CN1859851A

CN1859851A - 间皮素疫苗与模型系统

Info

Publication number: CN1859851A
Application number: CNA038166259A
Authority: CN
Inventors: E·雅菲; T－C·伍; C－F·翰格; R·赫鲁班
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 2002-07-12
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2006-11-08

Abstract

间皮素能够用作一种免疫治疗靶标。它诱导一种溶细胞性T细胞应答。鉴定了诱导这种应答的间皮素的部分。疫苗可以是基于多核苷酸的或是基于多肽的。用来产生溶细胞性T细胞应答的载体包括细菌和病毒。用来检验疫苗和其它抗肿瘤治疗剂和预防剂的小鼠模型包括强烈表达间皮素的转化的腹膜细胞系。

Description

间皮素疫苗与模型系统

下列所有申请的内容均在此引用：2002年7月12日提交的美国临时申请系列号60/395,556,2002年7月24日提交的60/398,217,2002年9月30日提交的系列号60/414,931,2003年6月5日提交的系列号60/475,783。

本发明利用美国政府的基金开展。基金NCI CA62924、NCI R01CA72631、NCI R01 CA71806、U19 CA72108-02和NCDDG RFA CA-95-020的条款准许美国政府在本发明中保留一定的权利。

发明领域

本发明涉及癌症治疗、癌症预后和抗癌药物研制领域。在某些方面，它涉及作为一种治疗靶标的间皮素(mesothelin)。另一方面，它涉及研制其它一些治疗靶标。

发明背景

正常细胞向恶性肿瘤细胞的转变包括复杂的遗传和后生改变，影响到大量基因(1，2)。许多改变的基因被翻译为新的、改变的或者过量表达的蛋白质，它们可能是免疫排斥的候选靶标。从肿瘤细胞分离的cDNA文库的T细胞筛选，主要组织相容性复合物(MHC)结合的抗原的生物化学洗脱和纯化，以及噬茵体展示文库的抗体筛查(SEREX法)，十分有利于鉴定肿瘤抗原，特别是恶性黑素瘤表达的抗原(3-13)。结果，有大量针对该疾病的抗原特异的疫苗方法处于临床研究阶段(3-6，14)。遗憾的是，这些抗原鉴定方法尚未成功用于鉴定其它许多普通癌症表达的抗原。主要的限制是不能产生能够用来鉴定免疫相关肿瘤靶标的来源于患者的T细胞系和克隆。而且，对特异人肿瘤抗原的T细胞应答尚未与免疫治疗后的临床反应相关联。

能够定量人组织中基因表达的高通量技术的最新发展已经使得大量基因得到鉴定，相对于作为来源的正常组织，这些基因在肿瘤中差异表达(15-18)。这些基因表达数据库能够作为最初的过滤工具，对其使用一种基于免疫的功能筛选策略(19)。已经列表报告了通过基因表达的系列分析(SAGE)证实在胰腺癌中差异表达的数量越来越多的基因(20-22)。然而，还不清楚这些差异表达的基因中有哪些与抗肿瘤反应免疫学相关。本领域需要一种在肿瘤和正常组织差异表达的蛋白质中鉴定免疫学相关蛋白质的方法。

发明简述

在第一个实施方案中，提供了一种诱导针对肿瘤的T细胞应答的方法，相对于作为该肿瘤来源的正常组织，该肿瘤过量表达间皮素。例如，该肿瘤可以是卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤或鳞状细胞癌。对带有所述肿瘤的患者或已经切除所述肿瘤的患者施用一种疫苗，该疫苗含有一种多肽，该多肽含有间皮素的MHC I类或II类结合表位。患者也可以是具有发展这种肿瘤的危险的人。该表位结合患者表达的MHC I类或MHC II类的等位基因形式。从而诱导对间皮素的T细胞应答。该疫苗不含完整肿瘤细胞。该多肽任选地是间皮素。T细胞应答可以是CD4⁺T细胞应答和/或CD8⁺T细胞应答。

在第二个实施方案中，提供了一种诱导针对肿瘤的T细胞应答的方法，相对于作为该肿瘤来源的正常组织，该肿瘤过量表达间皮素。例如，该肿瘤可以是卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤或鳞状细胞癌。对带有所述肿瘤的患者或已经切除所述肿瘤的患者施用一种疫苗，该疫苗含有编码一种多肽的多核苷酸，该多肽含有间皮素的MHC I类或MHC II类结合表位。患者也可以是具有发展这种肿瘤的危险的人。该表位结合患者表达的MHC I类或MHC II类的等位基因形式。从而诱导对间皮素的T细胞应答。该疫苗不含完整肿瘤细胞。该多肽任选地是间皮素。T细胞应答可以是一种CD4⁺T细胞应答和/或CD8⁺T细胞应答。

在第三个实施方案中，提供了一种鉴定可用作抗肿瘤疫苗候选物的免疫原的方法。选择一种蛋白质，其被一种肿瘤表达，而作为该肿瘤来源的正常组织最低限度地表达或不表达。优选地，所检测的一种肿瘤类型的肿瘤分离物有10％以上表达该蛋白质。检测已接种一种表达该蛋白质的疫苗的人的淋巴细胞，以确定淋巴细胞是否含有该蛋白质特异的CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞。CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞的存在表明该蛋白质是用作抗肿瘤疫苗的一种候选物。

本发明的第四方面提供了一种预测已接受肿瘤疫苗的患者将来对该肿瘤疫苗的反应的方法。检测患者的淋巴细胞，以确定这些淋巴细胞是否含有对于疫苗中的抗原特异的CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞。该CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞的存在预测比不合该CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞时存活时间更长。

本发明的第五方面提供了一种诱导CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞应答的疫苗。该疫苗含有一种多肽，该多肽含有间皮素的MHC I类或MHC II类结合表位。该表位结合患者表达的MHC I类或II类的等位基因形式。从而诱导对间皮素的T细胞应答。该疫苗不含完整肿瘤细胞。该疫苗还含有一种载体，用来刺激T细胞免疫应答。该多肽任选地含有间皮素。

本发明的另外一个实施方案提供了另外一种疫苗，其诱导CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞应答。该疫苗含有一种多核苷酸，其编码一种多肽，该多肽含有间皮素的MHC I类或MHC II类结合表位。该表位结合患者表达的MHC I类或II类的等位基因形式。从而诱导对间皮素的CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞应答。该疫苗不含完整肿瘤细胞。该疫苗还含有一种载体，用来刺激T细胞免疫应答。该疫苗的多核苷酸编码的多肽任选地含有间皮素。

本发明的另外一个实施方案提供了一种分离的9-25个氨基酸残基的多肽。该多肽含有选自如下的表位：SLLFLLFSL(SEQ ID NO：1)；VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)；ELAVALAQK(SEQ ID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)。

本发明的另外一个实施方案提供了一种抗体，该抗体可结合选自如下的表位：SLLFLLFSL(SEQ ID NO：1)；VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)；ELAVALAQK(SEQ ID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQ ID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)。

本发明的另外一个实施方案提供了可与MHC I类-肽复合物结合的CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞系，其中该肽含有选自如下的表位：SLLFLLFSL(SEQ ID NO：1)；VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)；ELAVALAQK(SEQ ID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQ ID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQID NO：6)。

本发明的第十个实施方案提供了一种预测接受肿瘤疫苗的患者将来对该疫苗的应答的方法。该肿瘤疫苗含有间皮素的至少一种T细胞表位。检测该患者，以确定该患者是否具有对间皮素的迟发型超敏反应(DTH)，其中这种反应的存在预示比没有这种反应的存活时间更长。

本发明的第十一个实施方案提供了一种重组小鼠细胞系，它含有已经被HPV-16基因E6和E7以及一种激活的癌基因转化的腹膜细胞。该细胞系经腹膜内注射到免疫活性小鼠体内后能够形成腹水和肿瘤。

也提供了一种小鼠模型，包括已经注射了一种重组小鼠细胞系的小鼠。该重组小鼠细胞系含有被HPV-16基因E6和E7以及一种激活的癌基因转化的腹膜细胞。前一种基因无限增殖化，后一种基因转化。该细胞系在腹膜内注射到免疫活性小鼠体内后能够形成腹水和肿瘤。

本发明的另外一个方面是一种检测物质的方法，用来确定它是否是一种可能的治疗癌症的药物。例如，所述癌症可以是卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤或鳞状细胞癌。待测物质与一种小鼠模型接触。该小鼠模型包括已经注射了一种重组小鼠细胞系的小鼠。这种注射可以在待测物质与小鼠接触之前或之后进行。该重组小鼠细胞系含有已经用HPV-16基因E6和E7以及一种激活的癌基因转染的腹膜细胞。该细胞系经腹膜内注射到免疫活性小鼠体内后能够形成腹水和肿瘤。检测该待测物质是否导致小鼠模型肿瘤形成的延迟或肿瘤消退，小鼠模型腹水体积的减少，或小鼠模型存活时间的延长。任一这些作用都表明该待测物质是一种可能的治疗癌症的药物。

附图简述

图1A-1F显示一种T2结合测定，它鉴定可以结合HLA-A2、A3和A24分子的间皮素和PSCA蛋白衍生的表位。T2细胞用100-400微克肽在室温下脉冲过夜，之后用流式细胞仪分析。图1A.表达HLA-A2并且用下列成分脉冲的T2细胞：无肽(黑线)、间皮素A1309-318结合肽(绿线)、间皮素A220-29(粉红线)和间皮素A2530-539(蓝线)。肽脉冲的细胞用一种未标记的小鼠抗HLA I类分子单克隆抗体W6/32和一种山羊抗小鼠FITC-标记的IgG2a第二抗体染色。图1B.遗传修饰后表达A3并且用下列成分脉冲的T2细胞：无肽(黑线)、间皮素A1309-318结合肽(绿线)、间皮素A383-92(粉红线)和间皮素A3225-234(蓝线)。肽脉冲的细胞用一种未标记的小鼠抗人HLA-A3特异性单克隆抗体GAPA3和一种FITC-标记的IgG2a第二抗体染色。图1C.遗传修饰后表达A24并且用下列成分脉冲的T2细胞：无肽(黑线)、间皮素A1309-318结合肽(绿线)、间皮素A24435-444(粉红线)和间皮素A24475-484(蓝线)。肽脉冲的细胞用一种未标记的pan-HLA抗体W6/32和一种FITC-标记的IgG2a第二抗体染色。图1D.表达HLA-A2并且用下列成分脉冲的T2细胞：间皮素A1309-318结合肽(绿线)、PSCA A25-13(粉红线)、PSCAA214-22(蓝线)、PSCA A2108-116(橙线)和PSCA A243-51(红线)。肽脉冲的细胞用一种未标记的小鼠抗-HLA I类分子单克隆抗体W6/32和一种FITC-标记的山羊抗小鼠IgG2a第二抗体染色。图1E.遗传修饰后表达A3并且用下列成分脉冲的T2细胞：间皮素A1309-318结合肽(绿线)、PSCA A399-107(粉红线)、A35-13(蓝线)、A314-22(橙线)、A3109-117(紫线)、A343-51(红线)和PSCA A320-28(黄线)。肽脉冲的细胞用一种未标记的小鼠抗人HLA-A3特异性单克隆抗体GAPA3和一种FITC-标记的IgG2a第二抗体染色。图1F.遗传修饰后表达A24并且用下列成分脉冲的T2细胞：间皮素A1309-318肽(绿线)、PSCAA2476-84(粉红线)、PSCA A24108-116(蓝线)、PSCA A2499-107(橙线)、PSCAA24109-117(紫线)和PSCA A2477-85(红线)。肽脉冲的细胞用一种未标记的pan-HLA抗体W6/32和一种FITC-标记的IgG2a第二抗体染色。

图2A-2D显示了对来自PBMC的CD8⁺T细胞进行的ELISPOT分析，证明在接受分泌GM-CSF的同种异体胰腺癌肿瘤疫苗后，3名DTH应答者发生间皮素特异性T细胞的接种后诱导，但是11名无DTH应答者不发生这种诱导。图2A.对两名HLA-A3阳性患者的PBL的ELISPOT分析；图2B.对两名HLA-A2和HLA-A3阳性患者的PBL的ELISPOT分析；图2C.对两名HLA-A24阳性患者的PBL的ELISPOT分析；图2D.对全部14名患者的PBL的ELISPOT分析，这些患者都用分泌GM-CSF的同种异体胰腺癌疫苗进行I期研究(28)。使用接种前一天或第一次接种后28天分离的PBMC，对表达IFN-γ的细胞进行ELISPOT分析。通过ficoll-hypaque分离法分离淋巴细胞，冻存于液氮中，直到测定之日。在分析之前进行CD8⁺T细胞富集。T2-A3细胞用两种间皮素衍生的表位MesoA3(83-92)(空心正方形)、MesoA3(225-234)(实心圆形)和HIV-NEFA3(94-103)(空心三角形)脉冲。T2-A2细胞用两种间皮素衍生的表位MesoA2(20-29)(实心正方形)，MesoA2(530-539)(空心圆形)和HIV-GAG(77-85)(实心三角形)脉冲。T2-A24细胞用两种间皮素衍生的表位MesoA24(435-444)(空心菱形)、MesoA24(475-484)(实心菱形)和酪氨酸酶A24(206-214)(星形)。所有DTH应答者都用红线表示，DTH无应答者用黑线表示。为了检测非特异性背景，计数无关对照肽特异的CD8⁺T细胞的IFN-γ斑点的数量。这些测定使用HLA-A2结合的HIV-GAG蛋白衍生的表位(SLYNTVATL；SEQ ID NO：7)、HLA-A3结合的HIV-NEF蛋白衍生的表位(QVPLRPMTYK；SEQ ID NO：8)和HLA-A24结合的酪氨酸酶蛋白衍生的表位(AFLPWHRLF；SEQ ID NO：9)作为阴性对照肽。数据代表一式三份测定的所有条件的平均值，标准差小于5％。对每10⁵个CD8⁺T细胞的人干扰素γ(hIFNγ)数量作图。每名患者的PBL至少分析两次。

图3显示一种ELISPOT分析，其用来评价所研究的所有5名HLA-A2阳性患者(4名无DTH应答者和1名DTH应答者)的PBL上流感基质蛋白HLA-A2结合表位M1(GILGFVFTL；SEQ ID NO：10)的识别。对上述图2A-2D所述的相同PBL样品进行这种分析。DTH应答者用红线表示，DTH无应答者用黑线表示。为了检测非特异的背景，计数无关对照肽特异的CD8⁺T细胞的IFN-γ斑点的数量。这些测定使用HLA-A2结合的HIV-GAG蛋白衍生的表位(SLYNTVATL；SEQ ID NO：7)、HLA-A3结合的HIV-NEF蛋白衍生的表位(QVPLRPMTYK；SEQ ID NO：8)和HLA-A24结合的黑素瘤酪氨酸酶蛋白衍生的表位(AFLPWHRLF；SEQ ID NO：9)作为阴性对照肽。数据代表一式三份测定的所有条件的平均值，标准差小于5％。对每10⁵个CD8⁺T细胞的人干扰素γ(hIFNγ)斑点数量作图。每名患者的PBL至少分析两次，所有ELISPOT分析均以盲法进行。

图4A-4D显示来自PBMC的CD8⁺T细胞的ELISPOT分析。在接受分泌GM-CSF的同种异体胰腺癌肿瘤疫苗的DTH应答者或无DTH应答者中没有观察到PSCA特异性T细胞的接种后诱导。图4A.对两名HLA-A3阳性患者的PBL的ELISPOT分析。图4B.对两名HLA-A2和HLA-A3阳性患者的PBL的ELISPOT分析；图4C.对两名HLA-A24阳性患者的PBL的ELISPOT分析；图4D.对8名无应答患者的PBL的ELISPOT分析。使用接种前一天或每次接种后28天分离的PBMC对表达IFN-γ的细胞进行ELISPOT分析。通过ficoll-hypaque分离法分离淋巴细胞，冻存于液氮中，直到测定之日。在分析之前进行CD8⁺T细胞富集。T2-A3细胞用6种PSCA衍生的表位脉冲：PSCAA3(7-15)(实心正方形)、PSCAA3(52-60)(实心菱形)、PSCAA3(109-117)(实心三角形)、PSCAA3(43-51)(空心正方形)、PSCAA3(20-28)(空心菱形)和PSCAA3(99-107)(空心三角形)。减去阴性HIV-NEFA3(94-103)值。T2-A2细胞用3种PSCA衍生的表位脉冲：PSCAA2(5-13)(实心正方形)、PSCAA2(14-22)(实心菱形)、PSCAA2(108-116)(实心三角形)。减去阴性HIV-GAG(77-85)值。T2-A24细胞用5种PSCA衍生的表位脉冲：PSCAA24(76-84)(实心菱形)、PSCAA24(77-85)(星形)、PSCAA24(109-117)(实心三角形)、PSCAA24(108-116)(实心圆形)和PSCAA24(99-107)(空心三角形)。减去阴性酪氨酸酶A24(206-214)值。所有DTH应答者都用红线表示，DTH无应答者用黑线表示。为了检测非特异性背景，计数无关对照肽特异的CD8⁺T细胞的IFN-γ斑点数量。这些测定使用HLA-A2结合的HIV-GAG蛋白衍生的表位(SLYNTVATL；SEQ ID NO：7)、HLA-A3结合的HIV-NEF蛋白衍生的表位(QVPLRPMTYK；SEQ ID NO：8)和HLA-A24结合的酪氨酸酶蛋白衍生的表位(AFLPWHRLF；SEQ ID NO：9)作为阴性对照。数据代表一式三份测定的所有条件的平均值，标准差小于5％。对每10⁵个CD8⁺T细胞的人干扰素γ(hIFNγ)数量作图。对每名患者的PBL至少分析两次。

图5显示Panc 6.03和Panc 10.05疫苗系上表面间皮素和PSCA的表达。使用间皮素特异的单克隆抗体CAK1(左图)和PSCA特异的单克隆抗体1G8(右图)作为第一抗体，以山羊抗小鼠IgG FITC作为第二抗体，用流式细胞仪分析胰腺癌疫苗系Panc 6.03(上两张图)和Panc 10.05(下两张图)的表面间皮素和PSCA的水平。实线代表同种型对照，绿色阴影区代表间皮素染色，粉红色阴影区代表PSCA染色。

图6A-6C显示多次接种分泌GM-CSF的同种异体肿瘤疫苗后，在DTH应答者中检测到间皮素特异的CD8⁺T细胞，而在无DTH应答者中未检测到。图6A.对两名HLA-A3阳性患者的PBL的ELISPOT分析；图6B.对两名HLA-A2和HLA-A3阳性患者的PBL的ELISPOT分析；图6C.对两名HLA-A24阳性患者的PBL的ELISPOT分析。使用接种前一天或如图2A-2D所述每次接种后28天分离的PBMC，对表达IFN-γ的细胞进行ELISPOT分析。每种肽的符号代码与图2A-2D所述相同。DTH应答者用红线表示，DTH无应答者用黑线表示。为了检测非特异性背景，计数无关对照肽特异的CD8⁺T细胞的IFN-γ斑点数量。这些测定使用HLA-A2结合的HIV-GAG蛋白衍生的表位(SLYNTVATL；SEQ ID NO：7)、HLA-A3结合的HIV-NEF蛋白衍生的表位(QVPLRPMTYK；SEQ ID NO：8)和HLA-A24结合的酪氨酸酶蛋白衍生的表位(AFLPWHRLF；SEQ ID NO：9)作为阴性对照肽。数据代表一式三份测定的所有条件的平均值，标准差小于5％。对每10⁵个CD8⁺T细胞的人干扰素γ(hIFNγ)数量作图。每名患者的PBL至少分析两次。

图7A-7C显示产生腹水的卵巢癌细胞系(WF-3)在小鼠中的产生和表征。WF-3肿瘤细胞以1×10⁵细胞/小鼠的剂量腹膜内注射到C57BL/6小鼠内。在肿瘤攻击4周后对小鼠施行安乐死。(7A)证明小鼠中腹水形成的代表性概图。注意：在肿瘤攻击4周后小鼠产生明显的腹水，腹围增加。(7B)外植肿瘤的苏木精-伊红染色，在90倍放大倍数下观察。肿瘤显示一种乳头状构型，在形态学上与来源于腹膜或卵巢的肿瘤一致。肿瘤在400x放大倍数下观察。插图更详细地显示WF-3肿瘤细胞的特征。

图8A和8B显示MHC I类(图8A)和MHC II类(图8B)在小鼠WF-3肿瘤细胞上的呈现。收集WF-3肿瘤细胞，胰蛋白酶消化，洗涤，重悬浮于FACSCAN缓冲液中。加入抗H2Kb/H-2D单克隆抗体或抗I-Ab单克隆抗体，随后通过流式细胞分析检测WF-3肿瘤细胞上的MHC I类和II类表达。(8A)与MHC I类阴性对照(细线)相比，WF-3肿瘤细胞是MHCI类呈递阳性的(粗线)。(8B)WF-3肿瘤细胞是MHC II类呈递阴性的。细线表示MHC II类阴性对照的染色。

图9A-9B显示在图9A和图9B所示的两个独立试验中，WF-3肿瘤剂量对腹水形成的影响。WF-3肿瘤细胞以不同剂量(1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵和1×10⁶细胞/小鼠)腹膜内注射到C57BL/6小鼠内。小鼠一周两次监测腹水形成和肿瘤生长。注意：所有小鼠均腹膜内注射5×10⁴、1×10⁵和1×10⁶细胞，在30天内产生腹水，且肿瘤生长。在肿瘤注射90天后，注射1×10⁴细胞的小鼠中有20％无肿瘤，无腹水形成。数据来源于进行的两个实验中的一个代表性实验。

图10显示WF-3肿瘤细胞中鼠间皮素的表达，通过RT-PCR及凝胶电泳证实。图10.RT-PCR。使用Superscript一步RT-PCR试剂盒(Gibco，BRL)和一组引物：5′-CCCGAATTCATGOCCTTGCCAACAGCTCGA-3′(SEQ IDNO：11)和5′-TATGAATCCGCTCAGCCTTAAAGCTGGGAG-3′(SEQ ID NO：12)，进行RT-PCR。第1道：分子量标准。第2道：来源于W-3细胞的RNA，第3道：来源于间皮素阴性B16肿瘤细胞的RNA。在第2道(WF-3细胞)观察到特异性扩增(用箭头表示)，但在第3道(B16细胞)中未观察到。

图11显示使用间皮素特异的DNA疫苗对WF-3肿瘤生长的体内肿瘤保护实验。小鼠在一周后接受相同剂量的加强，随后在1周后用5×10⁴WF-3细胞/小鼠腹膜内攻击。通过触诊和检查监测小鼠的腹水形成。在第90天杀死小鼠。注意：与接种其它DNA相比，接种pcDNA3-间皮素DNA使无肿瘤小鼠的百分数显著更高(P＜0.001)。此处显示的结果来源于进行的两个实验中的一个代表性实验。

图12显示CTL测定，其证明接种间皮素特异的DNA疫苗诱导的特异性裂解。小鼠(每组5只)用不同的DNA疫苗皮内免疫。小鼠在一周后接受相同剂量的加强。接种14天后收集小鼠脾细胞。为了进行细胞毒性测定，脾细胞与间皮素蛋白一起培养6天，用作效应细胞。WF-3肿瘤细胞作为靶细胞。WF-3细胞与脾细胞以不同的效靶比混合。通过定量测定LDH检测细胞溶解。注意：与其它DNA疫苗相比，pcDNA3-间皮素DNA疫苗产生显著更高百分比的特异性裂解(P＜0.001)。该图中的数据来源于进行的两个实验中的一个代表性实验。

发明详述

定量基因表达的高通量技术的最新进展使得在人癌症中差异表达的多种基因得到鉴定。然而，差异表达本身不能说明抗原是治疗靶标。因此，为了鉴定免疫学相关的肿瘤抗原，对SAGE基因表达数据库进行功能免疫学筛查。我们以前报道了在接受胰腺癌疫苗的14名患者的3名中，无疾生存期延长与抗肿瘤免疫的体内诱导之间的关系。在此我们鉴定间皮素是一种肿瘤抗原，它可被从这些接种患者中分离的未培养的CD8⁺T细胞识别。而且，在接受相同疫苗但是复发的其它11名患者中未发现间皮素特异的T细胞的诱导。为了证实间皮素是一种肿瘤抗原，我们证实所有患者都对另外一种差异表达的基因产物——前列腺干细胞抗原无应答。这些数据确定了间皮素是疫苗诱导的免疫应答的一种体外标记物，它与临床抗癌应答有关。本发明人也描述了一种功能基因组方法，用于鉴定并证实其它一些免疫学相关的人肿瘤抗原。

本发明的疫苗能够通过本领域公知的任何方法施用，以诱导T细胞细胞溶解反应。这些方法包括口服、静脉内注射、经皮划破、皮下注射、肌肉内注射和鼻内施用。这些疫苗能够通过基因枪皮内施用。可以在基因枪中使用DNA包被的金颗粒。也能够使用本领域公知的其它接种途径。

也可以使用有利于产生溶细胞性T细胞应答的其它试剂。这些试剂在此被称为载体。包括但不限于：B7共同刺激分子、白介素-2、干扰素-γ、GM-CSF、CTLA-4拮抗剂、OX-40/OX-40配体、CD40/CD40配体、沙格司亭、左旋咪唑、痘苗病毒、卡介苗(BCG)、脂质体、明矾、弗氏完全或不完全佐剂、脱毒的内毒素、矿物油、表面活性剂，如卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽和油或烃乳剂。优选诱导T细胞免疫应答的载体，相比抗体应答，其优先刺激溶细胞性T细胞应答，但是也能够使用刺激这两种类型应答的载体。当该试剂是一种多肽时，能够施用该多肽本身或编码该多肽的多核苷酸。载体可以是一种细胞，如抗原呈递细胞(APC)或树突细胞。抗原呈递细胞包括如下细胞型：巨噬细胞、树突细胞和B细胞。其它专业抗原呈递细胞包括单核细胞、边缘区枯否细胞、小胶质、郎罕氏细胞、指突状树突细胞、滤泡树突细胞和T细胞。也能够使用兼性抗原呈递细胞。兼性抗原呈递细胞的例子包括：星形胶质细胞、滤泡细胞、内皮和成纤维细胞。载体可以是一种细菌细胞，其经转化表达多肽或者输送一种多核苷酸，该多核苷酸随后在接种的个体的细胞中表达。能够加入佐剂，如氢氧化铝或磷酸铝，以提高疫苗触发、增强或延长免疫应答的能力。其它物质，如细胞因子、趋化因子和细菌核酸序列，如CpG，也是可能的佐剂。佐剂的其它代表性实例包括合成佐剂QS-21，其含有从Quillaja saponaria树皮和短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)中纯化的同质皂苷(McCune等人，Cancer，1979；43：1619)。应当理解，佐剂经过优化。换言之，熟练技术人员能够进行常规实验，来确定将要使用的最佳佐剂。

也能够使用其它添加剂，如防腐剂、稳定剂、佐剂、抗生素和其它物质。能够加入防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧基乙醇，以减缓或停止无意污染造成的细菌或真菌的生长，特别是准备多次使用或给药的疫苗瓶中可能发生的。能够加入稳定剂，如乳糖或谷氨酸单钠(MSG)，以使疫苗制剂在多种条件下稳定，如温育变化或冻干过程。

能够利用病毒载体施用编码多肽的多核苷酸，该多肽含有间皮素表位。这些病毒载体包括痘苗病毒和禽病毒，如新城疫病毒。可以使用的其它病毒载体在本领域公知。

施用多肽疫苗的一种具体方法是将多肽体外脉冲到APC或树突细胞上。该多肽与APC或树突细胞表面上的MHC分子结合。用干扰素-γ预先处理APC或树突细胞能够提高APC或树突细胞上MHC分子的数量。脉冲的细胞然后能够用作该多肽的一种载体。肽的脉冲如Melero等人，GeneTherapy 7：1167(2000)所述。

裸DNA能够直接注射到宿主内，产生免疫应答。这些裸DNA疫苗可以肌肉内注射到人肌肉组织内，或者经皮或皮内施用疫苗DNA，一般是使用颗粒轰击(biolistic)-介导的基因转移(即基因枪)。描述用于DNA免疫的基因枪和肌肉注射输送策略的最新综述包括Tuting，Curr.Opin.Mol.Ther.(1999)1：216-25，Robinson，Int.J.Mol.Med.(1999)4：549-55，Mumper和Ledbur，Mol.Biotechnol.(2001)19：79-95。输送质粒DNA的其它可能的方法包括电穿孔和离子电渗法。

另外一种可能的基因输送系统包括DNA与聚阳离子脂质体形成的离子复合物(参见，例如Caplen等人.(1995)Nature Med.1：39)。由于生物流体中聚电解质的电荷屏蔽效应，这些复合物通过静电作用能够结合在一起。一种强碱性脂类组合物能够稳定该复合物，但是这些脂类可能是细胞毒性的。其它可能的输送DNA的方法包括电穿孔和离子电渗法。

在DNA疫苗中使用细胞内和细胞间靶向策略可以进一步增强间皮素特异的抗肿瘤作用。以前，曾经使用细胞内靶向策略和细胞间扩散策略增强抗原的MHC I类或MHC II类呈递，分别产生CD8⁺或CD4⁺T细胞介导的强抗肿瘤免疫。例如，在DNA疫苗中，使用结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)热休克蛋白70(HSP70)(Chen等人，(2000)，Cancer Research，60：1035-1042)、钙网蛋白(Cheng等人，(2001)J Clin Invest，108：669-678)或铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A的易位结构域(结构域II)(ETA(dII))(Hung等人，(2O01)Cancer Research，61：3698-3703)与E7连接，增强了模型抗原HPV-16 E7的MHC I类呈递。为了增强MHC II类抗原加工，溶酶体结合的膜蛋白(LAMP-1)的分选信号与E7抗原连接，产生Sig/E7/LAMP-1嵌合体(Ji等人，(1999)，Human Gene Therapy，10：2727-2740)。为了进一步提高裸DNA疫苗的效能，能够使用促进细胞间抗原扩散的细胞间策略。这提高了DNA疫苗的效能，使用单纯疱疹病毒(HSV-1)VP22(一种HSV-1间层蛋白)已经证明这一点，该间层蛋白证明具有明显的细胞间转运特性，并且能够将蛋白质分配到周围许多细胞上(Elliot等人，(1997)Cell，88：223-233)。这样增强的连接蛋白质的细胞间扩散使抗原特异性CD8⁺T细胞介导的免疫应答和抗肿瘤作用增强。能够利用所有这些方法增强DNA疫苗对表达间皮素的肿瘤的效能。

已知间皮素在卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤和食道、肺和子宫颈的鳞状细胞癌中表达。因此，本发明的疫苗可用于治疗至少这些类型的肿瘤。表达间皮素的其它肿瘤也能够类似地治疗。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含一种多肽，该多肽含有间皮素的至少一种MHC I类结合表位，或者间皮素的至少一种MHC II类结合表位。此外，本发明的疫苗任选地含有一种多核苷酸，该多核苷酸编码一种多肽，该多肽含有间皮素的至少一种MHC I类结合表位，或者间皮素的至少一种MHC II类结合表位。任选地，疫苗的多肽(或者疫苗的多核苷酸编码的多肽)含有多种间皮素的MHC I类结合表位和/或间皮素的MHC II类结合表位。这些多肽的多种表位可以结合相同或不同的MHC等位基因分子。在一个实施方案中，该多肽的表位结合多种MHC等位基因分子。

尽管MHC I类结合表位在本发明的实施中有效，但是也能够使用MHCII类结合表位。前者可用于激活CD8⁺T细胞，后者用于激活CD4⁺T细胞。能够利用可公开获得的算法选择与MHC I类和/或II类分子结合的表位。例如，预测算法“BIMAS”根据预测的肽/HLA复合物的半衰期离解排列可能的HLA结合表位(23)。“SYFPEITHI”算法根据说明存在一级和二级HLA结合锚定残基的得分排列肽(25)。这两种计算机化的算法都根据指定蛋白质内的氨基酸序列对候选表位进行评分，该蛋白质具有与以前发表的HLA结合表位类似的结合基序。也能够利用其它算法鉴定用于进一步的生物检测的候选物。

用于免疫产生溶细胞性T细胞应答的多肽长度任选地为8-25个氨基酸残基。尽管在此具体公开了九聚体，但是也能够使用九聚体的任意8个连续氨基酸。这些多肽能够与其它这样的表位多肽融合，或者它们能够与载体(如B-7、白介素-2或干扰素-γ)融合。这种融合多肽能够通过重组生产或者通过化学连接制备，例如使用异双功能连接试剂。能够使用多肽混合物。可以是MHC分子的一种等位基因类型的表位混合物，或者多种等位基因类型的表位的混合物。这些多肽也能够含有一系列重复的表位序列或一系列不同的表位序列。

间皮素的MHC I类结合表位或间皮素的MHC II类结合表位在疫苗中作为免疫原的有效性能够如下评价：当在适当条件下，含有该表位的肽与抗原呈递细胞上的MHC分子结合并且与T淋巴细胞接触足以激活T淋巴细胞的一段时间时，估计该肽是否能够激活个体的T淋巴细胞，其中该个体对过量表达间皮素的肿瘤具有成功的免疫应答(相对于作为该肿瘤来源的正常组织)。这种评价的一个具体例子在下文实施例1-4中说明。

多个研究小组克隆了编码间皮素的cDNA，cDNA克隆的序列以及编码的间皮素多肽的序列已经在美国专利号6,153,430，Chang和Pastan，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，93：136-140(1996)，Kojima等人，J.Biol.Chem.，270：21984-21990(1995)和美国专利号5,723,318中报告。这些参考文献，包括间皮素编码核酸的序列，相应的间皮素多肽，和此处所述的片段，在此全文引用作为参考。间皮素cDNA编码一种分子量约为69kD的蛋白质，即初级翻译产物。间皮素的69kD形式被蛋白水解加工，形成一种40kD的膜结合成熟间皮素蛋白(Chang和Pastan(1996))。如此处所用的术语“间皮素”包括间皮素的所有天然存在的变体，无论表达蛋白质的细胞或组织如何。在一个实施方案中，该间皮素蛋白含有下列一种或多种氨基酸序列：SLLFLLFSL(SEQ ID NO：1)；VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)；ELAVALAQK(SEQ ID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)。例如，该间皮素蛋白任选地含有一种、两种、三种、四种或五种这样的表位。在另外一个实施方案中，该间皮素蛋白含有全部下列氨基酸：SLLFLLFSL(SEQ ID NO：1)；VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)；ELAVALAQK(SEQID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQ ID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)。

本发明的疫苗任选地含有间皮素或编码间皮素的多核苷酸。例如，该疫苗可能含有或者编码间皮素的成熟形式、间皮素基因的初级翻译产物或全长翻译产物。在一个实施方案中，该疫苗含有间皮素的cDNA。除了使用天然存在的间皮素形式(或者编码这些形式的多核苷酸)之外，在疫苗中还可以使用含有间皮素片段或编码间皮素片段的多核苷酸的多肽。疫苗中的或者疫苗的多核苷酸编码的多肽任选地与间皮素至少约95％，至少约90％，至少约85％，至少约80％，至少约75％，至少约70％，至少约65％，至少约60％，至少约55％，或者至少约50％相同。

在本发明的一个备选实施方案中，该疫苗的多肽或该疫苗的多核苷酸编码的多肽不是一种天然存在的间皮素蛋白，如成熟间皮素蛋白，间皮素的初级翻译产物，或成熟巨核细胞强化因子。

在一个实施方案中，间皮素的MHC I类结合表位的长度不到15个氨基酸，不到14个氨基酸，不到13个氨基酸，不到12个氨基酸，或者不到11个氨基酸。在另外一个实施方案中，间皮素的MHC I类结合表位含有一种肽中存在的至少7个或者至少8个连续氨基酸，该肽选自：SLLFLLFSL(SEQ ID NO：1)、VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)、ELAVALAQK(SEQID NO：3)、ALQGGGPPY(SEQ ID NO：4)、FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)。间皮素的MHC I类结合表位长度为至少7个氨基酸，至少8个氨基酸，或者至少9个氨基酸。

另外，在本发明的疫苗中使用的间皮素的MHC I类结合表位和间皮素的MHC II类结合表位不需要必须在序列上与间皮素内天然存在的表位序列相同。天然存在的表位序列不一定是刺激CTL应答的最佳肽。参见，例如(Parkhurst，M.R.等人，J. Immunol.，157：2539-2548，(1996)；Rosenberg，S.A.等人，Nat Med.， 4：321-327，(1998))。因此，它们能够用于修饰表位，使其更容易诱导CTL应答。表位通常可以在两种类型的位点处修饰。表位可以在预测可与MHC分子相互作用的氨基酸残基处修饰，在此情况下目的在于产生比亲本表位具有更高MHC分子亲和力的一种肽序列。这些表位也能够在预测可与CTL上的T细胞受体相互作用的氨基酸处修饰，在此情况下目的在于产生比亲本表位具有更高T细胞受体亲和力的一种表位。这两种类型的修饰都能够产生一种变异表位，它与亲本表位有关，但是能够比亲本表位更好地诱导CTL应答。

因此，在下列实施例中鉴定的或者通过使用本发明的方法鉴定的间皮素的MHC I类结合表位(SEQ ID NO：1-6)，以及使用本发明的方法鉴定的间皮素的MHC II类结合表位，能够通过在表位序列内不同的(可能是选择性)位点处置换一个或多个残基而修饰。这些置换可以是保守置换，例如，一个氨基酸被置换为类似结构和特征的氨基酸，如一种疏水性氨基酸被置换为另外一种疏水性氨基酸。甚至更保守的是相同或相似大小和化学性质的氨基酸置换，如亮氨酸被置换为异亮氨酸。在研究天然存在的同源蛋白质家族的序列变异中，某些氨基酸置换通常比其它的更能耐受，它们通常显示与原始氨基酸与其置换之间的大小、电荷、极性和疏水性相似性相关，这是定义“保守置换”的基础。

保守置换在此被定义为下列5组之一的交换：第1组—小的脂肪族、非极性或轻微极性的残基(Ala、Ser、Thr、Pro、Gly)；第2组-极性、带负电的残基及其酰胺(Asp、Asn、Glu、Gln)；第3组-极性、带正电的残基(His、Arg、Lys)；第4组-大的脂肪族、非极性残基(Met、Leu、Ile、Val、Cys)；和第5组-大的芳香族残基(Phe、Tyr、Trp)。一种酸性氨基酸也可以被置换为一种不同的酸性氨基酸，或者一种碱性(即碱)氨基酸可以被置换为一种不同的碱性氨基酸。保守性较差的置换可能包括一种氨基酸被具有类似特性，但是大小略微不同的另外一种氨基酸的置换，例如丙氨酸被异亮氨酸残基的置换。

例如，能够利用质粒和病毒载体在一种宿主细胞中表达一种肿瘤抗原蛋白。宿主细胞可以是任何一种原核或真核细胞。因此，例如，能够使用克隆间皮素蛋白产生的、编码全长蛋白质的全部或选择部分的核苷酸序列，通过微生物或真核细胞过程产生一种重组形式的间皮素多肽。编码序列能够连接到一种载体内，并且能够利用荷载的载体转化或者转染宿主，它们或者是真核(例如酵母、鸟类、昆虫或哺乳动物)或者是原核(细菌)细胞。这些技术包括本领域公知的标准方法。

一般而言，用于在体内或体外表达多肽的表达载体含有一种编码抗原多肽的核酸，该核酸与至少一个转录调节序列有效连接。这些调节序列在本领域公知，能够选择用来引导所述蛋白质以希望的方式(时间和空间)表达。例如，Goeddel，《基因表达技术：酶学方法》，AcademicPress，San Diego，CA (1990)描述了转录调节序列。

适于表达含有HLA结合表位的多肽的载体包括以下类型的质粒：pBR322衍生的质粒、pEMBL-衍生的质粒、pEX-衍生的质粒、pBTac-衍生的质粒和pUC-衍生的质粒，用于在原核细胞(如大肠杆菌)中表达。为了便于载体在细菌中繁殖，哺乳动物表达载体可以含有原核和真核序列，以及一种或多种能够在真核细胞中表达的真核转录单元。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体是适于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的例子。为了利于在原核和真核细胞中复制和选择，一些这样的载体用来自细菌质粒(如pBR322)的序列修饰。此外，如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或EB病毒(pHEBo、pREP衍生的和p205)等病毒的衍生物能够用来在真核细胞中瞬时表达蛋白质。也能够使用痘苗和禽病毒载体。可以在载体制备和宿主生物转化中使用的方法在本领域公知。关于适用于原核和真核细胞的其它表达系统，以及普通重组方法，参见《分子克隆：实验室手册》，第二版，Sambrook，Fritsch和Maniatis编著(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)，第16、17章。

也能够使用其它类型的表达盒。例如，以下描述病毒、细菌和酵母载体的参考文献说明可以在本发明中使用的其它表达载体。

在本发明的另外一个实施方案中，此处所述的一种多肽，或者编码该多肽的多核苷酸，在含有酵母的免疫原性组合物中被输送到一种宿主生物中。最近综述了活酵母DNA疫苗载体在抗原输送中的用途，报道在使用整个重组酿酒酵母表达肿瘤或HIV-1抗原的小鼠模型中有效(参见Stubbs等人.(2001)Nature Medicine 7：625-29)。

活酵母疫苗载体的用途在本领域公知。此外，美国专利号5,830,463，其内容在此引用作为参考，描述了在本发明中特别有用的载体和系统。在本发明的肿瘤/癌症疫苗方法和制剂中使用酵母输送系统可能特别有效，因为酵母似乎能够触发细胞介导的免疫，而不需要其它佐剂。特别优选的酵母疫苗输送系统是非致病的酵母，其携带至少一种能够调节免疫应答的重组表达系统。

细菌也能够作为本发明的表位的载体。一般而言，使用的细菌是突变体或重组体。细菌任选地减毒。例如，已经发展了大量细菌种用作疫苗，并且能够在本发明中使用，包括但不限于：弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)或分枝杆菌。在免疫原性组合物中使用的细菌载体可以是一种兼性细胞内细菌载体。可以利用细菌将此处所述的一种多肽输送给宿主生物中的抗原呈递细胞。最近综述了活细菌疫苗载体在抗原输送中的用途(Medina和Guzman(2001)Vaccine 19：1573-1580；Weiss和Krusch，(2001)Biol. Chem. 382：533-41；Darji等人.(2000)FEMSImmunol and Medical Microbiology 27：341-9)。此外，美国专利号6,261,568和6,488,926，其内容在此引用作为参考，也描述了可用于癌症疫苗的系统。

细菌介导的基因转移在通过肌肉内、皮内或口服施用质粒的遗传接种中特别有用；这种接种致使抗原在被接种者中表达。而且，细菌也能够产生佐剂作用，以及靶向免疫系统的诱导部位的能力。而且，细菌疫苗载体具有几乎无限的复制能力。细菌载体的使用通常与其它一些明显的好处有关，如直接粘膜或口服的可能性。能够使用的其它一些直接粘膜施用系统(除了活病毒或细菌疫苗载体外)包括粘膜佐剂、病毒颗粒、ISCOM、脂质体和微粒。

减毒的和共生微生物已经成功用作疫苗抗原的载体。在本发明中可以使用的减毒粘膜病原体包括：单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏茵属的种、霍乱弧菌(V.cholorae)、志贺氏菌属的种、分枝杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏茵和炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)。能够在本发明中使用的共生菌株包括：S.gordonii、乳杆菌属(Lactobacillus)的种和葡萄球菌属(Staphylococcus)的种。能够调节在制剂中使用的载体株的遗传背景，为实现减毒选择的突变类型，和免疫原的内在性质，来优化引发的免疫应答的程度和质量。为了优化细菌载体刺激的免疫应答需要考虑的普通因素包括：载体的选择；具体的背景株，减毒突变和减毒水平；减毒表型的稳定和最佳剂量的确定。需要考虑的其它抗原相关因素包括：抗原的内在性质；表达系统，抗原展示形式，和重组表型的稳定；调节分子的共同表达，和接种程序。

鼠伤寒沙门氏菌能够在本发明的免疫原性组合物中用作一种细菌载体。使用该细菌作为疫苗的一种有效载体在本领域中已经得到证实。例如，已经描述了鼠伤寒沙门氏菌作为经口身体转基因接种的一种减毒载体的用途(参见Darji等人.(1997) Cell 91：765-775；和Darji等人.(2000)FEMS Immun and Medical Microbiology 27：341-9)。实际上，已经使用减毒鼠伤寒沙门氏茵作为载体，获得了细菌介导的基因转移的大量知识。已经使用的两种代谢减毒的菌株包括鼠伤寒沙门氏茵aroA，它不能合成芳族体氨基酸，和鼠伤寒沙门氏茵22-11，其嘌呤代谢缺陷。已经使用这些载体表达了几种抗原：最早成功检测了李斯特茵溶胞素和actA(单核细胞增生李斯特氏菌的两种毒力因子)和大肠杆菌的β-半乳糖苷酶(β-gal)。在口服单剂量重组沙门氏菌后能够检测针对这些抗原的细胞毒性和辅助T细胞以及特异性抗体。另外，用携带一种编码李斯特茵溶胞素的表达质粒的沙门氏茵免疫也引发针对单核细胞增生李斯特氏菌致死攻击的保护性反应。口服转基因接种法现在已经扩展到包括2型单纯疱疹病毒和乙型肝炎感染模型中的保护性应答，在粘膜水平上检测到细胞介导的免疫应答。

在使用β-gal作为一种替代肿瘤抗原的肿瘤模型中，口服携带编码β-gal的质粒的沙门氏菌诱导针对攻击性纤维肉瘤的部分保护性免疫(参见Paglia等人.(1998) Blood 92：3172-76)。在使用表达β-gal的鼠肾细胞癌系RENCA的转染体的类似实验中，Zller和Christ(Woo等人.(2001)Vaccine 19：2945-2954)证实，当编码抗原的质粒在细菌载体中施用时，比使用裸DNA具有更好的效能。有意思的是，能够利用沙门氏茵诱导针对鼠黑素瘤B16的肿瘤生长延缓应答；沙门氏茵携带编码与遍在蛋白融合的自体肿瘤抗原gp100和TRP2的表位的小基因。这提示在这些情况下，能够克服对自身抗原的外周耐受。这被同一研究小组(Lode等人.(2000) Med Ped Oncol 35：641-646)在鼠成神经细胞瘤系统中使用类似的酪氨酸羟化酶表位构建体作为自身抗原证实。而且，最近通过用编码完整hCEA的膜结合形式的一种质粒免疫人致癌抗原(hCEA)转基因小鼠，扩展了这些发现。在这种情况下，检测了一种表达hCEA的结肠癌系统，在效应期全身施用白介素2(IL-2)作为佐剂，能够改善对肿瘤致死性攻击的保护(参见Xiang等人.(2001) Clin CancerRes 7：856s-864s)。

可以在此处所述的免疫原性组合物中使用的另外一种细菌载体是伤寒沙门氏茵。通常用于免疫的伤寒沙门氏菌株——Ty21a galE——缺乏细胞壁合成的一种必要成分。最近研发的改良菌株包括通过guaBA突变减毒的菌株，它编码鸟嘌呤生物合成途径的一种必需的酶(Pasetti等人，Infect. Immun. (2002)70：4009-18；Wang等人，Infect.Immun.(2001)69：4734-41；Pasetti等人，Clin. Immunol.(1999)92：76-89)。描述伤寒沙门氏菌和/或其它沙门氏菌菌株作为DNA疫苗输送载体的用途的其它参考文献包括：Lundin，Infect.Immun.(2002)70：5622-7；Devico等人，Vaccine，(2002)20：1968-74；Weiss等人，Biol.Chem.(2001)382：533-41；和Bumann等人，FEMS Immunol.Med.Microbiol.(2000)27：357-64。

本发明的疫苗和免疫原性组合物能够使用弗氏志贺氏菌作为一种输送载体。弗氏志贺氏茵是一种细菌DNA转移载体的原型，因为它从宿主细胞的液泡逃到细胞溶胶内。已经成功使用了几种减毒的弗氏志贺氏菌突变体将DNA体外转移到细胞系。营养缺陷株的细胞壁合成(Sizemore等人.(1995)Science 270：299-302和Courvalin等人.(1995)C R Acad Sci Ser III，318：1207-12)、芳族氨基酸合成(Powell等人.(1996)《疫苗96：控制传染病的分子方法》；Cold Spring HarborLaboratory Press)或鸟嘌呤核苷酸合成(Anderson等人.(2000)Vaccine 18：2193-2202)缺陷。

本发明的疫苗和免疫原性组合物可能含有单核细胞增生李斯特氏菌(Portnoy等人，Journal of Cell Biology，158：409-414(2002)；Glomski等人，Journal of Cell Biology，156：1029-1038(2002))。Wesikirch等人，Immunol. Rev. 158：159-169(1997)综述了单核细胞增生李斯特氏茵作为一种疫苗载体的能力。最近已经发展了单核细胞增生李斯特氏茵的菌株作为有效的异源蛋白质的细胞内输送载体，其将抗原输送给免疫系统，诱导对不允许注射致病剂的临床疾病，如癌症(美国专利号6,051,237；Gunn等人，J.Of Immunology，167：6471-6479(2001)；Liau等人，Cancer Research，62：2287-2293(2002)；美国专利号6,099,848；WO99/25376；和WO96/14087)和HIV(美国专利号5,830,702)的免疫应答。也已经证明，一种表达淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)抗原的重组单核细胞增生李斯特氏茵疫苗能够诱导针对该抗原的细胞介导的保护性免疫(Shen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：3987-3991(1995))。

作为一种兼性细胞内细菌，单核细胞增生李斯特氏菌能够引发体液和细胞介导的免疫应答。在李斯特氏茵进入宿主生物的细胞内后，李斯特氏菌产生李斯特氏菌特异的蛋白质，该蛋白质能够使其从吞噬宿主细胞的吞噬溶酶体逃到细胞的细胞溶胶内。单核细胞增生李斯特氏菌在其中增殖，表达存活必需的蛋白质，也表达与李斯特氏菌启动子有效连接的异源基因。MHC蛋白质在吞噬细胞表面上呈递这些异源蛋白质的肽可以产生T细胞应答。可用于将异源基因导入细菌内作为疫苗的两种整合载体包括pL1和pL2，如Lauer等人，Journal of Bacteriology，184：4177-4186(2002)所述。

另外，也已经产生了在免疫原性组合物中有用的单核细胞增生李斯特氏茵的减毒形式。单核细胞增生李斯特氏菌的ActA蛋白足以促进引起细胞内运活动的肌动蛋白补充和聚合事件。已经报告了一项人类安全性研究，口服单核细胞增生李斯特氏菌的一种actA/plcB-缺失的减毒形式在成年人中不会引起严重的后遗症(Angelakopoulos等人，Infection and Immunity，70：3592-3601(2002))。也描述了单核细胞增生李斯特氏茵的其它类型的减毒形式(参见，例如WO 99/25376和美国专利号6,099,848，其中描述了表达异源抗原的李斯特氏菌的营养缺陷型减毒株)。

小肠结肠炎耶尔森氏菌是另外一种细胞内细菌，它能够任选地在本发明的免疫原性组合物中作为一种细菌载体。小肠结肠炎耶尔森氏菌的减毒株作为疫苗载体的用途在PCT公开文本WO 02/077249中描述。

在本发明的其它一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有分枝杆菌，如卡介苗(BCG)。卡介苗已经在小鼠模型上用作疫苗载体(Gicquel等人，Dev.Biol.Stand 82：171-8(1994))。参见Stover等人，Nature 351：456-460(1991)。

此外，也能够使用病毒载体。病毒载体一般含有高度减毒的非复制型病毒。病毒载体包括但不限于DNA病毒载体，如基于腺病毒、单纯疱疹病毒、禽病毒如新城疫病毒、痘病毒如痘苗病毒和细小病毒包括腺伴随病毒的载体；和RNA病毒载体，包括但不限于逆转录病毒载体。美国专利号4,722,848描述了在免疫方案中有用的痘苗载体和方法。逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒和慢病毒，如人类免疫缺陷病毒。Naldini等人.(1996)Science 272：263-267。能够使用携带本发明的一种多核苷酸作为逆转录病毒基因组一部分的复制缺陷型逆转录病毒载体。这些载体已经详细描述。(Miller等人.(1990)Mol.Cell Biol.10：4239；Kolberg，R.(1992) J.NIH Res.4：43；Cornetta等人.(1991)Hum.Gene Therapy 2：215)。

在本发明中有用的腺病毒和腺伴随病毒载体可以按照本领域所述的方法产生。(参见，例如Karlsson等人.(1986)EMBO 5：2377；Carter(1992)Current Opinion in Biotechnology 3：533-539；Muzcyzka(1992)Current Top.Microbiol.Immunol.158：97-129；《基因打靶：实践方法》(1992) A.L.Joyner编著，Oxford University Press，NY)。有几种不同的方法是可行的。

甲病毒载体，如委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒、塞姆利基森林病毒(SFV)和辛德毕斯病毒载体能够用于有效的基因输送。复制缺陷型载体可以使用。这些载体能够通过本领域公知的多种方法施用，例如鼻内或瘤内。参见Lundstrom，Curr.Gene Ther.2001 1：19-29。

描述在本发明的方法中能够使用的病毒载体的其它参考文献包括：Horwitz，M.S.，“腺病毒科及其复制”，Fields，B.等人(编著)，《病毒学》，第二版，Raven Press New York，pp.1679-1721，1990)；Graham，F.等人，pp.109-128，《分子生物学方法》，第7卷：基因转移和表达方法，Murray，E.(编著)，Humana Press，Clifton，N.J.(1991)；Miller等人.(1995)FASEB Journal 9：190-199，Schreier(1994)Pharmaceutica Acta Helvetiae 68：145-159；Schneider和French(1993) Circulation 88：1937-1942；Curiel等人.(1992)Human GeneTherapy 3：147-154；WO 95/00655；WO 95/16772；WO 95/23867；WO94/26914；WO 95/02697(1995年1月26日)；和WO 95/25071。

作为疫苗的另外一种形式，DNA与通常靶向细胞表面受体的脂质体或配体复合。该复合物是有用的，因为它帮助保护DNA免遭降解，并且帮助将质粒导向特定的组织。这些复合物一般通过静脉内或肌肉内注射。

用作疫苗的多核苷酸能够在含有一种胶体分散系统的复合物中使用。胶体系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂类的系统，包括水包油乳剂、微团、混合微团和脂质体。本发明优选的胶体系统是一种脂类复合的或脂质体配制的DNA。在前一种方法中，例如在DNA与脂类配制之前，首先可以为了表达通过实验优化一种质粒，其含有携带希望的DNA构建体的转基因(例如，在5’非翻译区含有一个内含子，删除不必要的序列(Felgner等人，Ann NY Acad Sci 126-139，1995)。然后可以用公知的方法与材料配制DNA与(例如)不同的脂类或脂质体材料，并将其输送到受体哺乳动物中。参见，例如Canonico等人，Am JRespir Cell Mol Biol 10：24-29，1994；Tsan等人，Am J Physiol 268；Alton等人，Nat Genet. 5：135-142，1993和美国专利号5,679,647。

另外，复合物凝聚是一种自发的相分离过程，当带有不同电荷的两种聚电解质在一种水溶液中混合时发生。两个大分子种之间的静电作用导致团聚体(富含聚合物的相)与上清液(聚合物极少的相)分离。能够利用这一现象形成微球，并且将多种化合物装入胶囊。这种胶囊化过程能够完全在低温下在水溶液中进行，因此具有保持密封剂的生物活性的好机会。在研制一种可注射控释系统时，采用了明胶与硫酸软骨素的复合物凝聚，将大量药物和蛋白质装入胶囊(参见Truong等人.(1995)DrugDelivery 2：166)，为了癌症接种，在这些微球中已经将细胞因子装入胶囊(参见，Golumbek等人.(1993)Cancer Res 53：5841)。为了向关节关节内施用，以治疗骨关节炎，也已经加入了抗炎症药物(Brown等人.(1994)331：290)。美国专利号6,193,970、5,861,159和5,759,582描述了使用复合团聚体作为本发明的DNA疫苗输送系统的组合物和方法。具体而言，美国专利号6,475,995，其内容在此引用作为参考，描述了使用核酸和聚阳离子毫微型颗粒团聚体的DNA疫苗输送系统，当口服时可以作为有效的疫苗。

能够分离对于间皮素的特定MHC I类或II类结合表位特异的抗体。这些抗体可以是单克隆或多克隆抗体。它们尤其能够用于分离及纯化多肽，用作疫苗。可结合MHC I类或II类-肽复合物(其含有间皮素的一种具体的MHC I类或II类结合表位)的T细胞系可以用来筛选T细胞佐剂和免疫应答增强剂。这些细胞系能够从用含有间皮素的疫苗免疫并且产生对间皮素的有效T细胞应答的患者中分离。

为了在小鼠模型上检验候选癌症疫苗，能够在用本发明的肿瘤细胞系攻击之前或之后，对一群小鼠施用含有希望的肿瘤抗原的候选疫苗。因此，小鼠模型能够用来检验治疗和预防效果。接种一种候选疫苗能够与未接种、只接种载体或接种一种表达无关抗原的疫苗的对照群体相比较。如果该疫苗是一种重组微生物，它的相对效能能够与基因组未被修饰、表达抗原的一群微生物相比较。能够在对肿瘤或腹水容积的影响方面，或者在存活率方面，评价候选疫苗的有效性。接种候选疫苗的小鼠的肿瘤或腹水容积可能比不接种或者接种载体或者接种表达无关抗原的疫苗的小鼠中的肿瘤体积小约5％、约10％、约25％、约50％、约75％、约90％或约100％。在向小鼠内植入肿瘤细胞后至少10天，至少约17天，或者至少约24天，可以观察到肿瘤或腹水容积的差别。例如，与不接种或者接种载体或者接种一种表达无关抗原的疫苗的小鼠相比，接种一种核酸修饰的微生物的小鼠的存活时间中值可能长至少约2天，至少约5天，至少约7天，或者至少约10天。

小鼠模型能够用来检验本领域公知的任何类型的疫苗治疗。它们可以是常规或补充药物。它们可以是免疫药物或是细胞毒性药物。例如，候选癌症治疗可以是放射治疗、化学治疗或手术。候选癌症治疗可以是两种或多种疗法或预防的组合，包括但不限于抗癌药物、抗肿瘤疫苗、放射治疗、化学治疗和手术。

本领域公知的所有癌基因都能够用来制备腹膜或间皮细胞系，用于制备小鼠模型。这些癌基因包括但不限于：Ki-ras、Erb-B2、N-ras、N-myc、L-myc、C-myc、ABL1、EGFR、Fos、Jun、c-Ha-ras和SRC。

本发明的疫苗、多核苷酸、多肽、细胞和病毒能够对人或其它哺乳动物施用。其它哺乳动物可以是家畜，如山羊、猪、牛、马和绵羊，或者可以是宠物，如狗、兔和猫。其它哺乳动物可以是实验动物，如小鼠、大鼠、兔、猴或驴。

在一种药物组合物中含有在本发明的治疗方法中使用的试剂。药物组合物一般含有一种药学可接受的载体，它满足无菌、等渗性、稳定性和非致热原性的工业标准，在使用的剂量和浓度下对受体无毒。使用的具体载体取决于组合物中治疗剂的类型和浓度，和目的施用途径。希望时，可能包含一种稳定化合物。药物组合物的配制众所周知，例如在美国专利5,580,561和5,891,725中描述。

治疗有效剂量的确定在本领域技术人员的能力范围之内。治疗有效剂量是指与没有该治疗有效剂量相比，能够提高抗肿瘤细胞毒性T细胞活性的有效成分的剂量。

对于任何物质，治疗有效剂量最初能够通过细胞培养测定或者动物模型估计，通常是小鼠、兔、狗或猪。动物模型也能够用来测定适当的浓度范围和施用途径。然后能够利用这些信息确定可用于人的剂量和施用途径。

治疗效能和毒性，例如ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和LD50(使50％群体致死的剂量)，能够在细胞培养或实验动物中通过标准药学方法测定。毒性与治疗效果的剂量比是治疗指数，它能够表示为LD50/ED50比。

显示高治疗指数的药物组合物是优选的。在配制用于人的剂量时使用细胞培养测定和动物研究获得的数据。这些组合物中含有的剂量优选地在包括有极少或者没有毒性的ED50的循环浓度范围内。该剂量在该范围内变化，取决于使用的剂型、患者的敏感性和施用途径。

准确的剂量由医生根据与需要治疗的患者有关的因素确定。调节剂量和施用，以提供足够水平的有效成分，或者保持希望的效果。能够考虑的因素包括疾病的严重程度、患者的一般健康情况、年龄、体重和患者的性别、饮食、施用时间和频率、药物组合、反应灵敏性和对治疗的耐受/反应。长效作用的药物组合物能够每3-4天、每周或者每两周施用一次，这取决于具体制剂的半衰期和清除率。

正常剂量可以是0.1-100,000微克，可达约1g的总剂量，取决于施用途径。关于具体剂量和施用方法的指南在文献中提供，本领域的医生通常能够获得。本领域技术人员可以使用与蛋白质或其抑制剂不同的核苷酸制剂。类似地，多核苷酸或多肽的施用对于具体细胞、条件、位置等将是特异的。多核苷酸和多肽的有效的体内剂量是约100ng-约200ng、500ng-约50mg、约1μg-约2mg、约5μg-约500μg、约20μg-约100μg。

希望用作抗肿瘤疫苗的免疫原是在肿瘤与其相应正常组织之间高度差异表达的免疫原。表达差异优选地为至少2倍、3倍、4倍、5倍乃至10倍。表达能够用本领域公知的任何方法测定，包括但不限于SAGE、微阵列、Northern印迹和Western印迹。通过测定人体产生被蛋白质特异激活的CD4或CD8T细胞，对蛋白质(或编码基因)免疫的应答，可以增强这些蛋白质作为免疫原的意义。尤其能够使用TAP缺陷细胞系，如人T2细胞系，在MHC复合物中呈递可能的抗原，进行这些激活的检测。激活能够用本领域公知的任何测定法测定。一种这样的测定是ELISPOT测定。参见参考文献33-35。

将来对肿瘤疫苗的应答能够根据CD8⁺和/或CD4⁺T细胞应答来预测。如果肿瘤疫苗含有间皮素或者间皮素的至少一种T细胞表位，则监测对间皮素的CD8+和/或CD4+应答提供有用的预后信息。强CD8+和/或CD4+应答表明患者已经产生了有效的免疫应答，其存活期明显长于不这产生这种应答的患者。该肿瘤疫苗可以含有完整肿瘤细胞，特别是胰腺、卵巢或间皮瘤细胞。该肿瘤疫苗可以含有肿瘤细胞与树突细胞的聚乙二醇融合体。该肿瘤疫苗可以含有与树突细胞一起温育的凋亡或坏死的肿瘤细胞。该肿瘤疫苗可以含有与树突细胞一起温育的RNA或整个RNA。对间皮素的T细胞应答能够用本领域公知的任何测定法测定，包括ELISPOT测定。此外，通过测定对间皮素的迟发型超敏反应也能够监测将来对这种肿瘤疫苗的应答。这种应答已经被确定是一种阳性预后指标。

能够检验为一种可能的药物或免疫增强剂的待测物质可以是本领域公知的任何物质。该物质可以是以前对于另外一种用途所知的，或者可以是以前对于任何用途均不知的。该物质可以是一种纯化的化合物，如一种蛋白质、核酸或小分子，或者可以是一种混合物，如来自天然来源的提取物。该物质可以是一种天然产物，或者可以是一种合成产物。该物质可以是为了该目的特定且有目的地合成的，或者可以是能够筛查的化合物文库中的一种物质。

已经参照具体实施例描述了本发明，包括当前实施本发明的优选模式，但是本领域技术人员应当理解，如权利要求书所述的本发明的精神和范围内包括上述系统和技术的大量变化和修饰。

实施例

实施例1

为了鉴定能够作为大多数胰腺癌患者的潜在免疫靶标的基因，我们只聚焦于那些大多数胰癌患者过量表达且疫苗细胞系过量表达的未突变的基因。在该列表最前面的一种基因是间皮素(20，21)。为了比较和证实，我们也研究了前列腺干细胞抗原(PSCA)。SAGE数据证实，胰腺癌将以与间皮素类似的水平表达PSCA(22)。

我们利用两种公开使用的计算机算法的组合(23-25)预测可与三种常见的人白细胞抗原(HLA)I类分子结合的肽九聚体。用同种异体GM-CSF疫苗处理的所有14名患者都至少表达这些HLA I类分子之一(表2)。预测算法“BIMAS”根据肽/HLA复合物的预测的半衰期离解排列可能的HLA结合表位(23)。“SYFPEITHI”算法根据表明存在一级和二级HLA结合锚定残基的得分排列肽(25)。这两种计算机化的算法都根据指定蛋白质内的氨基酸序列对候选表位进行评分，该蛋白质具有与以前发表的HLA结合表位类似的结合基序。我们为HLA-A2、HLA-A3和HLA-A24合成了排列在前两位的间皮素表位，为两种算法优选的每一种MHC分子合成了前6位的PSCA表位(表1)，因为在我们的疫苗研究中治疗的14名患者至少表达这三种HLA I类分子之一(表2)。

表1.预测可与HLA A2、A3和A24结合的间皮素肽

HLA限制	氨基酸序列	蛋白质中的氨基酸位点
HLA限制	氨基酸序列	蛋白质中的氨基酸位点	HLA-A2HLA-A2HLA-A2HLA-A2HLA-A2HLA-A3HLA-A3HLA-A3HLA-A3HLA-A3HLA-A3HLA-A3HLA-A3HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24	SLLFLLFSLVLPLTVAEVLLALLMAGLALQPGTALLALLPALGLLELAVALAQKALQGGGPPYALQPAAAILLLALLMAGLALQPGTALLLLPALGLLLQLGEQCWTAALLCYSCKAFYPGYLCSLLYPKARLAFDYYVGKKNIALLPALGLLALQPAAAILLLPALGLLLYYVGKKNIT	间皮素A2_(20-28)间皮素A2_(530-538)PSCA A2_(5-13)PSCA A2_(14-22)PSCA A2_(108-116)间皮素A3_(83-92)间皮素A3_(225-234)PSCA A3_(99-107)PSCA A_(5-13)PSCA A3(_14-22)PSCA_(109-117)PSCA A3_(43-51)PSCA A3_(20-28)间皮素A24_(435-444)间皮素A24_(475-484)PSCA A24_(76-84)PSCA A24_(108-116)PSCA A24_(99-101)PSCA A24_(109-117)PSCA A24_(77-85)

三种肽HIV-gag A2_77-85(SLYNTVATL)(48)、HIV-NEF A3_94-103(QVPLRPMTYK)(49)和酪氨酸酶A24_206-214(AFLPWHRLF)(50)是以前发表的表位，分别用作HLA-A2、A3和A24结合的对照肽。所有结合研究都使用间皮素A1_309-318结合表位(EIDESLIFY)作为阴性对照肽。所有HLA-A2研究都使用M1肽(GILGFVFTL)_58-66(Gotch等人1988)作为阳性对照。

表2.用分泌GM-CSF的同种异体胰腺癌疫苗治疗的14名患者的选

择的特征

患者编号	疾病状态T(cm)LN空白	剂量×10⁷细胞	接受的疫苗总数	在A基因座处的HLAI类表达¹	疫苗后对自身肿瘤的DTH的增强²	无瘤生存期(月)	总生存期(月)
患者编号	疾病状态T(cm)LN空白	剂量×10⁷细胞	接受的疫苗总数	在A基因座处的HLAI类表达¹	疫苗后对自身肿瘤的DTH的增强²	无瘤生存期(月)	总生存期(月)	1	3.0 5/17 -	1	2	A1，A2	0	11	14
2	2.7 3/17 +	1	1	A2，A3	0	6	14	1	3.0 5/17 -	1	2	A1，A2	0	11	14
2	2.7 3/17 +	1	1	A2，A3	0	6	14	3	2.5 3/11 +	1	1	A1，A3	0	9	18
4	2.5 3/14 -	5	1	A2，A29	0	8	10	3	2.5 3/11 +	1	1	A1，A3	0	9	18
4	2.5 3/14 -	5	1	A2，A29	0	8	10	5	2.7 2/23 -	5	4	A3，A3	0	15	39
6	2.5 2/17 -	5	3	A2，A24	0	13	27	5	2.7 2/23 -	5	4	A3，A3	0	15	39
6	2.5 2/17 -	5	3	A2，A24	0	13	27	7	4.0 4/13 +	10	1	A31，A24	0	16	18
8	2.7 5/18 +	10	2	A2，A3	252mm	60+	60+	7	4.0 4/13 +	10	1	A31，A24	0	16	18
8	2.7 5/18 +	10	2	A2，A3	252mm	60+	60+	9	1.2 2/11 -	10	1	A3，A31	0	8	21
10	2.0 11/27 -	50	1	A3，A30	0	9	17	9	1.2 2/11 -	10	1	A3，A31	0	8	21
10	2.0 11/27 -	50	1	A3，A30	0	9	17	11	3.5 2/32 +	50	1	A1，A3	N/A	9	13
12	2.5 2/11 -	50	1	A3，A33	N/A	11	13	11	3.5 2/32 +	50	1	A1，A3	N/A	9	13
12	2.5 2/11 -	50	1	A3，A33	N/A	11	13	13	3.0 2/14 -	50	4	A3，A23	100mm	60+	60+
14	3.0 0/14 +	50	4	A1，A24	110mm	60+	60+	13	3.0 2/14 -	50	4	A3，A23	100mm	60+	60+

缩写：Pt＝患者，#＝编号，T＝手术时的肿瘤大小，LN＝阳性淋巴结数/采样的淋巴结总数，HLA＝人白细胞抗原，DTH＝迟发型超敏反应检测，Auto＝自体，N/A＝由于无法获得DTH细胞试剂，未检测，+＝仍然存活并且无疾病。

¹进行血清学HLA分型，并以分子学方法证实。

²对自体肿瘤细胞的迟发型超敏反应利用未传代的自体肿瘤细胞测定。在接种前以及在接种后28天放置10⁶个自体肿瘤细胞。报告了细胞放置48小时后观察到的硬化的垂直直径(测量单位为mm)之积的接种后改变。

通过脉冲表达相应HLA I类分子的TAP缺陷的T2细胞(T2-A2、T2-A3或T2-A24细胞)，检测这些表位与它们各自的HLA I类分子的结合。如图1A所示，脉冲两种预测可结合HLA-A2的间皮素衍生的表位可以在HLAI类特异性抗体W6/32染色后，利用流式细胞仪检测T2-A2细胞表面上的HLA-A2。相反，未脉冲的T2细胞或者用一种预测可结合HLA-A1的间皮素表位脉冲的T2细胞用相同的抗体无法染色。图1B和图1C分别显示用两种候选间皮素衍生的HLA-A3和两种候选HLA-A24表位脉冲的T2细胞的结合。对于HLA-A2、HLA-A3和HLA-A24，用PSCA衍生的肽进行一种类似的结合实验。(图1D、图1E和图1F)。

材料与方法：候选基因的鉴定和表位选择。利用SAGE确定间皮素是胰腺癌细胞系和如前报道的新鲜组织过量表达的基因之一(20，21)。利用公众可以获得的且通过互联网能够获得的两种计算机算法预测可结合HLA A2、A3和A24分子的肽。K.C.Parker与合作者发展了“BIMAS”，http：//bimas.dcrt.nih.gov/(NIH)，它测定最常见的HLA I类分子类型的最佳结合(23)。Rammensee等人发展了“SYFPEITHI”，并且根据考虑存在一级和次级MHC结合锚定残基的得分排列肽，http：//www.uni-tuebingen.de/uni/kxi (24)。

材料与方法：肽和T2细胞。肽由Macromolecular Resources(FortCollins，Colorado)根据发表的序列合成：M1肽GILGFVFTL(SEQ IDNO：10)，来源于流感基质蛋白(氨基酸位点58-66)(28)，表1列出的间皮素A2肽和PSCA A2肽用可以获得的数据库鉴定，HIV-gag A2肽SLYNTVATL(SEQ ID NO：7)(氨基酸位点75-83)(29)含有一个HLA-A2结合基序。间皮素A3肽和PSCA A3肽和HIV-NEF A3肽QVPLRPMTYK(SEQID NO：8)(氨基酸位点94-103)(30)含有一个HLA-A3结合基序。间皮素A24肽和PSCA A24肽和酪氨酸酶肽AFLPWHRLF(SEQ ID NO：9)(氨基酸位点206-214)(31)含有一个HLA-A24结合基序。对于每个测定，每种肽的贮存溶液(1mg/ml)都在10％DMSO(JTBaker，Phillippsburg，NJ)中制备，进一步用细胞培养基稀释，产生10ng/ml的终肽浓度。对照M1肽开始时溶解于100％ DMSO中，使用相同的贮存和终浓度，进一步用细胞培养基稀释。T2细胞是一种人B和T淋巴母细胞杂种，它只表达HLA-A*0201等位基因(26)。人T2细胞系是一种TAP缺陷的细胞系，它不能将新消化的HLA I类结合表位从细胞溶胶转运到内质网内，这些表位在其中与新生的HLA分子正常结合，并且稳定它们，以便细胞表面表达(26)。T2-A3是遗传修饰后表达HLA-A301等位基因的T2细胞，由Walter Storkus博士(University of Pittsburgh)惠赠(32)。T2-A24是遗传修饰后表达HLA-A24等位基因的T2细胞。HLA-A24基因由PaulRobbins博士(Surgery Branch，National Cancer Institute)惠赠(31)。T2细胞在RPMI-1640(Gibco，Grand Island，NY)、10％血清(Hyclone，Logan，Utah)中悬浮培养，其中补充了200μM L-谷氨酰胺(Gibco，GrandIsland，NY)、50单位-μg/ml青霉素/链霉素(Gibco)、1％NEAA(Gibco)和1％丙酮酸钠(Gibco)。

材料与方法：肽/MHC结合测定。将表达目的HLA分子的T2细胞重悬浮于不合AimV血清的培养基(Gibco)中，使浓度为2.5×10⁵细胞/ml，并用100-200微克肽在室温下脉冲过夜。在室温下脉冲允许优化可用于结合每种表位的空HLA分子的数量(30)。洗涤细胞，以1×10⁵细胞/ml的浓度重悬浮。肽的结合通过FACS(Beckon Dickenson，San Jose，CA)分析测定。

实施例2

为了确定间皮素和PSCA是否被CD8⁺T细胞识别，我们用患者的富含CD8⁺T细胞的PBL筛选抗原脉冲的T2细胞，这些患者接受了分泌GM-CSF的同种异体胰腺癌疫苗。我们以前报告了在最多接受两次疫苗的8名患者的3名中，接种后的体内迟发型超敏(DTH)反应与自体肿瘤存在联系。这些“DTH应答者”(它们在第一次手术切除时均有不好的预后指标)(27)只是在诊断后4年以上临床上未患胰腺癌的患者((27)，表2)。最初分析接种前和第一次接种后28天获得的PBL。用两种A3结合表位脉冲的T2-A3细胞与从患者10(无DTH应答者，在诊断9个月后复发)和患者13(DTH应答者，仍然保持无病)外周血分离的富含CD8⁺T细胞的淋巴细胞一起温育过夜，并且利用γ干扰素(IFN-γ)ELISPOT测定分析。选择ELISPOT测定是因为它只需要相对较少的淋巴细胞，是定量抗原特异性T细胞的最敏感的体外测定之一，并且将抗原特异性T细胞数量与功能(细胞因子表达)相关联(33-35)。图2A显示了接种前和第一次接种后28天，响应两种HLA-A3结合间皮素肽，在这两名患者的外周血中检测到的每1×10⁵个CD8⁺阳性T细胞的IFN-γ斑点数。

对于患者13(DTH应答者)，在接种28天后检测到间皮素特异的T细胞的诱导，而对于患者10(非DTH应答者)则检测不到。类似地，当使用分别用A2(图2B)和A24(图2C)结合表位脉冲的T2-A2和T2-A24细胞检测时，对于另外两名无病DTH应答者(患者8和患者14)，观察到间皮素特异的CD8⁺T细胞的接种后诱导，但是另外两名无DTH应答者未观察到。图2D显示了该ELISPOT结果的概要，它分析了用研究的同种异体疫苗治疗的全部14名患者在第一次接种后间皮素特异的CD8⁺T细胞的诱导。这些数据证实，在该临床试验中，观察到的接种后体内DTH应答与自体肿瘤、长期无瘤生存和接种后间皮素特异的T细胞应答的诱导之间有直接关系。具体而言，这3名DTH应答者均证实，接种后诱导对匹配各自HLA类型的每种间皮素肽的T细胞应答，而11名DTH无应答者中仅有1名接种后间皮素特异的T细胞应答增强，并且只是针对一种肽。因此，间皮素特异的T细胞应答的体外测定是一种新的候选体外免疫标记物，用来预测哪名患者对这种疫苗治疗有效。

材料与方法：外周血淋巴细胞(PBL)和供体。从接受分泌GM-CSF的同种异体胰腺癌疫苗的全部14名患者中获得外周血(100cc接种前和每次接种28天后)，作为以前报告的I期疫苗研究的一部分(27)。在患者登记参加该研究时获得贮存将要用于该抗原鉴定研究的淋巴细胞的知情同意。使用Ficoll-Hypaque(Pharmacia，Uppsala，瑞典)，通过密度梯度离心分离疫苗接种之前和之后的PBL。细胞用无血清RPMI-1640洗涤两次。PBL在含有10％DMSO的90％AIM-V培养基中冻存于-180℃下。

材料与方法：为CD8⁺T细胞富集PBL。利用人白细胞的磁性细胞分选，按照厂商说明(MACS，Miltenyi Biotec，Auburn，CA)从融化的PBL中分离CD8⁺T细胞。细胞用CD8-PE抗体(Becton Dickenson，San Jose，CA)荧光染色，以证实阳性群体含有CD8⁺T细胞，并用流式细胞仪分析。该方法始终产生＞95％的CD8⁺T细胞纯度。

材料与方法：ELISPOT测定。Multiscreen 96孔过滤板(Millipore，Bedford，MA)用60μl/孔10μg/ml抗hIFN-γ小鼠单克隆抗体(Mab)1-DlK(Mabtech，Nacka，瑞典)在4℃下包被过夜。然后用1×PBS洗孔3次，用T细胞培养基封闭2小时。在100μl T细胞培养基中用肽(10ng/ml)脉冲的1×10⁵T2细胞与纯化的1×10⁵融解的PBL温育过夜，以便重复6次在ELISPOT板上在100μl T细胞培养基中选择CD8⁺T细胞。平板在37℃、5％CO₂下温育过夜。用PBS+0.05％Tween 20(Sigma，St.Louis，MO)洗涤6次，从ELISPOT板上除去细胞。使用60μl/孔2μg/ml生物素化的Mab抗hIFN-γ7-B6-1(Mabtech，Nacka，瑞典)，孔在37℃、5％CO₂下温育2小时。用PBS/Tween 0.05％以每孔100μl洗涤6次后加入抗生物素蛋白过氧化物酶复合物(Vectastain ELITE ABC试剂盒，Vetcor Laboratories，Burlingame，CA)，在室温下温育1小时。以100μl/孔加入AEC-底物溶液(3-氨基-9-乙基咔唑)，在室温下温育4-12分钟。用自来水洗涤终止显色。平板在室温下干燥过夜，利用自动图像系统ELISPOT阅读仪(Axioplan2，Carl Zeiss MicroimagingInc.，Thomwood，NY)计数显色斑点。

实施例3

上述数据清楚地证明了对自体肿瘤的体内DTH应答和长期无病生存期与间皮素特异的CD8⁺T细胞应答的接种后诱导之间的相关性。然而，这种相关性可能是全身免疫抑制(对于不能证明对自体肿瘤的接种后DTH应答并且疾病进展的患者)，而不是在保持无病的DTH应答患者中疫苗特异性诱导对间皮素的T细胞应答。为了证明间皮素特异的CD8⁺T细胞的接种后诱导是肿瘤抗原特异的，我们评价了每名HLA-A2阳性患者对HLA-A2-结合流感基质肽M1的T细胞应答(28)。我们选择流感M1肽，因为该疫苗研究的大多数患者都在参与前的某个时间接受了一种流感疫苗。如图3所示，所有HLA-A2阳性患者都证明有类似的对M1肽的接种前和接种后T细胞应答。接种前应答为每10⁵个总CD8⁺T细胞19-50个IFN-γ斑点，所有患者的接种后应答都大约相同(图3)。未对HLA-A3和A24阳性患者进行类似的研究，因为已知没有发表的流感M1表位可以结合这些HLA分子。

对于来自相同的14名患者的淋巴细胞，我们评价了针对第二种过量表达的抗原PSCA的CD8⁺T淋巴细胞的接种后诱导。与间皮素不同，在3名DTH应答者中PSCA不引发免疫应答。另外，我们也为HLA-A2、HLA-A3和HLA-A24合成了两种算法优选的排在前两位的表位，并且根据在间皮素实验中使用的相同方案对其进行了分析。我们在所有患者中均未见PSCA特异性T细胞的任何接种后诱导；因此，我们为每种HLA I类分子合成了另外4种PSCA肽，以确保我们不会错过免疫原性表位。这些肽的分析也不能证明PSCA特异的CD8⁺T细胞应答的接种后诱导(分别是图4A、4B、4C)。在8名非应答者中也不能证明PSCA特异的应答(图4d)。该结果进一步支持我们的以下发现：间皮素是一种有关的胰腺癌抗原，因为根据SAGE分析，即使在胰腺癌中类似地过量表达，也没有疫苗诱导的对PSCA的免疫应答。另外，PSCA数据证明一种蛋白质在肿瘤中的过量表达不足以预测该蛋白质作为疫苗靶标的用途。

图5显示了使用两种同种异体疫苗细胞系对间皮素和PSCA表达的流式细胞分析。有意思的是，这两种疫苗细胞系同样地表达间皮素，而PSCA只被疫苗细胞系之一表达(Panc 6.03)。

材料与方法：CD8+M1特异性T细胞系。M1特异性T细胞系如下产生：开始时用照射的自体树突细胞，随后用照射的自体EB病毒(EBV)转化的B细胞，重复体外刺激HLA-A201阳性PBL，这两种细胞均用HLA-A201限制的表位脉冲。该细胞系用自体EBV细胞每两周刺激一次，其中该EBV细胞用10μg肽/ml各自的肽在37℃下脉冲2小时，细胞系用RPMI-1640洗涤两次，以10,000rads照射。T细胞在T细胞培养基(RPMI-1640，10％人血清(在Johns Hopkins Hemapheresis Unit采集的合并的血清)，含有200μM L-谷氨酰胺、50单位-μg/ml青霉素/链霉素、1％NEAA和1％丙酮酸钠)中以1∶2的T细胞：EBV细胞比刺激，该培养基中补充了20cetus单位IL-2/孔和10ng/孔IL-7。所有测定均使用该系作为阳性对照T细胞系。

材料与方法：流式细胞分析。疫苗系上间皮素和PSCA的表达通过流式细胞分析评价。将这些疫苗系洗涤两次，重悬浮于“FACS”缓冲液(HBSS，补充了1％PBS、2％FBS和0.2％叠氮钠)中，然后用小鼠单克隆间皮素(CAKl)抗体(Signet Laboratories，Dedham，MA)或小鼠单克隆PSCA抗体(克隆1G8，从R.B.R.获得)，随后用FITC标记的山羊抗小鼠IgG(BD PharMingen，San Jose，CA)染色，利用FACScan分析仪(BDImmunocytometry Systems)进行流式细胞分析。

这些数据证明，在单次接种分泌GM-CSF的同种异体肿瘤疫苗后，在DTH应答者中检测到间皮素特异的CD8⁺T细胞，而在非DTH应答者中未检测到。在报告的疫苗研究中处理的患者在胰十二指肠切除术8-10周后以及接受6个月的佐剂化学放射治疗4周前接受第一次接种(27)。这些患者中有6名在6个月结束时未患疾病，并且每隔一个月接受可达3次以上的接种。在多次疫苗治疗后，对这6名患者的CD8⁺T细胞富集系列PBL样品进行重复ELISPOT研究，以评价化学放射治疗和多次接种对间皮素特异的T细胞应答的影响。

如图6所示，3名DTH应答者中有2名证明在第2次接种后其间皮素特异的T细胞应答降低。在这两名患者中，间皮素特异的T细胞应答在第4次接种后回复到初次接种时的水平。在第二次接种后观察到的受到抑制的间皮素特异的T细胞应答可能是每名患者在第一次和第二次接种之间接受的化学治疗的结果。有意思的是，这3名患者之一证明在第一次和第二次接种后产生类似的间皮素特异的T细胞应答。该DTH应答者只接受两种疫苗，因为她随后发展为由于丝裂霉素C引起的晚期自身免疫抗体介导的并发症，需要医学干预并且退出疫苗研究。相反，对于第一次接种后未能证明有最初间皮素特异的T细胞应答的患者，重复接种不能诱导间皮素特异的T细胞应答(图6)。

描述由分泌GM-CSF的同种异体胰腺癌疫苗诱导的CD8⁺T细胞应答的这些数据支持下列结论。首先，间皮素能够作为疫苗诱导的免疫应答的一种体外生物标记物，它与胰腺癌患者中的体内应答有关。其次，对于经证实体内免疫应答与临床应答有关的患者，其未培养的接种后CD8⁺T细胞识别间皮素以及不能识别另外一种过量表达的基因产物(PSCA)的事实证实：这种抗原鉴定方法是鉴定CD8⁺T细胞的免疫相关肿瘤靶标的一种基于功能基因组的快速方法。

间皮素是大多数胰腺癌表达的间皮素/巨核细胞强化因子(MPF)家族的一个40千道尔顿跨膜糖蛋白成员(36)，(37-39)。已经报道卵巢癌、间皮瘤和某些鳞状细胞癌也表达间皮素(37-39)。已知间皮素与细胞膜通过一个糖基磷脂酰肌醇锚连接，预测其在细胞粘附中起作用(36)。间皮素和其基因家族的其它成员显示有限的正常组织表达。因此，它满足三个重要标准，非常有利于作为免疫原用于以后为胰腺癌和过量表达间皮素的其它肿瘤类型患者研制基于抗原的疫苗：大多数胰腺癌和卵巢癌广泛共有，在正常组织中有限表达，在接种表达该抗原的肿瘤细胞后诱导CD8⁺T细胞应答。

共有的生物相关肿瘤抗原的鉴定为设计可能比当前的全细胞疫苗更有效地诱导抗肿瘤免疫的基于抗原的疫苗提供了机会。另外，基于重组抗原的方法的放大在技术上比当前使用的全肿瘤细胞疫苗更可行。然而，基于重组抗原的疫苗需要鉴定患者广泛表达并且是免疫原性的抗原。直到今天，cDNA文库的T细胞筛查，噬菌体展示文库的抗体筛查，或者与MHC结合的抗原的生物化学洗脱和纯化，已经鉴定了大多数已知的肿瘤抗原，其中许多似乎来源于共有的未突变基因，相对于正常组织，这些基因在肿瘤细胞中过量表达或者重新激活(3-13)。遗憾的是，T细胞识别的肿瘤相关抗原的这个扩大列表通常只限于黑素瘤，因为从接种的其它类型癌症患者中分离和繁殖T细胞系和克隆具有技术困难。此处公开的肿瘤抗原鉴定方法是可行的，因为它只需要一种差异表达指定肿瘤内的基因的数据库，以及来自接种患者的排列、未培养的大量PBL。因此，这种抗原鉴定方法是快速的，能够适合大多数类型的癌症。另外，使用未培养的淋巴细胞而不是长期培养的T细胞系和克隆，具有可鉴定新生物相关免疫靶标的优点。

PSCA是发现在我们的SAGE胰腺基因表达数据库中过量表达的第二种基因产物。实际上，PSCA显示甚至比间皮素更高水平地过量表达。然而，在DTH应答者和DTH无应答患者中没有检测到接种后PSCA特异的T细胞应答。现在还不清楚为什么分泌GM-CSF的同种异体疫苗诱导对一种过量表达的抗原的T细胞应答，而不诱导对第二种类似地过量表达的抗原的应答。在最初的引发事件中，这两种抗原可能不同地加工和呈递(58)。

在本研究中，我们也证明了能够诱导间皮素特异的T细胞，它们是针对3种不同HLA-A基因座等位基因呈递的至少6种不同的肽。这一发现进一步支持间皮素能够作为一种共有抗原。在本研究中，根据基序预测排位最高的抗原表位是最佳HLA-A等位基因结合表位，可与它们各自的HLA等位基因结合，也被间皮素特异的T细胞识别。分析其它肿瘤抗原的报告已经发现，排位最高的表位不一定与T细胞的最佳识别相关(25)。我们也对两种黑素瘤抗原——酪氨酸酶和MAGE 1进行了计算机算法，来确定如何利用该方法排列发表的HLA-A2结合肽。我们发现，我们的HLA-A2结合间皮素表位获得与已知的酪氨酸酶和MAGE 1 HLA-A2结合表位相似的得分。对于在我们的分析中用作对照抗原的发表的HLA-A2 HIV GAG和HLA-A3 HO NEF表位，同样如此。通过两种算法选择高排位的表位似乎是与各自HLA分子结合的可能性的一种重要预测方法。

我们已经发展了鉴定候选胰腺癌抗原的一种功能基因组方法。这种抗原鉴定方法有利于鉴定是生物学相关免疫靶标的其它人类癌症抗原。体外T细胞应答与体内应答测定的相关性证实了该方法的生物学重要性。该方法是快速、可行的，可适于鉴定其它癌症类型表达的抗原。从而可以促进研制用于大多数人类癌症治疗的基于重组抗原的疫苗。

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实施例5

通过用HPV-16 E6和E7和激活的ras癌基因共转化，小鼠肿瘤细胞的构建。C57BL/6小鼠的初级腹膜细胞用HPV-16 E6和E7无限增殖化，然后用表达激活的人c-Ha-ras基因的pEJB转化。这种共转化产生一种致瘤细胞系。

收集C57BL/6小鼠腹膜细胞，用1×HBSS洗涤。初级单细胞悬液在RPMI1640中体外培养，其中补充了10％胎牛血清、50单位/ml青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和2mM非必需氨基酸，在37℃和5％CO₂下培养。HPV-16 E6和E7基因向初级腹膜细胞内的转导利用Denise A.Galloway(Fred Hutchinson Cancer Research Center，Seattle，WA)惠赠的LXSN16E6E7逆转录病毒载体进行(Halbert等人，(1991)J Virol，65：473-478)。利用含有HPV-16 E6-和E7的LXSN16E6E7感染CRIP细胞，产生具有广泛宿主范围的重组病毒。初级腹膜细胞如前所述通过转导无限增殖化(Halbert等人，(1991)J Virol，65：473-478)。转导后，除去逆转录病毒上清液，细胞在G418(0.4mg/ml)培养基中再培养3天，以使重组逆转录病毒基因整合并表达。这种无限增殖的肺(E6+E7+)细胞然后用Chi V.Dang(The John Hopkins Hospital，Baltimore，MD)惠赠的表达激活的人c-Ha-ras基因的pVEJB转导，用G418(0.4mg/ml)和潮霉素(0.2mg/ml)筛选。

实施例6

WF-3的组织学和病理学特征的表征。将5×10⁴ VF-3肿瘤细胞腹膜内注射到C57BL/6小鼠内。4周后杀死小鼠，检查腹水和肿瘤的形成。切除的器官用4％缓冲甲醛固定，制备组织切片，随后进行常规苏木精伊红染色。载玻片在光学显微镜下观察。

对小鼠腹膜内注射5×10⁴WF-3肿瘤细胞，4周后杀死。该细胞系能够在肿瘤细胞腹膜内攻击的小鼠中产生腹水(参见图7A)。在形态学上，WF-3肿瘤细胞显示一种乳头状结构，类似于在人卵巢/腹膜中发现的严重肿瘤(图1B)。此外，该肿瘤也显示高水平的有丝分裂活性、多形核、异常有丝分裂和高核/细胞质比，与高度恶性的肿瘤一致(参见图7C)。

图7显示产生腹水的卵巢癌细胞系(WF-3)的产生和表征。将WF-3肿瘤细胞以1×10⁵细胞/小鼠的剂量腹膜内注射到C57BL/6小鼠内。小鼠在肿瘤攻击4周后施行安乐死(参见图7A)。证明小鼠中腹水形成的代表性概图。注意：在肿瘤攻击4周后，小鼠产生明显的腹水，小鼠腹围增加。图7B显示对外植肿瘤的苏木精-伊红染色，在100×放大倍数下观察。肿瘤显示一种乳头状结构，在形态学上与来自腹膜或卵巢的肿瘤一致。图7C显示在400×放大倍数下观察的肿瘤。插图更详细地显示一种WF-3肿瘤细胞的特征。

实施例7

WF-3肿瘤细胞的MHC I类和II类呈递。为了流式细胞分析，收集并制备WF-3肿瘤细胞。为了检测WF-3肿瘤细胞上的MHC I类和II类表达，加入抗H-2Kb/H-2Db单克隆抗体或者抗I-Ab单克隆抗体。

收集WF-3肿瘤细胞，胰蛋白酶消化，洗涤，重悬浮于FACSCAN缓冲液中。加入抗H-2Kb/H-2Db单克隆抗体(克隆28-8-6，PharMingen，San Diego，CA)或抗I-Ab单克隆抗体(克隆25-9-17，PharMingen，SanDiego，CA)，在冰上温育30分钟。用FACScan缓冲液洗涤两次后，加入FITC偶联的山羊抗小鼠抗体(Jackson ImmunoResearch Lab.Inc.，West Grove，PA)，在冰上温育20分钟。将样品重悬浮于FACScan缓冲液中。利用Becton Dickinson FACScan使用CELLQuest软件(BectonDickinson Immunocytometry System，Mountain View，CA)进行分析。

我们的数据表明WF-3是MHC I类表达阳性的(图8A)，但是MHC II类表达阴性的(图8B)。具体而言，图8显示了WF-3肿瘤细胞上MHC I类和II类的呈递。收集WF-3肿瘤细胞，胰蛋白酶消化，洗涤，重悬浮于FACSCAN缓冲液中。加入抗H-2Kb/H-2D b单克隆抗体或抗I-Ab单克隆抗体，随后通过流式细胞分析检测WF-3肿瘤细胞上的MHC I类和II类表达。图8A显示与MHC I类阴性对照(细线)相比，MHC I类呈递阳性的WF-3肿瘤细胞(粗线)。图8B显示MHC II类呈递阴性的WF-3肿瘤细胞。细线表示MHC II类阴性对照的染色。

实施例8

导致致死性腹水形成的WF-3肿瘤细胞的最小肿瘤剂量的测定。将WF-3肿瘤细胞以不同的剂量(1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵和1×10⁶细胞/小鼠)腹膜内注射到C57BL/6小鼠内。每周监测两次小鼠的腹水和肿瘤形成，90天后杀死。对于肿瘤攻击后的存活率，小鼠用不同剂量的WF-3(1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵和1×10⁶细胞/小鼠)腹膜内攻击，并在肿瘤攻击后监测其存活率。

如图9A所示，腹膜内注射5×10⁴、1×10⁵和1×10⁶细胞的所有小鼠均在30天内形成腹水。同时，注射1×10⁴/小鼠的20％的小鼠在肿瘤攻击90天后没有肿瘤，并且没有腹水形成。注射5×10⁴肿瘤细胞或更高剂量的所有小鼠均在肿瘤攻击50天内死亡(图9B)。这些数据提示WF-3肿瘤细胞能够导致在小鼠的腹膜内形成腹水和实体瘤，最终在一定的肿瘤攻击剂量时杀死被注射的小鼠。

实施例9

间皮素在WF-3临床前卵巢癌模型上高度表达。我们已经进行了微阵列分析(Incyte Genomics Corporation，Palo Alto，California)，来表征WF-3相比pre-WF0的基因表达谱。使用以前描述的方法(Lin等人，(1996)Cancer Research，56：21-26)，通过用携带HPV-16 E6和E7基因的逆转录病毒载体使小鼠初级腹膜细胞无限增殖化，产生pre-WF0细胞系。为了鉴定WF-3中与晚期卵巢癌的致肿瘤性有关的基因，我们已经选择了pre-WFO作为一种参照细胞系。表4(下文)总结了WF-3中存在的相对于pre-WFO高度表达的基因。如以下表4所示，间皮素是WF-3中排在前10位的上调基因，提示WF-3可能是发展针对卵巢癌的间皮素特异的癌症化学治疗的一种合适的临床前模型。

表4.WF-3中特异表达的基因的总结

标记物/抗原	序列保藏号	平衡的差异表达
标记物/抗原	序列保藏号	平衡的差异表达	含有EGF的fibulin样胞外基质蛋白1	A1156278	6.5
间皮素	AA673869	3.8	含有EGF的fibulin样胞外基质蛋白1	A1156278	6.5
间皮素	AA673869	3.8	α-2-HS-糖蛋白	AI386037	3.3
蛋白激酶，cGMP-依赖的，II型	AA771678	3.2	α-2-HS-糖蛋白	AI386037	3.3
蛋白激酶，cGMP-依赖的，II型	AA771678	3.2	sema域，免疫球蛋白域(Ig)，短基本结构域，分泌的(信号素semaphorin)3E	AA241390	3.2
锚蛋白样重复蛋白	AA792499	2.8	sema域，免疫球蛋白域(Ig)，短基本结构域，分泌的(信号素semaphorin)3E	AA241390	3.2
锚蛋白样重复蛋白	AA792499	2.8	RIKEN cDNA1300019103基因	AA600596	2.6
基质γ-羧基谷氨酸盐(gla)蛋白	W88093	2.4	RIKEN cDNA1300019103基因	AA600596	2.6
基质γ-羧基谷氨酸盐(gla)蛋白	W88093	2.4	丝氨酸(或胱氨酸)蛋白酶抑制剂，cladeF(α-2抗纤溶酶，色素上皮来源的因子)成员1	AA727967	2.3
RIKEN cDNA1200011C15基因	AA608330	2.2	丝氨酸(或胱氨酸)蛋白酶抑制剂，cladeF(α-2抗纤溶酶，色素上皮来源的因子)成员1	AA727967	2.3

实施例10

间皮素mRNA和蛋白质在WF-3肿瘤细胞中的表达。我们利用RT-PCR进一步证实了WF-3细胞系的间皮素表达。

利用RNAzol(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)，按照使用说明，从WF-3肿瘤细胞中提取RNA。测定RNA浓度，使用oligo(dT)作为引物和Superscript逆转录酶(Gibco BRL)，在20ml体积中逆转录1mg细胞总RNA。使用一组引物(5′-CCCGAATTCATGGCCTTGCCAACAGCTCGA-3′和5′-TATGGATCCGCTCAGCCTTAAAGCTGGGAG-3′；分别为SEQ ID NOS：11和12)，PCR扩增1ml cDNA。该引物来源于发表的鼠间皮素cDNA序列(Kojima等人，(1995)J Biol Chem，270：21984-21990)。在含有各250mM dNTP、100nM引物、5ml 10×缓冲液(New England Biolabs，Berverly，MA)和1 U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)的50ml反应混合物中进行PCR，采用30个循环(94℃，1min变性；55℃，1min退火；72℃，2min延伸)。利用琼脂糖凝胶电泳(1％)在含有0.2mg/ml溴化乙锭的TAE缓冲液中分析反应混合物(10ml样品)。

鼠间皮素蛋白与人间皮素蛋白有大约65％的相似性。如图10所示，我们通过RT-PCR能够检测到WF-3肿瘤中鼠间皮素的mRNA表达(第2道)，而在对照B-16肿瘤细胞中检测不到(第3道)。进行Western blot分析，测定WF-3肿瘤细胞中间皮素蛋白的表达。肿瘤细胞用抗间皮素小鼠多克隆抗体染色。Western blot分析结果证实WF-3是间皮素蛋白阳性的，而B16黑素瘤细胞是间皮素阴性的(数据未显示)。因此，我们的结果表明WF-3细胞表达间皮素mRNA和蛋白质。

图10显示WF-3肿瘤细胞中鼠间皮素的表达，这通过RT-PCR及凝胶电泳得到证实。为了证实表达，也进行Western印迹分析(未显示)。如图10所示，使用Superscript One-Step RT-PCR试剂盒(Gibco，BRL)和一组引物：5′-CCCGAATTCATGGCCTTGCCAA-CAGCTCGA-3′和5′-TATGGATCCGCTCA GCCTTAAAGCTGGGAG-3′(分别为SEQ ID NOS：11和12)，进行RT-PCR。也利用Western印迹分析证实WF-3肿瘤细胞中间皮素蛋白的表达。肿瘤细胞用抗间皮素小鼠多克隆抗体染色，随后用FITC偶联的山羊抗小鼠IgG第二抗体染色(数据未显示)。

实施例11

间皮素DNA癌症疫苗免疫治疗。利用上述腹膜肿瘤模型，我们证实了编码间皮素的DNA疫苗产生比空质粒DNA更强的间皮素特异的细胞毒性T淋巴细胞应答和抗肿瘤效应的能力。这些数据表明，在治疗或控制间皮素高度表达的卵巢癌和其它癌症中能够使用一种靶向间皮素的DNA肿瘤疫苗。

质粒DNA构建。由于可以利用表达间皮素的肿瘤细胞系WF-3，我们产生了编码间皮素的DNA疫苗，用来检验它们在C57BL/6小鼠中对WF-3的抗肿瘤作用。我们使用一种哺乳动物细胞表达载体pcDNA3，产生一种编码全长鼠间皮素蛋白(总长度：625aa)的DNA疫苗。

为了构建pcDNA3-间皮素，首先使用Superscript One-Step RT-PCR试剂盒(Gibco，BRL)，使用一组引物(5′-CCCGAATTCATGGCCT-TGCCAACAGCTCGA-3′和5′-TATGGATCCGCTCAGCCTTAAAGCTGGGAG-3′；分别为SEQ ID NOS：11和12)，通过RT-PCR由WF-3提取的RNA扩增编码间皮素的DNA片段，并且将其克隆到pcDNA3的EcoRI/BamHI位点内。该引物来源于发表的鼠间皮素cDNA序列(11)。DNA构建体的准确性通过DNA测序证实。

接种一种编码间皮素蛋白的DNA疫苗可以保护表达间皮素的卵巢肿瘤的攻击。我们检验了该pcDNA3-间皮素DNA疫苗保护WF-3细胞肿瘤攻击的能力。DNA包被的金颗粒的制备和使用氦驱动的基因枪的基因枪介导的DNA接种(Bio-rad，Hercules，CA)按照以前描述的方法进行(Chen等人，(2000)Cancer Research，60：1035-1042)。使用氦驱动的基因枪(Bio-rad，Hercules，CA)，以400p.s.i的排气压力，向C57BL/6小鼠的剃毛的腹区输送DNA包被的金颗粒(1mg DNA/弹)。

对于肿瘤保护实验，小鼠(每组10只)皮内接种2mg pcDNA3-间皮素DNA。一周后，小鼠接受相同剂量的加强。在腹膜内致死注射5×10⁴WF-3肿瘤细胞加强一周后攻击小鼠。通过触诊和检查一周两次监测小鼠的腹水形成；在第90天杀死小鼠。测定每个接种组中无腹水小鼠的百分数。

我们的数据表明，pcDNA3-间皮素产生对WF-3肿瘤攻击的高度保护(60％)。对照只接种pcDNA3载体(0％)或者不接种(0％)。图11显示使用间皮素特异的DNA疫苗对WF-3肿瘤生长的体内肿瘤保护实验。

实施例12

接种pcDNA3-间皮素产生间皮素特异的细胞毒性免疫应答。CD8⁺T淋巴细胞是介导抗肿瘤免疫的重要的效应细胞。进行细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定，以测定pcDNA3-间皮素DNA疫苗产生的间皮素特异的CD8⁺T细胞的细胞毒性作用。来自接种小鼠的脾细胞在与含有间皮素蛋白的细胞裂解物培养后作为效应细胞。WF-3肿瘤细胞作为靶细胞。

由转染的293Db，Kb细胞产生含有间皮素的细胞裂解物。为了产生含有间皮素的细胞裂解物以便为了CTL测定脉冲脾细胞，使用lipofectamine 2000(Life Technologies)，根据厂商方案，将总共20mg pcDNA3-间皮素或空质粒DNA转染到5×10⁶个Db，Kb细胞内。转染后40-44小时收集转染的293Db，Kb细胞，然后用三个循环的冻融处理。使用Bio-Rad蛋白质测定法(Bio-Rad，Hercules，CA)，按照供应商的方案，测定蛋白质浓度。如下文所述，利用含有间皮素的细胞裂解液脉冲从不同接种小鼠中获得的脾细胞。

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定。使用CytoTox96非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega，Madison，WI)，按照厂商方案，通过定量测定乳酸脱氢酶(LDH)，测定细胞溶解。简言之，从接种的小鼠(每组5只)中收集脾细胞，在最后一次接种一周后合并。脾细胞在24孔组织培养板中用20mg细胞裂解物在总体积为2ml的RPMI 1640中脉冲6天作为效应细胞，该培养基中补充了10％(vol/vol)胎牛血清、50单位/ml青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、2mM非必需氨基酸。WF-3肿瘤细胞作为靶细胞。WF-3细胞与脾细胞以不同的效靶(E∶T)比混合。在37℃下温育5小时后，收集50μl培养基，根据厂商方案测定培养基中LDH的含量。根据下列方程式计算裂解百分比：100×(A-B)/(C-D)，其中A是实验效应信号值的读数，B是效应细胞自发背景信号值，C是靶细胞的最大信号值，D是靶标自发的背景信号值。

统计学分析。利用Student′s t-检验进行统计学分析。所有实验中存在双边P值，显著性定义为P＜0.05。统计学评价未排除任何小鼠。

如图12所示，接种pcDNA3-间皮素与接种pcDNA3或不接种相比，产生高百分比的特异裂解(P＜0.001，单向ANOVA)。这些结果表明接种pcDNA3-间皮素DNA能够产生间皮素特异的T细胞介导的特异性WF-3裂解。

证实接种间皮素特异的DNA疫苗诱导的特异性裂解的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定。小鼠(每组5只)用不同DNA疫苗皮内免疫。小鼠在一周后接受相同剂量的加强。接种14天后收集小鼠的脾细胞。为了进行细胞毒性测定，脾细胞与间皮素蛋白一起培养6天，用作效应细胞。WF-3肿瘤细胞作为靶细胞。WF-3细胞与脾细胞以不同的E∶T比混合。通过定量测定LDH测定细胞溶解。注意：pcDNA3-间皮素DNA疫苗产生比其它DNA疫苗显著更高百分比的特异性裂解(P＜0.001)。该图所示的数据来自于进行的两个实验中的一个代表性实验。

实施例13

在该实施例中，我们使用鼠伤寒沙门氏菌的一种减毒株作为口服遗传免疫的载体。我们构建了pcDNA3.1/myc-His(-)载体，其表达间皮素的一种myc-标签形式。在用携带间皮素表达载体的重组鼠伤寒沙门氏菌aroA株免疫后，我们能够使用一种抗myc抗体，通过免疫测定，检测间皮素/myc融合蛋白的高水平表达。鼠伤寒沙门氏茵营养缺陷型aroA株SL7202鼠伤寒沙门氏菌2337-65衍生物hisG46、DELA07[aroA：Tn10(Tc-s)])在这些体内研究中用作载体(参见Darji等人.(1997)Cell 91：761-775；Darji等人.(2000)FEMS Immunology andMedical Microbiology 27：341-9)。然后使用这种基于鼠伤寒沙门氏茵的间皮素DNA疫苗输送系统检测该疫苗是否能够保护采用我们的WF-3肿瘤模型系统的卵巢癌细胞攻击。

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序列表

<110>Jaffee，Elizabeth

Wu，Tzyy-Choou

Hung，Chien-Fu

Hruban，Ralph

<120>间皮素疫苗和模型系统

<130>001107.00363

<150>60/475，783

<151>2003-06-05

<150>60/395，556

<151>2002-07-12

<150>60/398，217

<151>2002-07-24

<150>60/414，931

<151>2002-09-30

<160>12

<170>FastSEQ for windows Version 4.0

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>1

Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu

1 5

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>2

Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val

1 5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>3

Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys

1 5

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>4

Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr

1 5

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>5

Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu

1 5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>6

Leu Tyr Pro Iys Ala Arg Leu Ala Phe

1 5

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>7

Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu

1 5

<210>8

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>8

Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys

1 5 10

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>9

Ala Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe

1 5

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>10

Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu

1 5

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>鼠肌(Mus musculus)

<400>11

cccgaattca tggccttgcc aacagctcga 30

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>鼠肌

<400>12

tatggatccg ctcagcctta aagctgggag 30

Claims

1.一种诱导针对肿瘤的T细胞应答的方法，相对于作为该肿瘤来源的正常组织，该肿瘤过量表达间皮素，所述方法包括：

对带有所述肿瘤的患者或已经切除所述肿瘤的患者施用一种疫苗，该疫苗含有一种多肽，该多肽含有间皮素的MHC I类结合表位，其中该表位可结合患者表达的MHC I类的等位基因形式，从而诱导对间皮素的T细胞应答，其中该疫苗不含完整肿瘤细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述肿瘤选自：卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤和鳞状细胞癌。

3.权利要求1的方法，其中所述肿瘤是胰腺癌。

4.权利要求1的方法，其中所述肿瘤是卵巢癌。

5.权利要求1的方法，其中所述表位选自：SLLFLLFSL(SEQ IDNO：1)；VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)；ELAVALAQK(SEQ ID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQ ID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)。

6.权利要求1的方法，其中所述多肽是成熟间皮素。

7.权利要求1的方法，其中所述多肽是间皮素的初级翻译产物。

8.权利要求1的方法，其中施用所述多肽的混合物。

9.权利要求8的方法，其中所述多肽可结合MHC I类分子的多种等位基因形式。

10.权利要求8的方法，其中所述多肽可结合MHC I类分子的一种等位基因形式。

11.权利要求1的方法，其中使用一种算法选择是MHC I类结合表位的多肽。

12.权利要求1的方法，其中使用两种算法选择是MHC I类结合表位的多肽。

13.权利要求1的方法，其中T细胞应答是特异性CD8⁺T细胞的诱导。

14.权利要求1的方法，其中所述疫苗是无细胞的。

15.权利要求1的方法，其中所述疫苗含有选自如下的细菌：弗氏志贺氏菌(shigella flexneri)、大肠杆菌(E.coli)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、小肠结肠炎耶尔森氏(Yersinia entero colitica)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和分枝杆菌。

16.权利要求1的方法，其中足量施用所述疫苗，以诱导肿瘤消退。

17.权利要求1的方法，其中足量施用所述疫苗，以使患者在切除肿瘤后保持无肿瘤状态。

18.一种诱导针对肿瘤的T细胞应答的方法，相对于作为该肿瘤来源的正常组织，该肿瘤过量表达间皮素，所述方法包括：

对带有所述肿瘤的患者或已经切除所述肿瘤的患者施用一种疫苗，该疫苗含有一种多肽，该多肽含有间皮素的MHC II类结合表位，其中该表位可结合患者表达的MHC II类的等位基因形式，从而诱导对间皮素的T细胞应答，其中该疫苗不含完整肿瘤细胞。

19.一种诱导针对肿瘤细胞的T细胞应答的方法，相对于作为该肿瘤细胞来源的正常细胞，该肿瘤细胞过量表达间皮素，所述方法包括：

对具有形成过量表达间皮素的肿瘤危险的患者施用一种疫苗，该疫苗含有一种多肽，该多肽含有间皮素的MHC I类结合表位或间皮素的MHCII类结合表位，其中该表位可结合患者表达的MHC I类或II类的等位基因形式，从而诱导对间皮素的T细胞应答，其中该疫苗不含完整肿瘤细胞。

20.权利要求19的方法，其中所述患者暴露于致癌物，该致癌物已知诱发相对于作为该肿瘤来源的正常组织而言过量表达间皮素的肿瘤。

21.权利要求20的方法，其中所述致癌物是石棉。

22.一种诱导针对肿瘤的T细胞应答的方法，相对于作为该肿瘤来源的正常组织，该肿瘤过量表达间皮素，所述方法包括：

对带有所述肿瘤的患者或已经切除所述肿瘤的患者施用一种疫苗，该疫苗含有一种多核苷酸，该多核苷酸编码一种多肽，该多肽含有间皮素的MHC I类结合表位，其中该表位可结合患者表达的MHC I类的等位基因形式，从而诱导对间皮素的T细胞应答，其中该疫苗不含完整肿瘤细胞。

23.权利要求22的方法，其中所述肿瘤选自：卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤和鳞状细胞癌。

24.权利要求22的方法，其中所述肿瘤是胰腺癌。

25.权利要求22的方法，其中所述肿瘤是卵巢癌。

26.权利要求22的方法，其中所述表位选自：SLLFLLFSL(SEQ IDNO：1)；VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)；ELAVALAQK(SEQ ID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQ ID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)。

27.权利要求22的方法，其中所述多肽是成熟间皮素。

28.权利要求22的方法，其中所述多肽是间皮素的初级翻译产物。

29.权利要求22的方法，其中所述疫苗含有编码所述多肽的混合物的一种或多种多核苷酸。

30.权利要求29的方法，其中所述多肽可结合MHC I类分子的多种等位基因形式。

31.权利要求29的方法，其中所述多肽可结合MHC I类分子的一种等位基因形式。

32.权利要求22的方法，其中使用一种算法选择是MHC I类结合表位的多肽。

33.权利要求22的方法，其中使用两种算法选择是MHC I类结合表位的多肽。

34.权利要求22的方法，其中所述T细胞应答是特异性CD8⁺T细胞的诱导。

35.权利要求22的方法，其中所述疫苗是无细胞的。

36.权利要求22的方法，其中所述疫苗含有选自如下的细菌：弗氏志贺氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和分枝杆菌。

37.权利要求22的方法，其中足量施用所述疫苗，以诱导肿瘤消退。

38.权利要求22的方法，其中足量施用所述疫苗，以使患者在切除肿瘤后保持无肿瘤状态。

39.一种诱导针对肿瘤的T细胞应答的方法，相对于作为该肿瘤来源的正常组织，该肿瘤过量表达间皮素，所述方法包括：

对带有所述肿瘤的患者或已经切除所述肿瘤的患者施用一种疫苗，该疫苗含有一种多核苷酸，该多核苷酸编码一种多肽，该多肽含有间皮素的MHC II类结合表位，其中该表位可结合患者表达的MHC II类的等位基因形式，从而诱导对间皮素的T细胞应答，其中该疫苗不含完整肿瘤细胞。

40.一种诱导针对肿瘤细胞的T细胞应答的方法，相对于作为该肿瘤细胞来源的正常组织，该肿瘤细胞过量表达间皮素，所述方法包括：

对具有形成过量表达间皮素的肿瘤危险的患者施用一种疫苗，该疫苗含有一种多核苷酸，该多核苷酸编码一种多肽，该多肽含有间皮素的MHC I类结合表位或间皮素的MHC II类结合表位，其中该表位可结合患者表达的MHC I类或II类的等位基因形式，从而诱导对间皮素的T细胞应答，其中该疫苗不含完整肿瘤细胞。

41.权利要求40的方法，其中所述患者暴露于致癌物，该致癌物已知可诱发相对于作为该肿瘤来源的正常组织过量表达间皮素的肿瘤。

42.权利要求41的方法，其中所述致癌物是石棉。

43.一种鉴定可用作抗肿瘤疫苗候选物的免疫原的方法，包括：

选择由肿瘤表达而作为该肿瘤来源的正常组织最低限度表达或不表达的一种蛋白质；

检测已接种一种含有该蛋白质的疫苗的人的淋巴细胞，以确定淋巴细胞是否含有该蛋白质特异的CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞，其中CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞的存在表明该蛋白质是用作抗肿瘤疫苗的候选物。

44.权利要求43的方法，其中人显示抗肿瘤免疫应答。

45.权利要求43的方法，其中所述疫苗含有完整肿瘤细胞。

46.权利要求44的方法，其中所述抗肿瘤免疫应答使手术切除肿瘤后的无疾存活时间比未接种的类似群体延长。

47.权利要求44的方法，其中所述抗肿瘤免疫应答导致肿瘤消退。

48.权利要求44的方法，其中所述抗肿瘤免疫应答使存活时间延长。

49.权利要求44的方法，其中所述抗肿瘤免疫应答是对自体肿瘤细胞的迟发型超敏反应。

50.权利要求43的方法，其中也检测所述淋巴细胞，以确定它们是否含有对于该疫苗不表达的抗原而言特异的CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞。

51.权利要求43的方法，其中根据对疫苗的反应将人分为两组，其中第一组包括应答者，第二组包括非应答者，其中如果在应答者中比在非应答者中更高频率地发现CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞，则该蛋白质被鉴定为在抗肿瘤疫苗中更可能有用。

52.权利要求51的方法，其中应答者显示对自体肿瘤细胞的迟发型超敏反应应答，而非应答者不显示这种应答。

53.权利要求51的方法，其中应答者比非应答者有更长的无疾存活时间。

54.预测已接受肿瘤疫苗的患者将来对肿瘤疫苗的反应的一种方法，该疫苗含有间皮素的至少一种T细胞表位，该方法包括：

检测患者的淋巴细胞，以确定这些淋巴细胞是否含有间皮素特异的CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞，其中该CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞的存在预示比不含该CD8⁺T细胞的存活时间更长。

55.权利要求54的方法，其中所述疫苗含有完整肿瘤细胞。

56.权利要求54的方法，其中所述疫苗含有胰腺癌细胞，所述抗原是间皮素。

57.权利要求54的方法，其中所述疫苗含有卵巢癌细胞，所述抗原是间皮素。

58.权利要求54的方法，其中所述疫苗含有间皮瘤细胞，所述抗原是间皮素。

59.一种诱导CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞应答的疫苗，其含有：

一种多肽，其含有间皮素的MHC I类或MHC II类结合表位，其中该表位可结合患者表达的MHC I类或II类的等位基因形式，从而诱导对间皮素的CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞应答，其中该疫苗不含完整肿瘤细胞；和

一种载体，其用来刺激CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞免疫反应。

60.权利要求59的疫苗，其中所述多肽含有MHC I类结合表位。

61.权利要求59的疫苗，其中所述多肽含有6-20个氨基酸残基。

62.权利要求59的疫苗，其中所述多肽含有选自如下的表位：SLLFLLFSL(SEQ ID NO：1)；VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)；ELAVALAQK(SEQID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQ ID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)。

63.权利要求59的疫苗，其中所述载体是CD40/CD40配体。

64.权利要求59的疫苗，其中所述载体是OX-40/OX40配体。

65.权利要求59的疫苗，其中所述载体是CTLA-4拮抗剂。

66.权利要求59的疫苗，其中所述载体是GM-CSF。

67.一种诱导CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞应答的疫苗，其含有：

一种多核苷酸，其编码一种多肽，该多肽含有间皮素的MHC I类或MHC II类结合表位，其中该表位可结合患者表达的MHC I类或II类的等位基因形式，从而诱导对间皮素的CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞应答，其中该疫苗不含完整肿瘤细胞；和

一种载体，其用来刺激CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞免疫反应。

68.权利要求67的疫苗，其中所述载体是CD40/CD40配体。

69.权利要求67的疫苗，其中所述载体是OX-40/OX40配体。

70.权利要求67的疫苗，其中所述载体是一种CTLA-4拮抗剂。

71.权利要求67的疫苗，其中所述载体是GM-CSF。

72.权利要求67的疫苗，其中所述多肽含有选自如下的表位：SLLFLLFSL(SEQ ID NO：1)；VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)；ELAVALAQK(SEQID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQ ID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)。

73.权利要求59的疫苗，其含有细菌。

74.权利要求67的疫苗，其含有细菌。

75.权利要求73的疫苗，其中所述细菌选自：弗氏志贺氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和分枝杆菌。

76.权利要求74的疫苗，其中所述细菌选自：弗氏志贺氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和分枝杆菌。

77.一种分离的9-25个氨基酸残基的多肽，其含有选自如下的表位：SLLFLLFSL(SEQ ID NO：1)；VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)；ELAVALAQK(SEQ ID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQ ID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)。

78.一种融合蛋白，其含有第一和第二部分，其中第一部分含有一种9-25个氨基酸残基的多肽，其含有选自如下的表位：SLLFLLFSL(SEQID NO：1)；VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)；ELAVALAQK(SEQ ID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQ ID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)，第二部分含有至少6个氨基酸残基的片段，其中第二部分的序列不存在于间皮素内。

79.一种表达载体，其编码一种9-25个氨基酸残基的多肽，其含有选自如下的表位：SLLFLLFSL(SEQ ID NO：1)；VLPLTVAEV(SEQ IDNO：2)；ELAVALAQK(SEQ ID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQ ID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)。

80.一种细菌，其含有权利要求79的表达载体。

81.权利要求80的细菌，其选自：弗氏志贺氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和分枝杆菌。

82.一种表达载体，其编码权利要求78的融合蛋白。

83.一种细菌，其含有权利要求82的表达载体。

84.权利要求83的细菌，其选自：弗氏志贺氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和分枝杆菌。

85.一种分离的抗体，它可与选自下列的表位结合：SLLFLLFSL(SEQID NO：1)；VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)；ELAVALAQK(SEQ ID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQ ID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)。

86.一种T细胞系，它可与选自下列的表位结合：SLLFLLFSL(SEQID NO：1)；VLPLTVAEV(SEQ ID NO：2)；ELAVALAQK(SEQ ID NO：3)；ALQGGGPPY(SEQ ID NO：4)；FYPGYLCSL(SEQ ID NO：5)；和LYPKARLAF(SEQ ID NO：6)。

87.权利要求77的多肽，它可结合MHC I类分子。

88.权利要求78的融合蛋白，它可结合MHC I类分子。

89.权利要求59的疫苗，其中所述载体是MHC I类分子。

90.权利要求87的多肽，其中所述MHC I类分子存在于树突细胞上。

91.权利要求88的融合蛋白，其中所述MHC I类分子存在于树突细胞上。

92.权利要求89的疫苗，其中所述MHC I类分子存在于树突细胞上。

93.权利要求87的多肽，其中所述MHC I类分子存在于抗原呈递细胞上。

94.权利要求88的多肽，其中所述MHC I类分子存在于抗原呈递细胞上。

95.权利要求89的疫苗，其中所述MHC I类分子存在于抗原呈递细胞上。

96.预测已接受肿瘤疫苗的患者将来对肿瘤疫苗的反应的一种方法，包括：

检查患者，以确定该患者是否具有对间皮素的迟发型超敏反应(DTH)，其中存在这种反应预示比没有这种应答的存活时间更长。

97.权利要求96的方法，其中所述疫苗含有完整肿瘤细胞。

98.权利要求96的方法，其中所述疫苗含有胰腺癌细胞。

99.权利要求96的方法，其中所述疫苗含有卵巢癌细胞。

100.权利要求96的方法，其中所述疫苗含有间皮瘤细胞。

101.一种重组小鼠细胞系，其含有已经被HPV-16E6和E7以及一种激活的癌基因转化的腹膜细胞，其中该细胞系在经腹膜内注射到免疫活性小鼠体内后能够形成腹水和肿瘤。

102.权利要求101的重组小鼠细胞系，其中激活的癌基因是激活的c-Ha-ras。

103.权利要求101的重组小鼠细胞系，它表达间皮素。

104.权利要求101的重组小鼠细胞系，它是WF-3。

105.一种小鼠模型，其包括：

已经注射权利要求101的重组小鼠细胞系的小鼠。

106.权利要求105的小鼠模型，它是免疫活性的。

107.一种检测物质以确定它是否是一种可能的治疗选自下列的癌症的药物的方法：卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤和鳞状细胞癌，该方法包括：

使权利要求105的小鼠模型接触一种待测物质；和

确定该待测物质是否引起小鼠模型肿瘤的消退、小鼠模型中腹水体积的减少，或小鼠模型存活时间的延长。

108.一种检测物质以确定它是否是一种可能的治疗选自下列的癌症的药物的方法：卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤和鳞状细胞癌，该方法包括：

使小鼠接触一种待测物质；

对小鼠注射权利要求101的重组小鼠细胞系；和

确定该待测物质是否引起小鼠模型中肿瘤的消退、小鼠模型中腹水体积的减少，或小鼠模型存活时间的延长。

109.权利要求59的疫苗，其中所述多肽是间皮素。

110.权利要求1的疫苗，其中所述多肽是间皮素。

111.权利要求22的疫苗，其中所述多肽是间皮素。

112.权利要求67的疫苗，其中所述多肽是间皮素。