ES2675020T3 - Vectores basados en Salmonella para inmunoterapia del cáncer dirigida al gen WT1 del tumor de Wilms - Google Patents

Vectores basados en Salmonella para inmunoterapia del cáncer dirigida al gen WT1 del tumor de Wilms Download PDF

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Abstract

Una cepa mutante atenuada de Salmonella que comprende al menos una copia de una molécula de ADN recombinante que comprende un casete de expresión eucariota que codifica la proteína tumoral de Wilms (WT1).

Description

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DESCRIPCION
Vectores basados en Salmonella para inmunoterapia del cáncer dirigida al gen WT1 del tumor de Wilms Campo de la invención
La presente invención se refiere a una cepa mutante atenuada de Salmonella que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende un casete de expresión eucariota que codifica la Proteína 1 del tumor de Wilms. En particular, la presente invención se refiere al uso de dicha cepa mutante atenuada de Salmonella en inmunoterapia contra el cáncer.
Antecedentes de la invención
El gen 1 del tumor de Wilms (WT1) codifica un factor de transcripción del dedo de zinc implicado en la diferenciación y proliferación celular. Éste se expresa altamente en una amplia variedad de neoplasias que incluyen varios tipos de neoplasias hematológicas y varios tumores sólidos. Por el contrario, la expresión del tejido normal de WT1 en adultos está restringida a células de las gónadas, útero, riñón, mesotelio y células progenitoras CD34+ en varios tipos de tejidos. WT1 se propuso al principio como un gen supresor de tumores. Sin embargo, pruebas más recientes apuntan hacia funciones oncogénicas de este factor de transcripción; Wt-1 afecta negativamente a la diferenciación y promueve la proliferación de células progenitoras. Además, WT1 sobreexpresado es inmunogénico; se han observado células T específicas de WT1 así como anticuerpos anti-WT1 de IgG en pacientes con cáncer. Por tanto, WT1 es un candidato prometedor para el desarrollo de vacunas contra el cáncer.
Se han presentado ensayos cínicos en seres humanos con vacunas WT1 basadas en fragmentos del péptido de WT1 restringida a HLA (antígenos leucocitarios humanos). Osada et al., Clin Cancer Res 2009;15:2789-2796, divulga una Vacuna de Adenovirus que codifica a WT1.
Para el conocimiento del inventor, no se había presentado una vacuna contra el cáncer de bacterias vivas dirigidas a WT1. Además, no se había descrito ninguna vacuna oral contra el cáncer dirigida a WT1.
Los derivados atenuados de Salmonella enterica son vehículos de transporte atractivos de antígenos heterólogos para el sistema inmunológico de mamíferos, ya que las cepas de S. enterica se pueden suministrar de manera potencial a través de vías de inmunización mediante mucosas, es decir, de manera oral o nasal, que ofrecen ventajas de simplicidad y seguridad en comparación con la administración parenteral. Además, las cepas de Salmonella producen fuertes respuestas inmunológicas humorales y celulares a nivel de los compartimentos tanto sistémicos como mucosales. Los costes de preparación de los lotes son relativamente bajos y las formulaciones de vacunas bacterianas vivas son altamente estables. La atenuación se puede realizar mediante la deleción de varios genes, que incluyen genes virulentos, reguladores, y metabólicos.
Se ha demostrado que varias cepas atenuadas de Salmonella typhimurium por mutaciones aro son vehículos de administración seguros y eficaces en modelos animales.
En WO 03/073995 se describen métodos para administrar construcciones de ADN que codifican antígenos, en particular proteínas del receptor VEGF, a través de cepas de Salmonella typhimurium vivas atenuadas en células diana de ratón. Niethammer et al., (Nature Medicine 2002, 8(12), 1369) demostró que la cepa SL7207 de S. typhimurium aroA alberga un vector de expresión que codifica el receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular murino (VEGFR-2 o FLK-1), el cual es esencial para la angiogénesis tumoral, es funcional como una vacuna contra el cáncer.
Sin embargo sólo hay una cepa serovar de Salmonella enterica atenuada, denominada Salmonella enterica serovar typhi Ty21a (abreviado: S. typhi Ty21a), que se haya aceptado para el uso en seres humanos y que se distribuye bajo el nombre comercial de Vivotif® (Berna Biotech Ltd., una empresa de Crucell, Suiza; autorización de comercialización número PL 15747/0001 con fecha del 16 de Diciembre de 1996).
Esta vacuna oral viva bien tolerada contra la fiebre tifoidea se obtuvo del aislado de la cepa bacteriana virulenta S. typhi Ty2 de tipo salvaje mediante mutagénesis química y alberga un gen ga/E con una mutación con pérdida funcional, así como otras mutaciones menos definidas. Se ha autorizado como vacuna tifoidea en muchos países después de demostrar ser eficaz y segura en ensayos clínicos.
WT1 es un antígeno tumoral prometedor para el desarrollo de vacunas contra el cáncer. Las principales limitaciones de las vacunas de péptidos WT1 previamente disponibles son la restricción de HLA y la administración parenteral. Hasta el momento no se ha conseguido la enorme necesidad de mejorar los métodos terapéuticos contra el cáncer en base a la focalización hacia el WT1.
Objetivos de la invención
En vista de la técnica anterior, es un objetivo de la presente invención proporcionar una nueva vacuna oral contra el cáncer dirigida a WT1. Tal vacuna contra el cáncer dirigida a WT1 ofrecería importantes ventajas para mejorar las opciones de tratamiento para pacientes con cáncer.
Compendio de la invención
En un aspecto, la presente invención se refiere a una cepa mutante atenuada de Salmonella que comprende al menos una copia de una molécula de ADN recombinante que comprende un casete de expresión eucariota que codifica la Proteína del Tumor de Wilms (WT1).
5 La cepa de Salmonella atenuada de la presente invención ha demostrado presentar actividad antitumoral en un modelo murino expuesto a células de leucemia murinas. Según el conocimiento del inventor, esta nueva cepa de Salmonella atenuada es la primera vacuna bacteriana viva contra el cáncer dirigida a WT1. Además, la cepa de Salmonella atenuada de la presente invención es la primera vacuna contra el cáncer oral dirigida a WT1. Ya que WT1 se sobreexpresa en una gran variedad de neoplasias hematológicas y tumores sólidos, la cepa de Salmonella 10 atenuada de la presente invención tiene un gran potencial como vacuna universal contra el cáncer.
En un primer estudio, la vacuna según la presente invención (VXM06) ha demostrado prolongar la supervivencia de manera eficaz de los ratones que portan células de leucemia implantadas de manera intraperitoneal. Estos resultados indican que la vacunación con VXM06 puede conducir a una respuesta inmunológica y al desarrollo de una memoria inmunológica contra células tumorales que sobreexpresan WT1. Es notable y sorprendente que la 15 nueva vacuna VXM06 sea eficaz a concentraciones relativamente bajas. La cepa mutante de Salmonella atenuada de la presente memoria se puede aplicar en monoterapia o en combinación con una segunda cepa mutante atenuada de Salmonella que comprende una molécula de ADN que codifica un segundo antígeno tumoral. Además, la cepa mutante atenuada de la presente invención se puede administrar en combinación con quimioterapia, radioterapia, o terapia biológica contra el cáncer. El tratamiento con VXM06 puede ser también eficaz, si el paciente 20 ha desarrollado una resistencia a la quimioterapia (pacientes quimio-refractarios). La nueva cepa de Salmonella atenuada de la presente invención puede, por lo tanto, ser útil en nuevos métodos de terapia contra el cáncer mejorados.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella es de las especies Salmonella enterica. En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella es Salmonella Typhi Ty21a.
25 Según la invención, el casete de expresión es un casete de expresión eucariota.
En realizaciones particulares, WT1 es WT1 humano.
En realizaciones particulares, WT1 está truncado. En realizaciones particulares, se elimina el dominio del dedo de zinc de WT1. En realizaciones particulares, el WT1 truncado tiene la secuencia de aminoácidos como se encuentra en SEQ ID NO:1.
30 En realizaciones particulares, la molécula de ADN recombinante comprende el gen de resistencia al antibiótico kanamicina, el ori pMB1, y un casete de expresión eucariota que codifica WT1 humano, particularmente el WT1 humano truncado, bajo el control de un promotor de CMV. En realizaciones particulares, la molécula de ADN recombinante es una plásmido denominado pVAX10.hWT1 y tiene la secuencia de ácidos nucleicos como se encuentra en SEQ ID NO:2.
35 En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella es para su uso como un medicamento.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella es para su uso como una vacuna.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella es para su uso en inmunoterapia contra el cáncer.
En realizaciones particulares, la inmunoterapia contra el cáncer comprende la administración de una o más cepas 40 mutantes atenuadas adicionales de Salmonella que comprende al menos una copia de una molécula de ADN recombinante que comprende un casete de expresión que codifica un antígeno tumoral y/o un antígeno del estroma tumoral. En realizaciones particulares, dicha una o más cepas mutantes atenuadas adicionales de Salmonella es/son Salmonella typhi Ty21a que comprende un casete de expresión eucariota. En realizaciones particulares, dicha una o más cepas de Salmonella comprende o comprenden una cepa o cepas mutantes atenuadas de 45 Salmonella que codifica el VEGFR-2 humano.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella se co-administra con dicha una o más cepas mutantes atenuadas adicionales de Salmonella.
En realizaciones particulares, la inmunoterapia contra el cáncer se combina con quimioterapia, radioterapia o terapia biológica contra el cáncer.
50 En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella se administra durante el ciclo de tratamiento de quimioterapia o radioterapia o durante la terapia biológica contra el cáncer.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella se administra antes del ciclo de tratamiento de quimioterapia o radioterapia o antes de la terapia biológica contra el cáncer.
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En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella se administra después del ciclo de tratamiento de quimioterapia o radioterapia o después de la terapia biológica contra el cáncer.
En otras realizaciones, la cepa mutante atenuada de Salmonella se administra antes y durante al menos un ciclo de tratamiento de quimioterapia o radioterapia y de la terapia biológica contra el cáncer. En casos donde se lleven a cabo más de una terapia de quimioterapia, radioterapia y terapia biológica contra el cáncer, la cepa mutante atenuada de Salmonella se puede administrar antes o durante, o antes y durante al menos una de estas terapias, particularmente durante al menos dos de estas terapias.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella se administra por vía oral.
En realizaciones particulares, el cáncer se selecciona de leucemia, particularmente de leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia linfoide aguda (LLA), y de tumores sólidos, particularmente de cáncer de pulmón, cáncer de mama, esófago, colon, colorrectal, gástrico, colangiocarcinoma, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, sarcoma sinovial, angiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de tiroides, cervical, endometrial, cáncer de ovario, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de próstata.
En realizaciones particulares, la dosis única es de aproximadamente 105 a aproximadamente 1011, particularmente de aproximadamente 106 a aproximadamente 1010, más particularmente de aproximadamente 106 a aproximadamente 109, más particularmente de aproximadamente 106 a aproximadamente 108, más particularmente de aproximadamente 106 a aproximadamente 107 unidades formadoras de colonias (UFC).
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella es para el uso en inmunoterapia personalizada contra el cáncer que comprende la etapa de evaluar el patrón de expresión del antígeno tumoral y/o el patrón de expresión del antígeno del estroma de un paciente.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se puede entender más fácilmente en referencia a la siguiente descripción detallada y a los ejemplos incluidos en la ella.
En un aspecto, la presente invención se refiere a una cepa mutante atenuada de Salmonella que comprende al menos una copia de una molécula de ADN recombinante que comprende un casete de expresión eucariota que codifica la proteína tumoral de Wilms (WT1).
Según la invención, la cepa atenuada de Salmonella funciona como el portador bacteriano de la molécula de ADN recombinante que comprende un casete de expresión que codifica la proteína tumoral de Wilms (WT1) para la administración de dicha molécula de ADN recombinante a una célula diana.
En el contexto de la presente invención, el término "atenuado" se refiere a una cepa bacteriana de virulencia reducida en comparación con la cepa bacteriana parental, que no alberga la mutación atenuante. Las cepas bacterianas atenuadas han perdido preferiblemente su virulencia pero conservan su capacidad para inducir inmunidad protectora. La atenuación puede lograrse mediante la eliminación de varios genes, incluidos la virulencia, los genes reguladores y metabólicos. Las bacterias atenuadas pueden encontrarse de forma natural o pueden producirse artificialmente en el laboratorio, por ejemplo, mediante la adaptación a un nuevo medio o cultivo celular o pueden producirse mediante tecnología de ADN recombinante.
En el contexto de la presente invención, el término “cepa mutante” se refiere a una cepa bacteriana que alberga una mutación en su genoma. En este contexto, el término “mutación” se refiere a un cambio en una secuencia de ácido nucleico, que incluye mutaciones puntuales, inserciones, deleciones, translocaciones e inversiones.
En el contexto de la presente invención, el término “comprende” o "que comprende" significa “que incluye, pero no se limita a”. El término está destinado a ser de composición abierta, para especificar la presencia de determinadas características, elementos, números enteros, etapas o componentes, pero no para excluir la presencia o adición de una o más características, elementos, números enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos. El término “que comprende” incluye, por tanto, los términos más restrictivos “que consiste en” y “que consiste esencialmente en”. En una realización, el término “que comprende” tal como se usa a lo largo de la solicitud y en particular dentro de las reivindicaciones, se puede reemplazar por el término “que consiste en”.
En el contexto de la presente invención, el término “molécula de ADN recombinante” se refiere a una construcción de ADN modificada genéticamente, compuesta preferiblemente de fragmentos de ADN de origen diferente. La molécula de ADN recombinante puede ser un ácido nucleico lineal, o preferiblemente, un plásmido de ADN recombinante circular generado al introducir un marco de lectura abierto que codifica WT1 en un plásmido de vector de expresión.
En el contexto de la presente invención, el término "casete de expresión" se refiere a una unidad de ácido nucleico que comprende al menos el gen WT1 bajo el control de secuencias reguladoras que controlan su expresión. El casete de expresión comprendido en la cepa mutante atenuada de Salmonella puede mediar preferiblemente la
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transcripción del marco de lectura abierto incluido que codifica WT1 en una célula diana. Los casetes de expresión comprenden normalmente un promotor, al menos un marco de lectura abierto, y una señal de terminación de la transcripción.
La proteína 1 del tumor de Wilms del factor de transcripción del dedo de zinc está codificada por el gen WT1. Contiene cuatro motivos de dedo de cinc en el extremo C y un dominio de unión a ADN rico en prolina/glutamina en el extremo N-terminal. Se han caracterizado bien varias variantes de transcripción, resultantes del splicing alternativo en dos exones codificantes. WT1 juega un papel esencial en el desarrollo del sistema urogenital y está involucrado en la proliferación y diferenciación celular. El gen WT1 se aisló como el gen responsable de una neoplasia renal infantil, el tumor de Wilms. Está altamente expresado en una amplia variedad de neoplasias que incluyen varios tipos de neoplasias hematológicas y varios tumores sólidos. Por el contrario, la expresión tisular normal de WT1 en adultos está restringida a células de las gónadas, útero, riñón, mesotelio y células progenitoras en varios tipos de tejidos. Debido a su perfil de expresión, sus funciones oncogénicas y su potencial inmunogénico, el antígeno tumoral WT1 es un candidato prometedor para el desarrollo de vacunas contra el cáncer.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella es de la especie Salmonella enterica. En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella es Salmonella typhi Ty21a. La cepa S. typhi Ty21a atenuada es el componente activo de Typhoral L®, también conocido como Vivotif® (fabricado por Berna Biotech Ltd., una compañía de Crucell, Suiza). Actualmente es la única vacuna oral viva con licencia contra la fiebre tifoidea. Esta vacuna ha sido ampliamente probada y ha demostrado ser segura con respecto a la toxicidad del paciente, así como a la transmisión a terceros (Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295). La vacuna tiene licencia en más de 40 países. El número de autorización de comercialización de Typhoral L® es PL 15747/0001 con fecha del 16 de diciembre de 1996. Una dosis de vacuna contiene al menos 2x109 unidades formadoras de colonias S. typhi Ty21a viables, y al menos 5x109 células S. typhi Ty21a no viables.
Una de las propiedades bioquímicas de la cepa bacteriana Ty21a de Salmonella typhi es su incapacidad para metabolizar galactosa. La cepa bacteriana atenuada tampoco es capaz de reducir el sulfato a sulfuro, lo que la diferencia de la cepa Salmonella typhi Ty2 de tipo salvaje. Con respecto a sus características serológicas, la cepa Ty21a de Salmonella typhi contiene el antígeno O9 que es un polisacárido de la membrana externa de la bacteria y carece del antígeno O5, que es a su vez un componente característico de Salmonella typhimurium. Esta característica serológica respalda la lógica para incluir la prueba respectiva en un panel de pruebas de identidad para la liberación de lotes.
En el contexto de la presente invención, el término “casete de expresión eucariota” se refiere a un casete de expresión que permite la expresión del marco de lectura abierto en una célula eucariota. Se ha demostrado que la cantidad de antígeno heterólogo requerida para inducir una respuesta inmunológica adecuada puede ser tóxica para la bacteria y dar como resultado la muerte celular, la sobre-atenuación o la pérdida de expresión del antígeno heterólogo. El uso de un casete de expresión eucariota que no se expresa en el vector bacteriano, sino sólo en la célula diana, puede superar este problema de toxicidad, y la proteína expresada puede presentar un patrón de glucosilación eucariota.
Un casete de expresión eucariota comprende secuencias reguladoras que son capaces de controlar la expresión de un marco de lectura abierto en una célula eucariota, preferiblemente un promotor y una señal de poliadenilación. Los promotores y las señales de poliadenilación incluidos en las moléculas de ADN recombinante comprendidas por la cepa mutante atenuada de Salmonella de la presente invención se seleccionan preferiblemente para que sean funcionales dentro de las células del sujeto a inmunizar. Ejemplos de promotores adecuados, especialmente para la producción de una vacuna de ADN para seres humanos, incluyen, pero no se limitan a, promotores de citomegalovirus (CMV), tales como el potente promotor temprano inmediato de CMV, virus de simio 40 (SV40), virus de tumor mamario de ratón (MMTV), Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), tal como el promotor de Repetición Terminal Larga (LTR) del VIH, virus Moloney, virus Epstein Barr (EBV), y del virus del sarcoma de Rous (RSV), así como promotores de genes humanos, tales como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana, y metalotioneína humana. En una realización particular, el casete de expresión eucariota contiene el promotor de cMv. En el contexto de la presente invención, el término “promotor de CMV” se refiere al promotor potente de citomegalovirus temprano inmediato.
Ejemplos de señales de poliadenilación adecuadas, especialmente para la producción de una vacuna de ADN para seres humanos, incluyen, pero no se limitan a, el sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH), señales de poliadenilación de SV40, y señales de poliadenilación de LTR. En una realización particular, el casete de expresión eucariota incluido en la molécula de ADN recombinante comprendida por la cepa mutante atenuada de Salmonella de la presente invención, comprende el sitio de poliadenilación BGH.
Además de los elementos reguladores requeridos para la expresión del gen WT1 heterólogo, como un promotor y una señal de poliadenilación, también se pueden incluir otros elementos en la molécula de ADN recombinante. Dichos elementos adicionales incluyen potenciadores. El potenciador puede ser, por ejemplo, el potenciador de actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y potenciadores virales, tales como los de CMV, RSV y EBV.
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Las secuencias reguladoras y los codones son generalmente dependientes de las especies, por lo que para maximizar la producción de proteínas, las secuencias reguladoras y los codones se seleccionan preferiblemente para que sean eficaces en las especies a inmunizar. El experto en la materia puede producir moléculas de ADN recombinante que son funcionales en una especie dada del sujeto.
En realizaciones particulares, WT1 es WT1 humana.
En este contexto, el término “aproximadamente” o “alrededor” significa dentro de 80% a 120%, alternativamente dentro de 90% a 110%, que incluye dentro de 95% a 105% de un valor o intervalo dado.
La proteína puede ser de origen natural, por ejemplo, un homólogo de WT1 de una especie diferente, o una proteína modificada genéticamente, por ejemplo, un derivado de WT1 modificado por ingeniería genética. Se sabe que el uso de codones es diferente entre especies. Por lo tanto, cuando se expresa una proteína heteróloga en una célula diana, puede ser necesario, o al menos útil, adaptar la secuencia de ácido nucleico al uso del codon de la célula diana. Los métodos para diseñar y construir derivados de una proteína dada son bien conocidos por cualquier experto en la técnica.
El WT1 humano puede contener una o más mutaciones que comprenden además, una deleción y/o sustitución de uno o más aminoácidos. Los métodos y algoritmos para determinar la identidad de secuencia, que incluyen la comparación de una proteína parental y su derivado que tiene deleciones, adiciones y/o sustituciones con respecto a una secuencia parental, son bien conocidos por los expertos en la técnica. A nivel del ADN, las secuencias de ácido nucleico que codifican WT1 humano pueden diferir en mayor medida debido a la degeneración del código genético.
En realizaciones particulares, WT1 está truncado. En realizaciones particulares, se elimina el dominio del dedo de cinc de WT1. En realizaciones particulares, el WT1 truncado tiene la secuencia de aminoácidos que se encuentra en la SEQ ID NO:1.
El dominio del dedo de zinc en el extremo C terminal de WT1 comprende cuatro motivos de dedo de cinc. El WT1 truncado de la secuencia de aminoácidos que se encuentra en SEQ ID NO:1 representa los aminoácidos 1 a 371 de UniProt ref P19544-7. La eliminación del dominio del dedo de zinc minimiza el riesgo de reactividad cruzada inmunológica con otros dedos de zinc que contienen factores de transcripción. Además, el WT1 truncado que carece del dominio del dedo de zinc tiene un mayor potencial inmunogénico que el WT1 de longitud completa. Además, la eliminación de los motivos del dedo de zinc, que son esenciales para la unión al ADN, anula el potencial oncogénico de WT1, minimizando por tanto el riesgo de oncogénesis.
En realizaciones particulares, la molécula de ADN recombinante comprende el gen de resistencia al antibiótico kanamicina, el ori pMB1, y un casete de expresión eucariota que codifica WT1 humano, particularmente WT1 humano truncado, bajo el control de un promotor de CMV. En realizaciones particulares, la molécula de ADN recombinante es un plásmido denominado pVAX10.hWT1 y tiene la secuencia de ácido nucleico como se encuentra en SEQ ID NO:2.
En realizaciones particulares, la molécula de ADN recombinante se deriva del plásmido de expresión pVAX1™ disponible comercialmente (Invitrogen, San Diego, California). Este vector de expresión se modificó reemplazando el origen de replicación de pUC de alta copia por el origen de replicación de pMB1 de copia baja de pBR322. La modificación de copia baja se realizó para reducir la carga metabólica y hacer la construcción más estable. La estructura del vector de expresión generado se denominó pVAX10. La inserción de WT1 truncado humano en esta estructura del vector de expresión a través de Nhel/Xhol produjo el plásmido de expresión pVAX10.hWT1 que tiene la secuencia de ácido nucleico como se encuentra en SEQ ID NO:2. El plásmido de expresión pVAX10.hWT1 se representa esquemáticamente en la Figura 3.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella es para uso como un medicamento.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella es para uso como una vacuna.
En el contexto de la presente invención, el término “vacuna” se refiere a un agente que es capaz de inducir una respuesta inmunológica en un sujeto tras la administración. Una vacuna puede preferiblemente prevenir, mejorar o tratar una enfermedad. Una vacuna de acuerdo con la presente invención comprende una cepa mutante atenuada de Salmonella, preferiblemente S. typhi Ty21a. La vacuna de acuerdo con la presente invención comprende además al menos una copia de una molécula de ADN recombinante que comprende un casete de expresión eucariota que codifica WT1, preferiblemente seleccionado de WT1. Preferiblemente, dicho WT1 está truncado, particularmente se elimina el dominio del dedo de zinc.
La cepa mutante de Salmonella atenuada viva según la presente invención que comprende una molécula de ADN recombinante que codifica WT1 se puede usar como vehículo para la administración oral de esta molécula de ADN recombinante. Tal vector de administración que comprende una molécula de ADN que codifica un antígeno heterólogo, tal como WT1, se denomina vacuna de ADN.
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La inmunización genética podría ser ventajosa con respecto a la vacunación convencional. El ADN diana puede detectarse durante un período de tiempo considerable actuando, por tanto, como un depósito del antígeno. Los motivos de secuencia en algunos plásmidos, como las islas GpC, son inmunoestimuladores y pueden funcionar como adyuvantes promovidos por la inmunoestimulación debida a LPS y otros componentes bacterianos.
Al contrario de las vacunas peptídicas que sólo pueden mediar la inmunidad contra un pequeño fragmento de la proteína WT1, la vacunación genética puede dar como resultado la inmunidad contra una amplia variedad de epítopos presentes en toda la longitud de la proteína WT1 codificada.
Además de esto, la vacuna peptídica WT1, que se ha usado en la mayoría de los ensayos clínicos, tiene una aplicación limitada debido a la restricción HLA de los péptidos, es decir, su capacidad de unión a moléculas HLA de células presentadoras de antígeno (APCs). Por el contrario, la vacuna de ADN de la presente invención no está restringida por HLA.
Los vectores bacterianos vivos producen sus propios factores inmunomoduladores, tales como lipopolisacáridos (LPS) in situ que pueden constituir una ventaja sobre otras formas de administración, tales como la microencapsulación. Además, el uso de la vía natural de entrada resulta ser beneficioso ya que muchas bacterias, como Salmonella, salen al lumen intestinal a través de las células M de las placas de Peyer y migran finalmente a los ganglios linfáticos y al bazo, permitiendo por tanto dirigir las vacunas a sitios inductivos del sistema inmunológico. La cepa vacunal de Salmonella typhi, Ty21a, ha demostrado tener un excelente perfil de seguridad. Al salir al lumen intestinal a través de las células M, las bacterias son absorbidas por las células fagocíticas, como los macrófagos y las células dendríticas. Estas células son activadas por el patógeno y comienzan a diferenciarse, y probablemente migren hacia los nódulos linfáticos y el bazo. Debido a sus mutaciones atenuantes, las bacterias de la cepa S. typhi Ty21 no son capaces de persistir en estas células fagocíticas pero mueren en este momento. Las moléculas de ADN recombinante se liberan y posteriormente se transfieren al citosol de las células inmunes fagocíticas, ya sea a través de un sistema de transporte específico o mediante una fuga endosómica. Finalmente, las moléculas de ADN recombinante ingresan en el núcleo, donde se transcriben, lo que conduce a la expresión de WT1 en el citosol de las células fagocíticas. Las células T citotóxicas específicas contra WT1 son inducidas por las células presentadoras de antígeno activado.
No hay datos disponibles hasta la fecha que indiquen que S. typhi Ty21a puede entrar en el torrente sanguíneo de manera sistémica. La cepa de la vacuna viva atenuada de Salmonella typhi Ty21a permite, por tanto, dirigirse de manera específica al sistema inmunológico mientras que muestra un excelente perfil de seguridad.
Los derivados atenuados de Salmonella enterica son atractivos como vehículos para la administración de antígenos heterólogos al sistema inmunológico de mamíferos, ya que las cepas de S. enterica pueden administrarse potencialmente a través de las mucosas de inmunización, es decir, por vía oral o nasal, lo que ofrece ventajas de simplicidad y seguridad en comparación con la administración parenteral. Además, las cepas de Salmonella provocan fuertes respuestas inmunológicas humorales y celulares a nivel de los compartimentos tanto sistémicos como mucosales.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella es para uso en inmunoterapia contra el cáncer.
En realizaciones particulares, la inmunoterapia contra el cáncer comprende además la administración de una o más cepas mutantes atenuadas adicionales de Salmonella que comprenden al menos una copia de una molécula de aDn recombinante que comprende un casete de expresión que codifica un antígeno tumoral y/o un antígeno del estroma tumoral. En realizaciones particulares, dicha una o más cepas mutantes adicionales de Salmonella es/son Salmonella typhi Ty21a que comprende un casete de expresión eucariota. En realizaciones particulares, dicha una o más cepas adicionales de Salmonella comprende o comprenden una cepa mutante atenuada de Salmonella que codifica VEGFR-2 humana.
La combinación de la cepa mutante atenuada de Salmonella de la presente invención con una segunda cepa mutante atenuada que comprende una molécula de ADN que codifica un segundo antígeno tumoral, puede tener efectos antitumorales sinérgicos. En particular, la selección simultánea de diferentes antígenos tumorales puede minimizar el riesgo de escape del tumor. La combinación de inmunoterapia contra el cáncer basada en WT1 con inmunoterapia basada en VEGFR-2 puede ser especialmente efectiva, ya que las células tumorales que sobreexpresan WT1 y la vasculatura del tumor son atacadas al mismo tiempo.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella se co-administra con una o más cepas mutantes atenuadas adicionales de Salmonella.
En el contexto de la presente invención, el término “co-administración” o “co-administrar” significa la administración de dos cepas mutantes atenuadas de Salmonella diferentes dentro de tres días consecutivos, más particularmente en dos días consecutivos, más particularmente en el mismo día, más particularmente dentro de las 12 horas. Más particularmente, en el contexto de la presente invención, el término “co-administración” se refiere a la administración simultánea de dos cepas mutantes atenuadas de Salmonella diferentes.
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En realizaciones particulares, la inmunoterapia contra el cáncer se combina con quimioterapia, radioterapia o terapia biológica contra el cáncer. Para la cura del cáncer, la erradicación completa de las células madre del cáncer puede ser esencial. Para una eficacia máxima, puede ser beneficiosa una combinación de diferentes métodos terapéuticos.
En el contexto de la presente invención, el término “terapia biológica contra el cáncer” o “inmunoterapia contra el cáncer” se refiere a la estimulación del sistema inmunológico del paciente para atacar células tumorales malignas o el estroma tumoral. Los enfoques de terapia biológica contra el cáncer incluyen el suministro de antígenos tumorales, el suministro de anticuerpos terapéuticos como fármacos, la administración de citoquinas inmunoestimuladoras, y la administración de células inmunológicas.
Agentes quimioterapéuticos que se pueden usar en combinación con la cepa mutante atenuada de Salmonella de la presente invención pueden ser, por ejemplo: gemcitabina, amifostina (ethyol), cabazitaxel, cisplatino, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, docetaxel, mecloretamina, estreptozocina, ciclofosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorrubicina (adriamicina), doxorrubicina liposomal (doxil), ácido folínico, gemcitabina (gemzar), daunorrubicina, daunorrubicina liposomal (daunoxome), procarbazina, ketoconazol, mitomicina, citarabina, etopósido, metotrexato, 5 -fluorouracilo (5-FU), vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparraginasa, busulfán, carboplatino, cladribina, camptotecina, CPT-11, 10-hidroxi-7-etil- camptotecina (SN38), dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, idarrubicina, mesna, interferón alfa, interferón beta, irinotecán, mitoxantrona, topotecán, leuprolida, megestrol, melfalán, mercaptopurina, oxaliplatino, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobromano, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinorelbina, clorambucilo, y combinaciones de los mismos.
Los agentes quimioterapéuticos más preferidos según la invención en combinación con VXM06 son cabazitaxel, carboplatino, oxaliplatino, cisplatino, ciclofosfamida, docetaxel, gemcitabina, doxorrubicina, paclitaxel (taxol), irinotecán, vincristina, vinblastina, vinorelbina, ácido folínico, 5-fluorouracilo y bleomicina, especialmente gemcitabina.
Puede ser también favorable dependiendo de la aparición de posibles efectos secundarios, incluir el tratamiento con antibióticos o agentes anti-inflamatorios.
En caso de que se produzcan efectos adversos que se asemejen a reacciones de hipersensibilidad mediadas por histamina, leucotrienos o citoquinas, hay opciones de tratamiento disponibles para la fiebre, anafilaxia, inestabilidad de la presión sanguínea, broncoespasmo y disnea. Las opciones de tratamiento en caso de auto-agresión derivada de células T no deseadas se derivan de esquemas de tratamiento estándar en la enfermedad aguda y crónica de injerto contra huésped aplicada después del trasplante de células madre. La ciclosporina y los glucocorticoides se proponen como opciones de tratamiento.
En el caso improbable de infección sistémica por Salmonella typhi tipo Ty21a, se recomienda una terapia antibiótica apropiada, por ejemplo, con fluoroquinolonas que incluyen ciprofloxacino u ofloxacino. Las infecciones bacterianas del tracto gastrointestinal deben tratarse con agentes respectivos, tal como rifaximina.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella se administra durante la quimioterapia o el ciclo de tratamiento de radioterapia o durante la terapia biológica contra el cáncer.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella se administra antes de la quimioterapia o del ciclo de tratamiento de radioterapia o antes de la terapia biológica contra el cáncer. Este enfoque puede tener la ventaja de que la quimioterapia o la radioterapia pueden realizarse en condiciones de mayor inmunidad frente al cáncer.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella se administra después de la quimioterapia o del ciclo de tratamiento de radioterapia o después de la terapia biológica contra el cáncer.
En realizaciones particulares, la cepa mutante atenuada de Salmonella se administra por vía oral. La administración oral es más simple, más segura y más cómoda que la administración parenteral. Las vacunas de péptidos de WT1, que se han empleado en la mayoría de los ensayos clínicos, se administran normalmente por vía subcutánea o intradérmica, dando a menudo como resultado eritema de la piel y reacciones de inflamación local. Estos efectos adversos pueden superarse mediante la administración oral de la vacuna de ADN de la presente invención. La cepa mutante atenuada de Salmonella de la presente invención también se puede utilizar, sin embargo, mediante cualquier otra vía de administración adecuada. Preferiblemente, se administra al sujeto una dosis eficaz terapéuticamente, y esta dosis depende de la aplicación particular, del tipo de neoplasia, del peso, de la edad, del sexo y del estado de salud del sujeto, de la forma de administración y de la formulación, etc. La administración puede ser única o múltiple, según sea necesario.
La cepa mutante atenuada de Salmonella de la presente invención se puede proporcionar en forma de una disolución, una suspensión, liofilizado o cualquier otra forma adecuada. Se puede proporcionar en combinación con vehículos, diluyentes y/o excipientes aceptables farmacéuticamente. También se pueden incluir agentes para ajustar el valor de pH, tampones, agentes para ajustar la toxicidad, y similares. En el contexto de la presente invención, el
término “aceptable farmacéuticamente” se refiere a entidades moleculares y otros ingredientes de las composiciones farmacéuticas, que son tolerables fisiológicamente y que normalmente no producen reacciones adversas cuando se administran a un mamífero (por ejemplo, un ser humano). El término “aceptable farmacéuticamente” también puede significar que está aprobado por una agencia reguladora de un gobierno federal o estatal o que está catalogado en 5 la Farmacopea de los Estados Unidos u otra Farmacopea reconocida generalmente para uso en mamíferos, y, más particularmente, en seres humanos.
En realizaciones particulares, el cáncer se selecciona de leucemia, en particular de leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia linfoide aguda (LLA), y de tumores sólidos, particularmente de cáncer de pulmón, cáncer de mama, esófago, colon, colorrectal, gástrico, colangiocarcinoma, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cabeza y 10 cuello, sarcoma sinovial, angiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de tiroides, cervical, endometrial, cáncer de ovario, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de próstata.
La vacuna de la presente invención es sorprendentemente eficaz a dosis relativamente bajas. En realizaciones particulares, la dosis única es de aproximadamente 105 a aproximadamente 1011, particularmente de aproximadamente 106 a aproximadamente 1010, más particularmente de aproximadamente 106 a aproximadamente 15 109, más particularmente de aproximadamente 106 a aproximadamente 108, lo más particularmente de
aproximadamente 106 a aproximadamente 107 unidades formadoras de colonias (UFC). La administración de dosis bajas de esta vacuna bacteriana viva minimiza el riesgo de excreción y, por lo tanto, de transmisión a terceros.
En este contexto, el término “alrededor de” o “aproximadamente” significa dentro de un factor de 3, alternativamente dentro de un factor de 2, incluyendo dentro de un factor de 1,5 de un valor o intervalo dado.
20 En la presente memoria se describe también la cepa mutante atenuada de Salmonella para el uso en inmunoterapia individualizada contra el cáncer que comprende la etapa de evaluar el patrón de expresión del antígeno tumoral y/o el patrón de expresión del antígeno del estroma de un paciente.
VXM06 se puede usar bien en solitario o bien en combinación con otras vacunas contra el cáncer a base de Salmonella typhi Ty21a, que comprenden sistemas de expresión eucariotas, para el tratamiento de varios tipos de 25 cáncer. En realizaciones particulares, VXM06 se puede usar para el tratamiento individualizado contra el cáncer específico del paciente. Para este fin, puede evaluarse en una primera etapa el patrón de expresión del antígeno tumoral y/o del antígeno estromal del paciente, por ejemplo, a través de los diagnósticos complementarios dirigidos al patrón del antígeno tumoral y/o estromal específico del paciente. Dependiendo del patrón de expresión del antígeno tumoral y/o estromal del paciente, VMX06 puede administrarse en solitario o en combinación con una o 30 más vacunas contra el cáncer basadas en Salmonella typhi Ty21a que comprenden sistemas de expresión eucariotas. Sin embargo, las combinaciones de VXM06 con una o más vacunas adicionales contra el cáncer basadas en Salmonella typhi Ty21a,se pueden administrar también como combinaciones fijas. Estas mezclas que combinan dos o más vacunas contra el cáncer basadas en Salmonella typhi Ty21a pueden consistir en productos disponibles en el mercado. Las combinaciones, ya sean fijas o individualizadas, pueden contener VXM01 como 35 terapia de base anti-angiogénica
Breve descripción de las tablas y figuras
Figura 1: Secuencia de aminoácidos de WT1 humano truncado codificada por ADNc de WT1 contenida en el plásmido pVAX10.hWT1
Figura 2: Secuencia de ácido nucleico de pVAX10.hWT1 40 Figura 3: Mapa del plásmido de pVAX10.hWT1
Figura 4: Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones portadores de leucemia FBL-3 tratados con VXM0m_vacío, VXM06m y VXM06
Figura 5: Supervivencia media de ratones portadores de leucemia FBL-3 tratados con VXM0m_vacío, VXM06m y VXM06
45 Tabla 1: Síntesis de genes in vitro: reacción de fosforilación
Tabla 2: Síntesis de genes in vitro: amplificación del producto de ligación - perfil de PCR Tabla 3: Composiciones de las vacunas
Tabla 4: Evaluación de la actividad antitumoral - diseño experimental
Tabla 5: Supervivencia de ratones portadores de leucemia FBL-3 tratados con VXM0m_vacío, VXM06m y VXM06 50 Tabla 6: Número de animales muertos después del desafío tumoral a lo largo del tiempo
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Tabla 7: Supervivencia promedio de ratones portadores de leucemia FBL-3 tratados con VXM0m_vacío, VXM06m y VXM06
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de plásmidos recombinantes pVAX10.mWT1 y pVAX10.hWT1
WT1 truncado humano (1116 pb, secuencia WT1 según la secuencia de referencia UniProt P19544-7, truncado por el dominio del dedo de cinc) y WT1 truncado murino (1101 pb, secuencia WT1 según la secuencia de referencia UniProt P22561-5, truncado por el dominio del dedo de zinc) se clonaron en la cadena principal de pVAX10 derivada de pVAX10.VR2-1. Los fragmentos de ADN de WT1 se generaron por síntesis génica de doble cadena, donde los oligonucleótidos se unieron entre sí utilizando una ligasa termoestable.
Síntesis y diseño de oligos:
En una primera etapa, la secuencia del gen de WT1 murino truncado y de WT humano truncado se subdividieron en oligonucleótidos individuales de 40 a 50 bases utilizando el programa informático “SeqEditor” (Entelechon). Los oligonucleótidos se entrecruzaron y se correspondieron con las hebras de ADN. Después de la síntesis de los oligonucleótidos de ambas cadenas de ADN, los oligonucleótidos se diluyeron con Tris 10 mM (pH 8,5) hasta una concentración final de 50 pmol/pl.
Reacción quinasa:
Los oligonucleótidos sintetizados in vitro se fosforilaron a continuación mediante la incubación con polinucleótido quinasa T4 (PNK T4) para permitir la ligación subsiguiente de los oligonucleótidos. Se fosforilaron los oligonucleótidos de avance y retroceso.
La preparación de la reacción se resume en la siguiente Tabla 1:
Volumen
Ingrediente
10 Mi 10 Mi 10 Mi
68 Mi
2 Mi
Mezcla del cebador
Tampón de polinucleótido quinasa T4 (PNK) 10x ATP (25 mM)
Agua estéril PNK T4 (10 U/Mi)
La mezcla de reacción se incubó durante 1 hora a 37°C en un baño de agua. A continuación, la polinucleótido quinasa T4 se inactivó mediante una etapa de calentamiento de cinco minutos a 95°C y después se enfrió inmediatamente en hielo hasta el tratamiento posterior.
Se emplearon 12,5 mí de la mezcla de quinasas directamente para la ligación (20 U de ADN ligasa Taq, 35 mí de volumen de reacción (New England Biolabs, M0208S).
La etapa de desnaturalización a 95°C se continuó mediante enfriamiento progresivo (1°C/min). Durante este proceso, los oligonucleótidos complementarios se unen a una cadena doble de ADN. El proceso se realizó en un termociclador (Ciclador Personal, Biometra). Por adición de ADN ligasa Taq termoestable, el extremo 5'-PO4 de los oligonucleótidos se unieron con el extremo 3'-OH libre del siguiente oligonucleótido. Mediante repetidas etapas de desnaturalización y renaturalización, se liberaron oligonucleótidos desemparejados. Al final del programa, la mezcla se enfrió a 4°C.
Amplificación de los productos de ligación por PCR:
Se amplificaron 5 mí de los productos de ligación obtenidos (aproximadamente 1,1 kb) por PCR en un volumen de 50 Mi con cebadores flanqueantes como se representa en la Tabla 2 siguiente:
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n°
etapa temperatura tiempo
1
desnaturalización 95°C 5 min
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desnaturalización 95°C 30 s
3
re-asociación 57°C 30 s
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elongación 72°C 90 s
5
extra-elongación 72°C 5 min
6
enfriamiento 4°C
imagen1
N° de ciclos
1
30x
1
1
La mezcla de PCR contenía los siguientes componentes: 0,2 - 0,5 pM de cada cebador, Tris-CI 20 mM, pH 8,8, KCl 10 mM, (NH4)2SO410 mM, MgSO4 2 mM, Triton X-10 0,1%, dNTP 25 mM (cada uno), polimerasa VentR2 U.
Los fragmentos de ADN sintetizados in vitro (WT1 truncado humano y murino, aproximadamente 1,1 kb cada uno) se clonaron en la cadena principal de pVAX10 mediante Nhel/Xhol (se reemplazó la región codificante de VEGFR-2 del plásmido recombinante pVAX10.VR2-1 por el WT1 truncado humana o murino). Para el control de calidad, se secuenciaron y alinearon los plásmidos enteros con la secuencia de referencia respectiva después de la transformación en E. coli. Ambas secuencias demostraron estar libres de errores. Los plásmidos resultantes se denominaron pVAX10.mWT1 y pVAX10.hWT1.
Ejemplo 2: Transformación de cepas de Salmonella atenuada con los plásmidos recombinantes:
Se transformó S. typhi Ty21a con el plásmido pVAX10.hWT1. S. typhimurium SL7207 (aroA-) se transformó con el plásmido pVAX10.mWT1. La transformación se realizó mediante electroporación.
Preparación de células competentes de Salmonella:
Se inocularon cultivos de glicerol de S. typhi Ty21a y S. typhimurium SL7207 en placas LB (peptona de soja [ACF] libre de componente animal). Las placas se incubaron a 37°C durante la noche. Se empleó una colonia de cada una para el precultivo líquido nocturno. Se incubaron 3 ml de medio LB (peptona de soja ACF) inoculados con una colonia cada uno a 37°C y 180 rpm durante la noche. Para preparar células competentes, se inocularon 2 x 300 ml de medio LB (peptona de soja ACF) con 3 ml de cultivo de una noche y se incubaron a 37°C y 180 rpm hasta una DO600 de aproximadamente 0,5. Los cultivos se pusieron en hielo durante 10 minutos. Posteriormente, las bacterias se centrifugaron durante 10 minutos a 3000 xg a 4°C y cada sedimento se resuspendió en 500 mL de H2Odest fría con hielo. Después de una nueva etapa de centrifugación, los gránulos bacterianos se lavaron dos veces en glicerol helado al 10%. Ambas paletas se pusieron juntas en 2 ml de glicerol al 10% y finalmente se congelaron en alícuotas de 50 pl en hielo seco. El glicerol empleado no contenía ningún ingrediente animal (Sigma Aldrich, G5150).
Transformación de células competentes de Salmonella:
Para cada reacción de transformación, se descongeló una alícuota de 50 pl de células competentes en hielo durante 10 minutos. Después de añadir 3-5 pl de ADN del plásmido (pvAx10.hWT1 para células S. typhi Ty21a competentes y pVAX10.mWT1 para células S. typhimurium SL7207 competentes) las mezclas se incubaron en hielo durante cinco minutos. Posteriormente, las mezclas se transfirieron a cubetas pre-enfriadas (1 mm de espesor). El impulso eléctrico se llevó a cabo a 12,5 kV/cm. Inmediatamente después, se añadió 1 ml de medio LB (peptona de soja ACF) a las células, las células se transfirieron a un tubo Eppendorf de 2 ml y se agitaron durante 1 hora a 37°C. Después de un corta etapa de centrifugación en una centrífuga de banco (16600 rcf, 20s), el sedimento bacteriano se resuspendió en 200 pl de medio libre de antibiótico LB (peptona de soja ACF). Las mezclas se aplicaron con una espátula Drigalski sobre placas LB (peptona de soja ACF) que contenía kanamicina (concentración = 25 pg/ml o 50 pg/ml). Las placas se incubaron a 37°C durante la noche.
Preparación plasmídica de clones recombinantes de Salmonella:
Se incubaron tres clones de cada cepa de Salmonella recombinante durante la noche en 3 ml de medio LB (peptona de soja ACF) que contenía kanamicina (50 pg/ml) a 37°C. El cultivo bacteriano luego se sedimentó por centrifugación (16600 rcf, 30 s). El aislamiento del plásmido se realizó utilizando el Kit Plasmídico NucleoSpin de Macherey-Nagel. El ADN plasmídico se eluyó de las columnas de gel de sílice con 50 pl de agua. Se utilizó como control 5 pl del eluido en electroforesis en gel de agarosa.
Para el almacenamiento a largo plazo, se produjeron cultivos de 1 ml de glicerol de los clones positivos. Para este fin, se agregaron 172 pl de glicerol (sin ingredientes de origen animal) a un medio de 828 pl de crecimiento
logarítmico de 3 ml en un microtubo de tomillo de 1 ml bajo. Las muestras se almacenaron a -70°C hasta su posterior uso.
Secuenciación completa del ADN plasmídico recombinante aislado de Salmonella:
Se inocularon 3 ml de medio LB-Kan líquido (peptona de soja ACF) con una colonia de Salmonella recombinante (S. 5 typhi Ty21a que alberga pVAX10.hWT1 y S. typhimurium SL7207 que alberga pVAX10.mWT1) y se incubaron durante la noche a 37°C y 180 rpm. El cultivo de una noche se sedimentó por centrifugación a 1300 rpm durante 30 s en una centrífuga de banco (Biofuge pico, Heraeus). El aislamiento del plásmido se realizó con el Kit Plasmídico NucleoSpin de Macherey-Nagel. Después de la lisis alcalina y de la precipitación del ADN genómico de alto peso molecular y de los componentes celulares, el ADN plasmídico se cargó en columnas con una membrana de sílice. 10 Después de una etapa de lavado, los plásmidos se eluyeron de la columna con 50 pl de agua estéril y se secuenciaron. Las secuencias se compararon con la secuencia de referencia respectiva a través de los alineamientos de los clones específicos, es decir, las secuencias plasmídicas de cada clon de Salmonella se alinearon con la secuencia de referencia. Todas las secuencias están en línea con las respectivas secuencias de referencia. Las cepas de Salmonella recombinante se denominaron VXM06 (S. typhi Ty21a que alberga el plásmido 15 pVAX10.hWT1) y VXM06m (S. typhimurium SL7207 que alberga el plásmido pVAX10.mWT1).
Ejemplo 3: evaluación de la actividad antitumoral de VXM06 y VXM06m en el modelo de ratón de leucemia singénica
Se evaluó la eficacia de VXM06 y VXM06m en un modelo de ratón C57/BL6J de leucemia singénica durante un período de 43 días (con la administración de dosis en días alternos durante 4 ocasiones seguidas dela inoculación de células de leucemia en el día 17). Dos grupos, cada uno compuesto por 10 ratones machos (n=10) recibieron 20 VXM06 (S. typhi Ty21a que contiene pVAX10.hWT1 que codifica Wt1 humano truncado) o vXM06m (S. typhimurium que contiene pVAX10.mWT1 que codifica WT1 murino truncado) a dosis de 1010 UFC/ocasión. Un grupo de control constituido de manera similar recibió VXM0m_vacío (control del vector de S. typhimurium sin plásmido de expresión) a la misma dosis que los grupos tratados. Durante el estudio, se llevaron a cabo investigaciones sobre el peso corporal, la mortalidad y la supervivencia. Antes de este estudio principal, se realizó un 25 estudio piloto durante 14 días en ratones macho C57B16 (n=5 por grupo) sin vacunación utilizando 5,0 x 106 y 3,0 x 107 células FBL-3, después de lo cual se juzgó la primera concentración celular como óptima para el estudio de vacunación principal.
Vacunas de ADN:
Se almacenaron VXM06, VXM06m y el vector vacío de S. typhimurium (VXM0m_vacío) sin plásmido de expresión, a 30 < -80°C hasta su uso. Los viales que no se usan en la vacunación no se congelaron de nuevo, sino que se
descartaron posteriormente. Las vacunas de ADN bajo investigación se caracterizan en la siguiente Tabla 3:
Elemento de ensayo
Lote Concentración Cantidad
VXM0m_vacío
VXM01m-e.1-01/2010 10'1'1 UFC/ml 0,7 ml/vial (10 viales)
VXM06m
VXM06m-031.1-01/2012 1011 UFC/ml 0,7 ml/vial (10 viales)
VXM06
VXM06-031.1-01/2012 1011 UFC/ml 0,7 ml/vial (10 viales)
Vía de administración del fármaco:
Se aplicaron 100 pl de VXM0m_vacío, VXM06m y VXM06 por animal y aplicación. Después de descongelar los 35 elementos de ensayo, la aplicación se realizó dentro de los 30 min. Todas las sustancias de ensayo se administraron por sonda oral (por vía oral, P.O) a través de una cánula con un volumen de inyección de 100 pl/ratón.
Independientemente de los grupos de animales, cada animal recibió un tampón de aplicación antes de la dosis para neutralizar el medio ácido en el estómago antes de la dosis (100 pg/animal/aplicación para todos los grupos de dosis). Este tampón contenía 2,6 g de hidrogenocarbonato de sodio, 1,7 g de ácido L-ascórbico, 0,2 g de lactosa 40 monohidratada y 100 ml de agua potable. Las aplicaciones previas a la dosis se realizaron hasta 30 minutos antes de la aplicación de los elementos de ensayo.
Cultivo de células:
Las células FBL-3 de leucemia de ratón que sobreexpresan WT1 requerían pases para asegurar la viabilidad y alcanzar la cantidad requerida de células.
Se recogieron las células tumorales que crecían exponencialmente, se mezclaron con azul de tripano (a la dilución recomendada 1:1) para la determinación de la viabilidad, y se contaron manualmente empleando una cámara de recuento bajo un microscopio óptico. Las células FBL-3 se lavaron y resuspendieron en medio RPMI libre de suero para las inyecciones en ratones C57BU6.
5 Vacunación e inoculación de células tumorales:
Condiciones de inyección celular para inyección intraperitoneal (I.P.): viabilidad celular >97%; 5,0 x 106 células/500 pl/ratón.
Se numeraron los animales (30 ratones C57BL/6, 4-6 semanas, macho, “20 g cada uno, Charles River, Francia), con una marca única de identificación en la oreja de los animales; el peso corporal se midió dos veces por semana.
10 Se vacunaron diez ratones cada uno (n =10 machos) con VXM0m_vacío, VXM06m y VMX06. La vacunación se llevó a cabo mediante sonda oral de 1010 UFC/aplicación los días 1, 3, 5 y 7. En el día 17, las células tumorales FBL-3 se inocularon en ratones mediante vía I.P. El diseño experimental se resume en la siguiente Tabla 4:
Grupo
Animales Células tumorales Tratamiento Dosis (UFC/adm) Vía de administración Programa de tratamiento
1
10 5 x 106 VXM0m_vacío 10'IU (en 100 pl) PO Q2Dx4 (D1, D3, D5, D7)
2
10 5 x 106 VXM06m 10'm (en 100 pl) PO Q2Dx4 (D1, D3, D5, D7)
3
10 5 x 106 VXM96 10m (en 100 Pl) PO Q2Dx4 (D1, D3, D5, D7)
Resultados:
15 En la siguiente Tabla 5 se enumeran los datos de supervivencia para los tres grupos de tratamiento:
Grupo 1; VXM0m_vacío Grupo 2; VXM06m Grupo 3; VXM06
Día
Supervivencia Supervivencia Supervivencia
-3
10 10 10
1
10 10 10
5
9 9 10
7
9 9 10
12
9 9 10
15
9 9 10
19
9 8 10
22
9 8 10
26
9 8 10
29
5 7 9
33
0 4 4
36
0 1 3
40
0 1 1
43
0 0 0
Se realizó un examen clínico diario de todos los animales: comportamiento, signos de sufrimiento (caquexia, devenir y dificultades para moverse o alimentarse).
El número de animales muertos después de la exposición tumoral se enumera en la siguiente Tabla 6:
Tiempo
Supervivencia Muertes Tratamiento
1
9 0 VXM0m_vacío
12
6 3 VXM0m_vacío
15
2 4 VXM0m_vacío
16
0 2 VXM0m_vacío
1
8 0 VXM06m
12
7 1 VXM06m
14
6 1 VXM06m
16
4 2 VXM06m
19
1 3 VXM06m
26
0 1 VXM06m
1
10 0 VXM06
12
9 1 VXM06
14
8 1 VXM06
15
6 2 VXM06
16
4 2 VXM06
19
3 1 VXM06
v21
2 1 VXM06
22
1 1 VXM06
26
0 1 VXM06
5 La Figura 4 representa las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones que portan leucemia FBL-3 tratada con VXM0m_vacío, VXM06m y VXM06. Los ratones tratados con VXM06m y VXM06 sobrevivieron más tiempo en comparación con los ratones de control (hasta 26 días). Alrededor del 40% de los ratones que recibieron VXM06m y VXM06 sobrevivieron más que los tratados con VXM0m_vacío. La mediana y la mediana de supervivencia de los tres grupos de ensayo se
10 representan en la siguiente Tabla 7:
Ratones
VXM0m_vacío 9 VXM06m 8 VXM06 10
Tiempo de supervivencia
1
12 12 12
2
12 14 14
3
12 16 15
4
15 16 15
5
15 19 16
6
15 19 16

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Una cepa mutante atenuada de Salmonella que comprende al menos una copia de una molécula de ADN recombinante que comprende un casete de expresión eucariota que codifica la proteína tumoral de Wilms (WT1).
  2. 2. La cepa mutante atenuada de Salmonella de la reivindicación 1, en donde la cepa mutante atenuada de Salmonella es de la especie Salmonella enterica, particularmente en donde la cepa mutante atenuada de Salmonella es Salmonella typhi Ty21a.
  3. 3. La cepa mutante atenuada de Salmonella de la reivindicación 1 ó 2, en donde WT1 es WT1 humana, particularmente en donde WT1 está truncada, más particularmente en donde se elimina el dominio del dedo de zinc de WT1, más particularmente en donde la WT1 truncada tiene la secuencia de aminoácidos como se encuentra en SEQ ID NO:1.
  4. 4. La cepa mutante atenuada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la molécula de ADN recombinante comprende el gen de resistencia al antibiótico kanamicina, el ori pMB1, y un casete de expresión eucariota que codifica WT1 humana, particularmente WT1 humana truncada, bajo el control de un promotor de CMV.
  5. 5. La cepa mutante atenuada de Salmonella de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso como un medicamento.
  6. 6. La cepa mutante atenuada de Salmonella para su uso según la reivindicación 5 como una vacuna.
  7. 7. La cepa mutante atenuada de Salmonella para su uso según la reivindicación 6 en la inmunoterapia contra el cáncer.
  8. 8. La cepa mutante atenuada de Salmonella para su uso según la reivindicación 7, en donde la inmunoterapia contra el cáncer comprende además la administración de una o más cepas mutantes atenuadas adicionales de Salmonella que comprenden al menos una copia de una molécula de ADN recombinante que comprende un casete de expresión que codifica un antígeno tumoral y/o un antígeno del estroma tumoral, particularmente en donde dicha una o más cepas mutantes atenuadas adicionales de Salmonella es/son Salmonella typhi Ty21a que comprende un casete de expresión eucariota, más particularmente en donde dicha una o más cepas mutantes atenuadas adicionales de Salmonella comprende o comprenden una cepa mutante atenuada de Salmonella que codifica VEGFR-2 humana, más particularmente en donde dicha una o más cepas mutantes atenuadas adicionales de Salmonella comprende o comprenden la cepa mutante atenuada de Salmonella denominada VXM01.
  9. 9. La cepa mutante atenuada de Salmonella para su uso según la reivindicación 8, en donde la cepa mutante atenuada de Salmonella se co-administra con dicha una o más cepas mutantes atenuadas adicionales de Salmonella.
  10. 10. La cepa mutante atenuada de Salmonella para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la inmunoterapia contra el cáncer se combina con quimioterapia, radioterapia o terapia biológica contra el cáncer, particularmente en donde la cepa mutante atenuada de Salmonella se administra antes o durante la quimioterapia o el ciclo de tratamiento de radioterapia o antes o durante la terapia biológica contra el cáncer, o antes y durante la quimioterapia o el ciclo de tratamiento de radioterapia o de la terapia biológica contra el cáncer.
  11. 11. La cepa mutante atenuada de Salmonella para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en donde la cepa mutante atenuada de Salmonella se administra por vía oral.
  12. 12. La cepa mutante atenuada de Salmonella para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde el cáncer se selecciona de leucemia, particularmente de leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia linfoide aguda (LLA), y de tumores sólidos, particularmente de cáncer de pulmón, cáncer de mama, esófago, colon, colorrectal, gástrico, colangiocarcinoma, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, sarcoma sinovial, angiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de tiroides, cervical, endometrial, cáncer de ovario, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de próstata.
  13. 13. La cepa mutante atenuada de Salmonella para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en donde la dosis única comprende de aproximadamente 105 a aproximadamente 1011, particularmente de aproximadamente 106 a aproximadamente 1010, más particularmente de aproximadamente 106 a aproximadamente 109, más particularmente de aproximadamente 106 a aproximadamente 108, lo más particularmente de aproximadamente 106 a aproximadamente 107 unidades formadoras de colonias (UFC).

    10 20 30 40 50 60
    MGSDVRDLNA LLPAVPSLGG GGGCALPVSG AAQWAPVLDF APPGASAYGS LGGPAPPPAP

    70 80 90 100 110 120
    PPPPPPPPHS FIKQEPSWGG AEPHEEQCLS AFTVHFSGQF TGTAGACRYG PFGPPPPSQA

    130 140 150 160 170 180
    SSGQARMFPN APYLPSCLES QPAIRNQGYS TVTFDGTPSY GHTPSHHAAQ FPNHSFKHED

    190 200 210 220 230 240
    PMGQQGSLGE QQYSVPPPVY GCHTPTDSCT GSQALLLRTP YSSDNLYQMT SQLECMTWNQ

    250 260 270 280 290 300
    MNLGATLKGV AAGSSSSVKW TEGQSNHSTG YESDNHTTPI LCGAQYRIHT HGVFRGIQDV

    310 320 330 340 350 360
    RRVPGVAPTL VRSASETSEK RPFMCAYPGC NKRYFKLSHL QMHSRKHTGE KPYQCDFKDC
    370
    ERRFSRSDQLK
    1G GGCTTTTGCTGG C C TTTTGC TC AC A TGTTCTTGACTC TTCGCGATGTACGGGCC AGATATACGCGTTGACATTGA1TATTGACTAGTTATTAATACTAATCAATTACGG GGTC ATTAGTTC AT AGCCC A [ A i A 1 GG AGTTCCGOGTT AC AT A ACTT ACGGT A A A TGGCCCGCC TGGCTGACCGC C C AACGACCCCCGCCCA TTGAC GTCAATAATGACG
    tatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggact
    A T ri’ACGGTAAACTGCCCACT ] GCpCAGTACATCAAG 1GTA I CATA L GCCAAG1 AC GCCCCC (ATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAG TAC! ATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACA ] CTACGTATTAG I CA I CGCTAT TACCATGCTGATGCGGTTTTGÍ iCAGTACATCAATG GGCGTCiGATAGCGOI íTGAC TCACGGOGAI I fCCAAGTCTC CAC C CC ATTgacgtcaatgggagtttgttttggca CCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGCTCGTAACAACrCCOOCCCATTGACGCAA AT GGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGG AGGT CT,ATATAAGCAG AGCTCTCTGGC T AA CTAGAGAACCCACTGCTTAC [ GGCTTATCGAAATI AATACGACTCACTATAGGGA GACCCAAGC TGGCTAGC A TGGAC TTC C TdTGCTGC AGGACC CGGCTTCC ACOTO
    tgtcccggagccggcgtctcagcacacgctccgctccgggcctgggtgcctacag
    CAGCCAGAGCAGCAGOGAGTCCGÍiGACCCGGGCÜGCATC IGGGCCAAG i TAGGC GCCGC CG AGGCC A GCGCTG A ACGTCTCC AGGGCXGG AGG AGCCGCGCiGGCG ICC OGGTCTGAGCCGCAGCAAATGGGCTCCGACGTGCGOGACCTGAACGCGCTGCTG CCCGCCGTCCCCTCCCTGGGTGGCGGCGGCGGCTGTGCCCTGCCTGTGAGCGGCG C GGCGCAGTGGGC GCC GGTGCTGGA C TTTGC GCC C C CGGGCGCTTCGGCTTAC GG
    gtcgttgggcggccccgcgccgccaccggctccgccgccacccccgccgccgccg
    C C TC AC TCCTTCATCAA A C AGGAGCC GAGCTGGGGC GGCGCGGAGCCG C AC GAG GAGCAGTGCCTO AGCGCC [ ICACTGTCCACTTTTCCGGC CAGTTCA CTGGC AC AG
    ccggagcctgtcgctacgggdccttcggtcctcctdcgcccagccaggcgtcatc
    CC G CC AGGCC AGG A l GTTTC CT A ACGCGCCCTACCTQCCCAGCTGCCT GG AG AGC CAGCCCGCTA1 ICGCAÁTCAGGG TI ACAGCACÜGTCACCTTCGACGGG ACGCCCA GCT A CGGTCACA CGC CCTCGCACCAT GCG G C GCAGT Tt CCC AA CCACTCATTCAA GCATGAGGATCCCAT GGG C C AGC AG GGCTC GC TGGGTG AGC AGC AG TACTCCGT 15 CCGCCCC CC ¡Gr TC TATGGCTGCC AC ACCCCC AC CG AC AÜC1 GC ACCGGC AGCCAG GCTTTGCTGCTCiAG GACGCCCTAC AGC A í 1TGACAÁTTT ATACC AAATCACA L CCC AGCTTGAATG C ATGA C CTGGAATCAG ATGAACTTAGG A GC CAC CTTAAAGGG AG TTGC TGCTGGGAG CTCC AGCTC AGTG AAATGG AC AG AAGC G C A G A GC A ACC AC A GC AC AGGG T ACG AG AGCG AT AACC AC AC AACGCCC ATCCTC: TGCGUAGCCCAAT ACAC3AATACAC ACGCACGGl Ü1C1TCAC AGGCA1TCAGTGACTCGAGTCTAGAGG GCCCGTTT A A A CCCGC TG ATC AGCCTCG ACTGTGCCT1CTAG l ICC C AOCC AT CTG TTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTG1C CTTTCCTA AT A A A ATG AGG A A ATTG CATCG CATTGTCTGAGTA GGTGTCATT CT AT TCTG GGCGGTGC GGTGGGCC AG GACAGCAA GGGGGAGG ATT GGGAAGACAATA GCACrGC ATGCTGGGG ATG CGGTG G G CTC T ATGGC TT C T AC TG GGCGGTT TTATG G ACAGCAAG CGAAC C GGAATTGC C AGCTG G GGCG CCCTC TGGTAAGGTTGGG AAG CCCTGCAAAG I AAACTGGATGGC1 TTCTCGCCGCCAAGf-ATCTGATGGCGCAGGG G ATC A AGCTCTGATC AA GAGA C AGG ATG AGG A L CGTT TCGC A J G ATTGA AC AAG ATGGATTG C ACGC AC GTTCTCCGGCCGCTTGGGTGG AGAGGCT ATTCGGC'L ATG A CTGGGC AC A AC AG AC A ATCGGC TGC TCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCG C AGG GGCGCCCGG l rCTTTTTGTGAAGACCGACCTGTCCGG [ GCCCTGAAl’G AAC TGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCG1GGCTGGCCACGACGGGCGT TCCTTGCGC AGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGA AGCGGGAAGGGAC TGGCI GC 1ATTGGGCGAA
    GFTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCrTGCTCCTGCCGAGAAAGTATOCA TCATGGCTGATG CAATGCGGCG GC TGC ATAC GC TTGATCCGGC TACCTGC C C ATT CGAOCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGG TC l'TGTC GATC AGG ATGATCTGGACG AAG AGC ATC AGGGGCTC GCGí 'CAGCCGA ACTG í rCGCC AGGCTC A AGGCG AGC A IGCCCGA CGGCG A GG ATCTCGTC CíTG ACC
    catggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggcogcttttctggat
    T C AT C G ACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATC AGGAC ATAGCGTTGG C TACCCGTG ATATTGCT G A AG A GC1T GGCGGCG A A rGGGCT G ACCGCTTCCTCGT G C1TTACGGTA I CGCCGCKCCGA n CGCAGCGCATCGCC I 1C TAI CCCCTTCTTGA CGAGTTCTTCTGAATlATTAACGCrTACAATTTCCTGATGCGGTATTTrCTCCTTAC GC ATCTG T GC GG TATTT CAC ACCGC ATAC AGGTG G CACTTTT C GGGG AAAT GTGC GCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATG AG AC AATAACC C TGAT AAATGCTTC AAT AAT AGC A CGTGC TAA ,\AC TTC ATTTTT AATTTAAA AGG ATCT AGGTG AA GATCC TTTTTGAT AAT C T C AT GACC AAAAl C CC TTAACGTG AGTTTTCGTTCCACTG At iCGTCACi ACCCCCATCAG J C ACCAAACAGG A A AAAAC C GCC C TT A A C ATGGC C CGC Tl'TATC AGAAGC CAGAC ATT AA C GCTTCT GGAGAAACTCAACGACCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCT TCACGACCACGCTGATGAGCnTACCGC AGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGAC GGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAG CGGATGCCGGGAGC AGACAAGCCCGT C AGGGCGCGT CAGCGGGTGTT QGCGGGT GTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTT AACTATGCGGCATCAGAGCAGA11'GTACTGAGAGTGCACCATAl GCGG 1GTGAA ATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCT CG CTC At:TG ACTC GCTGCGCTCGGT CGTTCGGCTG CGGC G AGCGGT AT CAGC T C A CTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAG.AA
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    imagen1
    imagen2
    Función de distribución de supervivencia
    90 ■■
    SO --
    70 *
    JS-ii
    40
    CO 30 -
    20
    10
    Tiempo (Días)
    vXMOrn vacio
    VXM06 m —A—VXM06
    imagen3
    20
    10
    18
    17
    16
    15
    14
    13
    12
    ti
    10
    imagen4
    imagen5
    Gráfica del Tiempo de Supervivencia
    i
    VXMOm_vacío VXM06m VXM06
    Grupos
    HVXM0m_vacío
    ®VXM06m
    □VXMOS
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