JPWO2011096408A1 - 複合体微粒子およびその製造方法、ならびに該複合体微粒子を用いた薬学組成物 - Google Patents

Abstract

生体内でその構造を非常に安定的に維持することができる複合体微粒子が提供される。本発明の複合体微粒子は、カチオン性ポリマーおよび核酸を含むコア粒子と；シリカで構成された、該コア粒子を被覆する被覆層と；を有する。好ましくは、コア粒子の直径に対する複合体微粒子の直径の比は、１００％を超えて１５０％以下であり、かつ、中性のｐＨ環境における複合体微粒子表面のζ電位は、−１０ｍＶ〜−２５ｍＶである。

Description

本発明は、複合体微粒子およびその製造方法、ならびに該複合体微粒子を用いた薬学組成物に関する。

ポリカチオンと核酸とにより形成されるポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）は、核酸を分解酵素から保護して細胞への取り込み効率を向上させることから、生体内での核酸デリバリーへの応用が広く検討されている（例えば、特許文献１）。しかし、このようなＰＩＣは、ポリカチオンの正電荷に起因して生体成分との非特異的相互作用を生じることがあり、その結果、ＰＩＣが生体内でその構造を安定的に維持できない場合が多い、および、血餅または血栓を発生させることがあるという問題がある。

国際公開第２００６／０８５６６４号パンフレット

本発明はこのような問題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、生体内でその構造を非常に安定的に維持することができ、かつ、血餅または血栓の発生を顕著に抑制し得る複合体微粒子を提供することにある。

本発明の複合体微粒子は、カチオン性ポリマーおよび核酸を含むコア粒子と；シリカで構成された、該コア粒子を被覆する被覆層と；を有する。
好ましい実施形態においては、上記カチオン性ポリマーは、ポリアルギニン（ＰＡｒｇ）、ポリリジン（ＰＬｙｓ）、グアニジン化ポリリジン（ＰＬｙｓ（Ｇ））、ポリ｛Ｎ−［Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル]アスパルタミド｝（ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））、ポリオルニチンおよびポリエチレンイミンからなる群から選択される。
好ましい実施形態においては、上記核酸は、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡおよびｓｉＲＮＡからなる群から選択される。
好ましい実施形態においては、上記被覆層の厚みは３ｎｍ〜２５ｎｍである。
好ましい実施形態においては、上記複合体微粒子の直径は５０ｎｍ〜５００ｎｍである。
好ましい実施形態においては、上記複合体微粒子は、中性のｐＨ環境における表面のζ電位が０ｍＶより小さく−３０ｍＶまでである。
好ましい実施形態においては、上記コア粒子の直径に対する複合体微粒子の直径の比は、１００％を超えて１５０％以下であり、かつ、複合体微粒子の中性のｐＨ環境における表面のζ電位は−１０ｍＶ〜−２５ｍＶである。
本発明の別の局面によれば、複合体微粒子の製造方法が提供される。当該製造方法は、カチオン性ポリマーと核酸とを混合し、コア粒子となる複合体を形成すること、および、該複合体とケイ酸塩溶液とを混合し、該複合体の表面にシリカで構成される被覆層を形成することを含む。
好ましい実施形態においては、上記核酸のアニオン性リン酸基に対する上記カチオン性ポリマーのカチオン性基のモル比は１より大きい。
好ましい実施形態においては、上記ケイ酸塩溶液の濃度は５ｍＭ〜６０ｍＭである。
本発明のさらに別の局面によれば、薬学組成物が提供される。当該薬学組成物は、上記の複合体微粒子と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。
本発明のさらに別の局面によれば、哺乳動物細胞への核酸の送達方法が提供される。当該方法は、上記の複合体微粒子を哺乳動物の細胞に接触させることを含む。

本発明によれば、カチオン性ポリイオンコンプレックスのコア粒子の表面にシリカで構成される被覆層を形成することにより、生体内でその構造を非常に安定的に維持することができ、かつ、血餅または血栓の発生を顕著に抑制し得る複合体微粒子を得ることができる。さらに、このような複合体微粒子は、細胞毒性が低く、トランスフェクション効率に優れているので、生体内の使用に好適であり得る。

本発明の好ましい実施形態による複合体微粒子の模式断面図である。 実施例の複合体微粒子調製後の時間に対するモノマー性ケイ酸および分子量の小さいシリカオリゴマーの濃度の関係を示すグラフである。 実施例の複合体微粒子調製後の時間に対する相対光散乱強度の関係を示すグラフである。 実施例の複合体微粒子についてＳｉ濃度に対する流体力学径の関係を示すグラフである。 実施例の複合体微粒子についてＳｉ濃度に対するζ電位の関係を示すグラフである。 生理学的塩の状況下に置かれた実施例の複合体微粒子および比較例のポリイオンコンプレックスについて、時間に対する流体力学径の関係を示すグラフである。 実施例の複合体微粒子および比較例のポリイオンコンプレックスについて、アガロースゲル電気泳動の結果を示す画像である。 実施例の複合体微粒子について透析時間と電気泳動の結果との関係を示す画像である。 実施例の複合体微粒子および比較例のポリイオンコンプレックスについて、ルシフェラーゼ遺伝子発現の時間プロファイルを示すグラフである。 フローサイトメトリーの結果をＣｙ５蛍光強度に対する細胞数の度数分布としてプロットしたグラフである。 比較例のポリイオンコンプレックスを添加してから２４時間後に得られた細胞内分布の共焦点蛍光画像である。 実施例の複合体微粒子を添加してから２４時間後に得られた細胞内分布の共焦点蛍光画像である。 図１１Ａおよび図１１Ｂにおいて、遺伝子と後期エンドソームまたはリソソームが共局在化した割合について実施例と比較例とを比較して示すグラフである。 実施例の複合体微粒子についてｐＨとζ電位との関係を示すグラフである。 カチオン性ポリマーが異なるそれぞれの複合体微粒子とそれに対応するポリイオンコンプレックスについて、ルシフェラーゼ発現量を比較して示すグラフである。

以下、本発明の好ましい実施形態を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる米国仮出願６１／３００，５４７号の明細書に記載の内容を包含する。さらに、本明細書において示されるすべての文書および刊行物は、その全体が本明細書に参考として援用される。

Ａ．複合体微粒子の全体構成
図１は、本発明の好ましい実施形態による複合体微粒子の模式断面図である。複合体微粒子１００は、コア粒子１０とコア粒子１０を被覆する被覆層２０とを有する。コア粒子１０は、カチオン性ポリマー１１および核酸１２を含む。代表的には、コア粒子１０は、核酸とカチオン性ポリマーとの静電相互作用により形成されたポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）である（以下、コア粒子をポリイオンコンプレックスとも称する場合がある）。コア粒子１０においては、核酸は、好ましくはカチオン性ポリマーに内包されている。被覆層２０は、シリカで構成されている。好ましくは、被覆層２０は、コア粒子１０の実質的に表面全体を被覆する。

複合体微粒子の直径は、好ましくは５０ｎｍ〜５００ｎｍであり、さらに好ましくは５０ｎｍ〜１５０ｎｍである。複合体微粒子の直径がこのような範囲であれば、生体内において悪影響を与えることなく核酸を所望の部位に良好に送達することができる。複合体微粒子の直径は、コア粒子の直径および被覆層の厚みを調整することにより制御することができる。コア粒子の直径は、カチオン性ポリマーの分子量や濃度等を調整することにより制御することができる。被覆層の厚みは、後述の製造方法において、被覆層形成材料であるケイ酸塩の濃度を調整することにより制御され得る。

複合体微粒子表面のζ電位は、中性のｐＨ環境（例えば、ｐＨ＝７）において、好ましくは０ｍＶより小さく−３０ｍＶまでであり、より好ましくは−５ｍＶ〜−２５ｍＶであり、さらに好ましくは−１０ｍＶ〜−２５ｍＶであり、特に好ましくは−１５ｍＶ〜−２２ｍＶである。言い換えれば、本発明の複合体微粒子は、その表面がアニオン性を有する。これは、（シリカで構成される）被覆層の性質に主として起因する。複合体微粒子表面がアニオン性を有することにより、生体内で微粒子の構造（形状）を安定的に維持することができる。より詳細には、生体内において、生理学的塩の存在に起因する凝集、および、アニオン性生体高分子（例えば、血清蛋白質）との相互作用による解離を顕著に抑制することができる。

１つの実施形態においては、複合体微粒子は、コア粒子の直径に対する複合体微粒子の直径の比が好ましくは１００％を超えて１５０％以下であり、かつ、中性のｐＨ環境における表面のζ電位が好ましくは−１０ｍＶ〜−２５ｍＶである。直径の比は、さらに好ましくは１０７％〜１２０％である。ζ電位は、さらに好ましくは−１５ｍＶ〜−２２ｍＶである。このような構成であれば、生体内で微粒子の構造（形状）をきわめて安定的に維持することができ、加えて、細胞内に良好に取り込まれ得る。

Ｂ．コア粒子
Ｂ−１．カチオン性ポリマー
上記カチオン性ポリマーとしては、本発明の効果が得られる限りにおいて、正電荷（代表的には、カチオン性基）を有する任意の適切なポリマーが採用され得る。本発明に用いられ得るカチオン性ポリマーとしては、例えば、ポリ（アミノ酸）、多糖類、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタンまたはビニルポリマーをベースとする主鎖と、当該主鎖に直接結合または連結基を介して結合した式−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ａ−（ＮＨ（ＣＨ_２）_２）_ｅ−ＮＨ_２で表される基（ここで、ａおよびｅはそれぞれ独立して１〜５の整数である）を含む側鎖とを有するポリマーあるいはその塩が挙げられる。本明細書において、「ポリ（アミノ酸）をベースとする主鎖」とは、天然もしくは合成のアミノ酸からのペプチド結合を介して形成されるポリアミノ酸の主鎖を意味する。「多糖類をベースとする主鎖」とは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、キトサンまたはポリガラクトサミンのような糖連鎖を意味する。「ビニルポリマーをベースとする主鎖」とは、不飽和エチレン性重合性モノマーの重合により形成される重合鎖を意味する。上記側鎖は、主鎖がポリ（アミノ酸）をベースとする場合には、例えば、ベーターまたはガンマー位に存在するカルボキシル基、ε−位のアミノ基等を介して主鎖に結合しており；主鎖が多糖類をベースとする場合には、糖部分のヒドロキシ基、アミノ基またはカルボキシル基を介して主鎖に結合しており；主鎖がビニルポリマーをベースとする場合には、例えば、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド）、またはポリ（メタクリル酸）等のヒドロキシ基、アミド基またはカルボキシル基を介して主鎖に結合している。カチオン性ポリマーにおける主鎖と側鎖とは，例えば、炭素原子数２２個までのアルキレン鎖を含む連結基（この連結基は１〜１０個の酸素または硫黄で中断されていてもよい）を介して結合することができる。側鎖は、高分子反応により導入されてもよく、それ以外の反応により導入されてもよい。側鎖を導入する反応の代表例としては、ハロゲンに対する置換反応、カルボキシル基またはアミノ基を利用した縮合反応、エステルに対するエステル交換反応、あるいはアミノリシスが挙げられる。カチオン性ポリマーの別の代表例としては、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリシンデンドリマーまたはそれらの塩が挙げられる。

なお、本明細書においては、コア粒子を形成するという文脈における用語「カチオン性ポリマー」は、カチオン性の高分子物質のみならず、カチオン性脂質をも包含する。カチオン性脂質を用いる場合には、コア粒子はいわゆるリポプレックスとして形成される。ＰＩＣおよびリポプレックスはいずれもカチオン性ナノ粒子であるので、両者ともに本発明の複合微粒子のコア粒子として良好に機能し得る。カチオン性脂質の代表例としては、〔N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N, N, N-trimethylammonium
methyl-sulfate〕（ＤＯＴＡＰ）が挙げられる。

カチオン性ポリマーとして塩を用いる場合、当該塩を形成する対イオンとしては、本発明の効果を損なわない限りにおいて、任意の適切な陰イオンを採用することができる。対イオンとしては、例えば、Ｃｌ⁻、Ｂｒ⁻、Ｉ⁻、（１／２ＳＯ_４）⁻、ＮＯ３⁻、（１／２ＣＯ_３）⁻、（１／３ＰＯ_４）⁻、ＣＨ_３ＣＯＯ⁻、ＣＦ_３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＳＯ_３ ⁻、またはＣＦ_３ＳＯ_３ ⁻が挙げられる。

カチオン性ポリマーの分子量としては、本発明の目的を達成できる限り任意の適切な分子量を設定できる。カチオン性ポリマーの分子量は、代表的には１０００〜２０００００である。

本発明に用いられるカチオン性ポリマーは、本発明の効果を損なわない限りにおいて、上記のカチオン性ポリマー由来のセグメントと非イオン性親水性ポリマー由来のセグメントとを有するブロックコポリマーであってもよい。非イオン性親水性ポリマーとしては、例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）およびポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）が挙げられる。なお、これらの非イオン性親水性ポリマーと上記のようなカチオン性ポリマーとのブロック共重合は当業界で周知であるので、詳細な説明は省略する。

１つの実施形態においては、カチオン性ポリマーは、下記一般式（Ｉ）で表されるポリ（アミノ酸）をベースとする主鎖を有するポリマーまたはその塩である。
式（Ｉ）において、Ｒ^１０は、水酸基、オキシベンジル基または−ＮＨ−Ｒ^１１基を表し、ここでＲ^１１は未置換または置換された直鎖もしくは分枝のＣ_１−２０アルキル基を表し；Ｒ^２ａおよびＲ^２ｂは、それぞれ独立して、メチレン基またはエチレン基を表し；Ｒ^３は、水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し；Ｒ^５ａおよびＲ^５ｂは、それぞれ独立して、水酸基、オキシベンジル基、または−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ａ−Ｘ基を表し、ここでａは１〜５の整数であり、Ｘはそれぞれ独立して一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内の一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であるが、Ｒ^５ａとＲ^５ｂの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ａ−Ｘ基であり、かつＸが（ＮＨ（ＣＨ_２）_２）_ｅ−ＮＨ_２（ｅは１〜５の整数である）であるものが少なくとも２つ以上存在し；Ｒ^６ａは、それぞれ独立して、水素原子または保護基であり、ここで保護基は通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基またはトリフルオロアセチル基であり；ｐは１〜５の整数、より好ましくは３〜４の整数であり；ｎは２〜１，０００の整数であり、ｙは０〜１，０００の整数であり、ｚは０〜１，０００の整数であるが、ｙ＋ｚはｎ以下である。また、上記の一般式における各繰り返し単位の配列順序は便宜上ブロック共重合体の形態で示しているが、各繰り返し単位の配列順序は特に限定されず、ブロック共重合体の形態であってもよく、交互共重合体の形態であってもよく、ランダム共重合体の形態であってもよい。

上記式（Ｉ）において、Ｒ^１１のＣ_１−２０アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基またはイコサニル基が挙げられる。当該アルキル基が置換された場合の置換基としては、例えば、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ_１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ_２−７アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ_１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基が挙げられる。ここで、アセタール化とは、ホルミル基のカルボニル部分とアルカノールの２分子またはアルキレンジオールとの反応によりアセタール部分を形成することを意味し、当該カルボニル部分の保護方法でもある。アルカノールとしては、例えば、炭素数１〜６個のアルカノールが挙げられる。アルキレンジオールとしては、例えば、炭素数２〜６個の直鎖状または分岐状のアルキレンジオールが挙げられる。例えば、置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ：またはアルデヒド基）に転化できる。ホルミル基、あるいはカルボキシル基またはアミノ基は、これらの基を介して、抗体またはその特異結合性を有する断片（例えば、Ｆ（ａｂ′）_２、Ｆ（ａｂ））を結合し、標的指向性およびその他の種々の機能性をカチオン性ポリマーに付与するのに利用できる。

上記式（Ｉ）において、Ｒ^５ａとＲ^５ｂの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ａ−Ｘ基であり、かつＸが（ＮＨ（ＣＨ_２）_２）_ｅ−ＮＨ_２（ｅは１〜５の整数である）であるものは、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８５％以上存在する。また、上記式（Ｉ）において、Ｒ^５ａおよびＲ^５ｂのすべてまたは一部が−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ａ−Ｘ基であり、ａが２であり、かつｅが１であるポリマーが好ましい。さらに、上記式（Ｉ）において、Ｒ^２ａおよびＲ^２ｂがメチレン基であるポリマーも好ましい。

１つの実施形態においては、上記式（Ｉ）のＲ^５ａおよび／またはＲ^５ｂにおけるＸは、好ましくは以下の化学式で表される基である：
ここで、Ｘ^２は、水素原子あるいはＣ_１−６アルキル基またはアミノＣ_１−６アルキル基を表し；Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂおよびＲ^７ｃは、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を表し；ｄ１、ｄ２およびｄ３は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；ｅ１、ｅ２およびｅ３は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し；ｆは０〜１５の整数を表し；Ｒ^８ａおよびＲ^８ｂは、それぞれ独立して、水素原子または保護基を表し、ここで保護基はＲ^６ａについて上述したとおりであり；ｇは０〜１５の整数を表す。この場合、より好ましくは、式（Ｉ）中のｚは０（ゼロ）であり、および／または、Ｒ^３はアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基である。

特に好ましいカチオン性ポリマーの具体例としては、ポリアルギニン（ＰＡｒｇ）、ポリリジン（ＰＬｙｓ）、グアニジン化ポリリジン（ＰＬｙｓ（Ｇ））、ポリ｛Ｎ−［Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル]アスパルタミド｝（ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））、ポリオルニチンまたはポリエチレンイミンが挙げられる。

Ｂ−２．核酸
本発明に用いられる核酸としては、本発明の効果が得られる限りにおいて任意の適切な核酸または核酸関連物質が採用され得る。より具体的には、カチオン性ポリマーとともにコア粒子（実質的にはＰＩＣまたはリポプレックス）を形成することができ、動物細胞に送達された際に細胞に対して何らかの作用を及ぼし得る核酸または核酸関連物質が採用され得る。化学構造により分類すると、オリゴマーまたはポリマーの範疇に属するＤＮＡ、ＲＮＡおよび核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸、核酸のリン酸部が例えばホスホロチオエート、メチルホスホナート、ホスフェートトリエステル、ホスホロアミデート等に改変されている核酸アナログ）が包含される。機能により分類すると、遺伝情報を担うものまたはアンチセンスの範疇に属するあらゆる分子が包含される。本発明に用いられる核酸の好ましい具体例としては、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡが挙げられる。

コア粒子中の核酸の含有量は、カチオン性ポリマー中のカチオンと核酸分子内のリン酸基との比率（Ｎ／Ｐ比）で表すことができる。Ｎ／Ｐ比は、次式によって定義される：
Ｎ／Ｐ比＝〔カチオン性ポリマー中のカチオンの総数〕／〔核酸中のリン酸基の総数〕
本発明においては、Ｎ／Ｐ比は、好ましくは１より大きく、さらに好ましくは１．１〜２０である。Ｎ／Ｐ比を１より大きくすることにより（すなわち、カチオンを過剰とすることにより）、表面が正電荷を有するコア粒子（ＰＩＣまたはリポプレックス）を安定して形成することができる。その結果、コア粒子表面でのケイ酸の縮合反応、すなわちシリカの形成を促進することができる。一方で、Ｎ／Ｐ比が大きすぎると、溶液中にフリーで（すなわち、核酸と結合せずに）存在するカチオン性ポリマー量が増大し、これがケイ酸の縮合反応を促進した場合、溶液がゲル化して複合体微粒子が得られない場合がある。Ｎ／Ｐ比は、後述の製造方法において、核酸とカチオン性ポリマーとを混合する際に、核酸のアニオン性リン酸基とカチオン性ポリマーのカチオン性基とのモル比を調整することにより制御することができる。

Ｂ−３．コア粒子の全体的特徴
コア粒子（代表的には、ＰＩＣまたはリポプレックス）は、上記カチオン性ポリマーと上記核酸とを混合することにより、これらの静電相互作用により自発的に形成され得る。上記所定のＮ／Ｐ比に設定することにより、特別な物理的および／または化学的な処理を行うことなく、コア粒子を良好に形成することができる。

コア粒子の直径は、好ましくは２０ｎｍ〜５００ｎｍであり、さらに好ましくは４０ｎｍ〜１５０ｎｍである。コア粒子の直径がこのような範囲であれば、上記所望の直径を有する複合体微粒子を得ることができる。上記のとおり、コア粒子の直径は、カチオン性ポリマーの分子量等を調整することにより制御することができる。

コア粒子表面のζ電位は、中性のｐＨ環境（例えば、ｐＨ＝７）において、好ましくは５ｍＶ〜４０ｍＶである。言い換えれば、コア粒子は、その表面がカチオン性を有する。このような性質を有することにより、コア粒子がＰＩＣとして簡便かつ安定的に形成され得る。

Ｃ．被覆層
被覆層２０は、上記のとおりシリカで構成される。より詳細には、被覆層は、−Ｓｉ−Ｏ−結合による網目構造を有する。被覆層を形成することにより、コア粒子のカチオン性ポリマーの露出を防止することができる。さらに、被覆層を構成するシリカの静電的性質に起因して、複合体微粒子表面をアニオン性とすることができる。その結果、複合体微粒子と生体成分との非特異的相互作用を防止し、生体内で微粒子の構造（形状）を安定的に維持することができる。より詳細には、生体内において、生理学的塩の存在に起因する凝集、および、アニオン性生体高分子（例えば、血清蛋白質）との相互作用による解離を顕著に抑制することができる。

一方で、被覆層を構成するシリカは、以下の平衡状態を有する：
ＳｉＯ_２ ＋ ２Ｈ_２Ｏ ⇔ Ｓｉ（ＯＨ）_４
ここで、生体内においては、遊離のケイ酸（Ｓｉ（ＯＨ）_４）が実質的に存在しない。このことに起因して、被覆層を構成するシリカ（ＳｉＯ_２）の上記平衡状態は、生体内では右側にずれてシリカが徐々にケイ酸となる。したがって、生体内の投与前および投与後の血液中で維持されていたシリカの網目構造が細胞内に代表される希釈環境下では崩壊し、被覆層は徐々に消失する。その結果、本発明の複合体微粒子は、血液中では核酸を内包した形態を安定して維持することができ、かつ、細胞に取り込まれた後は、核酸を徐々に放出することができる。

被覆層２０の厚みは、好ましくは３ｎｍ以上であり、より好ましくは３ｎｍ〜２５ｎｍであり、さらに好ましくは５ｎｍ〜１５ｎｍである。被覆層の厚みが３ｎｍ未満である場合には、コア粒子の表面全体を被覆できず、コア粒子の表面の一部が露出する場合がある。その結果、露出したカチオン性ポリマーの正電荷による生体成分との非特異的相互作用を生じる場合があり、微粒子の構造を生体内で安定的に維持できない場合がある。被覆層の厚みは、後述の製造方法において、被覆層形成材料であるケイ酸塩の濃度を調整することにより制御され得る。また、被覆層２０の厚みは、上記コア粒子の直径に対して、好ましくは１％〜５０％であり、さらに好ましくは３％〜２０％である。

Ｄ．薬学組成物
本発明の薬学組成物は、上記Ａ項〜Ｃ項に記載の複合体微粒子と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。薬学的に許容可能なキャリアとしては、目的とする投与形式に応じて任意の適切なキャリアが採用され得る。具体例としては、希釈剤、賦形剤、精製水、脱イオン水、等張剤、ｐＨ調整剤、緩衝液、単糖、オリゴ糖、糖アルコール、ポリエチレングリコールが挙げられる。投与形式の具体例としては、標的細胞または組織の近傍または組織内への直接導入または移植，静脈内注入、動脈内注入、筋肉内注入、経口投与、経肺投与が挙げられる。薬学組成物中の複合体微粒子の含有量は、目的、キャリアの種類、投与形式等に応じて適切に設定され得る。

Ｅ．複合体微粒子の製造方法
本発明の複合体微粒子の製造方法は、カチオン性ポリマーと核酸とを混合し、コア粒子となる複合体を形成すること、および、該複合体とケイ酸塩溶液とを混合し、該複合体の表面にシリカで構成される被覆層を形成することを含む。本発明の製造方法においては、まず、コア粒子となる複合体（代表的には、ＰＩＣまたはリポプレックス）を形成する。上記Ｂ項に記載のカチオン性ポリマーと核酸とを混合することにより、これらの静電相互作用によりコア粒子が自発的に形成され得る。混合は、代表的には、核酸およびカチオン性ポリマーがＨｅｐｅｓ緩衝液中の希薄溶液の状態で行われる。核酸およびカチオン性ポリマーを希薄溶液の状態で（すなわち、低濃度で）混合することにより、静電相互作用を介してナノ−マイクロスケールのコア粒子が得られる。混合の際の核酸のアニオン性リン酸基に対するカチオン性ポリマーのカチオン性基のモル比は、好ましくは１より大きく、さらに好ましくは１．１〜２０である。リン酸基に対するカチオン性基のモル比を１より大きくすることにより（すなわち、カチオンを過剰とすることにより）、特別な物理的および／または化学的な処理を行うことなく、表面が正電荷を有するコア粒子（ＰＩＣ）を安定して形成することができる。なお、当該モル比は、コア粒子のＮ／Ｐ比に対応する。

次に、形成されたコア粒子（ＰＩＣ）とケイ酸塩溶液とを混合する。当該混合により、以下に模式的に示すケイ酸塩の縮合反応によって、シリカの網目構造が形成される。特に、ケイ酸塩のケイ酸イオン（アニオン）とコア粒子の表面の電荷（カチオン）との静電相互作用および水素結合に起因した局所（コア粒子表面での）濃縮を通じて、当該縮合反応は、主としてコア粒子表面で進行する。したがって、シリカの網目構造は、主としてコア粒子表面に形成され、結果として、被覆層がコア粒子表面に形成される。

シリカ源のケイ酸塩としては、シリカ網目構造を有する被覆層が適切に形成される限りにおいて任意の適切なケイ酸塩が用いられ得る。ケイ酸塩の代表例としては、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸カリウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウムが挙げられる。

コア粒子とケイ酸塩（実質的には、ケイ酸イオン）との混合もまた、代表的には、Ｈｅｐｅｓ緩衝液中の希薄溶液の状態で行われる。当該混合の際のケイ酸塩溶液の濃度（すなわち、Ｓｉ濃度）は好ましくは０．１ｍＭ〜６０ｍＭであり、さらに好ましくは５ｍＭ〜３０ｍＭである。このように非常に薄い濃度領域で混合することにより、縮合反応が非常に良好に進行し、かつ、所望の厚みの被覆層が得られ得る。さらに、このような濃度領域においては、得られる複合体微粒子表面のζ電位がＳｉ濃度によらず所望の値でほぼ一定となる。溶液中のＳｉ濃度が低すぎると、コア粒子の表面の一部が露出し、生体内で複合体微粒子の形状が安定的に維持できない場合がある。また、溶液中のＳｉ濃度が５ｍＭ未満である場合には、Ｓｉ濃度に依存して複合体微粒子表面のζ電位が変化し得る。この場合、複合体微粒子表面のζ電位がゼロ（ニュートラル）となるＳｉ濃度が存在し得る。ζ電位がゼロ近辺の複合体微粒子は、静電反発の減少により凝集を起こす場合がある。一方で、溶液中のＳｉ濃度が高すぎると、コア粒子の存在とは関係なくケイ酸塩溶液がゲル化する場合がある。

以上のように、本発明の複合体微粒子の製造方法によれば、特別な物理的および／または化学的な処理を行うことなく、単純な混合操作のみで複合体微粒子を製造することができる。上記から明らかなように、本発明の複合体微粒子は、通常、液状組成物の形態で得られ得る。得られた複合体微粒子は、任意の適切な単離・精製方法により反応系から回収されてもよい。単離・精製方法の具体例としては、限外濾過、ダイアフィルトレーション、透析が挙げられる。上記単離および精製された複合体微粒子は、例えば、溶液状態のまま滅菌処理し、必要に応じて任意の適切な注射剤用助剤を添加して注射剤としてもよく、溶液を濃縮後、例えば凍結乾燥して、固体状の微小粉体としてもよい。複合体微粒子を微小粉体とする場合には、薬学的に許容されるキャリアと配合して、種々の投与形式に適合する剤形に加工することができる。本発明の複合体微粒子を用いた薬学組成物は、上記Ｄ項で説明したとおりである。

Ｆ．哺乳動物細胞への核酸の送達方法
本発明の哺乳動物細胞への核酸の送達方法は、上記本発明の複合体微粒子を哺乳動物の細胞に接触させることを含む。すなわち、本発明の複合体微粒子または当該複合体微粒子を含む組成物が、細胞または組織と接触し得る状態におかれればよい。このような接触としては、複合体微粒子の存在下で細胞を培養してもよく、細胞の培養物中に複合体微粒子を添加してもよい。また、生体内の細胞または組織と複合体微粒子の接触は、遺伝療法等の当該技術分野で常用されている投与方法により、複合体微粒子（実質的には核酸）の導入を必要とする個体に投与すればよい。このような個体としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタ、鳥類が挙げられる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

＜材料＞
実施例で用いた材料は以下のとおりである：
ポリアルギニン（ＰＡｒｇ、Ｍｗ＝５，０００〜１５，０００）、ケイ酸ナトリウム溶液（試薬グレード）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、およびトリプシン−エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）溶液は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。
Ｈｅｐｅｓ緩衝液は、殺菌された1Ｍのもの（ｐＨ＝７．３）をＡｍｒｅｓｃｏ社から購入し、蒸留水で希釈して用いた。
プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）は、理化学研究所から購入し、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテントセル中で増幅し、次いで、ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて精製して用いた。用いたｐＤＮＡは、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ、プロモーターとしてＣＡＧ配列が組み込まれている。
デキストラン硫酸ナトリウム（Ｍｗ＝５０００）およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、和光純薬から購入した。
すべての培養プレートおよび培養皿は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅから購入した。
Ｈｕｈ−７細胞は、理化学研究所Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから得た。
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、大日本住友製薬から購入した。
ルシフェラーゼの基質としてのルシフェリンは、住商ファーマインターナショナルから購入した。

＜実施例１：複合体微粒子の調製＞
ヌクレオチドのリン酸骨格に対して高い親和性を有し、かつ、静電相互作用および水素結合によりケイ酸ナトリウムに対して高い縮合能力を有するという理由で、ｐＡｒｇをカチオン性ポリマーとして選択した。ポリアルギニン（ＰＡｒｇ）を、５ｍｇ／ｍＬの濃度で、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ＝７．３）中に溶解した。このポリマー溶液を０．２３ｍｇ／ｍＬまで希釈した後、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ中の１３０μｇ／ｍＬのｐＤＮＡ溶液と混合し、最終のｐＤＮＡ濃度を８６．７μｇ／ｍＬとした。リン酸ユニットに対するＡｒｇユニットのモル比（Ｎ／Ｐ比）を１．５に調整することにより、わずかに過剰のカチオン性電荷を有するコア粒子（ポリイオンコンプレックス：ＰＩＣ）が得られた。動的光散乱（ＤＬＳ）およびζ電位測定によれば、得られたＰＩＣは約１００ｎｍの直径で、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ＝７．３）中で約３０ｍＶの正のζ電位を有していた。このＰＩＣは、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ＝７．３）中で十分なコロイド安定性を有していた。調製から３０分後、ＰＩＣ溶液を、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ＝７．３）中でケイ酸ナトリウム溶液（Ｓｉ濃度＝０．５ｍＭ）と混合し、４３．３μｇ／ｍＬの最終ｐＤＮＡ濃度を得た。このようにして、コア粒子がシリカ被覆層で被覆された複合体微粒子を得た。

＜実施例２〜８：複合体微粒子の調製＞
ケイ酸ナトリウム溶液のＳｉ濃度を、それぞれ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭおよび６０ｍＭとしたこと以外は実施例１と同様にして、コア粒子がシリカ被覆層で被覆された複合体微粒子を得た。

＜比較例１：ポリイオンコンプレックスの調製＞
実施例１で得られたＰＩＣをケイ酸ナトリウム溶液と混合することなくそのまま用いた。
なお、簡略化のため、以下の記載においては、実施例のシリカ被覆された複合体微粒子をＳＣポリプレックス（例えば、Ｓｉ濃度＝５ｍＭ）と略記し、比較例のシリカ被覆されていないポリイオンコンプレックスをＮＳＣポリプレックスと略記する場合がある。

＜評価＞
Ａ．被覆層形成の確認
（１）モノマー性ケイ酸および分子量の小さいシリカオリゴマーの定量
得られたＳＣポリプレックス（Ｓｉ濃度＝３０ｍＭ）溶液について、モリブデン黄色法（ｍｏｌｙｂｄｏｓｉｌｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、溶液中のモノマー性ケイ酸および分子量の小さいシリカオリゴマーを定量した。この方法においては、黄色に着色したケイモリブデン酸（Ｈ_８Ｓｉ（Ｍｏ_２Ｏ_７）_６）の形成により、モノマー性ケイ酸および分子量の小さいシリカオリゴマーの量を決定することができる。具体的には、調製後の異なる時点で、ＳＣポリプレックス（Ｓｉ濃度＝３０ｍＭ）の溶液２０μＬを、１８０μＬの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ＝７．３）で希釈した。希釈した溶液を直ちに０．１ｇ／ｍＬのヘプタモリブデン酸（１０μＬ）および１Ｍ塩酸（１０μＬ）と混合した。混合物を３０分間放置した後、ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて４００ｎｍで吸光度測定を行った。光学密度（ＯＤ）を、ポリプレックスを有さないケイ酸ナトリウム溶液の初期ＯＤに対する値に変換し、モノマー性ケイ酸および分子量の小さいシリカオリゴマーの濃度とした。調製後の時間に対するモノマー性ケイ酸および分子量の小さいシリカオリゴマーの濃度の関係を示すグラフを図２に示す。

図２から明らかなように、モノマー性ケイ酸および分子量の小さいシリカオリゴマーの濃度は、混合から時間が経過するにつれて減少し、混合後約４時間（２４０分）でプラトー状態に達した。このことから、コア粒子のＰＩＣ溶液と希釈ケイ酸ナトリウム溶液とを混合することにより、ケイ酸ナトリウム溶液の主要成分であるモノマー性ケイ酸および分子量の小さいシリカオリゴマーは、カチオン性ポリマーの存在下で効率的に縮合し、不溶性の（網目構造を有する）シリカを形成していることが示唆される。

（２−１）静的光散乱（ＳＬＳ）
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏｓｅｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて、検出角度１７３°および温度２５℃でＳＬＳ測定を行った。入射ビームとしてＨｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）を用いた。調製後の異なる時点で、ＳＣポリプレックス（Ｓｉ濃度＝３０ｍＭ）の溶液（４３．３μｇ／ｍＬのｐＤＮＡ）を小さなガラスキュベット（容量１２μＬ、ＺＥＮ２１１２、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）に加えた。各試料から得られた光子計数を、初期値に対する相対光散乱強度（ＳＬＩ）に変換した。調製後の時間に対する相対光散乱強度の関係を示すグラフを図３に示す。図３から明らかなように、相対ＳＬＩは粒子サイズに対応するところ、混合から２時間にわたって徐々に増加し、図２に示すケイ酸および分子量の小さいシリカオリゴマーの濃度と大まかな相関関係を示す。この結果からも、所定の厚みの被覆層が形成されていることが示唆される。図２および図３の結果から、被覆層の形成は、ＳＣポリプレックス調製後２〜４時間で飽和状態となることが示唆される。

（２−２）動的光散乱（ＤＬＳ）
ＳＬＳと同じ装置を用いてＤＬＳ測定を行った。調製から２〜３時間後、ｐＤＮＡ濃度が４３．３μｇ／ｍＬで、実施例で得られた異なるＳｉ濃度を有するＳＣポリプレックス溶液および比較例で得られたＮＳＣポリプレックス溶液を、ＳＬＳ測定と同様にして上記のキュベットに加え、次いで測定した。光子相関関数における減衰レートから得られたデータをキュムラント法により分析し、次いで、Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎの式により、ポリプレックスの流体力学径を計算した。塩誘導されたポリプレックスの凝集をモニターするために、各々のポリプレックス溶液を等体積の３００ｍＭ ＮａＣｌ溶液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ＝７．３）中）と混合し、混合直後にＤＬＳ測定を行った（最終ｐＤＮＡ濃度：２１．７μｇ／ｍＬ）。Ｓｉ濃度に対する流体力学径の関係を示すグラフを図４に示す。

次に、実施例で得られたＳＣポリプレックス（Ｓｉ濃度＝１０ｍＭ、２０ｍＭおよび３０ｍＭ）について、ＤＬＳ測定を行い、粒子の直径を調べた。結果を後述のζ電位測定の結果と併せて表１に示す。

（３）ζ電位測定
実施例で得られた異なるＳｉ濃度のＳＣポリプレックスおよび比較例で得られたＮＳＣポリプレックスについて、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏｓｅｒｉｅｓを用いて、検出角度１７３°および温度２５℃でζ電位測定を行った。入射ビームとしてＨｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）を用いた。各々のポリプレックス溶液を、ζ電位測定用キャピラリーセル（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）に注入した。下記のＳｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉの式により、得られた電気泳動移動度からζ電位を計算した。
ζ=４πην／ε
ここで、ηは溶媒の粘度であり、νは電気泳動移動度であり、εは溶媒の誘電定数である。Ｓｉ濃度に対するζ電位の関係を示すグラフを図５に示す。

表１ならびに図４および５から、コア粒子表面にアニオン性の被覆層が形成されていることがわかる。より詳細には、表１および図５から明らかなように、Ｓｉ濃度が５ｍＭまでは濃度が増加するにつれてζ電位は劇的に減少し、それ以上の濃度では約−２０ｍＶという負の値で一定化している。上記のとおりコア粒子としてのＰＩＣ（ＮＳＣポリプレックスに相当する）のζ電位は約＋３０ｍＶであるから、このような負のζ電位は、コア粒子表面がアニオン性のシリカ層で被覆されたことを示している。さらに、表１および図４から明らかなように、Ｓｉ濃度が５ｍＭを超えると、ＳＣポリプレックスは、ＮＳＣポリプレックスに比べて粒子径が８〜１０ｎｍ大きくなっている。このことから、形成された被覆層の厚みは４〜５ｎｍ程度であることがわかる。なお、Ｓｉ濃度が０．５〜２ｍＭのＳＣポリプレックスについては、粒子径が劇的に増大している。これは、このような濃度範囲においてＳｉ濃度が変化することによりＳＣポリプレックスのζ電位が正からゼロ（ニュートラル）へと変化することに伴い、ＳＣポリプレックス間の静電反発が減少することにより凝集が誘発されたと推定される。

Ｂ．複合体微粒子の安定性
（４）コロイド安定性試験
ＳＣポリプレックス（Ｓｉ濃度＝３０ｍＭ）およびＮＳＣポリプレックスについて、塩誘導凝集に対するコロイド安定性を調べた。具体的には、１５０ｍＭ ＮａＣｌの生理学的塩の状況下でＤＬＳ測定を行い、流体力学径を調べた。時間に対する流体力学径の関係を示すグラフを図６に示す。図６から明らかなように、ＮＳＣポリプレックス（○）は時間とともに徐々に凝集した。凝集は、塩の存在によりＮＳＣポリプレックス間の静電反発が減少したことによることが明らかである。一方、ＳＣポリプレックス（□）は凝集が完全に防止され、生理学的塩の状況下で高いコロイド安定性を示した。このような優れたコロイド安定性は、複合体微粒子を生体内に適用した場合に血液中などでの凝集を防止し、結果として、血餅および血栓の発生を抑制し得る。このことから、ＳＣポリプレックス（本発明の複合体微粒子）は、ｉｎ ｖｉｖｏ用途において有望であり得ることが示唆される。

（５）アガロースゲル電気泳動
ポリアニオンに誘発されるポリプレックスの解離に対する被覆層の抑制能力を調べた。具体的には、ＳＣポリプレックスの安定性を、ポリアニオンとしてのデキストラン硫酸（Ｍｗ＝５０００）との交換反応に起因するポリプレックスからのｐＤＮＡの放出により評価した。ＳＣポリプレックス溶液（５μＬ）をデキストラン硫酸溶液（１７０μｇ／ｍＬ、１５μＬ）と混合し、室温で終夜放置した。２１７ｎｇのｐＤＮＡを含む各試料溶液を、１．７ｍＭの酢酸ナトリウムを含む３．３ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸の電気泳動用緩衝液に浸した０．９ｗｔ％アガロースゲル上で、１００Ｖで１時間電気泳動した。臭化エチジウム（ＥｔＢｒ；０．５ｍｇ／Ｌ）を含む蒸留水にゲルを浸漬することにより、移動したｐＤＮＡを視覚化した。結果を図７に示す。図７から、シリカ被覆層を形成することにより、ポリアニオンの添加によって誘発されるｐＤＮＡの放出（ポリプレックスの解離）が抑制されていることが明らかである。より詳細には、ｐＤＮＡの放出が、Ｓｉ濃度５ｍＭ以上で完全に抑制されている。この結果は、図５の結果とも整合性が取れている。このことから、シリカ被覆層を形成する場合には、シリカ源としてのケイ酸塩溶液のＳｉ濃度は５ｍＭ以上であることが好ましいと推定される。

Ｃ．複合体微粒子の生物学的性能
（６）透析と拡散放出特性との関係
透析されたＳＣポリプレックスの核酸放出特性を調べた。すなわち、透析によりモノマー性ケイ酸および分子量の小さいシリカオリゴマーを除去してシリカ被覆層の脱被覆（ポリプレックスの解離）を促進し、そのような状態での核酸放出特性を調べた。ここで、水和シリカとケイ酸との間には平衡（ＳｉＯ_２ ＋ ２Ｈ_２Ｏ ⇔ Ｓｉ（ＯＨ）_４）が存在するので、透析により遊離ケイ酸（コア粒子を被覆するシリカ層から生成される）を除去することにより、シリカの脱被覆プロセス（シリカ被覆層の消失）が促進される。具体的には、調製から２時間後のＳＣポリプレックス（Ｓｉ濃度＝３０ｍＭ）溶液を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｅｓｔｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＭＷＣＯ＝１０，０００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）透析膜を用いて、５００倍の過剰体積の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ＝７．３）に対して時間を変化させて透析した。透析によるシリカの脱被覆プロセスを確認するために、ポリアニオン添加によるポリプレックスの解離挙動評価（ゲル電気泳動）、モリブデン黄色法およびζ電位測定を上記と同様の手順で行った。ゲル電気泳動の結果を図８に示す（対照として、透析しないＮＳＣポリプレックスの結果を併せて示す）。図８から、長時間の透析により、ＳＣポリプレックスからのｐＤＮＡの放出が促進されることがわかる。より詳細には、２４時間の透析後には、ＳＣポリプレックスは、ＮＳＣポリプレックスに類似したｐＤＮＡ放出を示した。一方、透析時間が４時間未満である場合には、ｐＤＮＡの放出は認められなかった。この結果は、モリブデン黄色法により決定された遊離ケイ酸／分子量の小さいシリカオリゴマー濃度（図２）と整合性が取れている。４時間の透析後、透析前に溶液中に存在した遊離ケイ酸／分子量の小さいシリカオリゴマーのうちの５０％は溶液中に残っていたが；終夜の透析後には透析前の５％以下にまで減少した。上記の結果から、ＳＣポリプレックス（本発明の複合体微粒子）は、細胞内で被覆層が効率的に崩壊して核酸を放出し、効率的な遺伝子発現を実現し得ることが示唆される。

（７）Ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率
ＳＣポリプレックスの生物学的性能を決定するために、ＳＣポリプレックスのＩｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率の時間依存性を、ＡＢ−２５５０ Ｋｒｏｎｏｓ Ｄｉｏ（アトー社製）を用いて測定した。この装置は、ルシフェラーゼが導入された細胞からの発光を１０分毎に測定できる。Ｈｕｈ−７細胞を３５ｍｍシャーレに播種した（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ ２ｍＬ中に２００００細胞／ウェル）。２４時間培養した後、培地を、１０％ＦＢＳおよび１００μＭルシフェリンを含む新鮮な培地（基質）と交換した。次いで、５μｇのｐＤＮＡを含み、Ｓｉ濃度が異なるＳＣポリプレックス溶液（調製から２時間後）をそれぞれ細胞に加え、続いて、Ｋｒｏｎｏｓ装置を用い、製造者のプロトコルにしたがって発光測定を行った。図９は、Ｓｉ濃度が異なるＳＣポリプレックスおよびＮＳＣポリプレックスを用いたルシフェラーゼ遺伝子発現の時間プロファイルを示す。ＮＳＣポリプレックスを用いた場合、ルシフェラーゼ発現はＮＳＣポリプレックス投与から４時間後に検出され、当該発現は投与後１２時間でプラトー状態に到達した。すべてのＳＣポリプレックスはトランスフェクション活性を示した。このことから、媒体および／または細胞内部でシリカ被覆層の脱被覆（網目構造の崩壊による被覆層の消失）が起こり、そのことにより、内包されたｐＤＮＡがポリプレックスから放出されたことが示唆される。Ｓｉ濃度が５ｍＭ以上のシリカ被覆層を形成することにより、Ｓｉ濃度に依存してポリプレックスのトランスフェクション効率が明らかに改善されている。Ｓｉ濃度３０ｍＭのＳＣポリプレックスは、ＮＳＣポリプレックスに比べて１けた以上大きいトランスフェクション効率を示した。Ｓｉ濃度が低い（０．５ｍＭ〜２ｍＭ）ＳＣポリプレックスについては、トランスフェクション効率はＮＳＣポリプレックスより低くなっている。これは、図４に示すような大きな凝集体（＞１μｍ）の形成に関連すると推定される。なお、ＳＣポリプレックスは、Ｓｉ濃度にかかわらず、被覆層の形成によりその構造の安定化に寄与できる。

（８）細胞による複合体微粒子の取り込み（フローサイトメトリー）
細胞によるポリプレックスの取り込みを、フローサイトメーターＬＳＲ ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ社製）とＣｙ５標識化されたｐＤＮＡとを用いて決定した。Ｌａｂｅｌ ＩＴ Ｃｙ５ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ Ｆｕｌｌ Ｓｉｚｅを用い、製造者プロトコルにしたがって、ｐＤＮＡをＣｙ５で標識化した。Ｈｕｈ−７細胞を６ウェル培養プレートに播種し（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ ２ｍＬ中に１０００００細胞／ウェル）、続いて終夜インキュベートした。ＮＳＣポリプレックスおよびＳＣ（Ｓｉ濃度＝３０ｍＭ）ポリプレックスを、それぞれ、上記と同様にして標識化されたｐＤＮＡを用いて調製した（最終Ｃｙ５−ｐＤＮＡ濃度：４３．３μｇ／ｍＬ）。調製から２時間後、５μｇのｐＤＮＡを含む各ポリプレックスを、培養されたＨｕｈ−７細胞に添加した。１時間インキュベートした後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液でさらに洗浄し、３７℃で数分間インキュベートした後、ＰＢＳ中で懸濁した。Ｈｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）を備えたＬＳＲ ＩＩを用いて、各細胞を分析した。５０００個の細胞について得られた結果をＣｙ５蛍光強度に対する細胞数の度数分布としてプロットしたグラフを図１０に示す。興味深いことに、トランスフェクション効率が高いにもかかわらず、ＳＣポリプレックスのＣｙ５蛍光強度（３つの試料の平均値：２４００±４００）はＮＳＣポリプレックス（３つの試料の平均値：８４００±６００）よりも低い。このことは、ポリプレックスの細胞内取り込みがシリカ被覆層の形成により減少したことを示している。シリカ層の負電荷により、ポリプレックスを形成するポリカチオンと細胞膜との静電相互作用が抑制され、細胞内取り込みが減少したと考えられる。一方、ＳＣポリプレックスが細胞内取り込みは少ないにもかかわらずルシフェラーゼ発現を促進したという事実は、このようなルシフェラーゼ発現が細胞内に取り込まれた後の細胞内動態に関連することを示唆している。

（９）共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）による複合体微粒子の細胞内分布の観察
ＮＳＣおよびＳＣ（Ｓｉ濃度：３０ｍＭ）ポリプレックスの細胞内動態（特にエンドソーム脱出）をＣＬＳＭにより比較した。具体的には、ｐＤＮＡをＣｙ５（赤色）で標識化し、後期エンドソーム／リソソームをＬｙｓｏＴＲａｃｋｅｒ（緑色）で染色した。したがって、後期エンドソーム／リソソームと共に局在化したｐＤＮＡは黄色として観察される。詳細な実験手順は以下のとおりである。Ｈｕｈ−７細胞（５００００細胞）を３５ｍｍガラスシャーレに播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ ２ｍＬ中で終夜培養した。翌日、培地を新鮮な培地（２ｍＬ）と交換し、Ｃｙ５で標識化されたｐＤＮＡ ５μｇを含むポリプレックス溶液を、ガラスシャーレに添加した。２４時間培養した後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。酸性後期エンドソームおよびリソソームをＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）で染色した後、ポリプレックスの細胞内分布をＣＬＳＭにより観察した。ＣＬＳＭ観察は、６３倍対物レンズ(Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を備えたＬＳＭ５１０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（緑色）については励起波長４８８ｎｍ（Ａｒレーザー）で、Ｃｙ５（赤色）については励起波長６３３ｎｍ（Ｈｅ−Ｎｅレーザー）でそれぞれ行った。図１１Ａおよび図１１Ｂは、それぞれ、ＮＳＣおよびＳＣ（Ｓｉ濃度：３０ｍＭ）ポリプレックスを添加してから２４時間後に得られた共焦点蛍光画像を示す。図１１Ａに比べて、図１１Ｂは黄色の領域が顕著に少なく、ほとんど観察されなかった。このことは、シリカ被覆層の形成により後期エンドソーム／リソソームに取り込まれたポリプレックス画分が減少したことを示している。さらに、蛍光画像を定量的に分析し、共に局在化した割合を以下のように計算した：
共に局在化した割合（％）＝（黄色の画像数／赤色および黄色の画像数）×１００
結果を図１１Ｃに示す。図１１Ｃに示すように、ＳＣポリプレックスは、ＮＳＣポリプレックスと比較して、顕著に低い後期エンドソーム／リソソームとの共局在化を示す。この結果は、シリカ被覆層の形成がポリプレックスのエンドソーム脱出を促進し、トランスフェクション効率を高めることを強く示唆している。エンドソーム脱出が促進されるにもかかわらずＳＣポリプレックスにおいて遺伝子発現の開始の遅延（図９）が見られたことから、細胞内でのポリプレックス表面のシリカ層の崩壊に要する時間に対応し、ＳＣポリプレックスからのｐＤＮＡの放出には時間がかかり得ることが示唆される。
エンドソームの酸性環境においては、シリカ層はプロトン化されて以下の平衡状態にあると推定される：
ＳｉＯ⁻ ＋ Ｈ^＋ ⇔ ＳｉＯＨ
実際、図１２は、ｐＨ（シリカのプロトン化に対応する）が減少するにしたがってＳＣポリプレックスのζ電位が増加することを明確に示している。エンドソームでのシリカのプロトン化により、エンドソーム膜を介したナトリウムイオンの放出と塩化物イオンを伴うプロトンの流入とが誘導され、その結果、エンドソーム内浸透圧が増大し、エンドソーム膜を崩壊させると推定される（プロトンスポンジ効果）。

（１０）細胞毒性アッセイ
ＮＳＣおよびＳＣ（Ｓｉ濃度＝３０ｍＭ）ポリプレックス溶液について、種々の時間での細胞生存率を調べることにより細胞毒性を評価した。可溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−８）を含むＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所社製）を用いた定量比色アッセイにより、各ポリプレックスの細胞毒性を評価した。Ｈｕｈ−７細胞（２００００細胞）を２４ウェル培養プレートに播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ ４００μＬ中で終夜培養した。次いで、培地を、１０％ＦＢＳと１μｇのｐＤＮＡを含む各ポリプレックス溶液とを含む新鮮な培地（４００μＬ）と交換した。６時間、２２時間および４４時間培養した後、培地を、１０％ＦＢＳおよび１０％ＷＳＴ−８を含む培地（４００μＬ）と交換し、３７℃で２時間培養した。４５０ｎｍフィルター（Ｍｏｄｅｌ ６８０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を備えたマイクロプレートリーダーを用いて、ＷＳＴ−８の還元により生成したホルマザンの吸光度を各ウェルについて測定した。得られた値（ｎ＝４）から細胞生存率を、ポリプレックスを有さないコントロールウェルの百分率として計算した。ＮＳＣおよびＳＣポリプレックスの両方について、４４時間で、ポリプレックスを有さないコントロール細胞に対して９０％以上の細胞生存率が維持された。このことは、ＳＣポリプレックスの細胞毒性が低いことを示している。

＜実施例９〜１２：複合体微粒子の調製＞
以下のカチオン性ポリマーを用いて実施例１と同様にしてコア粒子（ＰＩＣ）を形成し、当該ＰＩＣから、Ｓｉ濃度３０ｍＭで、実施例１と同様にして複合体微粒子（ＳＣポリプレックス）を調製した：
・グアニジン化ポリリジン（ＰＬｙｓ（Ｇ））（ＰＬｙｓ（Ｇ）のＤＰ＝５０、Ｎ／Ｐ＝２）
・ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ＰＬｙｓ（Ｇ）ブロック共重合体（ＰＥＧの分子量＝１２，０００、ＰＬｙｓ（Ｇ）のＤＰ＝４３、Ｎ／Ｐ＝２）
・ＰＥＧ−ＰＬｙｓブロック共重合体（ＰＥＧの分子量＝１２，０００、ＰＬｙｓのＤＰ＝４３、Ｎ／Ｐ＝２）
・１，２−ジアミノメタン側鎖を有するＰＥＧ−ポリアスパルタミド誘導体（ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））（ＰＥＧの分子量＝１２，０００、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）のＤＰ＝６８、Ｎ／Ｐ＝８）

それぞれのＳＣポリプレックスおよび対応するＮＳＣポリプレックスのＩｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率を、Ｈｕｈ−７細胞についてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）およびルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いるルシフェラーゼアッセイにより決定した。Ｈｕｈ−７細胞を２４ウェル皿に播種した（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ ４００μＬ中に２００００細胞／ウェル）。２４時間培養した後、培地を、１０％ＦＢＳと１μｇのｐＤＮＡを含むポリプレックス溶液（シリカ被覆から２時間後）とを含む新鮮な培地と交換した。細胞をポリプレックスで４８時間インキュベートし、続いてルシフェラーゼアッセイを行った。それぞれのＳＣポリプレックスおよび対応するＮＳＣポリプレックスについて、ルシフェラーゼ発現量を比較して示すグラフを図１３に示す。白い棒がＮＳＣポリプレックスの結果であり、グレーの棒がＳＣポリプレックスの結果である。図１３から明らかなように、いずれのポリプレックスについても、シリカ被覆層を形成することによりトランスフェクション効率が格段に増大する。カチオン性ポリマーがＰＬｙｓ（Ｇ）であるＳＣポリプレックスのトランスフェクション効率が最も高いことが示された。

本発明の複合体微粒子および薬学組成物は、製薬、医療等の分野で好適に用いられ得る。

Claims (12)

1. カチオン性ポリマーおよび核酸を含むコア粒子と、
   シリカで構成された、該コア粒子を被覆する被覆層と
   を有する、複合体微粒子。
2. 前記カチオン性ポリマーが、ポリアルギニン（ＰＡｒｇ）、ポリリジン（ＰＬｙｓ）、グアニジン化ポリリジン（ＰＬｙｓ（Ｇ））、ポリ｛Ｎ−［Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル]アスパルタミド｝（ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））、ポリオルニチンおよびポリエチレンイミンからなる群から選択される、請求項１に記載の複合体微粒子。
3. 前記核酸が、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡおよびｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１または２に記載の複合体微粒子。
4. 前記被覆層の厚みが３ｎｍ〜２５ｎｍである、請求項１から３のいずれかに記載の複合体微粒子。
5. 直径が５０ｎｍ〜５００ｎｍである、請求項１から４のいずれかに記載の複合体微粒子。
6. 中性のｐＨ環境における表面のζ電位が０ｍＶより小さく−３０ｍＶまでである、請求項１から５のいずれかに記載の複合体微粒子。
7. 前記コア粒子の直径に対する複合体微粒子の直径の比が、１００％を超えて１５０％以下であり、かつ、中性のｐＨ環境における表面のζ電位が−１０ｍＶ〜−２５ｍＶである、請求項１から６のいずれかに記載の複合体微粒子。
8. カチオン性ポリマーと核酸とを混合し、コア粒子となる複合体を形成すること、および
   該複合体とケイ酸塩溶液とを混合し、該複合体の表面にシリカで構成される被覆層を形成すること
   を含む、複合体微粒子の製造方法。
9. 前記核酸のアニオン性リン酸基に対する前記カチオン性ポリマーのカチオン性基のモル比が１より大きい、請求項８に記載の製造方法。
10. 前記ケイ酸塩溶液の濃度が５ｍＭ〜６０ｍＭである、請求項８または９に記載の製造方法。
11. 請求項１から７のいずれかに記載の複合体微粒子と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、薬学組成物。
12. 請求項１から７のいずれかに記載の複合体微粒子を哺乳動物の細胞に接触させることを含む、哺乳動物細胞への核酸の送達方法。