JPWO2014038662A1 - 海産魚の類結節症に対するdnaワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書における「類結節症」とは、P. damselae subsp. piscicidaの感染により引き起こされる類結節症を意味し、従って、ブリ類において発症した類結節症が含まれるだけでなく、ブリ類以外の魚類[例えば、スズキ目に属する魚類(クロダイ、マダイ、キジハタ等)、キュウリウオ目に属する魚類(アユ等)、フグ目に属する魚種(ウマヅラハギ等)等]において同原因菌によって発症したパスツレラ症が含まれる。
[1]フォトバクテリウム・ダムセラエ亜種ピシシダに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくはその配列をヒラメのコドン使用頻度を元に改変したヌクレオチド配列を含むDNA、又は前記DNAを含む発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする、[1]の魚類用DNAワクチン、
[2]前記免疫原性ポリペプチドが、フォトバクテリウム・ダムセラエ亜種ピシシダのppa1、ppa2およびppars1からなる群から選んだ遺伝子にコードされているポリペプチド又はその部分断片である、[1]の魚類用DNAワクチン、
[3]前記免疫原性ポリペプチドが、配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分断片である、[2]の魚類用DNAワクチン、
[4]前記免疫原性ポリペプチドが、(1)配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、(2)配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、フォトバクテリウム・ダムセラエ亜種ピシシダに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、若しくは(3)配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であり、しかも、フォトバクテリウム・ダムセラエ亜種ピシシダに対する免疫原性を有する相同ポリペプチド、又はそれらの部分断片である、[1]の魚類用DNAワクチン、
[5]前記ヌクレオチド配列が、(1)配列番号1、3、5、7、9又は11で表されるヌクレオチド配列、若しくは(2)配列番号1、3、5、7、9又は11で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、フォトバクテリウム・ダムセラエ亜種ピシシダに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそれらの部分配列である、[1]の魚類用DNAワクチン、
[6]前記発現ベクターが、天然型遺伝子を含むプラスミドwild-ppa1、wild-ppa2若しくはwild-ppars1、又は改変遺伝子を含むプラスミドopt-ppa1、opt-ppa2若しくはopt-ppars1である、[1]の魚類用DNAワクチン、
[7][1]〜[6]のいずれかの魚類用DNAワクチンを魚に投与することを特徴とする、類結節症の予防又は治療方法、
[8]前記魚がスズキ目、フグ目又はキュウリウオ目に属する魚である、[7]の方法、
[9][1]〜[6]のいずれかの魚類用DNAワクチンの、海産魚の類結節症に対する免疫応答の誘発への使用
に関する。
魚類用DNAワクチン用の、あるいは、類結節症の予防又は治療用の、フォトバクテリウム・ダムセラエ亜種ピシシダに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は前記DNAを含む発現ベクター、
フォトバクテリウム・ダムセラエ亜種ピシシダに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は前記DNAを含む発現ベクターの、魚類用DNAワクチンの製造のための使用
に関する。
(a)P. damselae subsp. piscicidaに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は
(b)前記DNA(a)を含む発現ベクター
が含まれる。前記DNA(a)は、免疫原性ポリペプチドの発現に必要な各種の調節配列を更に含むことができ、前記発現ベクター(b)も、前記調節配列を含むことができる。
(1)PCRプライマーの作製
P. damselae subsp. piscicida由来ppa1遺伝子(配列番号1)、ppa2遺伝子(配列番号3)およびppars1遺伝子(配列番号5)に対応するDNAの塩基配列から下記のPCRプライマーを、常法に従い、作製した。
ppa1-forward = 5' CGGAATTCACCATGAATCGTAAAGTAACTA 3'(配列番号 13)
ppa1-reverse = 5' CCGCTCGAGCTTAGTGTAAGAACCAC 3'(配列番号 14)
ppa2-forward = 5' CGGAATTCACCATGAGAAAACCTCTGCTTG 3'(配列番号 15)
ppa2-reverse = 5' CCGCTCGAGACGCATGATTAAATACA 3'(配列番号 16)
ppars1-forward = 5' CGGAATTCACCATGTCTAAAGTTCGTTATG 3'(配列番号 17)
ppars1-reverse = 5' CCGCTCGAGTTCAGCAAGAACTTGAG 3'(配列番号 18)
P. damselae subsp. piscicida TUMSAT-PPE05-02株を2%食塩調製したHI液体培地に植菌し、25℃で一晩振盪培養した。これを集菌し、抽出用溶媒(0.5%SDS, 0.016mg/mL protease K)中で溶解後、37℃で1時間処理した。次に5mol/L NaCl100μLおよびCTAB/NaCl84μLを加えてよく混和し65℃で10分間処理した。等量のイソプロパノール-クロロホルム、PCI600μL、99%エタノールを順に用いてこれを精製し、上層を捨てペレット状態となったゲノミックDNAを乾燥させ、TE buffer30μLに溶解した。
その増幅されたDNA断片をpGEM-T Eazyベクター (プロメガ社製)へと挿入し、蛍光標識されたM13プライマー(日清紡績社製)及び市販のシークエンスキット(Thermo Sequence Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit with 7-deaza-dGTP;amersham pharmacia bitech社製) を用いてダイデオキシ法(Dideoxy method)でサンプルを作成した後、DNAシークエンサー(DNA sequencer model 4000;LI-COR社製)を用いて塩基配列を決定した。この配列を解析したところ、PCRで増幅されたDNA断片は、249bp(ppa1)、1356bp(ppa2)あるいは996bp(ppars1)からなるオープンリーディングフレーム(ORF)が存在した(配列番号1、3および5)。このORFから予測されるタンパク質は、89アミノ酸残基、462アミノ酸残基ならびに341アミノ酸残基であった。
(1)改変配列を用いた人工遺伝子の作製
どの生物種においてもアミノ酸を指定するがコドンは複数存在し、その使用頻度が異なる。そこで、P. damselae subsp. piscicidaおよびヒラメのコドン使用頻度をもとに塩基配列を改変したppa1遺伝子(配列番号7)、ppa2遺伝子(配列番号9)およびppars1遺伝子(配列番号11)を人工的に合成しプラスミドへと挿入した。
実施例1(3)および実施例2(1)のDNA塩基配列の解析で用いたプラスミドをEcoRI及XhoIで処理した。そして、各ベクターから切り出されたP. damselae subsp. piscicida TUMSAT-PPE05-02株由来又は人工遺伝子のppa1遺伝子、ppa2遺伝子およびppars1遺伝子を、pcDNA3.1/myc-hisベクター (インビトロジェン社製)のヒトサイトメガロウイルス由来のプロモーター領域がコードされている配列の下流に位置するマルチクローニングサイトのEcoRI及びXhoI認識部位へ挿入し、プラスミドwild-ppa1、wild-ppa2、wild-ppars1、opt-ppa1、opt-ppa2およびopt-ppars1を作製した。
ヒラメ一尾当たり10.0μgのwild-ppa1、wild-ppa2、wild-ppars1、opt-ppa1、opt-ppa2およびopt-ppars1をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)100μLとともに、29Gの注射針を装着した注射器を用いて筋肉へと接種した。
各試験区には、ヒラメ稚魚(全長約8cm、平均魚体重10.0g)を用いた。試験魚は、60Lの水槽で、人工海水を循環して飼育し、平均水温19.0℃で飼育した。
まず、実施例4の方法に準じてwild-ppa1、wild-ppa2、wild-ppars1、opt-ppa1、opt-ppa2およびopt-ppars1 10.0μg、コントロールとしてPBS 100μL、pcDNA3.1ベクター10.0μgをそれぞれヒラメへ接種した。その接種の30日後に、実施例1(2)の条件と同様に2%食塩濃度調製したHI液体培地で培養したP. damselae subsp. piscicida TUMSAT-PPE05-02株の培養液を、人工海水を用いて1.0×105cfu/mLまで希釈した濃度で、30分間浸漬感染した。感染防御試験を行った区画は、次の通りである。
試験区1:wild-ppa1 10.0μg/ヒラメ1尾+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. piscicida TUMSAT-PPE05-02株
試験区2:wild-ppa2 10.0μg/ヒラメ1尾+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. piscicida TUMSAT-PPE05-02株
試験区3:wild-ppars1 10.0μg/ヒラメ1尾+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. piscicida TUMSAT-PPE05-02株
試験区4:opt-ppa1 10.0μg/ヒラメ1尾+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. piscicida TUMSAT-PPE05-02株
試験区5:opt-ppa2 10.0μg/ヒラメ1尾+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. piscicida TUMSAT-PPE05-02株
試験区6:opt-ppars1 10.0μg/ヒラメ1尾+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. piscicida TUMSAT-PPE05-02株
試験区7:pcDNA3.1/myc-hisベクター 10.0μg/ヒラメ1尾+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. piscicida TUMSAT-PPE05-02株
試験区8:PBS 100μL/ヒラメ1尾+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. piscicida TUMSAT-PPE05-02株
RPS={1−(X/C)}×100
[式中、記号Xは「ワクチン接種区の死亡率(%)」であり、Cは「陰性コントロール区の死亡率(%)」である]
ワクチンの効果は、その比較によって判定した。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (9)
- フォトバクテリウム・ダムセラエ亜種ピシシダ(Photobacterium damselae subsp. piscicida)に対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、若しくはその配列をヒラメのコドン使用頻度を元に改変したヌクレオチド配列を含むDNA、又は前記DNAを含む発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする、魚類用DNAワクチン。
- 前記免疫原性ポリペプチドが、フォトバクテリウム・ダムセラエ亜種ピシシダのppa1、ppa2およびppars1からなる群から選んだ遺伝子にコードされているポリペプチド又はその部分断片である、請求項1に記載の魚類用DNAワクチン。
- 前記免疫原性ポリペプチドが、配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分断片である、請求項2に記載の魚類用DNAワクチン。
- 前記免疫原性ポリペプチドが、(1)配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、(2)配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、フォトバクテリウム・ダムセラエ亜種ピシシダに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、若しくは(3)配列番号2,5又は8で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であり、しかも、フォトバクテリウム・ダムセラエ亜種ピスシシダに対する免疫原性を有する相同ポリペプチド、又はそれらの部分断片である、請求項1に記載の魚類用DNAワクチン。
- 前記ヌクレオチド配列が、(1)配列番号1、3、5、7、9又は11で表されるヌクレオチド配列、若しくは(2)1、3、5、7、9又は11で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、フォトバクテリウム・ダムセラエ亜種ピシシダに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそれらの部分配列である、請求項1に記載の魚類用DNAワクチン。
- 前記発現ベクターが、天然型遺伝子を含むプラスミドwild-ppa1、wild-ppa2若しくはwild-pars1、又は改変遺伝子を含むプラスミドopt-ppa1、opt-ppa2若しくはopt-ppars1である、請求項1に記載の魚類用DNAワクチン。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の魚類用DNAワクチンを魚に投与することを特徴とする、類結節症の予防又は治療方法。
- 前記魚がスズキ目、フグ目又はキュウリウオ目に属する魚である、請求項7に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の魚類用DNAワクチンの、海産魚の類結節症に対する免疫応答の誘発への使用。
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