい。
　さらなる実施形態では、本発明の細胞膜透過性ベシクルに含まれるPICsomeは
　(b)アニオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体、並びに
　(d)カチオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体
を含んでもよい。
（１－１）カチオン性セグメント
　カチオン性セグメントは、限定しない。例えば、カチオン性アミノ酸残基を3個以上、3個以上30個以下、3個以上20個以下、3個以上15個以下、又は3個以上10個以下、例えば、3個、4個、5個、6個、7個、又は8個で連結してなるものであってもよい。
（１－２）アニオン性セグメント
　アニオン性セグメントは、限定しない。例えば、アニオン性アミノ酸残基を3個以上、3個以上30個以下、3個以上20個以下、3個以上15個以下、又は3個以上10個以下、例えば、3個、4個、5個、6個、7個、又は8個で連結してなるものであってもよい。
　カチオン性セグメントにおけるカチオン性アミノ酸残基の個数、及びアニオン性セグメントにおけるアニオン性アミノ酸残基の個数の組合せは、上記の範囲のいずれの組合せであってもよい。例えば、カチオン性セグメントがカチオン性アミノ酸残基を3個以上30個以下で連結してなり、及び／又はアニオン性セグメントがアニオン性アミノ酸残基を3個以上30個以下で連結してなるものであってもよい。
　上記の(a)、(b)、(c)、及び(d)の一例として、以下に限定されないが、(a)ポリリジン（PolyLys又はP(Lys)）、(b) Alkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMe、(c) P(Lys(COOH))、(d) Alkyne-TEG-b-P(Lys)-OMeなどが挙げられる。
（１－３）非荷電親水性セグメント
　非荷電親水性セグメントは、限定しない。例えば、非荷電性親水性セグメントには、エチレングリコールの残基が含まれていてもよい。非荷電性親水性セグメントに含まれるポリエチレングリコールの残基数は、好ましくは2以上、2以上10以下、又は2以上6以下である。ベシクルの安定性の観点から、非荷電性親水性セグメントの分子量は1,000以下であるのが好ましい。一実施形態において、ポリエチレングリコールは、テトラエチレングリコール(TEG)である。
（２）細胞膜透過性ペプチド
　また、本発明の細胞膜透過性ベシクルに含まれる細胞膜透過性ペプチドの種類は限定せず、任意の細胞膜透過性ペプチドを使用することができる。例えば、BP100ペプチド、BP100(KH)9ペプチド、BP100CH7ペプチド、KAibAペプチドなどを使用してもよい。
　本発明において、細胞膜透過性ペプチドのPICsome表面への提示様式は限定しない。例えば、細胞膜透過性ペプチドはPICsomeを構成する任意の成分に結合していてもよい。ここでいう「結合」は、限定せず、例えば共有結合や超分子相互作用によるものであってもよい。共有結合は限定せず、例えばペプチド結合、ジスルフィド結合の他、クリック反応によって形成されるトリアゾール環を介した結合、及びチオールとマレイミドの反応で形成されるスクシンイミドを介した結合などが含まれる。また、「超分子相互作用」とは、分子間の非共有結合性の相互作用であれば限定せず、例えば水素結合、疎水性相互作用若しくは疎水結合、静電相互作用若しくはイオン結合、塩橋、配位結合などが例示される。
　また、細胞膜透過性ペプチドが結合するPICsomeの構成成分は、細胞膜透過性ペプチドがPICsome表面に提示され得る限り、限定しない。例えば、細胞膜透過性ペプチドは、カチオン性セグメントを含むポリマー、アニオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体、アニオン性セグメントを含むポリマー、及び／又はカチオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体のいずれに結合していてもよい。これらの分子において細胞膜透過性ペプチドが結合する位置は限定しないが、当該分子の末端、例えば一方の末端又は両端に結合してもよい。細胞膜透過性ペプチドが結合する個数は限定しないが、例えば1分子当たり1個の細胞膜透過性ペプチドを結合してもよい。
（３）機能性分子
　細胞膜透過性ベシクルに内包される機能性分子は、限定しない。例えばペプチド、多糖、核酸、化合物、又はそれらの混合物であってよい。一実施形態では、機能性分子は、機能性ペプチド及び／又は機能性核酸である。
　本発明において「機能性ペプチド」とは、生体内若しくは生体外、又は細胞内若しくは細胞外において、特定の生物学的機能を有するペプチドをいう。本明細書において「特定の生物学的機能」とは、タンパク質や核酸などの生体分子、細胞、組織又は個体に任意の影響を与え得る機能であれば限定しない。特定の生物学的機能は天然又は非天然を問わず、例えば細胞接着機能、シグナル伝達機能、結合機能、連結機能、標識機能、代謝機能などが例示される。連結機能は、例えば特定の生物学的機能を有する他のペプチドや核酸などの生体分子、低分子化合物、又は金属イオンを連結させる機能が該当する。抗原抗体結合又は受容体リガンド相互作用を媒介する機能、RNA及び／又はDNAなどの生体分子を結合する機能、ニッケルイオン、銅イオンなどを結合する機能などが例示される。標識機能は、タンパク質や核酸などの生体分子、細胞、組織及び個体を標識する機能が該当する。例えば、蛍光標識やエピトープ標識などが挙げられる。代謝機能には、ヌクレアーゼ活性などのゲノム編集機能などが挙げられる。機能性ペプチドは、使用目的に応じて適宜選択することができる。
　本発明において「機能性ペプチド」の具体例としては、酵素、結合タンパク質、マーカータンパク質、及び人工ペプチド、並びにそれらのペプチド断片などが挙げられる。「酵素」は、限定しないが、ゲノム編集タンパク質、例えばCas9タンパク質などのヌクアーゼであってもよい。「結合タンパク質」とは、特定の分子と特異的に結合するタンパク質である。限定はしないが、例えば、抗原抗体結合を媒介する抗体若しくは抗体断片又は抗原、（ストレプト）アビジン、マルトース結合タンパク質（MBP）、受容体リガンド相互作用を媒介する受容体又はリガンド、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質などが挙げられる。「マーカータンパク質」とは、細胞やタンパク質などを検出する際に標識となりうるタンパク質である。通常は、その活性に基づいて目的とするタンパク質の発現や存在の有無を判別できるポリペプチドが該当する。限定はしないが、例えば、GFPなどの蛍光タンパク質、ルシフェリン、又はイクオリンなどの発光タンパク質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、又はアルカリホスファターゼ（AP）などの酵素が挙げられる。「人工ペプチド」とは、タグペプチドとも呼ばれ、人工的に合成された数～十数アミノ酸からなるオリゴペプチドである。
　「機能性核酸」は、ガイドRNA分子、アンチセンス核酸（ASO）、siRNA、miRNA、アプタマーのいずれであってもよい。機能性核酸を構成する核酸は、天然型、非天然型のいずれであってもよい。
　一実施形態では、機能性分子は、Cas9タンパク質及び標的遺伝子に対するガイドRNA分子であってもよい。
　カチオン性セグメント及びアニオン性セグメントの混合比については特に制限はなく、PICsomeを形成可能な割合で混合することができる。例えば、正負の電荷が相殺される割合での混合であってもよい。例えば、前記カチオン性セグメント及びアニオン性セグメントがそれぞれ、側鎖に1価のカチオン基及びアニオン基を有する天然若しくは非天然のアミノ酸残基を含む、又はそれからなるペプチドであって、それぞれの平均重合度が1：1のモル比となるように混合してもよい。
　一実施形態では、PICsomeを形成しているアニオン性セグメント間、カチオン性セグメント間、及び／又はアニオン性セグメントとカチオン性セグメント間に架橋が形成されていてもよい。架橋は、例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC）などのカルボジイミド類を架橋剤として用いる側鎖の架橋反応により形成されていてもよい。
１－４．効果
　本発明の細胞膜透過性ベシクルによれば、植物細胞などの細胞内にタンパク質などの機能性分子を送達し、植物などの個体に対して新規形質を付与することができる。例えば、ゲノム編集タンパク質を細胞に送達し、核内で機能させることによって、変異を導入することが可能である。
　本発明の細胞膜透過性ベシクルに内包される機能性分子は、細胞膜透過性ベシクルが細胞内に移行した後、細胞膜透過性ベシクルに内包されたまま、プロテアーゼなどから保護された状態で、長期間にわたって安定して機能することができる。
　或いは、本発明の細胞膜透過性ベシクルに内包される機能性分子は、細胞膜透過性ベシクルが細胞内に移行した後、その一部又は全部が細胞膜透過性ベシクルから遊離した状態で機能することもできる。例えば、機能性分子がゲノム編集タンパク質である場合には、ゲノム編集タンパク質は、細胞膜透過性ベシクルから遊離し、ゲノム上の標的遺伝子配列を認識することができる。また、機能性分子がsiRNAやmiRNAなどの機能性核酸である場合には、機能性核酸は、細胞膜透過性ベシクルから遊離し、RNAi（RNA干渉）により標的mRNAの分解や翻訳抑制を誘導する。
　カチオン性セグメント及びアニオン性セグメントの一方のみの末端に非荷電性親水性セグメントが配置されている場合、PICsomeの安定性が向上する。
　本発明の細胞膜透過性ベシクルによれば、本発明の細胞膜透過性ベシクルを含む組成物もまた提供される。
２．細胞膜透過性ベシクルを含む植物、植物組織、又は植物細胞
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、本発明の細胞膜透過性ベシクルを含む植物、植物組織、又は植物細胞である。本態様の植物、植物組織、又は植物細胞は、細胞膜透過性ベシクルに内包される機能性分子に基づく新規形質を有する。
２－２．構成
（１）細胞膜透過性ベシクル
　本態様の植物、植物組織、又は植物細胞が含む細胞膜透過性ベシクルは、一以上の機能性分子を内包する。細胞膜透過性ベシクル、及び機能性分子の構成については、第１態様で既に詳述していることから、ここではその具体的な説明を省略する。
（２）植物、植物組織、又は植物細胞
　本態様における植物、植物組織、及び植物細胞の種類は限定しない。
　植物は、特に制限はされず、被子植物又は裸子植物のいずれであってもよい。また、被子植物には、双子葉類又は単子葉類植物のいずれも包含される。代表的なものとしては、農業上、特に種苗産業及び花卉園芸産業上、重要な植物、例えば、穀類、花、野菜、果物などの作物植物が挙げられる。具体的には、双子葉類植物であればアブラナ科に属する種（例えば、キャベツ、ダイコン、ハクサイ、アブラナ）、マメ科に属する種（例えば、ダイズ、ピーナッツ、エンドウ、インゲンマメ、アズキ、ソラマメ、スイートピー）、ナス科に属する種（例えば、トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、ピーマン、トウガラシ、ペチュニア）、バラ科に属する種（例えば、イチゴ、バラ、リンゴ、ナシ、モモ、ビワ、アーモンド、スモモ、ウメ、サクラ）、ラン科に属する種（例えば、シンビジウム、ファレノプシス、カトレア、デンドロビウム）、ユリ科に属する種（例えば、ユリ、チューリップ、ヒアシンス、ムスカリ、ネギ、タマネギ、ニンニク）、ミカン科（例えば、ミカン、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ユズ）、ブドウ科に属する種（例えば、ブドウ）、キク科に属する種（例えば、レタス、キク、ダリア、マーガレット、ヒマワリ）、ナデシコ科に属する種（例えば、カーネーション、カスミソウ）、ツバキ科に属する種（例えば、サザンカ、チャノキ）が該当する。また、単子葉類植物であればイネ科に属する種（例えば、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、サトウキビ、ソルガム、コウリャン）が該当する。
　植物組織は、特に制限はされず、具体的には任意の器官（例えば、根部、根毛、茎部、葉部、花部、表皮、若しくはそれらの組み合わせ、又は花粉、芽生え、卵細胞若しくは種子などを含む）、形態的及び／又は機能的に分化した細胞群からなる組織若しくはその一部であってもよい。
　植物細胞は、上記の植物組織に含まれる任意の細胞種を使用することができる。
３．機能性分子を細胞内に導入する方法
３－１．概要
　本発明の第３の態様は、機能性分子を細胞内に導入する方法である。
　本態様の方法は、細胞と細胞膜透過性ベシクルとを接触させる工程（接触工程）、及び細胞膜透過性ベシクルと接触した細胞に物理的刺激を付与する工程（物理的刺激工程）を含む。
　本態様の方法において、接触工程により細胞と接触した細胞膜透過性ベシクルは、物理的刺激工程によって細胞膜の透過及び細胞内への移行が促進され、ペプチドなどの機能性分子を細胞内に送達することができる。
３－２．方法
　本態様の方法は、細胞と細胞膜透過性ベシクルとを接触させる工程（接触工程）、及び細胞膜透過性ベシクルと接触した細胞に物理的刺激を付与する工程（物理的刺激工程）を含む。
　本発明の細胞膜透過性ベシクルによって機能性分子を導入する対象となる細胞は、特に限定しない。真核生物、細菌、又は古細菌の任意の細胞が対象となる。真核生物は、単細胞生物か多細胞生物かは問わず、また、動物細胞や植物細胞のいずれであってもよい。好ましくは、動物細胞又は植物細胞が対象となる。植物細胞は、第２態様に記載の植物種のいずれの細胞であってもよく、第２態様に記載の植物組織のいずれの細胞であってもよい。例えば、植物細胞は、カルス又は本葉の植物細胞であってもよい。動物細胞としては、ヒト以外の細胞、又はヒトに由来しヒト体外にある細胞（例えば、ヒトから単離された細胞）などが挙げられる。
　本態様において細胞に導入される細胞膜透過性ベシクルは、一以上の機能性分子を内包する。細胞膜透過性ベシクル、及び機能性分子の構成については、第１態様で既に詳述していることから、ここではその具体的な説明を省略する。
３－２－１．工程
（１）接触工程
　接触工程は、細胞と細胞膜透過性ベシクルとを接触させ得る工程であれば、特に限定しない。例えば、細胞膜透過性ベシクルを含む水溶液に、細胞、細胞を含む組織、若しくは細胞を含む個体を混合、懸濁、若しくは浸漬する工程、又は細胞膜透過性ベシクルを含む水溶液を細胞、細胞を含む組織、若しくは細胞を含む個体に噴霧、塗布、若しくは投与する工程などであってもよい。
（２）物理的刺激工程
　物理的刺激工程は、接触工程により細胞と接触した細胞膜透過性ベシクルの細胞膜の透過及び細胞内への移行を促進し得るものであれば、限定しない。物理的刺激は、好ましくは細胞膜の透過性を上昇し得る刺激である。例えば、加圧及び／若しくは減圧の圧力変化、昇温及び／若しくは降温の温度変化、凍結及び／若しくは融解、熱ショックなどの温度刺激、乾燥、切断、UV照射やX線照射、超音波照射、マイクロ波照射、又は浸透圧変化などを使用することができる。
４．細胞において標的遺伝子に変異を導入する方法
　本発明の第４の態様は、細胞において標的遺伝子に変異を導入する方法である。
　本態様の方法は、細胞と細胞膜透過性ベシクルとを接触させる工程（接触工程）、及び細胞膜透過性ベシクルと接触した前記細胞に物理的刺激を付与する工程（物理的刺激工程）を含む。
　本態様において使用する細胞膜透過性ベシクルは、機能性分子として、機能性ペプチド及び／又は機能性核酸を含む。より具体的には、本態様において、機能性分子はゲノム編集タンパク質などのゲノム編集ツールである。例えば、Cas9タンパク質及び標的遺伝子に対するガイドRNA分子である。その他の細胞膜透過性ベシクルの構成については、第１態様に準じる。
　また、対象となる細胞、接触工程、物理的刺激工程の構成については第３態様の記載に準じる。
　本態様の方法によれば、接触工程により細胞と接触した細胞膜透過性ベシクルが、物理的刺激工程によって細胞膜の透過及び細胞内への移行が促進され、Cas9タンパク質及び標的遺伝子に対するガイドRNA分子などのゲノム編集ツールが細胞内に送達され、変異を生じることができる。
５．変異体植物を作製する方法
　本発明の第５の態様は、変異体植物を作製する方法である。
　本態様の方法は、細胞と細胞膜透過性ベシクルとを接触させる工程（接触工程）、細胞膜透過性ベシクルと接触した植物細胞に物理的刺激を付与することによって、細胞膜透過性ベシクルを植物細胞内に導入し、標的遺伝子に変異を導入する工程（変異導入工程）、及び変異が導入された植物細胞から植物個体を得る工程を含む。
　本態様において使用する細胞膜透過性ベシクルの構成、対象となる細胞、接触工程は、第４態様に準じる。また、本態様の変異導入工程は、第４態様の物理的刺激工程を含む。本態様で細胞に導入される細胞膜透過性ベシクルに内包される好ましい機能性分子は、ゲノム編集タンパク質や、Cas9タンパク質及び標的遺伝子に対するガイドRNA分子などである。
　植物個体を得る工程は、特に限定しない。一実施形態では、変異導入工程で変異が導入された細胞を含む個体から種子を取得して、植物体を再生させることができる。別の実施形態では、変異導入工程で変異が導入された細胞、細胞を含む組織、又は細胞を含む個体から、その一部又は全部に対して、必要に応じて脱分化誘導（例えば、カルス誘導）を行うことで脱分化細胞（例えばカルス細胞）を得て、さらに、脱分化細胞又はカルスに対して再分化を誘導することによって、植物体を再生させることができる。この場合、脱分化誘導処理の方法には、当該分野において公知の任意の方法を用いることができる。限定しないが、植物ホルモン、熱ショックなどの温度刺激、切断処理などの傷害、ウイルスや細菌の感染などを用いることができる。また、再分化を誘導する方法は、限定せず、例えば植物ホルモンを用いる方法が挙げられる。
　本態様の方法によれば、接触工程により細胞と接触した細胞膜透過性ベシクルが、変異導入工程によって細胞膜の透過及び細胞内への移行が促進され、Cas9タンパク質及び標的遺伝子に対するガイドRNA分子などのゲノム編集ツールが細胞内に送達され、ゲノム上の標的遺伝子に変異を生じ、変異体植物を作製することができる。
６．細胞膜透過性ベシクルの調製方法
６－１．概要
　本発明の第６の態様は、細胞膜透過性ベシクルの調製方法である。本態様の方法によれば、一以上の機能性分子を内包し、かつその表面に細胞膜透過性ペプチドを提示させたベシクルを調製することができる。
６－２．方法
　本態様の方法は、一以上の機能性分子を内包する細胞膜透過性ベシクルの調製方法である。本態様の方法は、必須工程として、ポリマー及び／又はブロック共重合体を機能性分子の存在下で混合することによって、機能性分子を内包するポリイオンコンプレックスベシクルを構築する工程（PICsome構築工程）、並びに細胞膜透過性ペプチドをポリイオンコンプレックスベシクル表面上に提示する工程（細胞膜透過性ペプチド提示工程）を含み、選択的工程として、PICsomeを架橋する工程（架橋工程）を含む。本態様における機能性分子及び細胞膜透過性ペプチドの構成は第１態様に準じる。
６－２－１．工程
（１）PICsome構築工程
　PICsome構築工程において機能性分子の存在下で混合されるポリマー及び／又はブロック共重合体の組合せは、以下の（１）～（３）：
（１）(a)カチオン性セグメントを含むポリマー、並びに(b)アニオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体の組合せ、
（２）(c)アニオン性セグメントを含むポリマー、並びに(d)のカチオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体の組合せ、又は
（３）(b)アニオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体、並びに(d)カチオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体の組合せ
のいずれかから選択される。
　カチオン性セグメント、アニオン性セグメント、及び非荷電親水性セグメントの構成は、第１態様に準じる。これらのセグメントは、例えば、パパインを用いた酵素重合法により合成することができる。
　カチオン性セグメント及びアニオン性セグメントの混合比については特に制限はなく、PICsomeを形成可能な割合で混合することができる。例えば、正負の電荷が相殺される割合での混合であってもよい。例えば、前記カチオン性セグメント及びアニオン性セグメントがそれぞれ、側鎖に1価のカチオン基及びアニオン基を有する天然若しくは非天然のアミノ酸残基を含む、又はそれからなるペプチドであって、それぞれの平均重合度が1：1のモル比となるように混合してもよい。
　本工程において混合されるポリマー及び／又はブロック共重合体は、細胞膜透過性ペプチド提示工程において提示される細胞膜透過性ペプチドを結合し得る修飾基を有することが好ましい。
　一実施形態において、ポリマー及び／又はブロック共重合体は、クリックケミストリーによって細胞膜透過性ペプチドを結合し得るアルキン又はアジドを修飾基として含むことができる。
（２）細胞膜透過性ペプチド提示工程
　本態様における、細胞膜透過性ペプチドのPICsome表面への提示様式は限定しない。
　本工程において提示される細胞膜透過性ペプチドは、PICsome構築工程で構築されたPICsomeに結合し得る修飾基、例えば、PICsomeに含まれるポリマー及び／又はブロック共重合体に結合し得る修飾基を有することが好ましい。
　一実施形態において、修飾基は、クリックケミストリーによってポリマー及び／又はブロック共重合体に結合し得るアルキン又はアジドであってもよい。例えば、細胞膜透過性ペプチドはアジド基を有し、PICsomeに含まれるポリマー及び／又はブロック共重合体はアルキニル基を有してもよい。或いは細胞膜透過性ペプチドはアルキニル基を有し、PICsomeに含まれるポリマー及び／又はブロック共重合体はアジド基を有してもよい。この場合、クリック反応を用いてアルキンとアジドがトリアゾール環を形成させることによって、ポリマー及び／又はブロック共重合体に細胞膜透過性ペプチドを結合させることができる。
　ポリマー及び／又はブロック共重合体に細胞膜透過性ペプチドを結合させるクリック反応の条件は、任意の公知の条件を用いることができる。
（３）架橋工程
　PICsomeを架橋する架橋工程は、PICsomeに含まれる一部又は全部の構成成分の間を架橋する工程である。本工程は選択工程であり、PICsome構築工程と細胞膜透過性ペプチド提示工程の間、細胞膜透過性ペプチド提示工程の後、及び／又は細胞膜透過性ペプチド提示工程と同時に行うことができる。
　PICsomeを架橋する方法は、PICsomeを構成する成分を架橋し得る方法であれば限定しない。例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC）などのカルボジイミド類を架橋剤として使用して、ポリマー側鎖の縮合反応を行うことができる。
　本工程における架橋は、PICsomeに含まれるポリマーの間、ブロック共重合体の間、及び／又はポリマーとブロック共重合体との間で行うことができる。例えば、アニオン性セグメント間、カチオン性セグメント間、及び／又はアニオン性セグメントとカチオン性セグメント間に形成することができる。
　本工程によって、本態様の方法で得られる細胞膜透過性ベシクルの安定性を向上させることができる。
　本発明の一実施形態を図１に示す。アルキンを有するブロック共重合体であるAlkyne-TEG-b-P(Lys-(COOH))-OMe、及びAlkyne-TEG-b-P(Lys)-OMe又はTEGを有しないPolyLysを混合して、アルキンを表面に有するPICsomeを構築するとともに、PICsomeが構築される際に又は構築後に、タンパク質を混合する。混合には水系溶媒を用いることができる。これによりタンパク質を内包するPICsomeを得ることができる。次に、アジド基を有する細胞膜透過性ペプチド（N3-BP-100）を準備し、クリックケミストリーにより、ベシクル表面のアルキニル基と反応させて、表面に細胞膜透過性配列BP-100を有する細胞膜透過性ベシクルが得られる。このようにして得られた細胞膜透過性ベシクルを、細胞に導入することができる（図１）。
＜実施例１：Alkyne-TEG-b-P(Lys)-OMe及びAlkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMeから構成される集合体の調製＞
（目的）
　Alkyne-TEG-b-P(Lys)-OMe及びAlkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMeから構成される集合体を調製する。
（方法）
（１）カチオン性ブロック共重合体Alkyne-TEG-b-P(Lys)-OMe、カチオン性ポリマーPolyLys、及びアニオン性ブロック共重合体Alkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMeの合成
　パパインを用いた酵素重合法により、側鎖がBoc基により保護されたポリリジンP(Lys-(Boc))-OMeを合成した。ポリリジンにおけるリジン残基の反復回数は概ね5～7回である。これとアルキンを有するテトラエチレングリコール(TEG)とを無水コハク酸を用いて連結させることによって、Alkyne-TEG-b-P(Lys-(Boc))-OMeを合成した。このブロック共重合体の側鎖のBoc基をTFAにより脱保護した後、TEAを添加し透析することによって、カチオン性ブロック共重合体Alkyne-TEG-b-P(Lys)-OMe及びカチオン性ポリマーPolyLysを得た。また、得られたカチオン性ブロック共重合体の側鎖に無水コハク酸を反応させ、アニオン性ブロック共重合体Alkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMeを合成した。
　合成したポリマーはNMR、MALDI-TOF MSにより同定した。
（２）PICsomeの調製
　得られたポリマーをそれぞれMilliQ水に溶解させた。それらの溶液を1:1で混合し、10秒間Vortexミキサーにて撹拌することによって、PICsomeを調製した。
（３）PICsomeの粒径評価と形態観察
　得られたPICsomeの粒径は、動的光散乱(DLS)測定を用いて評価した。
　また、PICsome溶液をシリコンウェハ上に滴下し、減圧乾燥により乾燥後、電界放出形走査電子顕微鏡（FE-SEM）を用いて集合形態を観察した。
（結果）
　0.1 mM Alkyne-TEG-b-P(Lys)-OMe水溶液と0.1 mM Alkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMe水溶液とを混合し、10分間静置させた後、動的光散乱(DLS)測定を行なった。その結果、粒径200 nm程度の集合体の形成が確認された（図２、約0時間）。
　次に、電界放出形走査電子顕微鏡を用いて集合体の形態を評価した。その結果、集合体は球状の形態を有することが判明した（図３、左側の写真）。さらに、電子顕微鏡観察時の電子線照射により、球状集合体の表面が破壊された結果、内部が空洞となっていることが確認された（図３、右側の写真）。
　この結果から、Alkyne-TEG-b-P(Lys)-OMeとAlkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMeとの混合溶液中で、内部空洞を有するカプセル状粒子のPICsomeが形成されることが示された。
　次に、集合体の形態について経時的な観察を行った。その結果、Alkyne-TEG-b-P(Lys)-OMe水溶液とAlkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMe水溶液とを混合した後、形成した200 nm程度の集合体（図２、約0時間）は、時間とともにその粒径が増大し、12時間後には約1500 nmの粒径に達した（図２、12時間）。これは、集合体形成に使用した2種類のブロック共重合体がTEGを有するため、TEG同士の立体反発により集合体が不安定化し、時間とともにPICsome同士が合一してより大きな集合体が形成された結果であると考えられた。
＜実施例２：PolyLys及びAlkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMeから構成される集合体の調製と架橋＞
（目的）
　PICsomeを調製する際に用いるカチオン性ポリマーとしてTEG鎖を有しないPolyLysを使用し、PolyLys及びAlkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMeから構成される集合体を調製する。
（方法）
　PolyLys及びAlkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMeの合成は、実施例１の（１）及び（２）の方法に準じた。
　PICsomeの粒子としての安定性を向上させるために、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC）を用いたポリマー側鎖の縮合反応によりPICsomeの架橋を行なった。アニオン性ブロック共重合体の側鎖のカルボキシル基に対して1ｓ量のEDCを添加し12時間反応させた。架橋反応の進行は、MALDI-TOF MSによって確認した。NMRスペクトルより、反応後の架橋率は28％であった。反応後、透析によりEDCを除去した。その後、動的光散乱測定によって架橋後のPICsomeの粒径を評価した。
（結果）
　0.1 mM PolyLys水溶液と0.1 mM Alkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMe水溶液とを混合し、10分間静置させた後、動的光散乱測定を行なった。その結果、粒径150 nm程度の集合体の形成が観察された（図４）。
　この重合体は、調製から3時間程度までは粒径がわずかに増大したが、それ以降は増大せず、12時間後においても200 nm程度の粒径を維持した（図４）。これは、カチオン性ポリマーからTEG鎖を除いたことにより、立体障害が軽減され、粒子としての安定性の高いPICsomeが形成した結果であると考えられた。
　次に、PICsomeの粒子としての安定性を向上させるために、EDCを用いたポリマー側鎖の縮合反応によってPICsomeの架橋を行った後、動的光散乱(DLS)測定及び電界放出形走査電子顕微鏡観察を行った。その結果、架橋前と同様の粒径及び球状形態の集合体が形成したことが確認された。これらの結果から、粒径と球状形態を保持したPICsomeの架橋に成功したと考えられた。
＜実施例３：PICsomeの内部への機能性分子の封入＞
（目的）
　PICsomeの内部にゲスト分子を封入する。本実施例では、ゲスト分子として、ローダミンで修飾されたネオマイシンリン酸転移酵素II（Neomycin phospho-transferaseII、NPTII)（以下、「RhB-NPTII」と表記する）を用いる。NPTIIは、抗生物質カナマイシンにATPのリン酸基を転移させる活性を有する酵素であり、当該活性によって、カナマイシンを不活性化させる。
（方法）
　RhB-NPTII存在下でPICsomeの構築を行うことによって、PICsomeにRhB-NPTIIを内包させた。PICsomeとしては、PolyLys及びAlkyne-TEG-b-P(Lys(COOH))-OMeから構成されるPICsomeを使用し、PICsomeの調製と架橋は実施例２の方法に準じて行った。PICsomeに内包されなかったRhB-NPTIIは、透析によって除去した。
　次に、蛍光相関分光(FCS)法及び銀染色を行うことによって、RhB-NPTIIのPICsomeへの内包を検証した。
（結果）
　PICsomeに内包されていないRhB-NPTIIについて、蛍光相関分光法を用いて拡散時間を測定した。その結果、PICsomeに内包されていないRhB-NPTIIの拡散時間は0.243 msであった。
　次に、PICsomeに内包されたRhB-NPTIIについて、蛍光相関分光法を用いて拡散時間を測定した。その結果、PICsomeに内包されたRhB-NPTIIの拡散時間は4.86 msであり、PICsomeに内包されていないRhB-NPTIIに対して拡散時間が増大した。この結果から、RhB-NPTIIがPICsomeに内包されていることが示された。
　さらに、PICsomeに内包されたRhB-NPTIIを電気泳動した後、銀染色を行い、タンパク質の定量を行なった。その結果、8％程度のRhB-NPTIIがPICsomeに取り込まれていることが確認された。
　以上の結果から、RhB-NPTIIのPICsomeへの内包に成功したと考えられた。
＜実施例４：細胞膜透過性ベシクルの植物組織への導入＞
（目的）
　RhB-NPTIIを内包する細胞膜透過性ベシクルをシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の芽生えの根毛に導入する。
（方法）
　RhB-NPTIIを内包するPICsomeの調製は実施例３の方法に準じて行った。
　RhB-NPTIIを内包するPICsomeの表面に提示されているアルキンに対して、アジドを有する細胞膜透過性ペプチド（CPP）であるN3-(Lys-Aib-Ala)3（Aibは2-アミノイソ酪酸を示す；配列番号78）をクリック反応により修飾し、RhB-NPTIIを内包し、かつCPPを表面に提示するPICsome（以下、「細胞膜透過性ベシクル」と表記する）を得た。
　この細胞膜透過性ベシクルを含む水溶液中に、シロイヌナズナの芽生えを浸漬した後、減圧及び加圧を行った。その後、ローダミンに由来する赤色蛍光に対して共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)による観察を行い、細胞膜透過性ベシクルが根毛に導入されたか否かを検証した。対照として、PICsomeに内包されていないRhB-NPTIIを用いた。
（結果）
　シロイヌナズナの芽生えにPICsomeに内包されていないRhB-NPTIIを導入した後、共焦点レーザー顕微鏡観察を行った。その結果、芽生えの根毛内からRhBに由来する赤色蛍光が観察されなかった（図５、左側）。したがって、PICsomeに内包されていないRhB-NPTIIは、シロイヌナズナの根毛に導入されなかった。
　次に、RhB-NPTIIを内包する細胞膜透過性ベシクルをシロイヌナズナの芽生えに導入した。その結果、芽生えの根毛の内部からRhB由来の赤色蛍光が観察された（図５、右側の矢印）。
　この結果から、細胞膜透過性ベシクルを用いることで、RhB-NPTIIの根毛への導入に成功したことが示された。
＜実施例５：細胞膜透過性ベシクルを用いたゲノム編集＞
（目的）
　Cas9-ガイドRNA複合体を細胞膜透過性ベシクルに内包させて、シロイヌナズナの胚軸由来カルスに導入し、ゲノム編集を行う。
（方法）
　側鎖がBoc基により保護されたポリリジンP(Lys-(Boc))-OMeをエチレンジアミン四酢酸二無水物を用いて連結させることによって、側鎖がBoc基により保護された二本鎖ポリリジン(P(Lys-(Boc))-OMe)2を合成した。これとアルキンを有するテトラエチレングリコール(TEG)を連結させることによって、Alkyne-TEG-b-(P(Lys-(Boc))-OMe)2を合成した。このブロック共重合体の側鎖のBoc基をTFAにより脱保護し、その後、TEAを添加し透析することでカチオン性ブロック共重合体Alkyne-TEG-b-(P(Lys)-OMe)2を得た。また、カチオン性ポリマーPolyLysの側鎖に無水コハク酸を反応させ、アニオン性ポリマーP(Lys(COOH))-OMeを合成した。
　次に、Cas9タンパク質とガイドRNAの複合体であるリボヌクレオタンパク質（Ribonucleoprotein、RNP)をPICsome内部に封入した。ガイドRNAの塩基配列（配列番号77）はフィトエン不飽和化酵素（phytoene desaturase、PDS）遺伝子の塩基配列を特異的に認識し標的とするように設計した。配列番号77で示す塩基配列の1～20番目の塩基が標的配列（図６、「標的配列」）に対する認識配列に相当する。Cas9タンパク質（Alt-R（登録商標） S.p. Cas9 Nuclease V3; Integrated DNA Technologies、製品番号1081059）とガイドRNAを混合した後、室温で10分静置することによって、Cas9-ガイドRNA複合体であるRNPを得た。このRNP存在下にて、ポリマーの水溶液を1:2で混合し、10秒間Vortexミキサーにて撹拌することによって、RNPを内包するPICsomeを構築し、RNPを内包するPICsomeを得た。
　さらに、PICsomeの粒子としての安定性を向上させるために、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC）を用いたポリマー側鎖の縮合反応によりPICsomeの架橋を行った。このPICsomeの表面に提示されているアルキンに対して、アジドを有する細胞膜透過性ペプチド（CPP）であるN3-(Lys-Aib-Ala)3（配列番号78）をクリック反応により修飾し、RNPを内包し、かつCPPを表面に提示するPICsome（以下、「細胞膜透過性ベシクル」と称する）を得た。
　この細胞膜透過性ベシクルをシロイヌナズナの胚軸由来カルス又は本葉に導入して、ゲノム編集を行った。具体的には、カルスを用いた場合、細胞膜透過性ベシクルを含む水溶液（細胞膜透過性ベシクルの各構成成分の濃度：カチオン性ブロック共重合体250 μM、及びアニオン性ポリマー500 μM）中にカルスを浸漬して、真空ポンプ（ulvac GLD-051）と真空デシケーター（新光化成 V-１）を用いて-0.08 MPaでの減圧、及びコンパクトエアーポンプ（asone 1-361-02）とステンレス製加圧容器(ステンレスタンク)（ユニコントロールズTZA-11-C0671）を用いて+0.08 MPaでの加圧を1分ずつ行った。本葉を用いた場合は、細胞膜透過性ベシクルを含む水溶液を針無シリンジに充填し、本葉の裏側から押し当てながら排出して溶液を湿潤させた。二日間静置した後、カルス又は本葉からゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAからPDS遺伝子上の標的配列部分をPCRによって増幅した後、次世代シーケンサーを用いて増幅産物に対するディープシーケンスを行った。
（結果）
　カルスへの細胞膜透過性ベシクルの導入は、独立な3回の実験で行った。その結果、1回のサンプルにおいて、1塩基の欠失（図６(a)、「-1」）、及び14塩基の欠失と4塩基の挿入（図６（c)、「-14/+4」）が検出された。変異リード数／総リード数は6／81,677リードであり、変異率は約0.007％であった。
　次に、本葉への細胞膜透過性ベシクルの導入は、独立な3回の実験で行った。その結果、2回のサンプルにおいて、それぞれ1塩基の欠失（図６(a)、「-1」及び図６(ｂ)、「-1」）が検出された。各試行における変異リード数／総リード数は、2／117,648リード及び4／93,374リードであり、変異率は約0.002％及び約0.004％であった。
　一方、細胞膜透過性ベシクルで処理されていない未処理カルスを用いた、3回の試行における変異リード数／総リード数は、それぞれ0／102,764リード、0／97,757リード、及び0／84,929リードであり、変異は全く検出されなかった。
　カルス及び本葉においてゲノム編集による変異が確認された結果から、細胞膜透過性ベシクルによるRNPの植物組織への導入、及びそのゲノム編集に成功したことが示された。
　植物における従来のゲノム編集方法では、Cas9タンパク質をコードする外来遺伝子をアグロバクテリウム法やパーティクルガン法を用いてゲノムDNAに挿入することによって、Cas9タンパク質を発現させていた。この方法では、ゲノムDNAに導入された外来遺伝子がゲノム編集後に不要となる。それ故、後代からヌルセグリガントを得る必要があるため、手順が煩雑となり、一連の手順の完了には長い時間を要する。
　これに対して、本発明の細胞膜透過性ベシクルを用いたゲノム編集ツールの導入では、ゲノム編集タンパク質をコードする外来遺伝子をゲノムDNAに導入することなく、ゲノム編集タンパク質を直接送達することが可能である。そのため、簡便かつ短期間でゲノム編集を行うことができる。
　本実施例の結果によって、本発明の細胞膜透過性ベシクルが実際に細胞膜を透過して細胞内に移行し、核内のゲノムまで到達したこと、及び送達された機能性分子が細胞内や核内で実際に機能することが実証された。この結果から、ゲノム編集ツールのみならず、酵素などの機能性ペプチドを含む機能性分子が、本発明の細胞膜透過性ベシクルによって細胞内に送達され、細胞内や核内において機能し得ることが示された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (15)

  1. 　ポリイオンコンプレックスベシクル、及びその表面に提示される細胞膜透過性ペプチドを含む、細胞膜透過性ベシクル。
  2. 　前記ポリイオンコンプレックスベシクルが以下の(a)及び(b)を含む、請求項１に記載の細胞膜透過性ベシクル。
    　(a)カチオン性セグメントを含むポリマー、並びに
    　(b)アニオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体
  3. 　前記ポリイオンコンプレックスベシクルが以下の(c)及び(d)から構成される、請求項１に記載の細胞膜透過性ベシクル。
    　(c)アニオン性セグメントを含むポリマー、並びに
    　(d)カチオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体
  4. 　前記カチオン性セグメントが、カチオン性アミノ酸残基を3個以上30個以下で連結してなり、及び／又は
    　前記アニオン性セグメントが、アニオン性アミノ酸残基を3個以上30個以下で連結してなる、請求項２又は３に記載の細胞膜透過性ベシクル。
  5. 　前記細胞膜透過性ペプチドが、前記ブロック共重合体に連結されている、請求項２～４のいずれか一項に記載の細胞膜透過性ベシクル。
  6. 　一以上の機能性分子を内包する、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞膜透過性ベシクル。
  7. 　前記機能性分子が機能性ペプチド及び／又は機能性核酸である、請求項６に記載の細胞膜透過性ベシクル。
  8. 　前記機能性分子が、Cas9タンパク質及び標的遺伝子に対するガイドRNA分子である、請求項６に記載の細胞膜透過性ベシクル。
  9. 　請求項６～８のいずれか一項に記載の細胞膜透過性ベシクルを含む植物、植物組織、又は植物細胞。
  10. 　機能性分子を細胞内に導入する方法であって、
    　前記細胞と請求項６～８のいずれか一項に記載の細胞膜透過性ベシクルとを接触させる工程、及び
    　前記細胞膜透過性ベシクルと接触した前記細胞に物理的刺激を付与する工程
    を含む、前記方法。
  11. 　細胞において標的遺伝子に変異を導入する方法であって、
    　前記細胞と請求項８に記載の細胞膜透過性ベシクルとを接触させる工程、及び
    　前記細胞膜透過性ベシクルと接触した前記細胞に物理的刺激を付与する工程
    を含む、前記方法。
  12. 　前記細胞が植物細胞である、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 　前記植物細胞が、カルス又は本葉の植物細胞である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　変異体植物を作製する方法であって、
    　植物細胞と請求項８に記載の細胞膜透過性ベシクルとを接触させる工程、
    　前記細胞膜透過性ベシクルと接触した前記植物細胞に物理的刺激を付与することによって、前記細胞膜透過性ベシクルを前記植物細胞内に導入し、標的遺伝子に変異を導入する工程、及び
    　前記工程で変異が導入された植物細胞から植物個体を得る工程
    を含む、前記方法。
  15. 　一以上の機能性分子を内包する細胞膜透過性ベシクルの調製方法であって、
    　ポリマー及びブロック共重合体を機能性分子の存在下で混合することによって、前記機能性分子を内包するポリイオンコンプレックスベシクルを構築する工程、並びに
    　細胞膜透過性ペプチドを前記ポリイオンコンプレックスベシクル表面上に提示する工程
    を含み、
    　前記ポリマー及び前記ブロック共重合体は、
    　　(a)カチオン性セグメントを含むポリマー、並びに(b)アニオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体、又は
    　　(c)アニオン性セグメントを含むポリマー、並びに(d)のカチオン性セグメント及び非荷電親水性セグメントを含むブロック共重合体
    の組合せからなる、前記方法。
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