JPH08511678A

JPH08511678A - ５’（ｏｈ）および／または３’（ｏｈ）部位に１以上の放射活性のない標識要素を導入するために５’（ｏｈ）および／または３’（ｏｈ）が化学的に修飾された核酸プローブ、およびそれらの製造方法

Info

Publication number: JPH08511678A
Application number: JP6518492A
Authority: JP
Inventors: ボマリー−ジョエレデ; アレクスボレン
Original assignee: ラレジョンワロネ
Priority date: 1993-02-19
Filing date: 1994-02-18
Publication date: 1996-12-10
Also published as: DE69411891D1; NO953251D0; BE1007918A3; EP0684954A1; ES2122233T3; CA2155757A1; ATE168696T1; WO1994019364A2; WO1994019364A3; US5969128A; FI953897A0; EP0684954B1; NO953251L; DE69411891T2; FI953897A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を検出するための核酸プローブに関する。上記プローブは：ａ）検出される分子の型に応じて、ＤＮＡまたはＲＮＡの核酸配列Ｓにより構成されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボヌレオチド部分と、ｂ）発光または発色により放射性同位体を用いることなく検出か可能な１以上の検出単位もしくは標識要素Ｍの直接または間接的な接着を可能にする化学的特性を有するヌクレオチドてない部分とを含む。上記プローブは、ｂ）部分がアルキル基がちりばめられているホスフェート単位の鎖より構成されるという事実によって特徴づけられ、すなわち：ｂ１）異なるホスフェート基群を結び付け、そして特別の置換性（functionality）を示さないあるアルキル基群ｂ２）様々な試薬と結合して、直接的または間接的な検出を可能とする１級アミン基を示すアルキル基群であって、ｂ２）基群は上記ｂ１）の基のためにａ）部分または配列Ｓに結合されている。配列Ｓはその５’および／または３’端で１以上の標識要素Ｍに結合される。この型のプローブは、先天性の遺伝性疾患、癌遺伝子、ウイルス性、細菌性または寄生虫性疾患の検出および診断に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】５’（ＯＨ）および／または３’（ＯＨ）部位に１以上の放射活性のない標識要素を導入するために５’（ＯＨ）および／または３’（ＯＨ）が化学的に修飾された核酸プローブ、およびそれらの製造方法本発明は、放射活性のない核酸プローブ、および上記プローブの合成に有用な化合物に関する。先天性の遺伝子疾患、癌遺伝子、ウイルス、細菌あるいは寄生虫に起因する疾患の検出および診断のために核酸プローブを用いることは、きわめて一般的になってきており、そしてそれらはヒトの臨床および獣医学の分野と育種産業（food-growing industry）の分野において用いられている。考慮されたプローブは、一般的に、ある実験条件下で、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり、それらの相補的な配列を回復することができ、ハイブリッドを形成して安定な二本鎖を作り出す。従来、放射活性のある標識の使用を必要とするＤＮＡ-ＤＮＡまたはＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドの検出に用いられていた：プローブは、放射性同位体、通常、³² Ｐ放射性同位体で標識され、そしてハイブリダイゼーションの後の検出は、放射能のカウントまたはオートラジオグラフィーを必要とする。放射性同位体の使用に伴う不利益（崩壊の期間、コストおよび安全性）の点から、（放射性同位体を含まない）”コールド”プローブを使用する傾向にある。コールドプローブは、原理的に基質の存在下に発色する酵素系で、そして最も最近の系では、発光（蛍光、化学発光あるいは生物発光）を利用する検出技術が採用されている。こうしたプローブの標識を考慮する場合、現在までのところ発表された技術は、２つの主なカテゴリーに分けられる：１．第一は、上記プローブを直接検出可能な要素に結合すること、例えば上記プローブに酵素（アルカリフォスファターゼまたはパーオキシダーゼ））を共有結合することからなる。２．第二のカテゴリーは、ハイブリッドの間接的な検出からなる。これは、上記プローブに接着している単位（des motifs）を認識する中間体物質の使用を含む。これらは、主として、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの間の非常に激しい相互反応に基づき、ここでアビジンまたはストレプトアビジンは、ある酵素と対をなす。このアプローチは、核酸プローブに取り込まれる１以上のビオチンを必要とする。コールドプローブの使用に基づく技術は、直接的または間接的な検出を含むが、それゆえ、プローブを標識できるようにするために、上記のプローブでオリゴヌクレオチド鎖を化学的に修飾することが必要である。１級アミンまたはチオールなど種々の試薬で結合できる置換基を有するオリゴデオキシヌクレオチドは、文献に記載されている。これら置換基は、１以上の塩基、またはオリゴデオキシヌクレオチドの５’または３’端のいずれか一方に導入されてもよい。上記鎖の塩基の化学的修飾は、オリゴヌクレオチドが相同的な配列とハイブリッドを形成する際に、塩基対の形成を妨害するという不利益を招く。このために、５’または３’端へ置換基を導入するよりよい方法は、上記プローブのオリゴヌクレオチド部分から検出可能部分を十分離してこうしたプローブを製造する技術を提供することである。それゆえ、本発明は、下記のような核酸プローブを得ることを目的とする：ｉ）相補的な標的とする配列とよくハイブリダイゼーションすること； ii）直接的または間接的な検出が、放射性同位体を用いない方法により可能であり、検出限界値が可能な限り低いこと；および iii）合成が容易、言い換えれば、特に固相上での核酸の自動合成またはマニュアル合成に適していること。したがって、本発明は、ａ）Ｓ：検出される分子の型によってＤＮＡまたはＲＮＡの核酸配列となるで構成されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴデオキシヌクレオチド部分；およびｂ）発色または発光により放射性同位体を用いないで検出できる標識要素Ｍまたは検出単位の直接的または間接的接触を可能にする化学的性質を有する非ヌクレオチド部分を有する非核酸部分であって、ｂ）部分は、アルキル単位が散在されたリン酸基の単位の鎖からなることを特徴とし、言い換えれば：ｂ１）種々のリン酸基群が結合し、特別の置換性（fonctionalite）を示さないあるアルキル単位；ｂ２）直接的または間接的な検出を行うために、種々の試薬で結合できる１級アミン基を有するアルキル単位；ｂ２）単位は、ａ）部分またはｂ１）単位を介して配列Ｓにつながれている。本発明によれば、配列Ｓはその５’および／または３’端で１以上の標識要素Ｍにつながれている。１以上の検出単位の直接的または間接的な検出を可能にするＸ置換基を有する分子構造には、とりわけ、２つの型がある：ｉ）Ｘ置換基が直線状に配列された”くし”型構造。ｉｉ）Ｘ置換基が枝別れ状に配列されている”燭台”型構造。本発明は、いずれの型の構造も含む。Ｉ．”くし”型分子構造によって５’（ＯＨ）および（または）３’（ＯＨ）で化学的に修飾された核酸プローブこの型のプローブは、ヌクレオチド部分が標的の相補的な断片と相同性のある定義された核酸配列を含み、その配列は安定化エネルギーを供給し、検出されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子とのハイブリダイゼーションを強固にする。それは、リボースがちりばめられたリン酸基の単位の鎖から構成される。非ヌクレオチド部分は、上述の核酸配列の５’（ＯＨ）および／または３’（ＯＨ）端に導入可能なハイブリッドの直接的または間接的な検出を可能にする反応性を提供し、アルキル単位がちりばめられた直線状のリン酸基の単位の鎖から構成されており、言い換えれば：Ｌ：特殊な化学的置換性を示さないあるアルキル単位；”化学的アーム”としても知られているが、このような単位の出現順序は、検出単位の間に導入されている間隔（des espacements）による。Ｍ：種々の試薬と結合して直接的または間接的な検出単位の形成に導く１級アミン基群を有するアルキル単位を示す。Ｍ単位は、可変数の化学的アームＬによって互いに離されており、そしてＭは放射性同位体を用いない様式で直接的または間接的に検出できる、人工または天然の分子を含む。かくして構成されたプローブは、一般式 [(M)y'-(L)x']z'-S-[(L)x-(M)y]z （Ｉ）で表わされ、ここで、Ｓ、ＬおよびＭは上記の意味であり、ｘ、ｘ’、ｚ、ｚ’は、０以上の整数であり、かつｚおよびｚ’が同時に０でなく、ｙおよびｙ’は０を超える整数である。化学的修飾は、それゆえ、核酸配列の５’および／または３’端で行われ下記式Ｉで特定される：単位Ｓ、ＬおよびＭは以下のように記載される：Ｓ：核酸配列Ｊ＝ＨまたはＯＨｍは、１〜１０００の数を表わすＢは、核酸、ヌクレオチドによって異なるプリン塩基またはピリミジン塩基である。核酸は、ヌクレオチドのポリマー、ＲＮＡの場合リボヌクレオチド、ＤＮＡの場合デオキシリボヌクレオチドのいずれかであることが想起されるだろう。ＲＮＡのモノマーの場合、すなわち、ヌクレオチドは、リン酸、５つの炭素原子を含むリボース（Ｊ＝ＯＨ）と４つの基本的塩基：アデニン、グアニン、シトシン、およびウリジンから構成される。まれには、ジヒドロウラシルおよびシュードウリジンなどのメチル化あるいはヒドロキシル化された、いわゆる副塩基またはヌクレオシドが含まれる。ＤＮＡの場合、デオキシリボヌクレオチドの単糖類がＤ -２-デオキシリボース（Ｊ＝Ｈ）であり、４つの基本的塩基はアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンである；まれには、シトシンがメチルシトシンまたはヒドロキシメチルシトシンに置換されている。上記ポリヌクレオチドの本質的特徴の１つは、３’-５’リン酸ジエステル結合がヌクレオチド間にあることである。Ｌ：化学的アームｘ、ｘ’＝０〜１００ｎ’＝０〜２０化学的アームは、ヌクレオチドでないポリマーである。このポリマーの本質的特徴の１つは、ＤＮＡの場合もＲＮＡの場合も、上記モノマーを結合するリン酸ジエステル結合である。モノマーは、リン酸、１のジオール：１位の炭素上でアルキル側鎖に置換された１，３-プロパンジオールからなる。Ｍ：標識要素ｙ、ｙ’＝１〜１００ｎ＝０〜２０Ｘ：標識、直接：アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、フルオレセイン、基質の存在下に酵素が発色または発光を生じ得るいずれかの酵素；または間接：ビオチン、ジゴキシゲニン、放射性同位体を用いない方法で標識された抗体によって認識され得るいずれかのハプテンである。標識要素は、ヌクレオチドでないポリマーである。このポリマーの本質的特徴の一つは、ＤＮＡの場合でもＲＮＡの場合でも、モノマーの間にリン酸ジエステル結合があることである。上記モノマーは、リン酸、１のジオール：メチレンアセタミド-アルカンで１位の炭素上で置換された１，３−プロパンジオールからなり、上記アルキル鎖は標識のアミンにより末端が置換されている。最終的に、上記プローブの検出に応答する上記要素ＬＭは、ｚ’≠０；ｚ＝０のとき５’（ＯＨ）に、またはｚ’＝０；ｚ≠０のとき３’（ＯＨ）に、またはｚ≠０；ｚ’≠０のとき５’（ＯＨ）および３’（ＯＨ）に同時に導入されていてもよく、一般的に言えば、ｚおよびｚ’＝０〜１００である。化合物Ｉａは、かくして、Ｉの種々の要素、すなわち、Ｓ、ＬおよびＭという、上記モノマー同士が互いにリン酸ジエステル結合でつながっているポリマーであるため、古典的なヌクレオチド間結合により合成されてもよい。それゆえ、本発明は、Ａ１）好ましくは固相上における従来のマニュアルまたは自動ヌクレオチド結合を含むいずれかの合成方法による核酸配列Ｓの合成およびＡ２）上記配列を、好ましくは、合成と同じ方法、言い換えれば、固相支持体上で、一連のＭおよびＬ単位によるその５’（ＯＨ）端での伸長または一連のＭおよびＬ単位によるその３’（ＯＨ）端での伸長または二連のＭおよびＬ単位によるその５’（ＯＨ）端および３’（ＯＨ）端での伸長のいずれかに供することを特徴とする標識（marquer）の接着Ｂ）上記Ｌ単位は、ヌクレオチドでないポリマーＬの合成によって得られここで、ｎ’およびｘは上述の意味であり、そしてＣ）上記Ｍ単位は、ヌクレオチドでないポリマーＭの合成により得られここで、ｎおよびｙは上述の意味であり、Ｘは、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、放射性同位体を用いない方法で標識された抗体によって認識され得るいずれかのハプテン、または、上記核酸プローブＩの全合成の後に除去できる１級アミン基という一時的な保護基のいずれかを表わすを含む式Ｉａのプローブを製造する方法を提供することにある。実施例のためにのみ、この合成方法では、ｘは、アセチルＩＶ、トリフロロアセチルＶＩＩ、ベンゾイルＶＩＩＩを示し、そして、上記ＢおよびＣの合成もまた、好ましくは、従来のマニュアルまたは自動ヌクレオチド間結合合成方法を用いて、特に好ましくは、固相支持体上で行う。より好ましくは、化学的アームの各要素は、式を有する１，３-アルカンジオールから出発して、以下のａ）保護基Ｒ₁で１級アルコール基を保護し、式の化合物を得、ｂ）２級アルコールをＯＲ₂基に変換し、式の化合物を得、ここで、Ｒ₂は化合物ＩＩ（シントン、synthon）をヌクレオチド末端または他の存在しているシントンの末端に導入するために適した基を表わす、という工程で得られる。本発明の他の特徴によれば、各要素または検出単位Ｍは、式 HO-CH₂-CH₂-CH=CH₂ (XXX) を有するブテン-３オール-１から出発して、ａ）保護基Ｒ₁によって１級アルコールを保護し、式 R₁-O-CH₂-CH₂-CH=CH₂ (XXXI) を有する化合物を得、ｂ）化合物（ＸＸＸＩ）の二重結合をエポキシ化し、式の化合物を得、ｃ）上記エポキシドをアンモニアで開環し、式の化合物とし、ｄ）式の化合物の１級アミノ基を保護して、式の化合物を得、ここで、Ｘは上記の意味であり、ｅ）化合物（ＸＸＸＩＩＩ）を活性化し、ｆ）化合物（ＸＩＩＩａ）および（ＸＸＸＩＩＩ）をそれら自身の間で縮重合させて、式の化合物とし、ｇ）化合物（ＸＶａ）をリン酸化し、式を得、ここで、Ｒ₂は化合物（ＩＩＩａ）（シントン）をヌクレオチドの末端またはすでに存在するシントンの末端に選択的に導入するに適したリン酸化された基を表わす。上述の式中、Ｒ₁は、１級アルコール基の保護基である；実施例の方法によってのみ、固相支持体上でホスホロアミデート（phoshporoamidites）を合成する場合、Ｒ₁は、酸性溶媒中で不安定な式ＩＶの４，４’−ジメトキシトリチル（4,4’-dimethoxytrityl，ＤＭＴ）を表わし、そして、Ｒ₂は、Ｈまたは与えられた型のヌクレオチド間結合の合成について固相支持体上ですでに縮合されたあるシントンまたはヌクレオチドの５’端にシントンＩＩあるいはＩＩＩを導入するのに適した、可能な限り保護されたいずれかのリン酸基である。Ｒ₂は、実施例のために、固相支持体上でホスホロアミデートを合成する場合、式Ｖのシアノエトキシジイソプロピルアミノホスホロアミデート（cyanoethoxydiiso propylaminophosphoroamidite）を表わす。本発明の目的は、２つのヌクレオチドでない合成化合物を提供することにもあり、これらの化合物は、固相支持体上で既知のマニュアルまたは自動的なヌクレオチド間結合の合成方法によって、化合物ＩａのＭおよびＬ断片それぞれの中間体として有用である。クレームされた２つの合成化合物は、式ＩＩおよび式ＩＩＩで表わされ、ここで、Ｒ₁、Ｒ₂、ｎ、ｎ’およびＸは、すでに述べた意味である。本発明はまた、上記で概説した方法により中間体化合物ＩＩおよびＩＩＩを製造することに関する。ホスホロアミデートを合成する場合、化合物ＩＩの合成は、以下の模式図で示される：ホスホロアミデートの合成の場合と同様に、式ＩＩＩの化合物の製造手順は、下記の模式図で表わされる：工程Ａ）４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（4,4'-dimethoxytrityl chl oride）を用いたブテン３-オールの１級アルコールの保護工程Ｂ）メタ-クロロ過安息香酸（meta-chloroperbenzoic acid）を用いた二重結合のエポキシ化工程Ｃ）アンモニアを用いたエポキシドの開環、化合物ＸＩＩＩの生成工程Ｄ）６-アミノカプロン酸（6-aminocaproic acid）の１級アミンのトリフロロアセチル基による保護工程Ｅ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いた６−トリフロロアセチルアミドカプロン酸（6-trifluoroacetylamidocaproic acid）の活性化、化合物ＸＩＶの生成工程Ｆ）ＸＩＩＩおよびＸＩＶの縮合による化合物ＸＶの合成工程Ｇ）誘導体ＩＩＩの固相支持体上での連続的結合を可能にする試薬により２級アルコールＸＶをリン酸化し、それによってある型のヌクレオチド間結合を得る。ホスホロアミデートを合成する場合、リン酸化は、ジイソプロピルアミノシアノエトキシクロロホスフィン（diisopropylaminocyanoethoxychloro-phosphin e）ＸＩを用いて行われる。本発明のさらに別の目的は、ＣＰＧ（均質ポーラスガラス、controlled porou s glass）固相支持体を化合物Ｘにより置換（fonctionnalisation）するための方法である。それによって置換された上記固相支持体は、ｚが０でない、言い換えれば、その中でマーカーがプローブの３’部位に導入されるＩ型核酸プローブの製造を可能にする。実際、好ましくは固相支持体上で、いかなるマニュアルまたは自動ヌクレオチド間結合の既知合成方法も、３’端から５’端へ鎖を伸長させることによって機能する。ｚが０でないＩ型の核酸プローブでは、それゆえ、式ＸまたはＸＶの化合物で置換された固相支持体上で合成を開始することが必要である。しかしながら、得られる誘導体Ｘで与えら得る容易さを化合物ＸＶと比較すると、Ｘで上記支持体を置換することを選ぶ。上記固相支持体を置換するためのクレームされた方法−支持体は、最初に１級アミン基で被覆される−は、下記の工程を含む： −無水スクシン酸（succinique anhydride）によりＸの２級アルコールをアシル化し、式ＸＶＩＩの化合物を製造。 −化合物ＸＶＩＩのカルボキシル基を、カルボジイミドの存在下で、ペンタクロロフェノールにより活性化し、エステルＸＶＩＩＩを製造。 −誘導体ＸＶＩＩＩを接着し、固相支持体をアミノ化。置換された固相支持体ＸＩＸがこのようにして得られる。１１．”燭台”型分子構造によって５’（ＯＨ）が化学的に修飾された核酸プローブこの型のプローブでは、核酸部分が標的の相補的な断片と相同である定義された核酸配列から構成され、それは安定化エネルギーを提供し、検出されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子とのハイブリダイゼーションを強固にする。それは、リボース単位がちりばめられたリン酸基の単位の鎖から構成される。直接的にまたは間接的にハイブリッドを検出し得る反応性を提供する部分は、上記の核酸配列の５’（ＯＨ）端に導入される。それは、アルキル基がちりばめられた枝別れしたリン酸基の単位の鎖から構成される。 − 枝の内側にあるアルキル基、すなわち、様々なリン酸基を結び付けているアルキル基は、特別の化学的置換性を示さず、 − 枝の外側にあるアルキル基、すなわち、上記枝の様々なアームの終端にあるアルキル基は、上記鎖の末端に１級アミン基を有する。それゆえ、本発明の目的は、上記配列Ｓが標識要素Ｍにその５’端で結合されることを特徴とするＤＮＡまたはＲＮＡの核酸配列Ｓを含む核酸プローブＸＸである。それゆえ、上記化学的修飾は、上記核酸の５’（ＯＨ）で行われ、その結果、例えば、式ＸＸは下記式で特定される：単位ＳおよびＭは以下のように記載される：Ｓ：核酸配列Ｊ−ＨまたはＯＨｘは１〜１０００のヌクレオチド数を示すＢは、ヌクレオチドによって異なる、核酸塩基、プリン塩基、ピリミジン塩基である。核酸は、ヌクレオチド、ＲＮＡの場合はリボヌクレオチド、ＤＮＡの場合はデオキシリボヌクレオチドのポリマーであることが想起される。ＲＮＡの場合、モノマー、すなわち、ヌクレオチドは、リン酸、五炭糖、リボース（Ｊ＝ＯＨ）および４つの基本塩基：アデニン、グアニン、シトシンおよびウリジンの１つから構成される。ＤＮＡの場合、デオキシリボヌクレオチドオースは、Ｄ−２−デオキシリボース（Ｊ＝Ｈ）であり、４つの基本塩基は：アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンである。上記ポリヌクレオチドの本質的特徴の１つは、３’−５’ホスホジエステルヌクレオチド間結合である。Ｍ：標識要素、上記の例中、８つのアミノ化されたアームで終わっている。この点から、８順（d'ordre huit）と呼ばれる。枝別れの順は、やはり２〜１２８の値を推定してもよい（高順は、常に先行する順の２倍である）。ｎ、ｎ’およびｎ”＝０〜２０Ｘ：標識、直接：アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、フルオレセイン、基質の存在下に発色または発光し得るいずれかの酵素または間接：ビオチン、ジゴキシゲニン、放射性同位体で標識されていない抗体によって認識され得るいずれかのハプテン。上記標識要素は、ヌクレオチドでない、枝別れしているポリマーである。このポリマーの本質的特徴は、ＤＮＡの場合もＲＮＡの場合も、モノマー間にホスホジエステル結合があることである。枝別れしたポリマーＭは、別々の２つの型のモノマーから構成される： −枝別れ構造をとるために応答できる上記モノマー。これは、リン酸とトリオール：ＵＮ１、ｎ、ωアルカントリオールから構成される。 −１級アミン基を枝端に導入するために応答できるモノマー。これは、リン酸、およびアミノアルコール、１−アミノヘキサン６−オールから構成される。化合物ＸＸの異なる要素はポリマーであり、これらのモノマーはホスホジエステル結合で互いに結合されているため、化合物ＸＸの合成は、それゆえ、従来のヌクレオチド間合成を用いて行われる。本発明の他の目的は、それゆえ、核酸配列Ｓ：の合成を含む式ＸＸのプローブを製造する方法である：ここで、ＢおよびＪは上記の意味であり、いかなる既知のマニュアルまたは自動のヌクレオチド間結合の合成法によってもよいが、好ましくは固相支持体上での合成であり、上記配列は、好ましくは合成と同じ方法、すなわち、固相支持体上で、アーム終点に１級アミン基を有する枝別れ分子構造Ｍによってその５’（ＯＨ）端の伸長に供される。枝別れ分子構造は、下記の式を満たす：そして、より詳細には、いかなる既知のマニュアルまたは自動ヌクレオチド間結合の合成法によって合成してもよいが、好ましくは、固相支持体上で合成される。さらに、リン酸基および塩基が保護されているオリゴヌクレオチド鎖Ｓの合成は、上記鎖の５’（ＯＨ）端で縮合によって、下記式の一連の化合物を与える。ここで、Ｒ₁およびＲ₂は上述の意味である。化合物ＸＸＩとは別に、Ｍの合成は、枝端にアミノ化されたアームを導入するために、化合物ＸＸＩＩを用いることが必要である。 XHN-(CH₂)_n"-OR₂ XXII この化合物は、文献的に知られている。式ＸＸＩＩ中、Ｘは： −標識：アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、放射性同位体で標識されていない抗体で認識され得るいずれかのハプテン、 −または、核酸プローブＸＸの全合成に続いて除去され得る１級アミン基の一時的な保護基。実施例のために、この合成法では、ＸはトリフロロアセチルＶＩＩ、フロレニルメトキシカルボニル（fluorenylmethoxy carbonyl）ＸＸＩＩＩを表わしてもよいＲ₂は、上述の意味である。本発明によれば、式ＸＸＩの化合物は、式を有するアルカントリオールから、以下の工程により得られる。ａ）１級アルコール基をＲ₁保護基を用いて保護し、式の化合物を得る工程ｂ）２級アルコール基をＯＲ₂基に変換し、式の化合物を侍る。ここで、Ｒ₂は上記の意味である。より詳細には、工程ａ）においては、４，４’−ジメトキシトリチルクロライドにより保護が行われ、工程ｂ）においては、２級アルコール基のリン酸化はジイソプロピルアミノシアノエトキシクロロホスフィン（diisopropylaminoethoxy chlorophosphine（ＸＩ）を用いて行う。本発明はまた、式ＸＸのプローブ合成における中間体としての式ＸＸＩの化合物ならびに、上記したような、式ＸＸＩの中間体化合物の製造方法に関する。本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例により明らかにする。実施例Ｉ：１-Ｏ-（４，４’-ジメトキシトリチル）３-Ｏ-［Ｎ，Ｎ’ジイソプロピルアミノ-２シアノエトキシホスフィノ］１，３−ブタンジオール（1 -o-(4,4'-dimethoxytritvl) 3-o-[N,N'diisopropylamino-2cyanoethoxyphosphin o]1,3-butanediol）の製造方法１-Ｏ-（４，４’−ジメトキシトリチル）３−Ｏ−［Ｎ，Ｎ’ジイソプロピルアミノ−２シアノエトキシホスフィノ］１，３−ブタンジオール１は下記式：で示される。採用された方法の目的は、ヌクレオチドでないシントンを製造することにあり、しかしながら、このシントンは、標準的な自動ＲＮＡまたはＤＮＡ合成条件でモノマーがホスホジエステル結合でつながれているオリゴヌクレオチド鎖またはヌクレオチドでないポリマー中に導入可能な置換基を有する。このシントンは、自動合成またはマニュアル合成のルーチンから離れることなく、核酸配列の３’（ＯＨ）および（または）５’（ＯＨ）部位に、”化学的アーム”の導入を可能にする道具をユーザーに提供するという利点を有する。この結合中化学的アームによって担われる役割は、異なる標識要素の間に、他方、標識要素と核酸配列との間に、それらの各々のハイブリダイゼーションおよび検出において２つの部分のより高い効率を達成するために、間隔を導入することである。４，４’−ジメトキシトリチル基および２-シアノエトキシジイソプロピルアミノホスホロアミデート（2-cyanoethoxydiisopropylamino phosphoramidite）基は、ホスホロアミデート（phosphoramidites）の合成に適し、特に固相支持体上での合成に適する。下記のスキーム１に示された化合物１を得るための反応式は、以下のステージを含む：１．１，３−ブタンジオール２の１級アルコールの、酸性のｐＨで不安定な４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基による選択的保護２．２級アルコール３のリン酸化。上記図中に示されたホスホロアミデートの例に限定されない；リン酸トリエステルもしくはジエステル、またはホスホネートを同様に合成できるものであればよい。１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）１，３−ブタンジオール３の製造方法２．２５ｇ（２５ミリモル）の１，３−ブタンジオール２をアルゴンガス雰囲気の１００ccの２口フラスコに入れた。４０ccの無水ピリジンを加え、１１ｇ（３２．５ミリモル）の４，４’−ジメトキシトリチルクロライドを少量ずつ溶液に加える。この後、９０分間アルゴン雰囲気下でマグネチックスターラーで室温にて攪拌した。次に、１０ccのメタノールを反応溶液に加えた。この操作の目的は、過剰の４，４’−ジメトキシトリチルクロライドを中和することにある。反応混合物を加水分解（１００ccの５％ＮａＨＣＯ₃）し、ジクロロメタンで２回抽出した（ＣＨ₂Ｃｌ₂ ２回、７５cc）。得られた有機相を５％炭酸水素ナトリウム（５％ＮａＨＣＯ₃）で３回洗浄した。硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄ ）上で乾燥し、ろ過し、エバポレートした（ロータリーエバポレータ、ｐ＝２０ mmHg）。残さを、メルク（Merk）９３８５シリカカラム上で、ＣＨ₂Ｃｌ₂を溶離液として用いて精製した。上記シリカは、あらかじめ１％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を含むＣＨ₂Ｃｌ₂溶液中に懸濁して中和してある。精製後、６．７９ｇの化合物３（１７．３２ミリモル）を回収した−収率６９％。メルク５７３５薄層クロマトグラフィー板（シリカゲル６０Ｆ₂₅₄）上、展開溶媒ＣＨ₂Ｃｌ₂；Ｒｆ＝０．３。１-Ｏ-（４，４’-ジメトキシトリチル）３-Ｏ-［Ｎ，Ｎ’ジイソプロピルアミノ−２シアノエトキシホスフィノ］１，３−ブタンジオール１の製造方法６．７ｇの化合物３（１７．３ミリモル）を１００ccの２口フラスコに入れた。アルゴン雰囲気とし、その後５２ccの無水テトラヒドロフランと９cc（５１．９ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンを添加した。この反応混合物に、５．５２ｇ（２３．３５ミリモル、５cc）の２-シアノエトキシジイソプロピルアミノクロロホスフィンをシリンジで滴下した。１０分間反応させた後、大量の沈殿が反応混合物中に生じた（ジイソプロピルエチルアミンクロロハイドレート（diisopropylethylamine chlorohydrate））。この沈殿をろ過し、１００ccの酢酸エチルをろ液に加えて、有機相を得、５％ＮａＨＣＯ₃溶液で３回洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、ろ過して、エバポレートした（ロータリーエバポレータ、ｐ＝２０mmHg）。残さをメルク９３８５シリカカラム上で、ヘキサン６−酢酸エチル４を溶離液として使用して精製した。シリカは、あらかじめ１％ＤＩＥＡを含む溶離液に懸濁し中和した。続く精製により、９．２４ｇの化合物１が回収された。収率９０％。メルク５７３５薄層クロマトグラフィー板（シリカゲル６０Ｆ₂₅₄）上で、展開溶媒がヘキサン５−酢酸エチル５のとき、Ｒｆ＝０．８（この反応の出発物質である化合物３は、この条件の下で、Ｒｆ＝０．５であった）。実施例１１：１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）３−Ｏ−（Ｎ，Ｎ ’−ジイソプロピルアミノ２−シアノエトキシホスフィノ）４−アミド−（６ −トリフロロアセチルアミド）カプロエート４−アミノ１，３−ブタンジオール（1-O-(4,4'-dimethoxytrityl)3-O-(N,N'diisopropylamino 2-cyanoethoxyp hosphino)4-amido-(6-trifluoroacetylamido)caproate 4-amino 1,3-butanediol ）４の製造法誘導体１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）３−Ｏ−（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノ２−シアノエトキシホスフィノ）４−アミド−（６−トリフロロアセチルアミド）カプロエート４−アミノ１，３−ブタンジオール４は、下記の式を満たす：採用された方法の目的は、ヌクレオチドでないシントンを製造することにあり、しかしながら、このシントンは、標準的な自動またはマニュアルＲＮＡまたはＤＮＡ合成条件下で、モノマー同士がホスホジエステル結合でつながれたオリゴヌクレオチド鎖またはヌクレオチドでないポリマー中に導入できる置換基を有する。この系は、１以上の同位体でない標識要素を核酸配列の３’（ＯＨ）および（または）５’（ＯＨ）端に、自動またはマニュアル合成のルーチンを離れることなく、導入することを可能にする道具をユーザーに提供するという利点がある。上記標識要素は、一方で”化学的アーム”によってオリゴヌクレオチド鎖から分離され、他方、互いに分離された。この実施例で記載したような標識要素の直接的役割は、オリゴヌクレオチド鎖の５’（ＯＨ）および（または）３’（ＯＨ）位に、”化学的アーム”によって他方から分離された”１級アミン”アームを導入することにある。それらの求核的性質は、これらのアミノ化されたアームが、直接的または間接的に検出要素（酵素、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）に接着することを可能にした。４，４’−ジメトキシトリチル基およびＮ，Ｎ’ジイソプロピルアミノ２− シアノエトキシホスホロアミデート基は、ホスホロアミデートの合成に好適である。以下のスキームＩＩで表わされる化合物４を得るための反応経路は、下記のステージを含む：１．３−ブテン１−オール５のアルコールの、酸性ｐＨで不安定な４，４’ −ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）による保護。２．オレフィン６の末端のメタクロロ過安息香酸によるエポキシ化。３．エポキシド７のアンモニアを用いた開環。４．６−アミノカプロン酸の１級アミンのトリフロロアセチル基を用いた保護。５．誘導体９のカルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミノエステル（hy droxysuccinimic ester）による活性化。６．化合物８と化合物１０の縮合。７．２級アルコール１１のリン酸化。模式図に示されたホスホロアミデートの実施例に限定されるものではない。リン酸トリエステルもしくはジエステル、またはホスホネート（phoephonate）の合成に適したものであればよい。１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）３−ブテン１−オール（1-O-(4 ,4'-dimethoxytrityl)3-butene 1-ol）６の製造方法２５０mlの２口フラスコ中に、３．６ｇ（５０ミリモル）の３−ブテン１−オールを、アルゴンガス下に、８０ccの無水ピリジン中に加えた。２２ｇ（６５ミリモル）の４，４’−ジメトキシトリチルクロライドを少量ずつ加えた（反応は、わずかに発熱性である）。室温で４時間保持し、マグネチックスターラーで完全に攪拌した。その後、１０ccのメタノールを過剰の４，４’−ジメトキシトリチルクロライドを中和するために上記反応混合物に添加した。この反応混合物を、１００ccの５％ＮａＨＣＯ₃で加水分解した。この混合物を、１５０ccのジクロロメタンで２回抽出した。得られた有機相を、５％ＮａＨＣＯ₃で３回、水で３回、さらに飽和ＮａＣｌ水溶液で１回洗浄した。得られた有機相をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、ろ過して、エバポレートした（ロータリーエバポレーター、ｐ＝２０mmHg）。その後、得られた残さを、残ったピリジンを除去するためにトルエンと共沸させて留去し、その後残ったトルエンを除くためにジクロロメタンと共沸させて留去した。その後、残さを、メルク９３８５シリカカラムで、溶離液：ヘキサン１ −ジクロロメタン９で精製した。上記シリカは、あらかじめ、１％ＤＩＥＡを含む溶離液中に懸濁させて中和した。化合物６は９０％の収率で得られた。メルク５７３５プレート（シリカゲル６０Ｆ₂₅₄）上の薄層クロマトグラフィー、展開溶媒ジクロロメタン、Ｒｆ＝０．８５。１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）３，４−ブテンオキサイド(1-O-( 4,4'-dimethoxytrityl)3,4-butene oxide) ７の製造方法市販の５０％の水を含むm-クロロ過安息香酸を、水を除去するためにジクロロメタン中に入れ、水をデカンテ_□ングで除いた。１００ccの三角フラスコ中に、８．５gの５０％ｍ−クロロ過安息香酸（２４．６ミリモル）を入れ、６４ccのジクロロメタンを加えた。上層の水相をデカントした。２５０ccのフラスコ中に、６．３５gの化合物６（１７ミリモル）をアルゴン雰囲気の下に入れた。これに４０ccのジクロロメタンを加えた。次に、上述のように製造された過酸溶液をゆっくり加えた。この反応混合物を８時間、マグネチックスターラーで攪拌した。生成された沈殿をろ過した（ｍ−クロロ安息香酸）。１５０ccのジクロロメタンをろ液に加え、７５ccの５％ＮａＨＣＯ₃で加水分解した。有機相を７５ccの５％ＮａＨＣＯ₃で４回洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、ろ過しエバポレートした（ロータリーエバポレーター、ｐ＝２０mmHg）。その後、残さを、メルク９３８５シリカカラムで、溶離液ヘキサン２−ジクロロメタン８で精製した。シリカは、あらかじめ、１％ＤＩＥＡを含む溶離液中に懸濁させて中和した。精製後、５．３２gのエポキシド７が得られた、収率８０％。１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）４−アミノ１，３−ブタンジオール（1-O-(4,4'-dimethoxytrityl)4-amino1,3-butanediol）８の製造方法ねじぶたを取り付け高圧に耐えられるようにした２５ccのパイレックスフラスコ中に、３ｇ（７．６ミリモル）のエポキシド７、１０ccのアセトニトリルおよび２５ccの３２％アンモニアを加えた。この混合物を６０℃で８時間加熱し、その後、水およびアセトニトリルを留去した。得られた残さを、メルク９３８５シリカカラムで、ＣＨ₂Ｃｌ₂−ＣＨ₃ＯＨ、２−１０％メタノールグラジエントを溶離液として用いて精製した。上記シリカは、あらかじめ、１％ＤＩＥＡを含む最初の溶離液中に懸濁し中和した。精製後、誘導体８は、７５％の収率で得られた。メルク５７３５プレート、シリカゲル６０Ｆ₂₅₄上での薄層クロマトグラフィー、展開溶媒２０％ＣＨ₃ＯＨ−８０％ＣＨ₂Ｃｌ₂、Ｒｆ＝０．２。６−トリフロロアセトアミドカプロン酸（6-trifluoroacetamidocaproic acid）９の製造方法５０ccのロタベーパーフラスコ（Rotavapor flask）に２．６２g（２×１０^-2 モル）の６-アミノカプロン酸を入れた。これを４ccの無水ジメチルホルムアミドに懸濁し、その後３cc（２．３５×１０^-2モル）のＳ−エチルトリフロロチオアセテート(S-ethyl trifluoro thioacetate)をこの懸濁液に加えた。アルゴン雰囲気とし、この混合物を４時間攪拌し、その後この溶液は透明であった。ジメチルホルムアミドを減圧下（Ｐ＝２０mmHg）に留去した。残さをジクロメタン中で結晶化した。化合物９は、８４％の収率で得られた。メルク５７３５プレート、シリカゲル６０Ｆ₂₅₄上での薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、展開溶媒２０％ＣＨ₃ＯＨ-８０％ＣＨ₂Ｃｌ₂。Ｒｆ：０．５。６-トリフロロアセトアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミド（6 -trifluoroacetamido caproate of N-hydroxysuccinimide）１０の製造方法１００mlのフラスコ中に、２．２７g（１０^-2モル）の化合物９、２．０４ｇ（１０^-2モル）のジシクロヘキシルカルボジイミド(dicyclohexylcarbodiimide) および１．１５ｇ（１０^-2モル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを入れた。４０ccのＣＨ₂Ｃｌ₂を添加し、この混合物を５時間アルゴン雰囲気中で攪拌した。白色の沈殿が生成され、これをろ別した。ろ液をエバポレートした。得られた残さは、未精製であったが、薄層クロマトグラフィー上で単一のスポットを示し、収率は定量的であった。薄層クロマトグラフィー−メルク５７３５プレート、シリカゲル６０Ｆ₂₅₄−展開溶媒５％ＣＨ₃ＯＨ−９５％ＣＨ₂Ｃｌ₂。Ｒｆ：０．７。１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）４−アミド（６−トリフロロアセチルアミド）カプロエート４−アミノ１，３−ブタンジオール（1-O-(4,4'-dimeth oxytrityl)4-amido(6-trifluoroacetylamido)caproate 4-amino1,3-butanediol ）１１の製造方法アルゴン雰囲気中、２．４４ｇ（６ミリモル）の化合物８および３．４４gの化合物１０（９．４５ミリモル）を５０ccの２口フラスコに入れた。２５ccの無水ジメチルホルムアミドを加えて溶液とし、１６時間攪拌した。その後、ジメチルホルムアミドを減圧下（Ｐ＝２０mmHg）にロタベーパー中にて留去した。この残さを、メルク９３８５シリカカラム上、溶離液ヘキサン５−ＣＨ₂Ｃｌ₂９５、後にメタノール２⇒１０−ＣＨ₂Ｃｌ₂９８⇒９０で精製した。上記シリカは、あらかじめ、１％ＤＩＥＡを含む最初の溶離液に懸濁して中和した。精製後、化合物１１は８４％の収率で得られた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）-メルク５７３５プレート、シリカゲル６０Ｆ₂₅₄−展開溶媒１０％ＣＨ₃ＯＨ-９０％ＣＨ₂Ｃｌ₂。Ｒｆ：０．８。１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）３−Ｏ−（Ｎ，Ｎ’ジイソプロピルアミノ２-シアノエトキシホスフィノ）４−アミド−（６−トリフロロアセチルアミド）カプロエート４−アミノ１，３−ブタンジオール（1-O-(4,4'-dimethox ytrityl)3-O-(N,N'diisopropylamino 2-cyanoethoxyphosphino)4-amido-(6-trif luoroacetylamido)caproate4-amino 1,3-butanediol)）４の製造方法アルゴン雰囲気中、２g（３ミリモル）の誘導体１１を５０ccの２口フラスコに入れた。これに、１７mlの無水テトラヒドロフラン、１．６ccのジイソプロピルエチルアミン（diisopropylethylamine）および０．８８cc（４．１ミリモル）のＮ，Ｎ’ジイソプロピルアミノ２-シアノエトキシクロロホスフィンを加えた。この溶液を、１時間室温で攪拌し、その後２５ccの酢酸エチルおよび２０cc の５％ＮａＨＣＯ₃を加えた。得られた有機相を５％ＮａＨＣＯ₃で３回洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、ろ過して減圧下（Ｐ＝２０mmHg）に留去した。この残さを、メルク９３８５シリカカラム上；溶離液ヘキサン１５−酢酸エチル８５で精製した。上記シリカは、あらかじめ、１％ＤＩＥＡを含む上記溶離液に懸濁して中和した。精製後、誘導体４は６２％の収率で得られた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）−展開溶媒ヘキサン１０−酢酸エチル９０。Ｒｆ：０．７５。実施例ＩＩＩ誘導体１および４の反応性の調査ヌクレオチドでないホスホロアミデート１および４は、各々オリゴヌクレオチドの５’（ＯＨ）および（または）３’（ＯＨ）に導入するために使用することができる： -化学的アーム（誘導体１） -”１級アミン”アーム（誘導体４）上記”１級アミン”アームはたがいに隔てられており、化学的アームによってオリゴヌクレオチドから隔てられている。このような生体高分子的な構造を実現するために、化合物１および４の反応性を、標準的なＤＮＡまたはＲＮＡ合成条件下で試験した。このために、誘導体１および４をオリゴヌクレオチドの自動合成装置で縮合させた；それらは、縮合されて、５’（ＯＨ）端でチミジン-チミジン（Ｔ−Ｔ）二量体を形成し、固相支持体（ＣＰＧ支持体−制御された多孔質ガラス、従来の自動合成における支持体）に接着した。単位４の縮合から生じたアミノ化されたアームがＮを示し、そして単位１の縮合から生じた化学的アームがＳを示すとすると、合成された５’（ＯＨ）にある修飾されたＴ−Ｔ二量体は以下の通りである：ＮＴＴ１２ＳＴＴ１３ＮＳＴＴ１４ＳＮＳＴＴ１５誘導体１および４は、伸長されたオリゴヌクレオチド（ＮＴＴ、ＳＴＴ参照）の５’（ＯＨ）にうまく接着する。化合物４は化学的アーム（ＮＳＴＴ参照）の後ろにうまく接着し、化合物１はアミノ化されたアーム（ＳＮＳＴＴ参照）の後ろにうまく接着した。１の縮合に関する限り適切に供給されたオリゴヌクレオチドの伸長サイクルの流れにおいてルーチンに用いられるすべての条件（結合時間、試薬および溶媒の濃度）を考慮した。それにもかかわらず、４の縮合にとって、ルーチンに用いられる条件（ホスホロアミデート濃度０．１Ｍ、縮合時間２５秒）を最適化することが必要であることが示された。これは、ホスホロアミデート０．１Ｍ、縮合時間１０分で反応させたとき、誘導体４がほぼ定量的な収率で縮合することによる。４つの縮合の試みが各々行われた場合、得られた生産物は、キャピラリー電気泳動分析の結果から明らかなように、どの点から見ても、純品であった（図１）。これらの結果は、縮合、酸化、キャッピングおよび合成後の固相支持体からの切り離しといった反応が効率的で、三量体（ＮＴＴ、ＳＴＴ）、四量体（ＮＳＴＴ）、五量体（ＳＮＳＴＴ）が形成されるように分解していないことを示した。さらに、オリゴヌクレオチド合成で、ジメトキシトリチル基を脱保護する溶液を回収することが可能であり、また各縮合の収量を評価し得るために、カチオンのオレンジ色の発色を測定することができる。これらの測定は、ＳとＮの縮合で生じ、それらはほぼ定量的な収量を示した。アミン保護基（トリフロロアセチル基）の不安定性も、同様に調査した。実際、固相支持体からオリゴヌクレオチド鎖を切り離す従来の条件（３２％ＮＨ₄ ＯＨ、１時間、室温）、およびオリゴヌクレオチド鎖のホスフェートおよびアミン塩基を脱保護する従来の条件（３２％ＮＨ₄ＯＨ、８時間、５５℃）は、モノマー４の縮合によってポリマー１２、１４および１５中に導入された１級アミンを脱保護するために十分であることが証明された。誘導体１または誘導体４の固相結合、チミジン−チミジン二量体の不溶化固相支持体への接着無水アセトニトリル中で０．１Ｍの濃度で可溶化した誘導体１、または誘導体４を、同じ溶媒中で０．５Ｍのテトラゾールで活性化し、チミジン−チミジン二量体の５’側でヒドロキシル基と縮合し、ＡＢＩ３９４合成機におけるオリゴヌクレオチド合成でルーチンに用いられる不溶化固相支持体に接着した。化合物１の縮合に関する限り、すべての条件はオリゴヌクレオチド伸長サイクルで使用されたもの（Ｎ．Ｄ．シンハ（N.D.Shinha）、Ｊ．ビエーナ（J.Biernat）、Ｊ．マクマナス（J.McManus）、およびＨ．コースター（H.Koester）、Nucleic Ac ids Research（１９８４年）、１２巻（１１号）、４５３９頁）と同様であった。化合物４の縮合については、結合時間を従来の結合条件における２５秒から１０分に延長する他は、オリゴヌクレオチド伸長サイクルで採用された条件と同一であった。固相支持体からの切り離しは、標準的条件（３２％ＮＨ₄ＯＨ）下で行い、最終産物はオリゴヌクレオチド合成で現在達成されている収量に匹敵する量で得られた。合成された三量体、四量体および五量体１２、１３、１４および１５はキャピラリー電気泳動ＡＢＩ２７０Ａ、マイクローゲル１００（MICRO-GEL 100）キャピラリーカラム、内径５０μｍ、長さ５０cm、電圧１５ｋＶ、７５ｍＭトリス−ホスフェート１０％メタノール緩衝液、ｐＨ７．６で分析した（図１参照）。実施例ＩＶ：放射性同位体を用いない方法によるＤＮＡ配列の検出において有用なアミノ化されたアームがちりばめられた化学的アームの直線的なもつれを５ ’（ＯＨ）に有するオリゴデオキシリボヌクレオチド混合分子の製造方法オリゴデオキシヌクレオチド部分と化学的特性を有する他の部分とから構成される混合分子の合成および有用性は、放射性同位体を用いない方法により標的とするデオキシリボ核酸の簡便かつ迅速な検出を可能にした。標的のＤＮＡ断片と相同な配列で定義されるオリゴデオキシリボヌクレオチド部分は、安定化エネルギーを提供し、検出されるＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションを強固にした。ハイブリッドの直接的または間接的な検出を可能にする反応性を提供する部分は、核酸配列の５’（ＯＨ）および（または）３’（ＯＨ）端に導入され得る。この特別な実施例において、検出に応答する部分は、本質的に上記核酸配列の５ ’（ＯＨ）に導入された。検出に応答する部分は、固相支持体に接着しているオリゴヌクレオチドの５’（ＯＨ）に導入され、核酸配列の合成で採用されたと同様、ＤＮＡ自動合成機中で同じ反応サイクルを用いて誘導体１および４の一連の縮合を進めることによって、その塩基およびホスフェートを保護した。しかしながら、誘導体４の縮合時間については、従来のサイクルで用いられた２５秒のかわりに１０分に延長した。その固相支持体から５’が修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を切り離し、塩基およびホスフェートの脱保護を行ったのち、検出に応答する反応性を与える部分を共有結合を介して導入した。検出に必須の特性を有する様々な分子のうち好ましいものは、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、パーオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼである。これらの分子は、適切に活性化され、求核的性質のため、接着目的でに導入された１級アミンでオリゴヌクレオチド鎖に接着する。単位４の縮合から生じたアミノ化されたアームがＮを示し、単位１の縮合から生じた化学的アームがＳを示す場合、合成された５’（ＯＨ）が修飾されたオリゴマーは、下記の通りである：以上のように修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を固相支持体から切り離し、塩基およびホスフェートを脱保護した後、プローブ１６、１７、１８および１９をビオチニル化してビオチニル化プローブ２０、２１、２２および２３を製造し、キャピラリー電気泳動で分析した（図２ａおよび２ｂ参照）。単位４の縮合から生じたアミノ化されたアームがその後ビオチニル化されたものがＢを示し、単位１の縮合から生じた化学的アームがＳを示す場合、得られた５’（ＯＨ）がモノビオチニル化またはポリビオチニル化されたプローブは、下記の通りである：図２ａおよび２ｂ参照。アミノ化されたアーム１６、１７、１８および１９がちりばめられた化学的アームの直線的もつれを５’（ＯＨ）に有するオリゴデオキシリボヌクレオチド混合分子の製造方法ＤＮＡプローブは、標的配列と相補的なオリゴデオキシヌクレオチド配列で合成した。ＡＢＩ３９４ＤＮＡ自動合成機における固相では、５’ＴＴＴＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡ３’という配列を有する４つの同一のプローブが、同時に製造された（４つの反応槽中）。この合成機では、単位１および単位４の５’で接着した連続サイクルがプログラムされており、バイオポリマー１６、１７、１８、および１９が各々得られた。これは、ジメトキシトリチルイソブチルグアノシン（dimethoxytrityl isob utyl guanosine）３４μモル／ｇ、これは０．２μモルに相当、で置換された６ｍｇのＣＰＧ支持体の使用を含む。誘導体１および誘導体４を、無水アセトニトリル中で０．１Ｍで可溶化し、従来ない（non classiques）ホスホロアミデートを提供する場所で合成機内に導入した。バイオポリマー１６、１７、１８および１９を自動合成した後、以上のように修飾したオリゴヌクレオチド鎖を、ＣＰＧ支持体から、５００μｌの３２％ＮＨ₄ ＯＨで１５分間４回連続的に処理して切り離した。得られたアンモニア溶液を５５℃で５時間保持した。この第二の処理は、オリゴヌクレオチド鎖の塩基およびホスフェートの脱保護のために行った。アンモニア溶液を凍結乾燥し、４つの残さを分子ろ過クロマトグラフィー（Ｇ５０セファデックスゲル）に供し、ついで２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。アミノ化されたアームがちりばめられた化学的アームの直線のもつれを５’（ＯＨ）に有するオリゴデオキシリボヌクレオチド混合分子のビオチニル化方法。ビオチニル化プローブ２０、２１、２２および２３の製造アミノ化プローブ１６、１７、１８または１９の２０ＤＯを、エッペンドルフチューブに入れた１２０μｌの０．０１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７．５中で溶解した。２４０μｌのジメチルホルムアミド中に２０mgのスルホスクシニミジル６− ビオチンアミドカプロエート（sulfosuccinimidyl 6-biotinamidocaproate）を含む溶液を加えた。室温で１６時間インキュベートした。各溶液を分子ろ過クロマトグラフィー（Ｇ５０セファデックスゲル）に供し、その後２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ビオチニル化プローブ２０、２１、２２および２３．をマイクロ−ゲル１００（MICRO-GEL₁₀₀）、内径５０μｍ、長さ５０cm 、電圧１５ｋＶ、７５ｍＭトリス−ホスフェート−１０％メタノール緩衝液ｐＨ７．６を用いて、キャピラリー電気泳動で分析した。実施例Ｖ：１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）１，３−ブタンジオールで置換されたＣＰＧ固相支持体の製造方法１−Ｏ−（４，４’ジメトキシトリチル）１，３−ブタンジオールで置換されたＣＰＧ支持体は、式２４で表わされる以下のアプローチは、核酸プローブを製造するために、適切に置換された固相支持体を製造することを目的とし、この核酸プローブでは、化学的アームにちりばめられた１以上の標識要素が、固相支持体上でマニュアルまたは自動のヌクレオチド間結合を合成するいずれかの方法を用いてプローブの３’（ＯＨ）に導入された。上記ＣＰＧ支持体を置換するために採用された方法は、以下の工程を含む（スキームＩＩＩ）。１−Ｏ−（４，４’ジメトキシトリチル）１，３−ブタンジオール３を無水スクシン酸を用いて遊離の２級アルコールでアシル化し、その後産生された酸２５を、ペンタクロロフェノールエステル２６の形に活性化した。上記ＣＰＧ支持体は、その表面に”１級アミン”を有し、活性化されたエステルからのアミド結合を形成することによって、誘導体２６に接着した。１−Ｏ−（４，４’ジメトキシトリチル）３−スクシネート１，３−ブタンジオール（1-O-(4,4' dimethoxytrityl)3-succinate 1,3-butanediol）２５の製造方法２．３５ｇ（６ミリモル）の化合物３を、アルゴン雰囲気の５０ccの２口フラスコに入れた。ここへ、２２ccの無水ピリジン、０．７４ｇ（６．１ミリモル）の４−ジメチルアミノピリジンおよび０．６４ｇ（６．４ミリモル）の無水スクシン酸を加えた。反応混合物をマグネチックスターラーを用いて、３時間室温にて攪拌した。その後、トルエンをこの反応混合物に加え、トルエンを用いてピリジンを共沸させて留去した（ロータリーエバポレーター、ｐ＝２０mmHg）。得られた残さを７５ccのジクロロメタンに溶解した。得られた有機相を４×１０^-2Ｍのクエン酸溶液で２回洗浄した。その後有機相をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、ろ過してエバポレートした（ロータリーエバポレーターｐ＝２０mmHg）。残さをメルク９３８５シリカカラム−溶離液：グラジエントヘキサン１５−ＣＨ₂Ｃｌ₂ ８５⇒ＣＨ₂Ｃｌ₂１００⇒ＭｅＯＨ３−ＣＨ₂Ｃｌ₂９７で精製した。上記シリカは、あらあじめ、１％ＤＩＥＡを含む初めの溶離液に懸濁して中和した。精製後、１ｇの化合物２５が得られた。収率：３４％。１−Ｏ−（４，４’ジメトキシトリチル）３−（ペンタクロロフェノキシスクシネート）１，３−ブタンジオール（1-O-(4,4'dimethoxytrityl)3-(pentachlor ophenoxy succinate)1,3-butanediol）２６の製造方法１ｇの化合物２５（２ミリモル）を２５ccの２口フラスコに入れ、アルゴン雰囲気とし、０．５８ｇのペンタクロロフェノール（２．２ミリモル）と０．６２ｇのジクロロヘキシルカルボジイミド（３ミリモル）を含む１４ccの無水ジメチルホルムアミドを加えた。この反応混合物を室温で２４時間マグネチックスターラーで攪拌した。ジシクロヘキシルウレア（dicyclohexylurea）の沈殿をろ別し、この沈殿を５０ccのベンゼンで洗浄した。ベンゼンを留去した。残さをメルク９３８５シリカカラム−溶離液：ヘキサン１５−ジクロロメタン８５で精製した。上記シリカは、あらあじめ、１％ＤＩＥＡを含む溶離液に懸濁して中和した。精製後、１．７ｇの化合物２６が得られた。収率：±１００％。１−Ｏ−（４，４’ジメトキシトリチル）１，３−ブタンジオール置換基群２４で置換されたＣＰＧ（制御された多孔質ガラス）固相支持体の製造方法使用した固相支持体（ピアース社、カタログ番号２４８７５）は５００Åの孔を有し、その表面が”１級アミン”基で置換されている。１０ccのフラスコ中に、０．５ｇのアミノ化ＣＰＧ支持体、０．２ccの使用直前に蒸留したトリエチルアミン、０．３８５ｇのペンタクロロフェノールエステル２６（０．２６ミリモル）および１．３ccの無水ジメチルホルムアミドを入れた。フラスコを密封し、３７℃で２４時間攪拌した。この時点で２６により上記固相支持体が確かに置換されているかどうか、少量をとってチェックした。この少量（alriquot）エタノールで数回洗浄した後エーテルで数回洗浄し、無水アセトニトリル中にｐ−トルエンスルホン酸の０．１Ｍ溶液で処理した。この操作の目的は、１級アルコールを脱保護し、この無水溶媒中で形成されるジメトキシトリチルカチオンをオレンジ色に発色させることにある。それゆえ、オレンジ色の発色があった場合、置換された上記支持体の処理をさらに進めた。次のステージは、反応しなかった上記支持体上の１級アミン基を中和することにある。上記反応混合物に７０μｌの無水酢酸を添加し、１０分間３７℃で作用させた。上記固相支持体をろ別した。次いで、上記支持体を２０ccのジメチルホルムアミド、２０ccのエチルアルコール、２０ccのジオキサン、および２０ccのエチルエーテルで連続して洗浄した。五酸化リンの存在下、デシケーター中で真空（ｐ＝２０mmHg）で乾燥した。続いて、固相支持体に接着している分子２６の数を支持体１ｇあたりの酸性溶媒中に遊離した４，４’−ジメトキシトリチル基の数を分光（可視）定量分析することによって定量した。１０ccの目盛付フラスコに、８．１ｇの置換されたＣＰＧ支持体を入れ、ここに１０mlの無水アセトニトリル中に０．１Ｍのｐ−トルエンスルホン酸を含む溶液を加えた。溶液がオレンジ色になり、４９７nmで測定した。ε＝７．１０⁴。吸光度は、１．７２であった。上記支持体の置換は、以上から３０．３μモル／ｇであった。実施例ＶＩ：１−Ｏ−（４，４’ジメトキシトリチル）１，３−ブタンジオール単位で置換されたＣＰＧ支持体の反応性の調査１−Ｏ−（４，４’ジメトキシトリチル）１，３−ブタンジオール単位で置換されたＣＰＧ支持体２４は、オリゴヌクレオチドの３’（ＯＨ）に −化学的アーム（誘導体１の縮合） −”１級アミン”アーム（誘導体４の縮合）を導入するために使用することができる。上記”１級アミン”アームは、互いに分離されており、化学的アームによってオリゴヌクレオチド鎖から分離されている。この種のバイオポリマー構造を実現するために、上記ＣＰＧ支持体２４の反応性をオリゴヌクレオチドの自動合成条件下で試験した。このために、上記ＣＰＧ支持体２４をオリゴヌクレオチド自動合成装置の反応槽に入れ、ホスホロアミデート１および４の各々の一連の縮合およびチミジン（Ｔ）の縮合に供した。単位４の縮合から生じたアミノ化されたアームがＮを示し、単位１の縮合から生じた化学的アームがＳを示すとすると、合成されたポリマーは下記の通りである：四量体ＳＳＴＴは、キャピラリー電気泳動でＴＴＳＳと比較するためにのみ合成された。上記ホスホロアミデート１および４は、その後連続的にオリゴヌクレオチド自動合成装置において従来の縮合条件（結合時間、溶媒、試薬）で、上記ＣＰＧ支持体２４上に接着した。しかしながら、化合物４の縮合については、結合時間を従来のサイクルで採用されている２５秒から１０分に延長しなければならなかった。さらに、これらの固相支持体からオリゴヌクレオチドを切り離すために採用されている従来の条件（３２％ＮＨ₄ＯＨ−４×（５００μｌ−１５分））は、化合物２７、２８および３０が良い収率で得られたので、適当であることが明らかになった。行われたこれらの各縮合試験において、キャピラリー電気泳動分析（図３）の結果に示されるように、比較的純粋な産物が得られた。さらに、オリゴヌクレオチド合成においては、ジメトキシトリチル基を脱保護する溶液を回収し、各縮合の収量を評価するためにカチオンのオレンジ色の発色の強度を測定することが可能であった。これらの測定は、各縮合に関しては上記支持体２４上で行われ、ほぼ定量的な収量が示された。ＣＰＧ支持体２４上におけるホスホロアミデート１および４の縮合。ポリマー２７、２８および３０の合成。上記３つのポリマー２７、２８および３０を同時に、ＡＢＩ３９４オリゴヌクレオチド自動合成機で合成した。このために、６．６ｍｇ（０．２μモル）の３０．３μモル／ｇで置換されたＣＰＧ支持体２４を３つの反応槽に入れた。誘導体１および誘導体４を無水アセトニトリル中で０．１Ｍ濃度で可溶化し、従来ないホスホロアミデートを提供する場所に入れた。上記合成機は、２７、２８および３０の配列に従って１、４およびＴの縮合サイクルを実行するようにプログラムされた。２７、２８および３０の自動的合成後、上記ポリマーを、上記ＣＰＧ支持体から連続した４回の５００μｌの３２％ＮＨ4ＯＨによる１５分の処理で切り離した。アンモニア溶液を凍結乾燥し、残さをキャピラリー電気泳動、内径５０μｍ、長さ５０cmのマイクロ−ゲル₁₀₀カラム、電圧１５ｋＶ、７５ｍＭトリス−ホスフェート−１０％メタノール緩衝液ｐＨ７．６で分析した。実施例ＶＩＩ：放射性同位体を用いない方法によるＤＮＡ配列の検出に有用なアミノ化されたアームがちりばめられた化学的アームの直線のもつれを３’（ＯＨ）に有するオリゴデオキシリボヌクレオチド混合分子の製造オリゴデオキシリボヌクレオチド部分と化学的特性を有する他の部分とを含む混合された分子は、放射性同位体を用いない方法で標的のオリゴデオキシリボ核酸の簡便かつ迅速な検出を可能にする。標的のＤＮＡ断片と相同である定義された配列のオリゴデオキシリボヌクレオチド部分は、安定化エネルギーを提供し、検出されるＤＮＡ分子とのハイブリッドを強固にした。上記ハイブリッドの直接的または間接的な検出を可能にする反応性を提供する部分を、核酸配列の５’（ＯＨ）および（または）３’（ＯＨ）端に導入した。この特別の実施例で、検出に応答する部分を、本質的に上記核酸配列の３’（ＯＨ）に導入することができる。検出に応答する部分は、オリゴヌクレオチド自動合成機において固相ＣＰＧ支持体２４上で誘導体１および４の一連の縮合を最初に進めることによって、オリゴヌクレオチド鎖の３’（ＯＨ）に導入される。化学的アームと１級アミンの所望の配列が一度自動合成機で作られると、オリゴヌクレオチド鎖の構造は、その後上記構造に基づいて作られる。オリゴヌクレオチド自動合成機中のホスホロアミデート１および４の縮合は核酸配列の合成で採用されたと同じ反応サイクルを用いて行われた。しかしながら、誘導体４の縮合時間については、従来のサイクルで用いられた２５秒にかえて１０分に延長した。上記固相支持体から３’が修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を切り離した後、またオリゴヌクレオチド鎖のホスフェートおよび塩基を脱保護した後、検出に応答する反応性を提供する部分を、共有結合で導入した。検出に必要とされる特性を有する様々な分子のうち、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼが好適に使用される。これらの分子は、適切に活性化され、それらの求核的な性質によって目的達成のために導入された１級アミンでオリゴヌクレオチド鎖に接着した。単位４の縮合によって生じたアミノ化されたアームがＮを示し、そして単位１の縮合によって生じた化学的アームがＳを示す場合、合成された３’（ＯＨ）が修飾されたオリゴマーは下記の通りである：上記固相支持体から修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を切り離し、そして塩基およびホスフェートの脱保護を行った後、４つのオリゴヌクレオチドをキャピラリー電気泳動で分析した（図４）。１級アミンの脱保護の後、プローブ３１、３２、３３および３４をビオチニル化した。生じたビオチニル化プローブ３５、３６、３７および３８をキャピラリー電気泳動で分析した（図４）。単位４の縮合によって生じた、アミノ化され続いてビオチニル化されたアームがＢを示し、そして単位１の縮合によって生じた化学的アームがＳを示す場合、得られた３’（ＯＨ）がモノビオチニル化またはポリビオチニル化されたプローブは、下記の通りである：アミノ化されたアームがちりばめられた化学的アームの直線のもつれを３’（ＯＨ）に有するオリゴデオキシリボヌクレオチド混合分子の製造方法。プローブ３１、３２、３３および３４の合成。４つのプローブ３１、３２、３３および３４を、ＡＢＩ３９４自動合成機で、同時に合成した。このために、６．６ｍｇ（０．２μモル）の３０．３μモル／ｇで置換されたＣＰＧ支持体２４を４つの反応槽に入れた。誘導体１および誘導体４を無水アセトニトリル中で０．１Ｍ濃度で可溶化し、従来ないホスホロアミデートを提供する場所に入れた。上記合成機を、３１、３２、３３および３４の配列にしたがって、ホスホロアミデート１および４を接着するサイクルを開始するようにプログラムし、その後ヌクレオチドホスホロアミデートを用いて標的配列に相補的な核酸配列を合成した：バイオポリマー３１、３２、３３および３４の自動合成に続いて、上記のように修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を、連続的な１５分間の５００μｌの３２％ＮＨ₄ＯＨ処理で上記ＣＰＧ支持体から切り離した。得られたアンモニア溶液を、５５℃で５時間保持した。この第二の処理の目的は、上記オリゴヌクレオチド鎖の塩基およびホスフェートの脱保護である。上記アンモニア溶液を凍結乾燥し、４つの残さを分子ろ過クロマトグラフィー（Ｇ５０セファデックスゲル）に供し、その後２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。アミノ化されたアームがちりばめられた化学的アームの直線のもつれを３’（ＯＨ）に有するオリゴデオキシリボヌクレオチド混合分子のビオチニル化方法。ビオチニル化されたプローブ３５、３６、３７および３８の合成。２０ＤＯのアミノ化されたプローブ３１、３２、３３および３４を、エッペンドルフチューブに入れた１２０μｌの０．０１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７．５中で溶解した。２４０μｌのジメチルホルムアミド中に２０ｍｇのスルホスクシニミジル６−ビオチンアミドカプロエート（6-biotinamidocaproate）を含む溶液を加えた。これを室温で１６時間インキュベートした。次いで、各溶液を分子ろ過クロマトグラフィー（Ｇ５０セファデックスゲル）に供し、その後２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。対応するアミノ化されたプローブ３１、３２、３３および３４と同様、ビオチニル化プローブ３５、３６、３７および３８をマイクローゲル₁₀₀（MICRO-GEL₁₀₀）、内径５０μｍ、長さ５０cm、電圧１５ｋＶ、７５ｍＭトリス−ホスフェート−１０％メタノール緩衝液ｐＨ７．６を用いて、キャピラリー電気泳動で分析した。実施例ＶＩＩＩ：放射性同位体を用いない方法によるＤＮＡ配列の検出に有用なアミノ化されたアームがちりばめられた化学的アームの直線のもつれを３’（ＯＨ）および（または）５’（ＯＨ）に有するオリゴデオキシリボヌクレオチド混合分子の製造方法オリゴデオキシリボヌクレオチド部分と化学的特性を有する他の部分とを含む混合された分子は、放射性同位体を用いない方法で標的のオリゴデオキシリボ核酸の簡便かつ迅速な検出を可能にする。標的のＤＮＡ断片と相同である定義された配列のオリゴデオキシリボヌクレオチド部分は、安定化エネルギーを提供し、検出されるＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションを強固にした。上記ハイブリッドの直接的または間接的な検出を可能にする反応性を提供する部分を、核酸配列の５’（ＯＨ）および（または）３’（ＯＨ）端に導入した。この特別の実施例で、検出に応答する部分を、オリゴヌクレオチド配列の５’（ＯＨ）および３ ’（ＯＨ）端に同時に導入することができた。検出に応答する部分を、オリゴヌクレオチド自動合成機において固相ＣＰＧ支持体２４の上で誘導体１または４の一連の縮合を最初に進めることによって、オリゴヌクレオチド鎖の３’（ＯＨ）に導入した。化学的アームと１級アミンの所望の配列が一度自動合成機で作られると、その後のオリゴヌクレオチド鎖の構造は、すでに存在する上記構造に基づいて作られる。ついでオリゴヌクレオチド鎖が単位１および４の５’に接着するサイクルを繰り返すように上記合成機をプログラムした。上記自動合成機中のホスホロアミデート１および４の縮合は、核酸配列の合成で採用されたと同じ反応サイクルを用いて行った。しかしながら、化合物４の縮合時間については、従来のサイクルで用いられた２５秒にかえて１０分に延長した。上記固相支持体から３’（ＯＨ）および５’（ＯＨ）が修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を切り離し、オリゴヌクレオチド鎖のホスフェートおよび塩基を脱保護した後、検出に応答する反応性を提供する部分を、共有結合を介して導入した。検出に必要とされる特性を有する様々な分子のうち、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、パーオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが好適に使用できた。これらの分子は、適切に活性化され、それらの求核的な性質によって目的達成のために導入された１級アミンでオリゴヌクレオチド鎖に接着した。単位４の縮合によって生じたアミノ化されたアームがＮを示し、そして単位１の縮合によって生じた化学的アームがＳを示す場合、合成された３’（ＯＨ）および５’（ＯＨ）が修飾されたオリゴマーは下記の通りである：上記固相支持体から修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を切り離し、そして塩基およびホスフェートの脱保護を行った後、４つのオリゴヌクレオチドをキャピラリー電気泳動で分析した（図５）。プローブ３９、４０、４１および４２をビオチニル化した；生じたビオチニル化プローブ４３、４４、４５および４６をキャピラリー電気泳動で分析した（図５）。単位４の縮合によって生じたアミノ化されつづいてビオチニル化されたアームがＢを示し、そして単位１の縮合によって生じた化学的アームがＳを示す場合、得られた３’（ＯＨ）および５’（ＯＨ）がビオチニル化されたプローブは、下記の通りである：アミノ化されたアームがちりばめられた化学的アームの直線のもつれを３’（ＯＨ）および５’（ＯＨ）に有するオリゴデオキシリボヌクレオチド混合分子の製造方法。プローブ３９、４０、４１および４２の合成。４つのプローブ３９、４０、４１および４２を、ＡＢＩ３９４自動ＤＮＡ合成機で、同時に合成した。このために、６．６ｍｇ（０．２μモル）の３０．３μ モル／ｇで置換されたＣＰＧ支持体２４を４つの反応槽に入れた。誘導体１および誘導体４を無水アセトニトリル中で０．１Ｍ濃度で可溶化し、従来ないホスホロアミデートを提供する場所に入れた。上記合成機は、３９、４０、４１および４２の各配列にしたがって、ホスホロアミデート１および４を接着するサイクルを開始するようにプログラムされ、その後ヌクレオチドホスホロアミデートを用いて標的配列に相補的な核酸配列を合成する：そして、最終的に単位１および４について、上記核酸鎖の５’で縮合サイクルを続けた。バイオポリマー３９、４０、４１および４２の自動合成に続いて、上記のように修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を連続的な１５分間の５００μｌの３２％ＮＨ4ＯＨ処理で上記ＣＰＧ支持体から切り離した。得られたアンモニア溶液を、５５℃で５時間保持した。この第二の処理の目的は、上記オリゴヌクレオチド鎖の塩基およびホスフェートの脱保護である。上記アンモニア溶液を凍結乾燥し、４つの残さを分子ろ過クロマトグラフィー（Ｇ５０セファデックスゲル）に供し、その後２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。アミノ化されたアームがちりばめられた化学的アームの直線のもつれを３’（ＯＨ）および５’（ＯＨ）に有するオリゴデオキシリボヌクレオチド混合分子のビオチニル化方法。ビオチニル化プローブ４３、４４、４５および４６の合成。２０ＤＯのプローブ３９、４０、４１および４２を、エッペンドルフチューブに入れた１２０μｌの０．０１Ｍのリン酸緩衝液pH7.5中で溶解した。３６０μ ｌのジメチルホルムアミド中に３０mgのスルホスクシニミジル６−ビオチンアミドカプロエートを含む溶液を加えた。これを室温で１６時間インキュベートした。次いで、各溶液を分子ろ過クロマトグラフィー（Ｇ５０セファデックス）に供し、その後２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。アミノ化されたプローブ３９、４０、４１および４２に対応して、同様に、ビオチニル化プローブ４３、４４、４５および４６をマイクロ−ゲル₁₀₀（MICRO-GEL₁₀₀）、内径５０μｍ、長さ５０cm、電圧１５ｋＶ、７５ｍＭトリス−ホスフェート−１０％メタノール緩衝液ｐＨ７．６を用いて、キャピラリー電気泳動で分析した。実施例ＩＸ：固相支持体上でのハイブリダイゼーションにおける実施例ＩＶ，ＶＩＩおよびＶＩＩＩに記載のビオチニル化プローブの使用−検出限界本発明の利点を示すために、５’（ＯＨ）がポリビオチニル化されたプローブ２０、２１、２２および２３、３’（ＯＨ）がポリビオチニル化されたプローブ３５、３６、３７および３８を、ならびに３’（ＯＨ）および５’（ＯＨ）がポリビオチニル化されたプローブ４３、４４、４５および４６を、診断用にどの程度使用できるかという可能性を調べるために、ハイブリダイゼーションで試験した。一般的に言えば、ハイブリダイゼーションは５’（ＯＨ）端でプラスチックの固相支持体に接着するオリゴヌクレオチド（３０マー）と３’（ＯＨ）端で試験されるプローブ（２３マー）に相補的なオリゴヌクレオチドとの間で生じる。各固相支持体（チューブ）を、試験されるプローブに相補的な１０ｎｇ、約１０１２コピーを示すオーダーのオリゴヌクレオチド（３０マー）で被覆した。上述した各ビオチニル化オリゴヌクレオチドを、１ｐｇの標識されたオリゴヌクレオチド（〜１０⁸コピー）で始まり、３００ａｔｇ（３×１０⁴コピー）まで次々に３倍希釈された８つの異なるハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーションの後、化学発光（ＣＳＰＤ−トロピックス（Tropix））を見るために使用し、蛍光計で測定した。スキームＩＶにまとめた結果は、５’（ＯＨ）でポリビオチニル化されたプローブ２０、２１、２２および２３にプラスチックチューブに接着している相補的な３０マーとのハイブリダイゼーションに関するものである。３’（ＯＨ）がポリビオチニル化されたプローブ３５、３６、３７および３８についてのハイブリダイゼーションの結果をスキームＶにまとめた。５’（ＯＨ）および３’（ＯＨ）がポリビオチニル化されたプローブ４３、４４、４５および４６についてのハイブリダイゼーションの結果を図ＶＩにまとめた。モノビオチニル化されたまたはポリビオチニル化されたプローブ（２３マー）とプラスチックチューブに接着している相補的なオリゴマー（３０マー）とのハイブリダイゼーション方法相補的なオリゴヌクレオチド（３０マー）で被覆したチューブを、最初に痕跡程度のアジドを含む１×ＴＢＳ中に凍結乾燥スキムミルク５％を含む溶液２００ μｌで、３７℃にて１時間飽和させた。その後チューブを、ハイブリダイゼーション緩衝液（１００μｌ）：５×デンハルト溶液、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／mlのサケ精子ＤＮＡとともに、５０℃で２時間プレハイブリダイズした。試験される各オリゴヌクレオチドのために、下記の量で８つの試みが行われた（１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液中）：１ｐｇ（１０⁸コピー）、３００ｆｇ、１００ｆｇ（１０⁷コピー）、３０ｆｇ、１０ｆｇ（１０⁶コピー）、３ｆｇ、１ｆｇ（１０⁵コピー）、０．３ｆｇ。ビオチニル化されていない、相補的でないオリゴマーで被覆した一連の８つのチューブ、およびオリゴヌクレオチドなしの８つのチューブもまた作成した。すべてのチューブを２時間５０℃でハイブリダイズし、その後、６×ＳＳＣ溶液で１０分間、５０℃で３回洗浄した。これらのチューブは、緩衝液１で５分間１回洗浄した。緩衝液Ｉ：０．１Ｍトリス、２ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０５％トライトン、１ＭＮａＣｌ。アルカリ性のストレプトアビジン−ホスファターゼ溶液をここで製造した（トロピックスキットにより提供された）：５，５００μｌの緩衝液Ｉにキット付属の溶液１μｌを入れた。１００μｌのこの溶液を各チューブに入れ、室温で３０分間インキュベートし、その後各チューブを緩衝液Ｉで６回洗浄した。化学発光試薬ＣＳＰＤの溶液を製造した：（３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’トリシクロ［３．３．１．１．］クロロデカン−４−イル）フェニルホスフェート（(3−(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3. 1.1.]chlorodecane]-4-yl)phenylphosphate）。この溶液を以下のようにして製造した：８０μｌのＣＳＰＤ（トロピックス）、５００μｌの”エメラルド”（トロピックス）および４，４２０μｌの発光用緩衝液。発光用緩衝液：０．１Ｍジエタノールアミン、１mＭＭｇＣｌ₂、０．０２％アジ化ナトリウム。１００μｌのこの溶液を各チューブに入れ、４５分間インキュベートし、蛍光計で測定した。実施例Ｘ：１，６−Ｏ−（４，４’ジメトキシトリチル）２−Ｏ−（Ｎ，Ｎ’ジイソプロピルアミノ２−シアノエトキシホスフィノ）１，２，６−ヘキサントリオール（1,6-O-(4,4'dimethoxytrityl)2-O-(N,N'diisopropylamino 2-canoethox yphosphino)1,2,6-hexane triol）の製造誘導体１，６−Ｏ−（４，４’ジメトキシトリチル）２−Ｏ−（Ｎ，Ｎ’ジイソプロピルアミノ２−シアノエトキシ−ホスフィノ）１，２，６−ヘキサントリオール４７は、以下の式で表わされる：適用された方法は、標準的なＲＮＡまたはＤＮＡ自動合成条件の下で、モノマーがホスホジエステル結合でつながれているヌクレオチドでないポリマーまたはオリゴヌクレオチド鎖の５’（ＯＨ）に置換基の導入を可能にするヌクレオチドでないシントンを製造することを目的とする。このシントンは、ルーチンの自動またはマニュアル合成から離れることなく、核酸配列の５’（ＯＨ）位に枝別れ鎖の導入を可能にする道具をユーザーに提供するという利点がある。これは、ジメトキシトリチル基で保護された２つの１級アルコール置換基（fo nctions）を有するためであり、それゆえ、各縮合サイクルとともに、下記の縮合にとっての部位の数が２倍になる。縮合部位を増加させる利点は、合成の最後に、上記部位に１級アミンを有するアルキル鎖を導入できることにある。この導入は、合成の最後に、作られたn個の１級アルコール部位で、誘導体４８を縮合することにより可能である。誘導体４８は、文献的に知られており、それゆえ、請求の範囲に記載しておらず、明細書にも記載していない。化合物４７に関しては、４，４’ジメトキシトリチル基および２−シアノエトキシジイソプロピルアミノホスホロアミデート（2-cyanoethoxydiisopropylamin ophosphoramidite）基が、特に固相支持体上で、ホスホロアミデートを用いて合成するのに適している。化合物４７を得るためのスキームＶＩＩに示された反応経路は、下記の工程を含む：１）酸性ｐＨに不安定なジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴ）を使用する、１，２，６−ヘキサントリオール４９の２つの１級アルコールの選択的保護。２）２級アルコール５０のリン酸化。スキームＶＩＩに示すホスホロアミデートの例に制限されるものではなく；リン酸トリエステルもしくはジエステルまたはホスホナートの合成も同様に可能である。１，６−Ｏ−（４，４’ジメトキシトリチル）１，２，６−ヘキサントリオール（1,6-0-(4,4'dimethoxytrityl)1,2,6-hexane triol）５０の製造方法１．３４ｇの１，２，６−ヘキサントリオール４９（１０^-2モル）を５０ccの２口フラスコに入れた。これをアルゴン雰囲気中におき、その後２０ccの無水ピリジンを加えた。次いで、８．４５ｇ（２．５×１０^-2モル）のジメトキシトリチルクロライドをこの溶液に加え、２時間室温で攪拌した。反応混合物を加水分解し（２５ccの５％ＮａＨＣＯ₃）、ジクロロメタン（２×５０cc）で抽出した。得られた有機相を水で３回、飽和食塩水で１回洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、その後ろ過して、減圧下にエバポレートした（ロータリーエバポレーターｐ＝２０mmHg）。次に、残ったピリジンを減圧下にトルエンと共沸させて留去した。その後、残ったトルエンを減圧下にジクロロメタンと共沸させて留去した。得られた残さをメルク９３８５シリカカラム−溶離液エーテル０⇒４０−ヘキサン１００⇒６０で精製した。シリカは、あらかじめ、１％ＤＩＥＡを含む開始溶離液に懸濁し中和した。精製後、４．５ｇ（６．１×１０^-3モル）が回収された；収率６１％。薄層クロマトグラフィー−メルク５７３５プレート（６０F₂₅₄シリカゲル）、展開溶媒エーテル４−ヘキサン６；Ｒｆ：０．３。１，６−Ｏ−（４，４’ジメトキシトリチル２−Ｏ−（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエトキシホスフィノ）１，２，６−ヘキサントリオール（1,6-O-(4,4'dimethoxytrityl 2-O-(N,N'-diisopropylamino-2-cyanoethoxyp hosphino)1,2,6-hexanetriol）４７の製造方法１．１ｇの化合物５０（１．５×１０^-3モル）を２５ccの２口フラスコに入れた。アルゴン雰囲気とし、６ccの無水テトラヒドロフランおよび０．８４ccのジイソプロピルエチルアミンを加えた。次に、０．４５cc（２×１０^-3モル）の２ −シアノエトキシジイソプロピルアミノクロロホスフィンを、シリンジを用いて一度に１滴ずつ反応混合物に加えた。１０分間反応させた後、大量の沈殿が反応混合物中に生じた（ジイソプロピルエチルアミンクロロハイドレート(diisoprop ylethylamine chlorohydrate)）。反応混合物を加水分解し（１５cc ５％ＮａＨＣＯ₃）、ジクロロメタン（２×３０cc）で抽出した。生じた有機相を水（３ ×２０cc）で、その後飽和食塩水（１×２０cc）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、ろ過して減圧下にエバポレートした（ロータリーエバポレーターｐ＝２０ mmHg）。残さをメルク９３８５シリカカラム−溶離液酢酸エチル３−ヘキサン７で精製した。上記シリカは、あらかじめ、１％ＤＩＥＡを含む開始溶離液に懸濁し中和した。精製後、１．２ｇの化合物４７が得られた。収率８４％。メルク５７３５プレート（６０F₂₅₄シリカゲル）を用いた薄層クロマトグラフィー−展開溶媒酢酸エチル３−ヘキサン７。Ｒｆ：０．６。実施例ＸＩ：化合物４７の反応性の調査ヌクレオチドでないホスホロアミデート４７を核酸配列の５’（ＯＨ）部位に枝別れ鎖を導入するために使用した：４７の利点は、各縮合とともに、縮合部位の数が２倍になるという点にある。それゆえ、合成の終了までに、このようにしてつくられた縮合部位に１級アミンを有するアルキル鎖を導入することができる。１級アミンの導入は、n個の１級アルコール部位がつくられた誘導体４８の最後の縮合によって行われる。初期の段階では、誘導体４７は、オリゴヌクレオチド自動合成装置中で、従来自動合成で使用された固相支持体（ＣＰＧ支持体均質多孔質ガラス）に固定されたチミジン−チミジンＴ−Ｔ二量体の５’（ＯＨ）に縮合した。ートを表わす場合、合成された５’（ＯＨ）が修飾された上記ＴＴ二量体は、以下の様式で表わされる：キャピラリー電気泳動分析で示されたように（図６）、誘導体４７は伸長されたオリゴヌクレオチド（５１参照）の５’（ＯＨ）位に連続的に接着し、それがＴＴ上の４７の最初の縮合の後に作られた２つの縮合部位に連続的に接着し（５２参照）、ＴＴ上の４７の２つの連続的縮合の後に作られた４つの縮合部位に連続的に接着した（５３参照）。与えられた縮合部位の数は、各サイクルごとに２倍になり、オリゴヌクレオチド自動合成機中で同時に誘導体５１、５２および５３を製造するために用いられた４７の溶液は０．４Ｍ（従来の条件では０．１Ｍ）である；さらに、結合時間を１０分に延長した（従来の条件では２５秒）。これらの結果もまた、縮合、酸化、キャッピング反応および合成に続く固相支持体からの切り離しが効率的であり、ポリマー５１、５２および５３が分解していないことを示した。さらに、オリゴヌクレオチド合成において、ジメトキシトリチル基を脱保護する溶液を回収することができ、各縮合の収率を評価するためにカチオンのオレンジ色の強度を測定することができた。これらの測定は、各サイクルで５３を合成するために行った；それらは、下記に示すように良い収率を示した（スキームＶＩＩＩ）。第２の場合、従来の自動合成の固相支持体（ＣＰＧ支持体）に接着しているＴＴチミジン−チミジン二量体上でｘ回の４７の縮合を行い（ｘ＝１⇒３）、その後、引き続いてｎ個の標識要素に接着するためにｎ個の１級アミン部位に導入することを目的として作られたｎ個の縮合部位上に４８を縮合させることによって終了した。・がホスフェートを表わし、・がホスフェートを表わす場合、合成された修飾されたＴＴ二量体は、以下の通りである：実施例のために、化合物５５についてのキャピラリー電気泳動分析で示したように（図７）、誘導体４８は痕跡の５２が５５の電気泳動結果に認められるため、ポリマー５２中につくられた４つの縮合部位に効果的に接着した。与えられた縮合部位の数は、各サイクルごとに２倍になり、オリゴヌクレオチド自動合成機中で同時に化合物５４、５５および５６を製造するために用いられた４７の溶液は0.4Ｍであり、４８の溶液は0.8Ｍであった（従来の条件では０．１Ｍ）。さらに、４７と４８を縮合するための結合時間を１０分に延長した（従来の条件では２５秒）。固相ＣＰＧ支持体に接着しているチミジン−チミジン二量体と誘導体４７および４８の固相結合ホスホロアミデート４７を０．４Ｍの濃度で無水アセトニトリルに溶解し、ホスホロアミデート４８を０．８Ｍ濃度で同じ溶媒に溶解した。これらを、オリゴヌクレオチド自動合成機中の従来ないホスホロアミデートを提供する場所に入れた。４７および４８を縮合するために、ホスホロアミデート濃度および結合時間を除いて、オリゴヌクレオチド伸長サイクルに適用された縮合条件をすべて用いた。固相支持体からの切り離しは、標準的条件（３２％ＮＨ₄ＯＨ）で行い、最終生成物は現在オリゴヌクレオチド合成で得られている収率に匹敵する収率で得られた。ポリマー５１、５２、５３、５４、５５および５６を、ＡＢＩ２７０Ａ、マイクローゲル₁₀₀キャピラリーカラム、内径５０μｍ、長さ５０cm、電圧１５ｋＶ、７５ｍＭトリス−ホスフェート１０％メタノール緩衝液ｐＨ７．６を用いてキャピラリー電気泳動により分析した。実施例ＸＩＩ：放射性同位体を用いない方法でＤＮＡ配列の検出に有用なアミノ化された鎖で終了するアルキル鎖の枝別れのもつれを５’（ＯＨ）に有すオリゴデオキシリボヌクレオチド混合分子の製造方法混合された分子の合成および使用は、オリゴデオキシリボヌクレオチド部分と放射性同位体を用いない方法によって標的のデオキシリボ核酸の簡便かつ迅速な検出を可能にする化学的特性を有する部分を含む。標的のＤＮＡ断片と相同な配列で定義されるオリゴデオキシリボヌクレオチド部分は、安定化エネルギーを供給し、検出されるＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションを強固にした。ハイブリッドの直接的または間接的な検出を可能にする反応性を提供する上記部分は、上記核酸配列の５’（ＯＨ）および（または）３’（ＯＨ）端に導入できた。この特別の実施例において、検出に応答する部分は、本質的に上記核酸配列の５’ （ＯＨ）位に導入される。採用された戦術は、検出に応答する部分が、５’（ＯＨ）位のみに導入されるということを意味する。これは、いまた固相支持体に接着しており、その塩基およびホスフェートが保護されているオリゴヌクレオチド鎖上でのホスホロアミデート４７の一連の縮合を進めることによって行われる。４７の一連の縮合後、ホスホロアミデート４８の最後の縮合が連続的な４７の縮合によってつくられたn 個の縮合部位（１級アルコール部位）に、n個の１級アミン基を４８の縮合によって導入することを可能にする。４７および４８の縮合は、核酸配列の合成に採用された自動オリゴヌクレオチド合成機において同じ反応サイクルを用いて行われた。しかしながら、連続的な４７の縮合が、各サイクルごとに縮合部位の数を２倍にする効果を有することに留意しつつ、用いた４７の縮合は０．４Ｍ、４８のそれは０．８Ｍであった（従来の濃度は０．１Ｍ）。２つのホスホロアミデート４７および４８について、結合時間を従来のサイクルで使用されていた２５秒から１０分に延長した。固相支持体から５’が修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を切り離し、塩基およびホスフェートの脱保護を行った後、検出に応答する反応性を提供する部分を共有結合によって導入した。検出に要求される様々な特性を有する分子のうち、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、パーオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが好ましい。これらの分子は、適当に活性化され、求核的な性質のために導入された１級アミンでオリゴヌクレオチド鎖に接着した。ここで：・がホスフェートを表わし、ここで：・がホスフェートを表わす場合、合成された５’（ＯＨ）が修飾されたオリゴマーは、以下の通りである：上記のようにして修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を固相支持体から切り離し、塩基およびホスフェートの脱保護を行った後、プローブ５７、５８および５９をビオチニル化して、対応するビオチニル化プローブ６０、６１および６２を得た（図８）。１級アミン基でのビオチンＮヒドロキシスクシンイミドの縮合から生じたビオチン単位がＢで表わされる場合、次のポリビオチニル化されたプローブが５’（ＯＨ）位に得られた。アミノ化された鎖で終わるアルキル鎖の枝別れしたもつれを５’（ＯＨ）に有するオリゴデオキシリボヌクレオチド混合分子の製造方法標的配列に相補的なオリゴデオキシヌクレオチド配列でＤＮＡプローブを合成した。ＡＢＩ３９４ＤＮＡ自動合成機中で固相において、配列：を有する３つの同じプローブを同時に合成した（３つの反応槽中）。この合成機は、単位４７の５’に接着するサイクルを繰り返し、その後、単位４８の合成の終わりにプローブ５７、５８および５９が得られるようにプログラムした。これは、０．２μモルに相当する、３４μモル／ｇのジメトキシトリチルベンゾイルアデノシン（dimethoxytrityl benzoyl adenosine）で置換された６ｍｇのＣＰＧ支持体を使用することを含む。誘導体４７および４８を無水アセトニトリル中で、４７は０．４Ｍ、４８は０．８Ｍの濃度で溶解した。これらを、合成機中の従来ないホスホロアミデートのために提供された場所に入れた。バイオポリマー５７、５８および５９を自動合成した後、上記のように修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を、５００μｌの３２％ＮＨ₄ＯＨを用いて連続的に１５分間４回処理し、上記ＣＰＧ支持体から切り離した。得られたアンモニア溶液を、５５℃で５時間保持した。この第二の処理の目的は、上記オリゴヌクレオチド鎖の塩基およびホスフェートの脱保護にある。上記アンモニア溶液を凍結乾燥し、４つの残さを分子ろ過クロマトグラフィー（Ｇ５０セファデックスゲル）に供し、そしてその後２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。アミノ化された鎖で終わるアルキル鎖の枝別れしたもつれを５’（ＯＨ）に有するオリゴデオキシリボヌクレオチド混合分子のビオチニル化方法２０ＤＯのアミノ化されたプローブ５７、５８または５９を、エッペンドルフチューブに入れた１２０μｌの０．０１Ｍのリン酸緩衝液pH7.5中で溶解した。２４０μｌのジメチルホルムアミド中に２０mgのスルホスクシニミジル６−ビオチンアミドカプロエートを含む溶液を加えた。これを室温で１６時間インキュベートした。次いで、各溶液を分子ろ過クロマトグラフイー（Ｇ５０セファデックスゲル）に供し、その後２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。プローブ５７、５８、５９、６０、６１および６２を、ＡＢＩ２７０Ａ、マイクローゲル₁₀₀カラム、内径５０μｍ、長さ５０cm、電圧１５ｋＶ、７５ｍＭトリス−ホスフェート−１０％メタノール緩衝液ｐＨ７．６を用いて、キャピラリー電気泳動で分析した。実施例ＸＩＩＩ：固相支持体上のハイブリダイゼーションにおける実施例ＸＩＩに記載されたビオチニル化プローブの使用−検出限界本発明の利点を示すために、５’（ＯＨ）がポリビオチニル化されたプローブ６０、６１および６２を、診断用にどの程度使用できるかという可能性を調べるために、ハイブリダイゼーションで試験した。一般的に言えば、ハイブリダイゼーションは５’（ＯＨ）端でプラスチックの固相支持体に接着するオリゴヌクレオチド（３０マー）と３’（ＯＨ）端で試験されるプローブ（２３マー）に相補的なオリゴヌクレオチドとの間で生じる。各固相支持体（チューブ）は、試験されるプローブに相補的な１０ｎｇ、約１０¹² コピーを示すオーダーのオリゴヌクレオチド（３０マー）で被覆されている。上述した各ビオチニル化オリゴヌクレオチドを、１ｐｇの標識されたオリゴヌクレオチド（〜１０⁸コピー）で始まり、３００ａｔｇ（３×１０⁴コピー）まで次々に３倍希釈された８つの異なるハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーションの後、化学発光（ＣＳＰＤ−トロピックス（Tropix））を見るために使用し、蛍光計で測定した。スキームＩＸにまとめた結果は、プローブ６０、６１および６２のハイブリダイゼーションに関するものである。モノビオチニル化またはポリビオチニル化されたプローブ（２３マー）とプラスチックチューブに接着している相補的なオリゴマー（３０マー）とのハイブリダイゼーション方法相補的なオリゴヌクレオチド（３０マー）で被覆したチューブを、最初に、痕跡程度のアジドを含む１×ＴＢＳ中に凍結乾燥スキムミルク５％を含む溶液２００μｌで、３７℃にて１時間飽和させた。その後チューブを、ハイブリダイゼーション緩衝液（１００μｌ）：５×デンハルト溶液、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１００μg／mlのサケ精子ＤＮＡとともに、５０℃で２時間プレハイブリダイズした。試験される各オリゴヌクレオチドのために、下記の量で８つの試みが行われた（１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液中）：１ｐｇ（１０⁸コピー）、３００ｆｇ、１００ｆｇ（１０⁷コピー）、３０ｆｇ、１０ｆｇ（１０⁶コピー）、３ｆｇ、１ｆｇ（１０⁵コピー）、0.3ｆｇ。ビオチニル化されていない、相補的でないオリゴマーで被覆した一連の８つのチューブ、およびオリゴヌクレオチドなしの８つのチューブもまた作成した。すべてのチューブを２時間５０℃でハイブリダイズし、その後、各チューブを６×ＳＳＣ溶液で１０分間、５０℃で３回洗浄した。これらのチューブを、緩衝液Ｉで５分間１回洗浄した。緩衝液Ｉ：０．１Ｍトリス、２ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０５％トライトン、１ＭＮａＣｌ。アルカリ性のストレプトアビジン−ホスファターゼ溶液をここで製造した（トロピックスキットにより提供された）：５，５００μｌの緩衝液Ｉにキット付属の溶液１μｌを入れた。１００μｌのこの溶液を各チューブに入れ、室温で３０分間インキュベートし、その後各チューブを緩衝液Ｉで６回洗浄した。化学発光試薬ＣＳＰＤの溶液を製造した：（３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１．］クロロデカン−４−イル）フェニルホスフェート（(3−(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo[3. 3.1.1.]chlorodecane]-4-yl)phenyl phohosphate）。この溶液を以下のようにして製造した：８０μｌのＣＳＰＤ（トロピックス）、５００μｌの”エメラルド ”（トロピックス）および４，４２０μｌの発光用緩衝液。発光用緩衝液：０．１Ｍジエタノールアミン、１ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０２％アジ化ナトリウム。１００μｌのこの溶液を各チューブに入れ、４５分間インキュベートし、蛍光計で測定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (54)【発明の名称】５’（ＯＨ）および／または３’（ＯＨ）部位に１以上の放射活性のない標識要素を導入するために５’（ＯＨ）および／または３’（ＯＨ）が化学的に修飾された核酸プローブ、およびそれらの製造方法

Claims

【特許請求の範囲】１．ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を検出する核酸プローブであって、ａ）Ｓ：検出される分子のタイプに依存するＤＮＡまたはＲＮＡ核酸配列によって構成されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴデオキシヌクレオチド部分およびｂ）発色または発光により放射性同位体を用いないで検出できる１以上の検出単位または標識単位Ｍの直接的または間接的な接着を可能にする化学的特性を有するヌクレオチドでない部分からなり、前記ｂ）部分がアルキル基がちりばめられたホスフェート単位の鎖で構成され、すなわち、ｂ１）種々のホスフェート基が結合し、特別の機能を示さないアルキル基；ｂ２）直接的または間接的な検出を行うために、種々の試薬で結合できる１級アミン基を有するアルキル基、前記ｂ２）基は、ａ）部分にまたはｂ１）基を介して配列Ｓにつながれていることを特徴とする核酸プローブ。２．前記ｂ）部分は直鎖であり、ここでｂ１）基が標識要素Ｍを構成するｂ２）基の間に適当な間隔を導入するために必要な”化学的アーム”Ｌを形成することを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の核酸プローブ。３．式 [(M)y'-(L)x']z'-S-[(L)x-(M)y]z (I) （ここで、Ｓ、ＬおよびＭは請求の範囲第１および２項に記載された意味であり、ｘ、ｘ’、ｚ、ｚ’は、０以上の数であり、但しｚおよびｚ’が同時に０でなく、ｙおよびｙ’は０より大きな数である。）で表わされる請求の範囲第２項に記載の核酸プローブ。４．請求の範囲第３項に記載の核酸プローブであって、一般式Ｉａ（ここで：Ｓ、ＬおよびＭは請求の範囲第１および２項に記載された意味であり、配列Ｓ中、Ｊは、ＨまたはＯＨを示し、Ｂは、ヌクレオチドによって異なっていてもよい核酸、プリンまたはピリミジン塩基を示し、ｍは、１〜１０００であり、配列Ｌ中、ｘおよびｘ’＝０〜１００ｎおよびｎ’＝０〜２０であり、配列Ｍ中、ｙおよびｙ’＝１〜１００ｎおよびｎ’＝０〜２０であり、Ｘは適当な標識を示し、ここで標識は直接または間接のいずれであてもよく、直接の場合、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼおよびフルオレセインなどの基質の存在下に発色または発光し得る酵素から選ばれ、または間接の場合、放射性同位体を用いずに標識された抗体によって認識され得るビオチンまたはジゴキシゲニンなどのハプテンから選ばれ、ここでプローブの検出に応答する要素ＬＭは、ｚ’≠０かつｚ≠０のとき、５’（ＯＨ）に、または、ｚ’＝０かつｚ≠０のとき３’（ＯＨ）に、または、ｚ’≠０かつｚ≠０のとき、同時に５’（ＯＨ）および３’（ＯＨ）に導入され、ｚ’およびｚは一般に０〜１００である。）で表わされることを特徴とする核酸プローブ。５．請求の範囲第１項に記載の核酸プローブであって、標識要素を形成するｂ）部分が、枝別れした分子内に置換基があるときはｂ１）基を、基が枝別れした分子の外にある場合にはｂ２）基を含むアルキル基がちりばめられたホスフェート単位の枝別れ鎖、言い換えれば枝別れ配列が様々なアームで終わっているホスフェート単位の枝別れ鎖によって構成されることを特徴とする核酸プローブ。６．請求の範囲第５項に記載の核酸プローブであって、一般式ＸＸ（ここで、配列Ｓ中、ＪはＨまたはＯＨを示し、Ｂは、ヌクレオチドによって異なっていてもよい核酸、プリンまたはピリミジン塩基を示し、ｘは１〜１０００のヌクレオチド数を示し、ｎ、ｎ’およびｎ”は０〜２０の数であり、Ｍは枝分れオーダーが２〜１２８の値、例えば８と推定してもよいが、高次のオーダーが常に先行する値の２倍であるような、標識要素を示し、Ｘは、適当な標識であり、直接または間接のいずれであってもよく、直接の場合、基質の存在下に発色または発光し得る、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼおよびフルオレセインなどの酵素から選ばれ、または間接の場合、放射性同位体で標識されていない抗体によって認識され得るビオチン、ジゴキシゲニンなどのハプテンから選ばれる。）で表わされることを特徴とする核酸プローブ。７．請求の範囲第４項で定義された式Ｉａのプローブの製造方法であって、Ａ１）核酸配列Ｓ（ここで、ＢおよびＪおよびｎは請求の範囲第４項と同じ意味である。）の、マニュアルまたは自動のヌクレオチド間結合の既知合成法による、好ましくは固相支持体上での合成、およびＡ２）標識の接着からなり、上記標識を接着するために、上記配列が、上記と同じ合成法により、特に固相支持体上で、一連のＭおよびＬ単位による５’（ＯＨ）端での伸長か、または一連のＭおよびＬ単位による３’（ＯＨ）端での伸長か、または二連のＭおよびＬ単位による５’（ＯＨ）端および３’（ＯＨ）端での伸長かのいずれかに好ましくはかけられ、ＭおよびＬは請求の範囲第４項で定義されており、Ｂ）上記Ｌ単位はそれぞれ、ヌクレオチドでないポリマー（ここで、ｎおよびｘ’は請求の範囲第４項で与えられた意味である。）の合成によって得られ、Ｃ）上記Ｍ単位はそれぞれ、ヌクレオチドでないポリマー（ここで、ｎおよびｙは請求の範囲第４項で与えられた意味であり、そして、Ｘは、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、放射性同位体で標識されていない抗体によって認識され得るいずれかのハプテンなどの標識、または核酸プローブの全合成が終了した後に除去される、例えはアセチル基（ＶＩ）、トリフロロアセチル基（ＶＩＩ）またはベンゾイル基（ＶＩＩＩ）：のような１級アミンの保護基のいずれかを表わす。）の合成によって得られ、そして、前記ＢおよびＣは、好ましくは固相支持体上で、既知のマニュアルまたは自動のヌクレオチド間結合合成法により合成されることを特徴とする製造方法。８．放射性同位体を用いない方法によってＤＮＡ配列の検出に有用なアミノ化されたアームがちりばめられた化学的アームのもつれを５’（ＯＨ）端に有するオリゴヌクレオチド鎖によって構成されるプローブを調製する請求の範囲第７項に記載の方法であって、 −ホスフェート基および塩基が保護されたオリゴヌクレオチド鎖を固相支持体上で合成する工程 −前記鎖の５’（ＯＨ）端に、前記オリゴヌクレオチド鎖の合成と同様の縮合サイクルを用いて、化学的アームおよびアミノ化されたアームを生成する連続した誘導体を縮合する工程 −前記固相支持体から修飾された５’オリゴヌクレオチド鎖を分離する工程 −前記鎖のホスフェートおよび塩基を脱保護する工程 −検出に応答する反応性を提供する部分を１級アミノ基に導入する工程によって特徴づけられる方法。９．放射性同位体を用いない方法によってＤＮＡ配列の検出において有用なアミノ化されたアームがちりばめられた化学的アームのもつれを３’（ＯＨ）端に有するオリゴヌクレオチド鎖によって構成されるプローブを調製する請求の範囲第７項に記載の方法であって、 − 固相支持体上で、核酸合成と同様の縮合サイクルを用いて、化学的アームおよびアミノ化されたアームを生成する誘導体を縮合し、所望の化学的アームおよびアミノ化されたアームの配列をつくる工程、 − 前記配列上にオリゴヌクレオチド鎖を構築し、それによってホスフェート基および塩基が保護された修飾された３’（ＯＨ）オリゴヌクレオチド鎖を得る工程、 −前記修飾された鎖を前記固相支持体から離す工程、 −ホスフェート基および塩基を脱保護する工程、 −検出に応答する反応性を提供する部分を１級アミノ基に導入する工程によって特徴づけられる方法。１０．放射性同位体を用いない方法によってＤＮＡ配列の検出において有用なアミノ化されたアームがちりばめられた化学的アームのもつれを３’（ＯＨ）端および５’（ＯＨ）端に有するオリゴデオキシリボヌクレオチド鎖プローブを調製する請求の範囲第７項に記載の方法であって、 − 固相支持体上で、核酸合成と同様の縮合サイクルを用いて、化学的アームおよびアミノ化されたアームを生成する誘導体を縮合し、所望の化学的アームおよびアミノ化されたアームの配列をつくる工程、 − ホスフェート基および塩基が保護された修飾された３’（ＯＨ）端に接着するオリゴヌクレオチド鎖を前記配列上に構築する工程、 − 前記オリゴヌクレオチド鎖の５’（ＯＨ）端に化学的アームおよびアミノ化されたアームの配列を構築する工程、 − ３’（ＯＨ）および５’（ＯＨ）が修飾された前記オリゴヌクレオチド鎖を前記固相支持体から離し、ホスフェート基および塩基を脱保護する工程、 − 検出に応答する反応性を提供する部分を１級アミノ基に導入する工程によって特徴づけられる方法。１１．請求の範囲第７ないし１０項のいずれかに記載の方法であって、式の１，３アルカンジオールを出発物質として、ａ）保護基Ｒ₁によって１級アルコール基を保護し、式の化合物を得る工程、ｂ）２級アルコール基をＯＲ₂に変換し、式（ここで、Ｒ₂は、ヌクレオチドの端に化合物ＩＩ（シントン）をまたは存在している他のシントンの端に該化合物ＩＩを導入するのに適した基を示す。）の化合物を得る工程によって、化学的アームＬの各要素を得ることを特徴とする方法。１２．請求の範囲第１１項に記載の方法であって、ステージａ）では、Ｒ₁が式：の４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴと略す）を示し、１級アルコール基の保護が、４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴ −Ｃｌ）によって行われ、式の化合物を得、そしてステージｂ）は、化合物（Ｘ）のリン酸化を含み、式（ここで、Ｒ₂は可能ならば保護されたリン酸化された基を示し、ヌクレオチド端にまたはヌクレオチド間結合の合成の与えられた型に適当な固相支持体上ですでに縮合された他のシントンの端に化合物Ｘ’（シントン）を導入するのに適している。）の化合物を得ることを特徴とする方法。１３．請求の範囲第１２項に記載の方法であって、ホスホロアミデートを用いた合成に適用された際、ステージｂ）で用いられたリン酸化試薬が、式のジイソプロピルアミノシアノエトキシクロロホスフィンであり、前記ステージの結果として得られた式ＩＩａの化合物中、Ｒ₂が、式のジイソプロピルアミノシアノエトキシホスフィンまたはシアノエトキシジイソプロピルアミノホスホロアミデートであることを特徴とする方法。１４．請求の範囲第７から１３項のいずれかに記載の方法であって、式 HO-CH₂-CH₂-CH=CH₂ (XXX) のブテン-３オール-１から出発し、ａ）保護基Ｒ₁によって１級アルコール基を保護し、式 R₁-O-CH₂-CH₂-CH=CH₂ (XXXI) を有する化合物を得る工程、ｂ）前記化合物（ＸＸＸＩ）の二重結合をエポキシ化し、式を有する化合物を生成する工程、ｃ）アンモニアによって前記エポキシドを開環し、式の化合物を生成する工程、ｄ）１級アミノ基を、式の化合物によって保護し、式（ここで、Ｘは請求の範囲第７項で与えられた意味である。）の化合物を生成する工程、ｅ）化合物（ＸＸＸＩＩＩ）を活性化する工程、ｆ）化合物（ＸＩＩＩａ）と（ＸＸＸＩＩＩ）とをそれら自身の間に縮合させ、式の化合物を生成する工程、ｇ）化合物（ＸＶａ）をリン酸化し、式（ここで、Ｒ₂は、ヌクレオチドの端（３’および／または５’）またはすでに存在するシントンの端に化合物ＩＩＩａ（シントン）を導入するのに適したリン酸化された基を示す。）の化合物を生成する工程によって、各検出要素または単位Ｍが得られることを特徴とする方法。１５．請求の範囲第１４項に記載の方法であって、ステージａ）において、Ｒ₁が４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴと略す）を示し、そして４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴ−Ｃｌ）によって１級アルコール基を保護して、式 DMTO-CH₂-CH₂-CH=CH₂ (XXXIa) の化合物を得る工程、ステージｂ）において、メタクロロ過安息香酸を用いてエポキシ化を行い、式の化合物を生成する工程、ステージｃ）において、アンモニアを用いて前記エポキシドを開環し、式の化合物を得る工程、ステージｄ）において、トリフロロアセチル基を用いて化合物（ＸＸＶＩ）の１級アミノ基を保護し、式の化合物を生成する工程、ステージｅ）において、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて化合物（ＸＸＸＩＩａ）を活性化し、式の化合物を生成する工程、ステージｆ）において、化合物（ＸＩＩＩ）および（ＸＩＶａ）を縮合し、式の化合物を生成する工程、ステージｇ）において、化合物（ＸＶｂ）をリン酸化し、式（ここで、Ｒ₂は、ヌクレオチドの端に化合物またはシントン（ＩＩＩａ）をまたは与えられた型のヌクレオチド間結合の合成に適した固相支持体上ですでに縮合された他のシントンの端に、化合物またはシントン（ＩＩＩａ）を導入するのに適した、必要により保護されるリン酸化された基を示す。）の化合物を得る工程を特徴とする方法。１６．請求の範囲第１５項に記載の方法であって、ホスホロアミデートを用いた合成に適用された際、ステージｇ）で用いられたリン酸化試薬が、式のジイソプロピルアミノシアノエトキシクロロホスフィンであり、このステージの結果物である式ＩＩＩの化合物中、Ｒ₂は、式のジイソブロピルアミノシアノエトキシホスフィノまたはシアノエトキシジイソプロピルアミノホスホロアミデート基であることを特徴とする方法。１７．式（ＸＸＸＩＩａ，ＸＩＶａ，ＸＶｂおよびＩＩＩａ）中、ｎが５であることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の方法。１８．核酸配列Ｓ（ここで、ＢおよびＪは請求の範囲第４項ですでに与えられたと同じ意味である。）の、既知の自動またはマニュアルのヌクレオチド間結合の合成法による、好ましくは固相支持体上での合成、および、標識の接着からなり、前記標識の要素の接着のために、前記配列は、好ましくは前記合成と同じ方法により、すなわち、固相支持体上で、請求の範囲第６項で定義された標識要素Ｍによる５’（ＯＨ）端での伸長にかけられ、１級アミノ基を各アームの終点に有する枝別れした分子構造を形成することを特徴とする請求の範囲第６項に記載された式ＸＸのプローブの製造方法。１９．放射性同位体で標識されていない方法によってＤＮＡ配列の検出において有用なアミノ化された鎖で終了するアルキル鎖の枝別れしたもつれを５’（ＯＨ）に有するオリゴヌクレオチド鎖によって構成されるプローブを調製するための請求の範囲第１８項に記載の方法であって、 − 固相支持体上でホスフェート基および塩基が保護されたオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程、 − 前記鎖の５’（ＯＨ）端に、式（ここで、Ｒ¹は、１級アルコール基を保護する基であり、Ｒ₂はＨまたは必要により保護され、１級アルコール部位であるｎ個の縮合位を生じさせる、ヌクレオチドまたはすでに存在するシントンの５’端に、シントンＸＸＩを導入するのに適した他のリン酸化された基を示す。）の一連の化合物を縮合する工程、前記１級アルコール部位各々の上に、式 XHN-(CH₂)_n"-OR₂ XXII （ここで、Ｒ₂は上記の意味であり、Ｘは、 −アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、放射性同位体で標識されていない抗体で認識され得るいずれかのハプテンの標識、 −または、核酸プローブＸＸの全合成の後に除去される、１級アミンを一時的に保護する基のいずれかであり；例のために、この合成においてＸは、トリフロロアセチルＶＩＩ、フルオレニルメトキシカルボニル基ＸＸＩＩＩを示していてもよい。）の化合物を最後に縮合させ、化合物ＸＸＩおよびＸＸＩＩの縮合はオリゴヌクレオチド配列の合成のための縮合サイクルと同じサイクルを用い、 − 前記オリゴヌクレオチド鎖の塩基およびホスフェート基を脱保護する工程および − 検出に応答する反応性を提供する部分を１級アミノ基に導入する工程を含むことを特徴とする方法。２０．請求の範囲第１９項に記載の方法であって、式のアルカントリオールを出発物質とし、ａ）１級アルコール基を保護基Ｒ₁で保護して、式の化合物を生成する工程、ｂ）２級アルコール基をＯＲ₂グループに変換して化合物（ここで、Ｒ₂は請求の範囲第１９項で与えられた意味を持つ。）を得る工程から式ＸＸＩの化合物を得ることを特徴とする方法。２１．請求の範囲第２０項に記載の方法であって、ステージａ）において、Ｒ₁が式の４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴと略す）であり、４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴ−Ｃｌ）を用いて１級アルコール基を保護し、式の化合物を得る工程、そしてステージｂ）は化合物ＸＸＶのリン酸化を行い、化合物（ここで、Ｒ₂は、ヌクレオチドの５’端またはヌクレオチド間結合の合成が与えられた型に適合する固相支持体上ですでに縮合されたシントンの一端に、化合物（ＸＸＩａ）（シントン）を導入するのに適したリン酸化された基である。）を得る工程を含むことを特徴とする方法。２２．請求の範囲第２１項に記載の方法であって、ホスホロアミデートによる合成に適用された際、ステージｂ）で用いられたリン酸化試薬が、式のジイソプロピルアミノシアノエトキシクロロホスフィンであり、このステージの結果得られた化合物ＸＸＩａ中、Ｒ₂が、ジイソプロピルアミノシアノエトキシホスフィン、または式のシアノエトキシジイソプロピルアミノホスホロアミデート基であることを特徴とする方法。２３．化合物ＸＸＩＩにおいて、Ｒ₂基が特に請求の範囲第１９および２２項で与えられた意味であり、Ｘが核酸プローブＸＸの全合成の後に除去される、１級アミノ基の一時的保護基を示すことを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の方法。２４．化合物ＸＸＩＩにおいて、置換基Ｘがトリフロロアセチル基ＶＩＩまたはフルオレニルメトキシカルボニル基ＸＸＩＩＩを示すことを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の方法。２５．化合物ＸＸＩａにおいて、ｎは１であり、ｎ’は４であり、Ｒ₂はシアノエトキシジイソプロピルアミノホスホロアミデート基であり、使用された化合物ＸＸＩａが、式で表わされることを特徴とする請求の範囲第２１および２２項に記載の方法。２６．化合物ＸＸＩＩにおいて、置換基Ｒ₂はシアノエトキシジイソプロピルアミノホスホロアミデート基であり、Ｘはフルオレニルメトキシカルボニル基であり、ｎ”は６であり、使用された化合物ＸＸＩＩが、式で表わされることを特徴とする請求の範囲第２４項に記載の方法。２７．前記固相支持体が、置換されたＣＰＧ（均質多孔質ガラス）支持体であることを特徴とする請求の範囲第７ないし２６項のいずれかに記載の方法。２８．３’（ＯＨ）が標識されたオリゴヌクレオチドの場合、前記ＣＰＧが、式（ここで、ＤＭＴおよびｎ’は請求の範囲第７および１２項で与えられた意味である。）の化合物によって置換されることを特徴とする請求の範囲第２７項に記載の方法。２９．請求の範囲第２８項に記載された方法であって、前記ＣＰＧの置換が、 − 式Ｘの化合物の第２アルコール基をアシル化して式（ここで、ＤＭＴおよびｎ’は請求の範囲第７および１２項で与えられた意味である。）の化合物を生成する工程 − 式ＸＶＩＩの化合物のカルボキシル基を、カルボジイミドの存在下にペンタクロロフェノールを用いて活性化し、式のエステルを生成する工程および − 誘導体ＸＶＩＩＩをアミノ化された固相支持体に接着し、置換された支持体をつくる工程を含むことを特徴とする方法。３０．化学的アームＬの調製に中間体として有用な、式（ここで、ｎ’は０〜２０の整数を示し、Ｒ₁は１級アルコール基の保護基であり、Ｒ₂はＨ、または、ヌクレオチドあるいは与えられた型のヌクレオチド間結合の合成のために固相支持体上にすでに縮合されていたシントンの３’および／または５’端にシントンＩＩを導入するのに適した、必要によって保護されたリン酸化された基を示す。）の化合物。３１．標識単位Ｍの製造のために中間体として有用な、式（ここで、ｎは０〜２０の整数を示し、Ｒ₁は、１級アルコール基の保護基を示し、Ｒ₂は、Ｈ、または、ヌクレオチドあるいは与えられた型のヌクレオチド間結合の合成のために固相支持体上にすでに縮合されていたシントンの端にシントンＩＩＩを導入するのに適した、必要によって保護されたリン酸化された基を示し、そしてＸは、標識のすべて、すなわち、核酸プローブの全合成の後に除去される１級アミン基の一時的保護基を示す。）の化合物。３２．請求の範囲第３０および３１項に記載された化合物であって、Ｒ₁が、酸性溶媒中で不安定な４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴと略す）であり、そしてＲ₂がシアノエトキシジイソプロピルアミノホスホロアミデート基であることを特徴とする化合物。３３．Ｘがトリフロロアセチル基またはベンゾイル基であることを特徴とする請求の範囲第３１および３２項に記載の化合物。３４．燭台型核酸プローブにおいて枝別れした標識要素Ｍの合成で中間体として有用な、式（ここで、ｎおよびｎ’は０〜２０の数を示し、Ｒ₁は４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴと略す）などの１級アルコール基の保護基を示し、そしてＲ₂はＨ、または、ヌクレオチドあるいはシアノエトキシジイソプロピルアミノホスホロアミデートなどの与えられた型のヌクレオチド間結合の合成のために固相支持体上にすでに縮合されていたシントンの５’端にシントン（ＸＸＩ）を導入するのに適した、必要により保護されたリン酸化された基を示す。）の化合物。３５．請求の範囲第３０項で定義された式ＩＩの中間体の製造方法であって、式の１，３−アルカンジオールを出発物質とし、そして、請求の範囲第１１項に記載されたように１級および２級アルコール基を、好ましくは、請求の範囲第１２および１３項に記載された特別の特徴で保護する工程を含むことを特徴とする製造方法。３６．請求の範囲第３１項で定義された式ＩＩＩの中間体化合物の製造方法であって、式 HO-CH₂-CH₂-CH=CH₂ (XXX) のブテン-３-オール-１から出発し、連続して、１級アルコールを保護し、二重結合をエポキシ化し、前記エポキシドを開環し、式の化合物と縮合反応し、請求の範囲第１４項に記載されたように、好ましくは、請求の範囲第１５ないし１７項に記載された特殊な特徴でリン酸化する工程に供することを特徴とする製造方法。３７．請求の範囲第３４項で定義された式ＸＸＩの中間体化合物の製造方法であって、式のアルカントリオールから出発し、そして、請求の範囲第２０項に記載された１級および２級アルコール基を、好ましくは、請求の範囲第２１および２２項に記載された特別の特徴で保護する工程を含むことを特徴とする製造方法。