CN108239181A - 一种壳聚糖衍生物r6h6-cs、其制备方法及应用 - Google Patents

一种壳聚糖衍生物r6h6-cs、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明制备了6‑聚精氨酸‑6‑聚组氨酸(R6H6)短肽修饰的壳聚糖(CS)衍生物作为新型载体用于siRNA的递送，利用R6H6修饰的CS加载小干扰RNA(siRNA)制备纳米粒，并对其进行体内外应用性研究。本发明采用交联‑缩合法将R6H6短肽连接于CS的伯胺基团上，制备的新型载体(R6H6‑CS)安全无毒，且具有较好的细胞穿膜能力和溶酶体逃逸功能，R6H6‑CS共聚物能够有效的递送siRNA药物进入肿瘤细胞，且R6H6‑CS共聚物加载siRNA制备的纳米粒(R6H6‑NP)在体内外具有良好的治疗效果，因此，R6H6‑NP具有较好的开发前景。

Description

一种壳聚糖衍生物R6H6-CS、其制备方法及应用
技术领域：
本发明属于生物医学材料领域，涉及一种聚合物材料，具体涉及R6H6短肽修饰的壳聚糖形成的壳聚糖衍生物R6H6-CS，其制备方法、筛选及应用。
研究背景：
基因疗法是近年来发展起来的一种新型疗法，因其高特异性、低毒性，因此常用于治疗各种恶性肿瘤。siRNA作为基因治疗药物已见报道，siRNA能够特异性的沉默与疾病相关的靶基因，抑制其表达，近而发挥治疗作用。siRNA具有特异性高、用药剂量小、毒副作用小等优点，因此，在癌症的治疗中受到医药界广泛关注。然而，siRNA半衰期短、体内稳定性差、易被核酸酶降解，种种缺陷限制了其在临床上的应用，因此，siRNA必须借助适宜的载体，进行安全有效的递送，才能发挥其治疗作用。
已有文献报道，用于siRNA递送的载体包括阳离子脂质、聚乙烯亚胺、壳聚糖等(参考Zhi DF,Zhao YN,Cui SH,et al.Acta Biomater,2016,36：21-41.)，其中壳聚糖因其安全无毒及良好的生物可降解性和生物相容性常被用做siRNA递送载体。壳聚糖因其分子结构中含有大量的伯胺基团，使其在微酸性环境中带正电荷，可压缩带负电荷的siRNA形成纳米粒或纳米复合物，壳聚糖纳米粒能够较好的保护siRNA分子，使其免于体内核酸酶的降解。但是壳聚糖纳米粒转染效率低，不容易被肿瘤细胞摄取，使siRNA不能最大程度的发挥其治疗作用。因此，利用壳聚糖作为基因药物递送载体时，通常要对壳聚糖分子进行结构改造，修饰后的壳聚糖，其转染效率大大提高，有利于siRNA的递送。
细胞穿膜肽(Cell penetrating peptides,CPPs)是一类可以帮助大分子物质入胞的物质，据相关文献报道，CPPs的氨基酸序列中含有大量的精氨酸，精氨酸在CPPs发挥细胞穿膜的过程中起到至关重要的作用。有人比较了不同长度的精氨酸片段的短肽的细胞穿膜能力，发现6-聚精氨酸、8-聚精氨酸、9-聚精氨酸都具备一定程度的细胞穿膜能力，利用这些精氨酸片段修饰基因药物递送载体可提高其细胞摄取能力(参考Kinam Park,JControl Release,2012,159(2):153.)。此外，组氨酸也常用于修饰基因药物递送载体以增加其缓冲能力，组氨酸因其分子结构中含有咪唑环，在pH较低的溶酶体环境内，发生质子化，产生“质子海绵效应”，使溶酶体膜发生破裂，帮助被困药物实现溶酶体逃逸，近而使释放到细胞质中的药物增加(参考Jiang TY,Zhang ZH,Zhang YL，et al.Biometerials,2012,33(36):9246-9258.)。
本发明用6-聚精氨酸和6-聚组氨酸合成多功能短肽，用其修饰壳聚糖分子，意在获得具有细胞穿膜能力和溶酶体逃逸功能的新型载体，将其用于siRNA递送时，可显著提高转染效率。研究结果表明：R6H6-CS共聚物能够较好的复合siRNA药物，形成稳定的纳米粒，并对该纳米粒进行了体内外药效学评价，发现多功能肽修饰的纳米粒能够高效的被细胞摄取，且在动物体内具有很好的抗肿瘤活性。本发明经专利查询及文献检索，目前尚未发现探讨R6H6短肽对壳聚糖核酸药物递送效率影响的报道。
发明内容：
本发明需要解决的技术问题是一种R6H6短肽修饰壳聚糖CS形成的壳聚糖衍生物R6H6-CS，其制备方法以及应用，该载体细胞毒性低，具有细胞穿膜能力和溶酶体逃逸功能，体内外应用效果良好。
为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明技术方案的第一方面是提供了一种R6H6短肽修饰壳聚糖CS形成的壳聚糖衍生物R6H6-CS，特征在于，CS和R6H6-CS分子结构式分别是(A)n-(C)(m+x)和(A)n-(B)m-(C)x,具体结构式如下：
其中，A、B、C分别表示
壳聚糖CS的分子量为20-113kDa,脱乙酰度用(m+x)/(n+x+m)表示，脱乙酰度为70％-99％，，且n和(m+x)仅表示A、C单元在CS分子中的个数，与A、C单元的连接顺序无关；
壳聚糖衍生物R6H6-CS中，R6H6表示6-聚精氨酸-6-聚组氨酸短肽，其中，6-聚精氨酸选自L型和D型的精氨酸的任意组合，6-聚组氨酸选自L型和D型的组氨酸的任意组合，m为重复单位B的个数，且m等于连接于CS分子上的R6H6短肽的个数，用m/(m+x)表示R6H6短肽取代壳聚糖游离氨基的取代水平，n和x分别表示重复单元A和C的个数，且m、n、x仅表示A、B、C单元在R6H6-CS分子中的个数，与A、B、C单元的连接顺序无关。
其中，优选的壳聚糖CS的分子量为50kDa，所述壳聚糖CS的脱乙酰度为89％。
本发明技术方案的第二方面是提供了壳聚糖衍生物R6H6-CS的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将R6H6短肽溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1-羟基苯并三氮唑(HOBt)作为缩合剂，并加入少量三乙胺，室温下活化；
2)将壳聚糖加入上述溶液中，室温下，继续反应；
3)反应结束后，透析,冷冻干燥,既得壳聚糖衍生物R6H6-CS。
其中，R6H6短肽取代壳聚糖游离氨基的取代水平用m/(m+x)表示，为7％-12％。
聚合物合成路线如附图1所示。
其中步骤(1)中
优选R6H6短肽的剂量是：9mg、18mg、36mg、54mg
优选的EDC剂量：5mg、10mg、15mg、20mg
优选的HOBt剂量：3mg、7mg、12mg、15mg
优选的三乙胺用量：4μL、8μL、12μL、16μL
优选的DMF体积范围是：2ml、5ml、8ml、10ml
优选的反应温度：20℃、25℃、30℃
优选的活化时间：2h、4h、6h
其中步骤(2)中
壳聚糖的分子量范围：-20kDa-113kDa
壳聚糖的用量范围：30mg、50mg、100mg、150mg
优选的反应温度：20℃、25℃、30℃
优选的反应时间：6h、12h、24h、48h
其中步骤(3)中
透析袋截留分子量范围：2000Da～1kDa
优选的透析液：乙醇、去离子水、二甲基亚砜(DMSO)
透析的时间：24h、48h、72h
冷冻干燥时间：12h、24h、48h
在壳聚糖衍生物R6H6-CS的制备方法中，最优选的DMF体积是5ml、最优的R6H6短肽质量是36mg、最优的EDC和HOBt质量分别是10mg和7mg、三乙胺为12μL、活化时间4h、反应时间24h。
在优选的工艺条件下，考察了壳聚糖的分子量以及脱乙酰度对壳聚糖衍生物R6H6-CS包载siRNA能力的影响，并在此基础上考察了R6H6短肽取代壳聚糖游离氨基的取代水平对siRNA沉默效率的影响。发现分子量50kDa且脱乙酰度89％的壳聚糖包载siRNA形成的纳米粒粒径较小，结构圆整。另外，R6H6短肽取代壳聚糖游离氨基的取代度即m/m+x，
经1H-NMR测试计算：取代度优选是7-12％，更优选是10％；
其中，所述的R6H6短肽结构为：
本发明技术方案的第三方面是提供了R6H6短肽修饰的壳聚糖形成的壳聚糖衍生物R6H6-CS在体内外作为核酸药物递送载体中的应用。
所述的核酸选自RNA或DNA；进一步的所述的RNA选自小干扰RNA；所述的siRNA的大小为15-30bp，最优选的siRNA以生存素基因作为靶点。
本发明的一个方面，提供了R6H6短肽修饰的壳聚糖形成的壳聚糖衍生物R6H6-CS作为非病毒递送载体的筛选过程，获得低毒高效的递送载体，并将其应用于siRNA的递送。本发明的另一个方面，提供了上述R6H6短肽修饰的壳聚糖形成的壳聚糖衍生物R6H6-CS在体内、体外作为siRNA递送载体的应用。所制备得到的壳聚糖衍生物R6H6-CS能不同程度地提高转染效率。
室温条件下，本发明提供的壳聚糖衍生物R6H6-CS与siRNA分子能够按照一定质量比复合形成纳米粒。在一个实验例中，上述壳聚糖衍生物R6H6-CS用于递送siRNA时，其递送效率显著高于未修饰的壳聚糖。本发明提供的载治疗性siRNA纳米粒在体内外对肿瘤细胞有显著的抑制作用，说明R6H6短肽修饰后的壳聚糖形成的壳聚糖衍生物R6H6-CS作为基因药物递送载体能够有效的将siRNA递送入胞，发挥其治疗效果。
有益技术效果
本发明采用交联-耦合法将R6H6短肽共价结合于壳聚糖分子上，制备方法简单；通过筛选R6H6短肽修饰的壳聚糖衍生物作为核酸药物的递送载体，该载体细胞毒性低，具有细胞穿膜能力和溶酶体逃逸功能，体内外应用效果良好。
壳聚糖衍生物R6H6-CS与siRNA通过正负电荷作用形成纳米粒并转染细胞，纳米粒被肿瘤细胞摄取效率显著提高；壳聚糖衍生物R6H6-CS加载siRNALuc制备得到的纳米粒对荧光素酶基因的沉默效率明显高于对照组；壳聚糖衍生物R6H6-CS加载靶向生存素的siRNA应用于体内后，抗肿瘤效果良好。
附图说明
图1是实施例1的合成路线。
图2是实施例4中不同R6H6取代度的壳聚糖衍生物R6H6-CS作为递送载体复合siRNA形成的纳米粒沉默荧光素酶基因的情况
图3是实施例5中的壳聚糖衍生物R6H6-CS与siRNA复合形成纳米粒(R6H6-NP)的透射电子显微镜图
图4是实验例1中制备的壳聚糖衍生物R6H6-CS的细胞毒性柱状图。
图5是实验例2中所制备的R6H6-NP下调荧光素酶靶基因表达的效果。图中a为裸siRNA组，b为未修饰的壳聚糖纳米粒，c为R6H6-NP。
图6是按照实验例3所制备的载功能性siRNAsur纳米粒体外抑制细胞增殖效果。
图7是按照实验例4所制备的载功能性siRNAsur纳米粒体外抑制细胞迁移情况。
图8是按照实验例5所制备的载FAM标记的siRNA纳米粒的细胞摄取情况。图中a为空白细胞的摄取曲线，b为裸siRNA组细胞的摄取曲线，c为未修饰的壳聚糖纳米粒的细胞摄取曲线，d为R6H6-NP的细胞摄取曲线。
图9是按照实验例6所制备的载功能性siRNAsur纳米粒诱导细胞凋亡情况。a为空白细胞的凋亡情况，b为裸siRNA诱导细胞凋亡情况，c为未修饰的壳聚糖纳米粒诱导细胞凋亡情况，d为R6H6-NP诱导细胞凋亡情况。
图10是按照实验例7所制备的载功能性siRNAsur纳米粒体内抗肿瘤效果。
图11是按照实验例8所制备的载功能性siRNAsur纳米粒提高荷瘤小鼠生存率情况
术语和简称
CS：壳聚糖
siRNA:小干扰RNA
CPPs：细胞穿膜肽
EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
HOBt：1-羟基苯并三氮唑
R6H6：6-聚精氨酸-6-聚组氨酸多肽
R6H6-CS：6-聚精氨酸-6-聚组氨酸修饰的壳聚糖
R6H6-NP：6-聚精氨酸-6-聚组氨酸修饰的壳聚糖纳米粒
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DMSO：二甲基亚砜
具体实施方式
实施例
实施例1：R6H6-CS的合成
将36mg R6H6短肽溶解于5ml DMF中，加入10mg EDC和7mg HOBt作为缩合剂，加入12μL三乙胺，室温下活化4h。将50mg壳聚糖加入到上述溶液中，室温下，继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量3500Da透析袋中，于去离子水中透析48h,冷冻干燥24h,既得R6H6短肽修饰的壳聚糖。其合成路线见图1。
实施例2:利用不同分子量的CS合成壳聚糖衍生物R6H6-CS
将36mg R6H6短肽溶解于5ml DMF中，加入10mg EDC和7mg HOBt作为缩合剂，加入12μL三乙胺，室温下活化4h。分别将分子量20kDa、50kDa和113kDa的壳聚糖(50mg)加入到上述溶液中，室温下，继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量3500Da透析袋中，于去离子水中透析48h,冷冻干燥24h,既得R6H6短肽修饰的壳聚糖衍生物，发现分子量50kD的壳聚糖制备的壳聚糖衍生物R6H6-CS复合siRNA时，形成的纳米粒粒径较小(平均175nm)且结构圆整,而分子量20kDa和113kDa的壳聚糖制备的壳聚糖衍生物R6H6-CS复合siRNA时也能形成结构圆整的纳米粒，但是粒径较大，均在200nm以上，故分子量50kD的壳聚糖是最优选择。
实施例3:利用不同脱乙酰度的壳聚糖合成壳聚糖衍生物R6H6-CS
将36mg R6H6短肽溶解于5ml DMF中，加入10mg EDC和7mg HOBt作为缩合剂，加入12μL三乙胺，室温下活化4h。分别加入脱乙酰度70％、89％和99％的壳聚糖(分子量均为50kDa,各50mg)，室温下，继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量3500Da透析袋中，于去离子水中透析48h,冷冻干燥24h,既得R6H6短肽修饰的壳聚糖衍生物。当利用脱乙酰度70％的壳聚糖制备的壳聚糖衍生物R6H6-CS负载siRNA时，形成的纳米粒粒径大于300nm,且PDI大于0.2，而利用脱乙酰度89％和99％的壳聚糖制备的壳聚糖衍生物R6H6-CS负载siRNA时，粒径较小且外观圆整，但是考虑到99％的壳聚糖价格较高，故脱乙酰度89％的壳聚糖是最优选择。
实施例4：制备不同取代度的壳聚糖衍生物R6H6-CS
分别将18mg、36mg和54mg的R6H6短肽溶解于5ml DMF中，加入10mg EDC和7mg HOBt作为缩合剂，加入12μL三乙胺，室温下活化4h。加入50mg壳聚糖(脱乙酰度89％、分子量均为50kDa)，室温下，继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量3500Da透析袋中，于去离子水中透析48h,冷冻干燥24h,既得R6H6短肽修饰的壳聚糖衍生物R6H6-CS，通过H-NMR图谱计算壳聚糖衍生物R6H6-CS的R6H6短肽取代度分别是7％、10％和12％。通过转染实验比较了三种不同取代度的壳聚糖衍生物R6H6-CS制备的纳米粒对荧光素酶基因的沉默效应(图2)，发现取代度10％的壳聚糖衍生物R6H6-CS制备的纳米粒对荧光素酶基因的沉默效率略高于其它两组，故取代度10％壳聚糖衍生物R6H6-CS是最佳载体。
实施例5：R6H6-NP的制备
采用复凝聚法制备载siRNA纳米粒。将一定浓度的R6H6-CS共聚物溶液与一定浓度的siRNA溶液分别置于55℃恒温水浴预热20min。预热后，将两种溶液等体积混合，迅速在旋涡混合器上混合40s，即得R6H6-NP。
从图3中看出，所制备的纳米粒平均粒径为175nm，粒子大小均一、结构圆整。
实验例：
实验例1：壳聚糖衍生物R6H6-CS的细胞毒性评价
将4T1细胞以5×103/孔密度接种于96孔板中，培养24h后，吸去旧培养基，分别加入浓度为5-100μg/ml的R6H6-CS共聚物溶液，培养48h后，吸弃旧培养基，每孔加入含的MTT溶液20μL和180μL无FBS的培养基，继续培养4h后，加入150μl DMSO溶液，摇床振摇10分钟，然后用酶标仪测定各孔在490nm处的OD值。计算细胞的存活率，每组实验设置6个重复孔。
从附图4可以看出，R6H6-CS在检测浓度5-100μg/ml的范围内，细胞存活率均>90％，说明合成的载体R6H6-CS安全无毒。
实验例2：R6H6-NP抑制荧光素酶基因的表达
将4T1-Luc细胞以3×104/孔密度接种于24孔板中，5％CO2、37℃培养24h后，吸弃旧培养基，加入R6H6-NP混悬液和无FBS的培养基，4h后，吸去培养基，更换含10％FBS的培养基，继续培养44h。将裸siRNALuc和CS-NP作为对照组，将未处理的细胞设为空白对照，每个样品设3个复孔。实验结束后，吸去各孔培养基，PBS清洗两次，每孔加入150μL被动裂解工作液，将细胞培养板置于摇床上振摇15min,观察细胞裂解情况，待裂解完毕吸取20μL细胞裂解液，加入50μL荧光素酶底物，迅速于生物发光仪上检测荧光素酶活力，检测时间为5s。实验例2中所选siRNALuc可以特异性沉默荧光素酶基因。
从图5结果中可以看出R6H6-NP对靶基因的沉默效率均高于其它对照组。
实验例3：载功能siRNAsur纳米粒体外抗肿瘤细胞增殖效果
将处于对数生长期的4T1细胞以5×103/孔的密度铺于96孔板中，37℃、5％CO2培养24h，以siRNAsur剂量5pmo/孔转染至相应孔中，4h后,吸去培养基，更换含10％FBS的培养基，继续培养44h。设空白组、裸siRNA、CS-NP和R6H6-NP组，同时以脂质体2000作为阳性对照组，每组设6个复孔。转染结束后，每孔加入MTT剂20μL，继续培养4h，然后每孔加入150μl DMSO溶液。酶标仪490nm处测定吸收值(A)，按下式计算存活率细胞存活率％＝AS/Ab×100％。其中，AS、Ab分别为给药组和空白组的吸收值。通过计算细胞存活率，考察纳米粒对肿瘤细胞的杀伤能力(见图6)。实验例3中所选siRNAsur可以特异性沉默生存素基因。结果表明R6H6-NP对4T1细胞增殖具有良好的抑制效果。
实验例4：载功能siRNAsur纳米粒体外抗肿瘤细胞迁移效果
将处于对数生长期的4T1细胞以5×104/孔的密度铺于24孔板中，37℃、5％CO2培养24h，无菌枪头沿直径划痕，更换不含FBS的培养基，将R6H6-NP以30pmol/孔的剂量转染细胞4h后，吸去培养基，更换含10％FBS的培养基，继续培养44h。同时设空白对照、裸siRNA组和CS-NP组，每组设3个复孔，分别于0、24h和48拍照，观察划痕愈合情况。实验例4中所选siRNAsur可以特异性沉默生存素基因。
从实验结果上看(图7)，给药结束后，R6H6-NP组仍能看到清新划痕，而其它组划痕几乎闭合，说明R6H6-NP能有效抑制细胞迁移。
实验例5：载siRNA-FAM纳米粒的细胞摄取情况
将处于对数生长期的4T1细胞，以15×104/孔的密度铺于12孔板中，37℃、5％CO2条件下培养过夜。以FAM标记的siRNA为模型药物，制备R6H6-NP并以siRNA剂量100pmol/孔转染入相应孔中,4h后，同时将转染相同剂量的裸siRNA-FAM组和CS-NP组设为对照组，将未处理的细胞设为空白组。用浓度为0.25％的胰蛋白酶消化收集各孔内的细胞，并分散于0.5mLPBS溶液，避光保存，尽快上机检测。实验例5中所选siRNA-FAM是荧光标记的siRNA。
从摄取实验研究结果上看(附图8)，与裸siRNA组和CS-NP组相比，R6H6-NP组细胞的摄取曲线显著右移，说明经R6H6-CS共聚物能够更有效的将siRNA递送入胞。
实验例6：载功能siRNAsur纳米粒体诱导细胞凋亡情况
将处于对数生长期的4T1细胞以8×104/孔的密度铺于6孔板中，37℃、5％CO2培养24h，将R6H6-NP以siRNAsur剂量200pmo/孔转染至相应孔中，继续培养48h，同时设空白组、裸siRNA和CS-NP作为对照组。给药结束后，PBS清洗2次，用0.25％胰酶消化细胞，将细胞悬浮于300μL缓冲溶液中，加入5μL annexinV-FITC和5μL propidium iodide后，混合均匀，上机检测。实验例6中所选siRNAsur可以特异性沉默生存素基因。
从图9的实验结果来看，R6H6-NP诱导细胞凋亡率是CS-NP组的两倍，说明修饰后的纳米粒能够显著的诱导细胞凋亡。
实验例7：载功能siRNAsur纳米粒体内抗肿瘤效果
取15只4-6周龄的雌性BALB/c小鼠，选择处于对数生长期的4T1乳腺癌细胞，以15×105/只的数量接种于BALB/c小鼠右侧第四乳腺垫，建立乳腺癌荷瘤小鼠模型。待肿瘤生长至130-140mm3时，将荷瘤鼠随机为3组(每组5只):空白组(生理盐水组)、裸siRNA组和R6H6-NP治疗组。分别于分组后的第1天、3天、5天、7天、9天给药，各组的给药方式为瘤内注射，给药剂量是0.3mg/kg,分别于给药前称量小鼠体重和瘤体积，给药结束后的第4天，将小鼠脱臼处死，剥离出肿瘤并称重。实验例7中所选siRNAsur可以特异性沉默生存素基因。
从附图10可知，裸siRNA组小鼠的瘤重与生理盐水组无明显差异，说明裸siRNA抗肿瘤作用不佳；而R6H6-NP组瘤重显著小于生理盐水组和裸siRNA组，说明R6H6-NP抗肿瘤效果显著，具有非常好的研发前景。
实验例-8：载功能siRNAsur纳米粒对小鼠生存率的影响
取30只4-6周龄的雌性BALB/c小鼠，选择处于对数生长期的4T1乳腺癌细胞，以20×105/只的数量接种于BALB/c小鼠右侧第四乳腺垫，待肿瘤生长至130mm3时，将荷瘤鼠随机为3组(每组10只)：空白组(生理盐水组)、裸siRNA组和R6H6-NP治疗组。分别于分组后的第1天、3天、5天、7天、9天给药，纳米粒的给药方式为瘤内注射，给药剂量是0.3mg/kg，生理盐水也通过瘤内注射给药。观察小鼠生存情况。实验例8中所选siRNAsur可以特异性沉默生存素基因。
从图11结果来看，生理盐水组小鼠在给药结束后第38天全部死光，裸siRNA组小鼠寿命略有延长，在给药后的第42天全部死光，而R6H6-NP组将小鼠寿命延长至49天，说明R6H6-NP不仅能够抑制肿瘤的生长和转移，而且还能明显的延长荷瘤小鼠的生存期。

Claims (9)

1.一种R6H6短肽修饰壳聚糖CS形成的壳聚糖衍生物R6H6-CS，其特征在于，CS和R6H6-CS分子结构式分别是(A)n-(C)(m+x)和(A)n-(B)m-(C)x,具体结构式如下：
其中，A、B、C分别表示
壳聚糖CS的分子量为20-113kDa,脱乙酰度用(m+x)/(n+x+m)表示，脱乙酰度为70％-99％，，且n和(m+x)仅表示A、C单元在CS分子中的个数，与A、C单元的连接顺序无关；
壳聚糖衍生物R6H6-CS中，R6H6表示6-聚精氨酸-6-聚组氨酸短肽，其中，6-聚精氨酸选自L型和D型的精氨酸的任意组合，6-聚组氨酸选自L型和D型的组氨酸的任意组合，m为重复单位B的个数，且m等于连接于CS分子上的R6H6短肽的个数，用m/(m+x)表示R6H6短肽取代壳聚糖游离氨基的取代水平，n和x分别表示重复单元A和C的个数，且m、n、x仅表示A、B、C单元在R6H6-CS分子中的个数，与A、B、C单元的连接顺序无关。
2.根据权利要求1的壳聚糖衍生物R6H6-CS，其特征在于，所述的壳聚糖CS的分子量为50kDa，所述壳聚糖CS的脱乙酰度为89％。
3.权利要求1所述的壳聚糖衍生物R6H6-CS的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将R6H6短肽溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1-羟基苯并三氮唑(HOBt)作为缩合剂，并加入少量三乙胺，室温下活化；
2)将壳聚糖加入上述溶液中，室温下，继续反应；
3)反应结束后，透析,冷冻干燥,既得壳聚糖衍生物R6H6-CS。
4.根据权利要求3的制备方法，其特征在于，R6H6短肽取代壳聚糖游离氨基的取代水平用m/(m+x)表示，为7％-12％。
5.权利要求1的壳聚糖衍生物R6H6-CS在体内外作为核酸递送载体中的应用。
6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述的核酸选自RNA或DNA。
7.根据权利要求6的应用，其特征在于，所述的RNA选自小干扰RNA。
8.根据权利要求7的应用，其特征在于，所述的siRNA的大小为15-30bp。
9.根据权利要求8的应用，其特征在于,所述的siRNA以生存素基因作为靶点。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009036022A1 (en) * 2007-09-10 2009-03-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Enhancement of polysaccharide-mediated nucleic acid delivery
CN101759812A (zh) * 2009-12-28 2010-06-30 中国药科大学 一种新型仿穿膜肽结构的壳聚糖衍生物
CN102260356A (zh) * 2010-05-24 2011-11-30 中国科学院上海药物研究所 一种用作基因载体的壳聚糖衍生物及其制备方法和用途
CN102268459A (zh) * 2011-06-07 2011-12-07 北京大学 一种dna或rna复合物的制备方法
CN104826132A (zh) * 2015-04-20 2015-08-12 南通大学 一种仿生siRNA胶束纳米复合物及应用
US20150231274A1 (en) * 2014-02-14 2015-08-20 The University Of Akron Dextran-peptide hybrid for efficient gene delivery
CN105218699A (zh) * 2014-07-04 2016-01-06 中国医学科学院药物研究所 寡聚精氨酸共价修饰的壳聚糖、制备方法、筛选及应用
CN105879056A (zh) * 2016-03-29 2016-08-24 中国药科大学 壳聚糖还原敏感体系作为基因药物递送载体的应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009036022A1 (en) * 2007-09-10 2009-03-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Enhancement of polysaccharide-mediated nucleic acid delivery
CN101759812A (zh) * 2009-12-28 2010-06-30 中国药科大学 一种新型仿穿膜肽结构的壳聚糖衍生物
CN102260356A (zh) * 2010-05-24 2011-11-30 中国科学院上海药物研究所 一种用作基因载体的壳聚糖衍生物及其制备方法和用途
CN102268459A (zh) * 2011-06-07 2011-12-07 北京大学 一种dna或rna复合物的制备方法
US20150231274A1 (en) * 2014-02-14 2015-08-20 The University Of Akron Dextran-peptide hybrid for efficient gene delivery
CN105218699A (zh) * 2014-07-04 2016-01-06 中国医学科学院药物研究所 寡聚精氨酸共价修饰的壳聚糖、制备方法、筛选及应用
CN104826132A (zh) * 2015-04-20 2015-08-12 南通大学 一种仿生siRNA胶束纳米复合物及应用
CN105879056A (zh) * 2016-03-29 2016-08-24 中国药科大学 壳聚糖还原敏感体系作为基因药物递送载体的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAI-LING CHANG等: "Efficient Gene Transfection by Histidine-Modified Chitosan through Enhancement of Endosomal Escape", 《BIOCONJUGATE CHEM》 *
ULRICH LÄCHELT等: "Fine-tuning of proton sponges by precise diaminoethanes and histidines in pDNA polyplexes", 《NANOMEDICINE: NANOTECHNOLOGY, BIOLOGY, AND MEDICINE》 *
杨飞飞 等: "siRNA 非病毒递送载体的研究现状", 《药学学报》 *

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