ES2823551T3 - Amplificaciones de ácido nucleico - Google Patents

Abstract

Un procedimiento que comprende: (a) combinar un polinucleótido y una mezcla de reactivos de amplificación a una primera temperatura para formar una mezcla de reacción, donde (i) la mezcla de reactivos de amplificación comprende un agente quelante sensible al pH, iones divalentes, una endonucleasa de corte, una ADN o ARN polimerasa y un tampón sensible a la temperatura y (ii) los iones divalentes se unen de forma reversible al agente quelante sensible al pH en solución a la primera temperatura de modo que no se produzca la amplificación del polinucleótido, y (b) ajustar el pH de la mezcla de reacción cambiando la temperatura de la mezcla de reacción de la primera temperatura a una segunda temperatura para liberar los iones divalentes unidos de forma reversible, iniciando así la amplificación del polinucleótido; donde la primera temperatura está entre 10 °C y 30 °C y la segunda temperatura está entre 40 °C y 70 °C.

Description

DESCRIPCIÓN

Amplificaciones de ácido nucleico

CAMPO TÉCNICO

[0001] Esta descripción se refiere a amplificaciones de ácido nucleico.

ANTECEDENTES

[0002] Muchas enzimas, incluyendo casi todas las enzimas que interactúan con los ácidos nucleicos y la mayoría de las proteasas, requieren un cofactor de iones divalentes. Por ejemplo, las enzimas implicadas en reacciones de amplificación de ácido nucleico a menudo requieren ion magnesio divalente (Mg++) como cofactor.

[0003] Las amplificaciones de ácido nucleico pueden generar productos de amplificación no específicos. En muchos casos, esto se debe al cebado de oligonucleótidos no específicos y los eventos posteriores de extensión del cebador antes del procedimiento de amplificación en sí, ya que las enzimas utilizadas a menudo son activas a temperatura ambiente. Por ejemplo, los productos de amplificación debido a la dimerización del cebador y posterior extensión se observan con frecuencia. Los procedimientos utilizados para superar este problema incluyen las llamadas reacciones de "arranque en caliente", donde al menos un componente implicado en la reacción de amplificación (por ejemplo, una enzima o cofactor de iones de magnesio divalentes) se separa de la mezcla de reacción o se mantiene en un estado inactivo hasta que la temperatura de la mezcla de reacción alcanza la temperatura adecuada.

[0004] El documento US 2009081670A1 se dirige en general a la amplificación exponencial rápida de secuencias cortas de ADN o ARN a una temperatura constante. El documento US2008038782 se refiere a composiciones, procedimientos y kits para la replicación de ácido nucleico, que incluyen reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y reacciones de mutagénesis. El documento US6403341 proporciona un procedimiento para realizar reacciones de PCR de arranque en caliente basadas en el secuestro de iones de magnesio en forma de un precipitado que inactiva una ADN polimerasa hasta el momento adecuado en la reacción de PCR cuando se alcanza una determinada temperatura. El documento WO03012066 describe un procedimiento de arranque en caliente de precipitado de magnesio para la manipulación molecular de ácidos nucleicos. El documento WO2007096182 se dirige a un péptido sintético que tiene una longitud de no más de 30 aminoácidos que comprende un sitio de unión a cationes divalentes. El documento GB2416352 proporciona procedimientos para controlar el inicio de una reacción enzimática, que es catalizada por una enzima dependiente de iones metálicos. El documento WO2011085160 describe materiales y procedimientos para la amplificación isotérmica de ácido nucleico. El documento EP2824189 describe una composición para la reacción de transcripción inversa de arranque en caliente y una composición para la PCR de transcripción inversa. El documento US6566103 describe realizar una reacción en cadena de la polimerasa isotérmica al ciclar la concentración de iones metálicos divalentes.

RESUMEN

[0005] Esta descripción se basa, al menos en parte, en el desarrollo de procedimientos para el control de reacciones enzimáticas.

[0006] Esta descripción también se basa, al menos en parte, en el desarrollo de procedimientos y composiciones para la amplificación de ácido nucleico que pueden proporcionar las ventajas de las reacciones de arranque en caliente usando reactivos simples.

[0007] Sobre la base de la descripción contenida en esta invención, un primer aspecto de la invención proporciona un procedimiento que comprende: (a) combinar un polinucleótido y una mezcla de reactivos de amplificación a una primera temperatura para formar una mezcla de reacción, donde (i) la mezcla de reactivos de amplificación comprende un agente quelante sensible al pH, iones divalentes, una endonucleasa de corte, una ADN o ARN polimerasa y un tampón sensible a la temperatura y (ii) los iones divalentes se unen de forma reversible al agente quelante sensible al pH en solución a la primera temperatura de modo que no se produzca la amplificación del polinucleótido y (b) ajustar el pH de la mezcla de reacción cambiando la temperatura de la mezcla de reacción de la primera temperatura a una segunda temperatura para liberar los iones divalentes unidos de forma reversible, iniciando así la amplificación del polinucleótido; donde la primera temperatura está entre 10 °C y 30 °C y la segunda temperatura está entre 40 °C y 70 °C.

[0008] En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento que comprende: formar una mezcla que comprende: (a) una muestra que comprende un polinucleótido diana y (b) reactivos que comprenden un agente de unión, un ion unido por el agente de unión en solución, un tampón y reactivos de amplificación que comprenden al menos un componente que tiene una primera actividad en presencia del ion cuando el ión está unido por el agente de unión y una segunda actividad diferente en presencia del ion cuando el ion está libre del agente de unión; y liberar una cantidad del ion del agente de unión suficiente para cambiar la actividad del al menos un componente de los reactivos de amplificación de la primera actividad a la segunda actividad mediante el aumento de una temperatura de la mezcla de una primera temperatura a una segunda temperatura, donde el procedimiento se realiza sin ciclar la temperatura de la mezcla entre una temperatura más baja a la que se hibridan sustancialmente los polinucleótidos de cadena doble presentes en la mezcla y una segunda temperatura a la que se desnaturalizan sustancialmente los polinucleótidos de cadena doble presentes en la mezcla; donde la primera temperatura está entre 10 °C y 30 °C y la segunda temperatura está entre 40 °C y 70 °C.

[0009] Algunas realizaciones preferidas de la presente invención son como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

[0010] En algunas realizaciones, el ion divalente se selecciona del grupo que consiste en: magnesio, calcio, cobre, zinc, manganeso, hierro, cadmio y plomo.

[0011] En algunas realizaciones, el ion divalente es magnesio.

[0012] En cualquier realización de la invención, la mezcla de reactivos de amplificación incluye un agente quelante sensible al pH. El agente quelante sensible al pH se puede seleccionar del grupo que consiste en: ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter) tetraacético (EGTA), derivados de EGTA y derivados de e DtA. Preferentemente, los iones divalentes en solución se unen de forma reversible al agente quelante sensible al pH. Preferentemente, el agente quelante sensible al pH es ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter) tetraacético.

[0013] En cualquier realización de la invención, la mezcla de reactivos de amplificación puede incluir un tampón sensible a la temperatura. En algunas realizaciones, el tampón sensible a la temperatura puede incluir tris(hidroximetil)aminometano.

[0014] En cualquier realización de la invención, el pH de la mezcla de reacción puede ajustarse según el pH del tampón sensible a la temperatura.

[0015] En cualquier realización de la invención, el pH de la mezcla de reacción puede ajustarse cambiando la temperatura de la mezcla de reacción de una primera temperatura a una segunda temperatura.

[0016] En cualquier realización de la invención, el pKa del tampón sensible a la temperatura a la segunda temperatura es al menos 0,4 menor que el pKa del tampón sensible a la temperatura a la primera temperatura.

[0017] En cualquier realización de la invención, el tampón sensible a la temperatura tiene un ApKa de entre -0,04 °C-1 y -0,015 °C .

[0018] En cualquier realización de la invención, la primera temperatura está entre 10 °C y 20 °C, o entre 20 °C y 30 °C. Preferentemente, la primera temperatura está entre 20 °C y 30 °C.

[0019] En cualquier realización de la invención, la segunda temperatura está entre 40 °C y 50 °C, entre 50 °C y 60 °C, entre 60 °C y 70 °C.

[0020] Preferentemente, la segunda temperatura está entre 50 °C y 60 °C.

[0021] En realizaciones específicas de la invención, la primera temperatura está entre 20 °C y 30 °C y la segunda temperatura está entre 50 °C y 60 °C.

[0022] En cualquier realización de la invención, la mezcla de reactivos de amplificación puede incluir una endonucleasa de corte, una ADN o ARN polimerasa, una recombinasa y/o una transcriptasa inversa.

[0023] En realizaciones, la mezcla de reactivos de amplificación incluye una recombinasa y una ADN o ARN polimerasa. Opcionalmente, estas realizaciones pueden incluir una transcriptasa inversa.

[0024] En cualquier realización de la invención, la relación entre la concentración del agente quelante y la concentración del ion divalente es de 0,5 a 2.

[0025] En cualquier realización de la invención, la concentración de iones divalentes libres a la primera temperatura está entre 0 y 10.

[0026] En cualquier realización de la invención, la concentración de iones divalentes libres a la segunda temperatura está entre 5 mM y 50 mM.

[0027] En cualquier realización de la invención, la mezcla de reactivos de amplificación puede comprender uno o más componentes en forma liofilizada. En realizaciones específicas, la mezcla de reactivos de amplificación puede comprender una sal de magnesio en forma liofilizada. La sal de magnesio liofilizada se puede reconstituir en un tampón para formar iones de magnesio en solución. En otras realizaciones, la mezcla de reactivos de amplificación puede comprender un agente quelante sensible al pH en forma liofilizada. El agente quelante liofilizado sensible al pH puede reconstituirse en un tampón. Según estas realizaciones, el tampón puede ser un tampón sensible a la temperatura. En algunas realizaciones, los iones de magnesio en solución se unen de forma reversible a un agente quelante sensible al pH. Según cualquiera de las realizaciones anteriores, el pH del tampón es operable para que el agente quelante sensible al pH se una de forma reversible a los iones de magnesio libres en solución. Preferentemente, la mezcla de reactivos de amplificación comprende iones de magnesio en solución unidos de forma reversible a un agente quelante sensible al pH, donde los iones de magnesio en solución se forman a partir de la reconstitución de una sal de magnesio liofilizada en un tampón sensible a la temperatura.

[0028] En cualquier realización de la invención, la amplificación del polinucleótido puede producirse en condiciones sustancialmente isotérmicas.

[0029] En cualquier realización de la invención, el polinucleótido no se desnaturaliza antes de combinarse con la mezcla de reactivos de amplificación.

[0030] En cualquier realización de la invención, la etapa de combinación se realiza a una temperatura entre 10 °C y 20 °C, o entre 20 °C y 30 °C. Preferentemente, la etapa de combinación se realiza a una temperatura entre 20 °C y 30 °C.

[0031] En cualquier realización de la invención, la amplificación del polinucleótido no se produce hasta que la temperatura de la mezcla de reacción está entre 40 °C y 50 °C, entre 50 °C y 60 °C, entre 60 °C y 70 °C.

[0032] Preferentemente, la amplificación del polinucleótido no se produce hasta que la temperatura de la mezcla de la reacción está entre 50 °C y 60 °C.

[0033] En cualquier realización de la invención, la amplificación del polinucleótido puede producirse sin ciclos repetidos de la temperatura de la mezcla de reacción entre una primera temperatura y una segunda temperatura.

[0034] En cualquier realización de la invención, uno o más componentes de la mezcla de reactivos de amplificación pueden proporcionarse en un recipiente adecuado para su uso en un dispositivo fluídico, cartucho o dispositivo de flujo lateral.

[0035] En cualquier realización de la invención, la amplificación del polinucleótido puede producirse sin reactivos adicionales agregados a la mezcla de reacción formada en la etapa de combinación (a).

[0036] En cualquier realización de la invención, el procedimiento puede incluir además la etapa (c): detectar los polinucleótidos amplificados. En una realización adicional del procedimiento que incluye la etapa (c), la detección de los polinucleótidos amplificados puede producirse sin reactivos adicionales agregados a la mezcla de reacción formada en la etapa de combinación (a).

[0037] En cualquier realización de la invención, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o sustancialmente todos los iones divalentes en la mezcla de reacción están en forma soluble. En realizaciones adicionales, los iones divalentes se unen de forma reversible a un agente quelante sensible al pH. En realizaciones adicionales, los iones divalentes comprenden iones divalentes libres. En otras realizaciones, los iones divalentes comprenden iones divalentes unidos y libres.

[0038] En cualquier realización de la invención, los iones divalentes en solución no se forman a partir de la disolución de un precipitado.

[0039] En cualquier realización de la invención, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 % o sustancialmente ninguno de los iones divalentes forma precipitados antes de la amplificación del polinucleótido.

[0040] En una realización adicional del procedimiento que incluye la etapa (c), menos del 20 %, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 1 % o sustancialmente ninguno de los iones divalentes forma precipitados antes de la detección de los polinucleótidos amplificados.

[0041] En cualquier realización de la invención, la mezcla de reacción no incluye iones divalentes unidos en forma precipitada.

[0042] En cualquier realización de la invención, el polinucleótido no se precalienta, por ejemplo, a una temperatura superior a 30 °C, superior a 40 °C, superior a 50 °C o superior a 60 °C antes de la etapa de combinación (a).

[0043] En cualquier realización de la invención, la mezcla de reactivos de amplificación no se precalienta, por ejemplo, a una temperatura superior a 30 °C, superior a 40 °C, superior a 50 °C o superior a 60 °C antes de la etapa de combinación (a).

[0044] En cualquier realización de la invención, la temperatura de la mezcla de reactivos de amplificación que se combina con el polinucleótido en la etapa (a) está entre 10 °C y 20 °C, o entre 20 °C y 30 °C. Preferentemente, la temperatura de la mezcla de reactivos de amplificación que se combina con el polinucleótido en la etapa (a) está entre 20 °C y 30 °C.

[0045] En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento que comprende: (a) combinar un polinucleótido y una mezcla de reactivos de amplificación para formar una mezcla de reacción, donde la mezcla de reactivos de amplificación comprende iones de magnesio unidos de forma reversible en solución, un tampón sensible a la temperatura y un agente quelante sensible al pH; y (b) ajustar la temperatura de la mezcla de reacción de (i) una primera temperatura a la cual el pH del tampón sensible a la temperatura es operable para que el agente quelante sensible al pH se una de forma reversible a los iones de magnesio libres en solución, de modo que se inhiba la amplificación del polinucleótido, a (ii) una segunda temperatura a la cual el pH del tampón sensible a la temperatura es operable para liberar los iones de magnesio unidos del agente quelante sensible al pH, de modo que pueda continuar la amplificación del polinucleótido, iniciando así la amplificación del polinucleótido.

[0046] En cualquier realización del procedimiento anterior, el agente quelante sensible al pH se puede seleccionar del grupo que consiste en: ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter) tetraacético, derivados de eGtA y derivados de EDTA. Preferentemente, el agente quelante sensible al pH es ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter) tetraacético.

[0047] En cualquier realización del procedimiento anterior, el tampón sensible a la temperatura puede incluir tris(hidroximetil)aminometano.

[0048] En cualquier realización del procedimiento anterior, el pKa del tampón sensible a la temperatura a la segunda temperatura es al menos 0,4 menor que el pKa del tampón sensible a la temperatura a la primera temperatura.

[0049] En cualquier realización del procedimiento anterior, el tampón sensible a la temperatura tiene un ApKa de entre -0,04 °C-1 y -0,015 °C .

[0050] En cualquier realización del procedimiento anterior, la primera temperatura está entre 10 °C y 20 °C, o entre 20 °C y 30 °C. Preferentemente, la primera temperatura está entre 20 °C y 30 °C.

[0051] En cualquier realización del procedimiento anterior, la segunda temperatura está entre 40 °C y 50 °C, entre 50 °C y 60 °C, entre 60 °C y 70 °C. Preferentemente, la segunda temperatura está entre 50 °C y 60 °C.

[0052] En cualquier realización del procedimiento anterior, la mezcla de reactivos de amplificación puede incluir una endonucleasa de corte, una ADN o ARN polimerasa, una recombinasa y/o una transcriptasa inversa. En realizaciones específicas, la mezcla de reactivos de amplificación incluye una endonucleasa de corte y una ADN o ARN polimerasa. En otras realizaciones, la mezcla de reactivos de amplificación incluye una recombinasa y una ADN o ARN polimerasa. Opcionalmente, estas realizaciones pueden incluir una transcriptasa inversa.

[0053] En cualquier realización del procedimiento anterior, la relación entre la concentración del agente quelante y la concentración del ion magnesio es de 0,5 a 2.

[0054] En cualquier realización del procedimiento anterior, la concentración de iones de magnesio libre a la primera temperatura está entre 0 y 10 mM.

[0055] En cualquier realización del procedimiento anterior, la concentración de iones de magnesio libre a la segunda temperatura está entre 5 mM y 50 mM.

[0056] En cualquier realización del procedimiento anterior, la mezcla de reactivos de amplificación puede comprender uno o más componentes en forma liofilizada. En realizaciones específicas, la mezcla de reactivos de amplificación comprende una sal de magnesio en forma liofilizada. La sal de magnesio liofilizada se puede reconstituir en un tampón para formar iones de magnesio en solución. En otras realizaciones, la mezcla de reactivos de amplificación comprende un agente quelante sensible al pH en forma liofilizada. El agente quelante liofilizado sensible al pH puede reconstituirse en un tampón. Según estas realizaciones, el tampón puede ser un tampón sensible a la temperatura. En algunas realizaciones, los iones de magnesio en solución se unen de forma reversible a un agente quelante sensible al pH. Según cualquiera de las realizaciones anteriores, el pH del tampón es operable para que el agente quelante sensible al pH se una de forma reversible a los iones de magnesio libres en solución. Preferentemente, la mezcla de reactivos de amplificación comprende iones de magnesio en solución unidos de forma reversible a un agente quelante sensible al pH, donde los iones de magnesio en solución se forman a partir de la reconstitución de una sal de magnesio liofilizada en un tampón sensible a la temperatura.

[0057] En cualquier realización del procedimiento anterior, la amplificación del polinucleótido puede producirse en condiciones sustancialmente isotérmicas.

[0058] En cualquier realización del procedimiento anterior, el polinucleótido no se desnaturaliza antes de combinarse con la mezcla de reactivos de amplificación.

[0059] En cualquier realización del procedimiento anterior, la etapa de combinación se realiza a una temperatura entre 10 °C y 20 °C, o entre 20 °C y 30 °C. Preferentemente, la etapa de combinación está a una temperatura de entre 20 °C y 30 °C.

[0060] En cualquier realización del procedimiento anterior, la amplificación del polinucleótido no se produce hasta que la temperatura de la mezcla de reacción está entre 40 °C y 50 °C, entre 50 °C y 60 °C, entre 60 °C y 70 °C. Preferentemente, la amplificación del polinucleótido no se produce hasta que la temperatura de la mezcla de reacción está entre 50 °C y 60 °C.

[0061] En cualquier realización del procedimiento anterior, la amplificación del polinucleótido se produce sin ciclos repetidos de la temperatura de la mezcla de reacción entre una primera temperatura y una segunda temperatura.

[0062] En cualquier realización del procedimiento anterior, uno o más componentes de la mezcla de reactivos de amplificación pueden proporcionarse en un recipiente adecuado para su uso en un dispositivo fluídico, cartucho o dispositivo de flujo lateral.

[0063] En cualquier realización del procedimiento anterior, la amplificación del polinucleótido puede producirse sin reactivos adicionales agregados a la mezcla de reacción formada en la etapa de combinación (a).

[0064] En cualquier realización del procedimiento anterior, el procedimiento puede incluir además la etapa (c): detectar los polinucleótidos amplificados. En realizaciones adicionales del procedimiento que incluye la etapa (c), la detección de los polinucleótidos amplificados puede producirse sin reactivos adicionales agregados a la mezcla de reacción formada en la etapa de combinación (a).

[0065] En cualquier realización del procedimiento anterior, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o sustancialmente todos los iones divalentes en la mezcla de reacción están en forma soluble. En realizaciones adicionales, los iones divalentes pueden unirse de forma reversible a un agente quelante sensible al pH. En realizaciones adicionales, los iones divalentes pueden comprender iones divalentes libres. En otras realizaciones, los iones divalentes pueden comprender iones divalentes unidos y libres.

[0066] En cualquier realización del procedimiento anterior, los iones divalentes en solución no se forman a partir de la disolución de un precipitado.

[0067] En cualquier realización del procedimiento anterior, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 % o sustancialmente ninguno de los iones divalentes forma precipitados antes de la amplificación del polinucleótido.

[0068] En realizaciones adicionales del procedimiento anterior que incluye la etapa (c), menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 % o sustancialmente ninguno de los iones divalentes forma precipitados antes de la detección de los polinucleótidos amplificados.

[0069] En cualquier realización del procedimiento anterior, la mezcla de reacción no incluye iones divalentes unidos en forma precipitada.

[0070] En otro aspecto, la descripción proporciona una composición que comprende uno o más reactivos para la amplificación de ácido nucleico e iones de magnesio unidos de forma reversible dependientes del pH en solución.

[0071] En cualquier realización de la composición anterior, la composición puede incluir además un tampón sensible a la temperatura y un agente quelante sensible al pH. En realizaciones específicas, el tampón sensible a la temperatura puede incluir tris(hidroximetil)aminometano. En otras realizaciones específicas, el agente quelante sensible al pH puede incluir ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter) tetraacético. Preferentemente, la composición incluye además tris(hidroximetil)aminometano y ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter) tetraacético.

[0072] En cualquier realización de la composición anterior, el tampón sensible a la temperatura puede tener un ApKa de entre -0,04 °C-1 y -0,015 °C-1.

[0073] En cualquier realización de la composición anterior, el uno o más reactivos para la amplificación de ácido nucleico pueden incluir una endonucleasa de corte, una ADN o ARN polimerasa, una transcriptasa inversa y/o una recombinasa. En realizaciones específicas, el uno o más reactivos incluyen una endonucleasa de corte y una ADN o ARN polimerasa. En otras realizaciones, el uno o más reactivos incluyen una recombinasa y una ADN o ARN polimerasa. Opcionalmente, estas realizaciones pueden incluir una transcriptasa inversa.

[0074] En cualquier realización de la composición anterior, el uno o más reactivos para la amplificación de ácido nucleico puede comprender uno o más componentes en forma liofilizada. En realizaciones específicas, el uno o más reactivos pueden comprender una sal de magnesio en forma liofilizada. La sal de magnesio liofilizada se puede reconstituir en un tampón para formar iones de magnesio en solución. En otras realizaciones, el uno o más reactivos pueden comprender un agente quelante sensible al pH en forma liofilizada. El agente quelante liofilizado sensible al pH puede reconstituirse en un tampón. Según estas realizaciones, el tampón puede ser un tampón sensible a la temperatura. Preferentemente, la composición anterior comprende iones de magnesio unidos de forma reversible dependientes del pH en solución, donde los iones de magnesio en solución se forman a partir de la reconstitución de una sal de magnesio liofilizada en un tampón sensible a la temperatura.

[0075] En cualquier realización de la composición anterior, los iones de magnesio en solución no se forman a partir de la disolución de un precipitado.

[0076] En cualquier realización de la composición anterior, la composición no comprende iones de magnesio unidos en forma precipitada.

[0077] En cualquier realización de la composición anterior, uno o más componentes se proporcionan en un recipiente adecuado para su uso en un dispositivo fluídico, cartucho o dispositivo de flujo lateral.

[0078] En otro aspecto, la descripción proporciona una composición que comprende uno o más reactivos para la amplificación de ácido nucleico, un tampón sensible a la temperatura, un agente quelante sensible al pH y una sal de magnesio.

[0079] En cualquier realización de la composición anterior, el tampón sensible a la temperatura puede incluir tris(hidroximetil)aminometano.

[0080] En cualquier realización de la composición anterior, el tampón sensible a la temperatura puede tener un ApKa de entre -0,04 °C-1 y -0,015 °C-1.

[0081] En cualquier realización de la composición anterior, el agente quelante sensible al pH puede incluir ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter) tetraacético.

[0082] Preferentemente, la composición incluye tris(hidroximetil)aminometano y ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter) tetraacético.

[0083] En cualquier realización de la composición anterior, el uno o más reactivos para la amplificación de ácido nucleico pueden comprender una endonucleasa de corte, una ADN o ARN polimerasa, una transcriptasa inversa y/o una recombinasa. En realizaciones específicas, el uno o más reactivos incluyen una endonucleasa de corte y una a Dn o ARN polimerasa. En otras realizaciones, el uno o más reactivos incluyen una recombinasa y una ^a Dⁿ o ARN polimerasa. Opcionalmente, estas realizaciones pueden incluir una transcriptasa inversa.

[0084] En cualquier realización de la composición anterior, el uno o más reactivos pueden comprender uno o más componentes en forma liofilizada. En realizaciones específicas, el uno o más reactivos pueden comprender una sal de magnesio en forma liofilizada. La sal de magnesio liofilizada se puede reconstituir en un tampón para formar iones de magnesio en solución. En otras realizaciones, el uno o más reactivos pueden comprender un agente quelante sensible al pH en forma liofilizada. El agente quelante liofilizado sensible al pH puede reconstituirse en un tampón. Según estas realizaciones, el tampón puede ser un tampón sensible a la temperatura. Preferentemente, la composición anterior comprende una sal de magnesio liofilizada que se reconstituye en un tampón sensible a la temperatura para formar iones de magnesio unidos de forma reversible dependientes del pH en solución.

[0085] En cualquier realización de la composición anterior, los iones de magnesio en solución no se forman a partir de la disolución de un precipitado.

[0086] En cualquier realización de la composición anterior, la composición no comprende iones de magnesio unidos en forma precipitada.

[0087] En cualquier realización de la composición anterior, uno o más componentes pueden proporcionarse en un recipiente adecuado para su uso en un dispositivo fluídico, cartucho o dispositivo de flujo lateral.

[0088] En otro aspecto más, la descripción proporciona un procedimiento que comprende: (a) combinar una enzima y una mezcla de reactivos para formar una mezcla de reacción, donde la mezcla de reacción comprende iones divalentes unidos de forma reversible en solución, y (b) ajustar el pH de la mezcla de reacción para liberar los iones divalentes unidos de forma reversible, activando así la enzima.

[0089] En cualquier realización del procedimiento anterior, el ion divalente se selecciona del grupo que consiste en: magnesio, calcio, cobre, zinc, manganeso, hierro, cadmio y plomo.

[0090] En cualquier realización del procedimiento anterior, la mezcla de reactivos puede comprender un agente quelante sensible al pH.

[0091] En cualquier realización del procedimiento anterior, la mezcla de reactivos puede comprender un tampón sensible a la temperatura.

[0092] En cualquier realización del procedimiento anterior, el pH de la mezcla de reacción se puede ajustar según el pH del tampón sensible a la temperatura.

[0093] En cualquier realización del procedimiento anterior, el pH de la mezcla de reacción se puede ajustar cambiando la temperatura de la mezcla de reacción de una primera temperatura a una segunda temperatura.

[0094] En realizaciones del procedimiento anterior, la enzima puede ser una ADN o ARN polimerasa.

[0095] En cualquier realización del procedimiento anterior, la enzima puede ser una endonucleasa de corte.

[0096] Los procedimientos de la invención pueden incluir una reacción para amplificar el polinucleótido, por ejemplo, en condiciones sustancialmente isotérmicas o no. Por ejemplo, las reacciones de amplificación pueden incluir reacción de amplificación de corte y extensión (NEAR) o amplificación de polimerasa recombinasa (RPA).

[0097] En otro aspecto, la descripción presenta composiciones (por ejemplo, composiciones secas) que incluyen una endonucleasa de corte (por ejemplo, N.BstNBI), una ADN polimerasa (por ejemplo, una ADN polimerasa termófila) y un agente quelante sensible al pH (por ejemplo, EGTA). En algunas realizaciones, las composiciones incluyen además un tampón sensible a la temperatura (por ejemplo, Tris). En realizaciones, las composiciones incluyen además una transcriptasa inversa. En algunas realizaciones, las composiciones o procedimientos de la invención pueden incluir (i) una plantilla directa que incluye una secuencia de ácido nucleico que tiene una región de reconocimiento en el extremo 3' que es complementaria al extremo 3' de una cadena antisentido de secuencia diana, un sitio de unión a enzima de corte, un sitio de corte aguas arriba de la región de reconocimiento y una región estabilizadora aguas arriba de dicho sitio de corte y/o (ii) una plantilla inversa que incluye una secuencia de nucleótidos que tiene una región de reconocimiento en el extremo 3' que es complementaria al extremo 3' de una cadena sentido de secuencia diana (por ejemplo, el complemento de la cadena antisentido de secuencia diana), un sitio de unión a enzima de corte, un sitio de corte aguas arriba de la región de reconocimiento y una región estabilizadora aguas arriba de dicho sitio de corte. En algunas realizaciones, las composiciones pueden incluir además una sal de magnesio o iones de magnesio.

[0098] En algunas realizaciones, las composiciones o procedimientos de la invención pueden incluir una o más enzimas de corte, por ejemplo, seleccionadas del grupo que consiste en Nt.BspQI, Nb.BbvCI , Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsI, Nt.AlwI, Nt.BbvCI, Nt.BstNBI, Nt.CviPII, Nb.BpulOl, Nt.BpulOI y N.BspD6I. En determinadas realizaciones, la enzima de corte se puede seleccionar del grupo que consiste en Nt.NBst.NBI, Nb.BsmI y Nb.BsrDI. Preferentemente, la enzima de corte es Nt.BstNBI o N.BspD6I. Los expertos en la materia son conscientes de que pueden usarse varias enzimas de corte distintas de las mencionadas específicamente en esta invención en los procedimientos y composiciones de la presente invención.

[0099] En algunas realizaciones, las composiciones o procedimientos de la invención pueden incluir plantillas, que pueden ser oligonucleótidos que se unen a una región de reconocimiento de la diana y también contienen una región de unión a enzima de corte aguas arriba de la región de reconocimiento y una región estabilizadora aguas arriba de la región de unión a enzima de corte. La "región de reconocimiento" puede ser una secuencia de ácido nucleico en la plantilla que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico en la secuencia diana. La región de reconocimiento en la secuencia diana puede ser la secuencia de nucleótidos en la secuencia diana que es complementaria y se une a la plantilla. La "región estabilizadora" puede ser una secuencia de ácido nucleico que tiene, por ejemplo, aproximadamente el 50 % de contenido de GC, diseñada para estabilizar la molécula para, por ejemplo, las reacciones de corte y/o extensión.

[0100] En otro aspecto más, la descripción presenta composiciones (por ejemplo, composiciones secas) que incluyen una recombinasa (por ejemplo, UvsX), una ADN polimerasa y un agente quelante sensible al pH (por ejemplo, EGTA). En algunas realizaciones, las composiciones incluyen además un tampón sensible a la temperatura (por ejemplo, Tris). Las composiciones o procedimientos de la invención pueden incluir uno o más de (i) una proteína de unión al ADN de cadena simple (por ejemplo, gp32), (ii) UvsY y (iii) un agente de apiñamiento (por ejemplo, polietilenglicol (PEG)). En algunas realizaciones, las composiciones pueden incluir además una sal de magnesio o iones de magnesio. En algunas realizaciones, las composiciones y procedimientos de la invención pueden comprender preferentemente análogos modificados y modificados por ingeniería genética de recombinasas tales como E. coli recA y bacteriófago T4 uvsX, polimerasas que incluyen el fragmento Klenow de E. coli ADN polimerasa I, Bst polimerasa, Phi-29 polimerasa, Bacillus subtilis Pol I (Bsu), PolV y proteínas de unión al ADN de cadena simple de E. coli y T4 (por ejemplo, proteína gp32).

Las sondas marcadas que son suficientemente complementarias e hibridan con polinucleótidos o productos de polinucleótidos amplificados se pueden utilizar en cualquier aspecto o realización de la invención.

[0101] Se describe un dispositivo de flujo lateral que contiene reactivos de amplificación de polinucleótidos tales como ADN o ARN polimerasas, enzimas de corte, recombinasas y/o transcriptasa inversa para la amplificación de ácido nucleico, y uno o más tampónes de pH sensibles a la temperatura, uno o más agentes quelantes sensibles al pH y uno o más iones divalentes tales como iones de magnesio y/o una o más sales metálicas divalentes tales como una sal de magnesio o un sulfato de magnesio. En algunas realizaciones, uno o más de estos componentes pueden liofilizarse.

[0102] Se describe un dispositivo microfluídico que contiene reactivos de amplificación de polinucleótidos tales como ADN o ARN polimerasas, enzimas de corte, recombinasas y/o transcriptasa inversa para la amplificación de ácido nucleico, y uno o más tampónes de pH sensibles a la temperatura, uno o más agentes quelantes sensibles al pH y uno o más iones divalentes tales como iones de magnesio y/o una o más sales metálicas divalentes tales como una sal de magnesio o un sulfato de magnesio. En algunas realizaciones, uno o más de estos componentes pueden liofilizarse.

[0103] Se describe un cartucho que contiene reactivos de amplificación de polinucleótidos tales como ADN o ARN polimerasas, enzimas de corte, recombinasas y/o transcriptasa inversa para la amplificación de ácido nucleico, y uno o más tampónes de pH sensibles a la temperatura, uno o más agentes quelantes sensibles al pH y uno o más iones divalentes tales como iones de magnesio y/o una o más sales metálicas divalentes tales como una sal de magnesio o un sulfato de magnesio. En algunas realizaciones, uno o más de estos componentes pueden liofilizarse.

[0104] Se describe un dispositivo de preparación y transferencia de muestras que contiene reactivos de amplificación de polinucleótidos tales como ADN o ARN polimerasas, enzimas de corte, recombinasas y/o transcriptasa inversa para la amplificación de ácido nucleico, y uno o más tampónes de pH sensibles a la temperatura, uno o más agentes quelantes sensibles al pH y uno o más iones divalentes tales como iones de magnesio y/o una o más sales metálicas divalentes tales como una sal de magnesio o un sulfato de magnesio. En algunas realizaciones, uno o más de estos componentes pueden liofilizarse.

[0105] Los procedimientos y composiciones descritos en esta invención pueden proporcionar reacciones de amplificación de ácido nucleico sin necesidad de precalentar la reacción a una temperatura de reacción. También pueden proporcionar una mayor selectividad, sensibilidad y reproducibilidad de las reacciones de amplificación de ácido nucleico sin precalentamiento.

[0106] En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento que comprende:

formar una mezcla que comprende: (a) una muestra que comprende una diana y (b) reactivos que comprenden un agente de unión, un ion unido por el agente de unión, un tampón y reactivos de amplificación que comprenden al menos un componente que tiene una primera actividad en presencia del ion cuando el ion está unido por el agente de unión y una segunda actividad diferente en presencia del ion cuando el ion está libre del agente de unión; y liberar una cantidad del ion del agente de unión suficiente para cambiar la actividad del al menos un componente de los reactivos de amplificación de la primera actividad a la segunda actividad mediante el aumento de una temperatura de la mezcla de una primera temperatura a una segunda temperatura.

[0107] En cualquier realización del procedimiento anterior, la muestra puede ser una muestra, por ejemplo, un líquido tal como sangre, plasma, suero, esputo, un hisopo nasal, un hisopo vaginal, saliva, mucosa o fluido espinal, de un ser humano o animal.

[0108] En cualquier realización del procedimiento anterior, la diana puede ser un polinucleótido, por ejemplo, un polinucleótido de un patógeno tal como una bacteria o virus. La diana, tal como está presente en la muestra, puede ser de un polinucleótido de cadena doble o de un polinucleótido de cadena simple.

[0109] En cualquier realización del procedimiento anterior en el que la diana es un polinucleótido de cadena doble, el procedimiento puede realizarse sin elevar la temperatura del polinucleótido a una temperatura suficiente para desnaturalizar completamente más del 50 %, 35 %, 25 %, 15 %, 7,5 %, 5 % o 2,5 % del polinucleótido de cadena doble. Por ejemplo, el procedimiento puede realizarse sin elevar la temperatura por encima de una temperatura a la que esencialmente todo el polinucleótido de doble cadena permanece hibridado.

[0110] En cualquier realización del procedimiento anterior, los reactivos de amplificación pueden amplificar la diana mientras la actividad del al menos un componente se encuentra en el segundo estado. La etapa de amplificación se puede realizar sin combinar la mezcla con reactivos adicionales que participan en la amplificación y/o detección de la diana después de la etapa de formación de la mezcla.

[0111] En cualquier realización del procedimiento anterior, el procedimiento puede comprender además detectar la presencia y/o cantidad de la diana. La detección se puede realizar después de amplificar una cantidad de la diana al menos 106 veces, por ejemplo, al menos 106 veces, al menos 107 veces, al menos 108 veces, al menos 109 veces, al menos 1010 veces, al menos 1011 veces o al menos 1012 veces.

[0112] En cualquier realización del procedimiento anterior que comprende amplificar, al menos el 50%, al menos el 75 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o esencialmente toda la cantidad total de amplificación se puede realizar cuando la temperatura está a aproximadamente la segunda temperatura, por ejemplo, dentro de los 15 °C de la segunda temperatura, dentro de los 10 °C de la segunda temperatura, dentro de los 7,5 °C de la segunda temperatura, dentro de los 5 °C de la segunda temperatura, dentro de los 2,5 °C de la segunda temperatura o esencialmente a la segunda temperatura.

[0113] En cualquier realización del procedimiento anterior, la etapa de formación de la mezcla puede comprender poner en contacto la muestra con los reactivos donde los reactivos están en forma liofilizada cuando entran en contacto con la muestra.

[0114] En cualquier realización del procedimiento anterior que comprende detectar, la etapa de detección se puede realizar en menos de 25 minutos, menos de 20 minutos o menos de 17,5 minutos después de poner en contacto la muestra y los reactivos. En cualquier realización del procedimiento anterior, la etapa de formación de la mezcla se puede realizar sin aumentar una temperatura de la mezcla en más de 30 °C, en más de 25 °C, en más de 20 °C, en más de 15 °C, en más de 10 °C, en más de 5 °C por encima de una temperatura ambiente adyacente a la mezcla. Por ejemplo, la etapa de formación de la mezcla se puede realizar con los reactivos a aproximadamente una temperatura ambiente adyacente a los reactivos.

[0115] En cualquier realización del procedimiento anterior, la etapa de formación de la mezcla se puede realizar sin aumentar sustancialmente una temperatura de los reactivos por encima de una temperatura de los reactivos inmediatamente antes de la etapa de formación. La temperatura de los reactivos inmediatamente antes de la etapa de formación puede ser aproximadamente la misma que una temperatura ambiente que rodea los reactivos.

[0116] En cualquier realización del procedimiento anterior, el procedimiento se puede realizar sin poner en contacto la mezcla con (a) reactivos adicionales que participan en la amplificación y/o detección de la diana o (b) cualquier reactivo adicional en cada caso después de que la temperatura de la mezcla se ha aumentado por encima de la primera temperatura.

[0117] En cualquier realización del procedimiento anterior, el procedimiento se puede realizar sin agregar (a) reactivos adicionales que participan en la amplificación y/o detección de la diana o (b) cualquier reactivo adicional en cada caso después de la etapa de liberación de una cantidad de iones.

[0118] En cualquier realización del procedimiento anterior, el procedimiento se puede realizar sin devolver el al menos un componente al primer estado desde el segundo estado.

[0119] En cualquier realización del procedimiento anterior, el procedimiento se puede realizar sin volver a unir simultáneamente más del 25 %, más del 15 %, más del 10 % o más del 5 % de la cantidad liberada de iones.

[0120] En cualquier realización del procedimiento anterior, el procedimiento se puede realizar sin poner en contacto la muestra y/o diana con un precipitado insoluble que comprende una cantidad del ion suficiente para cambiar la actividad del al menos un componente de los reactivos de amplificación de la primera actividad a la segunda actividad.

[0121] En cualquier realización del procedimiento anterior, el procedimiento se puede realizar sin poner en contacto la muestra y/o diana con un precipitado insoluble que comprende una cantidad del ion suficiente para cambiar la actividad del al menos un componente de los reactivos de amplificación de la primera actividad a la segunda actividad y a continuación disolver el precipitado.

[0122] En cualquier realización del procedimiento anterior, el procedimiento se puede realizar sin precipitar más del 25 %, más del 15 %, más del 10 %, más del 5 %, más del 2,5 % de la cantidad liberada de iones de la mezcla.

[0123] En cualquier realización del procedimiento anterior, el procedimiento se puede realizar sin precipitar una cantidad del ion suficiente para cambiar la actividad del al menos un componente de los reactivos de amplificación de la segunda actividad a la primera actividad.

[0124] En cualquier realización del procedimiento anterior, la primera temperatura puede ser una temperatura ambiente adyacente a la mezcla.

[0125] En cualquier realización del procedimiento anterior, el primer procedimiento se puede realizar sin elevar la temperatura de la mezcla a una temperatura superior a 80 °C, a una temperatura superior a 70 °C, a una temperatura superior a 65 °C o a una temperatura superior a 60 °C.

[0126] En cualquier realización del procedimiento anterior, la primera temperatura puede ser inferior a 30 °C o inferior a 27,5 °C.

[0127] En cualquier realización del procedimiento anterior, la segunda temperatura puede ser de al menos 40 °C, al menos 45 °C, al menos 50 °C o al menos 55 °C.

[0128] En cualquier realización del procedimiento anterior, la segunda temperatura puede ser inferior a 67,5 °C, inferior a 62,5 °C, inferior a 60 °C o 56,5 °C o inferior.

[0129] En cualquier realización del procedimiento anterior que comprende detectar, la detección se puede realizar cuando la temperatura está a aproximadamente la segunda temperatura, por ejemplo, dentro de los 15 °C de la segunda temperatura, dentro de los 10 °C de la segunda temperatura, dentro de los 7,5 °C de la segunda temperatura, dentro de los 5 °C de la segunda temperatura, dentro de los 2,5 °C de la segunda temperatura o esencialmente a la misma temperatura.

[0130] En cualquier realización del procedimiento anterior, el procedimiento se puede realizar sin ciclar la temperatura de la mezcla entre la primera y la segunda temperatura.

[0131] En cualquier realización del procedimiento anterior, el procedimiento se puede realizar sin ciclar la temperatura de la mezcla entre una temperatura más baja a la que se hibridan sustancialmente los polinucleótidos de cadena doble presentes en la mezcla y una segunda temperatura a la que se desnaturalizan sustancialmente los polinucleótidos de cadena doble presentes en la mezcla.

[0132] En cualquier realización del procedimiento anterior, las etapas de formación y combinación se pueden realizar dentro de una red fluídica dentro de un alojamiento. El alojamiento puede ser portátil, por ejemplo, de mano. El alojamiento puede ser un alojamiento de un solo uso que comprende los reactivos almacenados en él y el primer procedimiento puede comprender introducir la muestra en la red fluídica del alojamiento. El alojamiento puede comprender un suministro de energía interno tal como una batería y un calentador alimentado por la batería y suficiente para elevar la temperatura de la mezcla a la segunda temperatura.

[0133] En cualquier realización del procedimiento anterior, los reactivos se pueden liofilizar antes de formar la mezcla.

[0134] En cualquier realización del procedimiento anterior, el agente de unión puede ser un agente de unión sensible al pH y el tampón puede ser un tampón sensible a la temperatura donde el aumento de una temperatura de la mezcla de la primera temperatura a la segunda temperatura cambia la capacidad de amortiguación del tampón de modo que el pH de la mezcla cambia de un primer pH a un segundo pH diferente y donde el agente de unión libera la cantidad suficiente del ion al segundo pH.

[0135] En cualquier realización del procedimiento anterior, el al menos un componente puede ser una enzima tal como una ADN polimerasa, una ARN polimerasa, una endonucleasa de corte o una recombinasa . Por ejemplo, la enzima puede ser una enzima de corte tal como Nt.BstNBI o N.BspD6I.

[0136] En cualquier realización del procedimiento anterior, el agente de unión puede ser un quelante tal como ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter) tetraacético, derivados de EGTA y derivados de EDTA. En cualquiera de las realizaciones del procedimiento anterior, el ion puede ser magnesio, calcio, cobre, zinc, manganeso, hierro, cadmio y plomo. En cualquiera de las realizaciones del procedimiento anterior, el tampón puede ser tris(hidroximetil)aminometano. En cualquiera de las realizaciones del procedimiento anterior, los reactivos de amplificación pueden comprender una cantidad de reactivos suficiente para amplificar la diana por NEAR. Por ejemplo, el quelante puede ser ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter) tetraacético, el ion puede ser magnesio, el tampón puede ser tris(hidroximetil)aminometano, el al menos un componente puede ser una ADN polimerasa, una ARN polimerasa, Nt.BstNBI o N.BspD6I y los reactivos de amplificación pueden comprender una cantidad de reactivos suficiente para amplificar la diana por NEAR.

[0137] En cualquier realización del procedimiento anterior, la actividad del al menos un componente es al menos 10 veces mayor en presencia de la cantidad liberada de iones que cuando la cantidad de iones está unida por el agente de unión, al menos 20 veces mayor en presencia de la cantidad liberada de iones que cuando la cantidad de iones está unida por el agente de unión, al menos 50 veces mayor en presencia de la cantidad liberada de iones que cuando la cantidad de iones está unida por el agente de unión, o al menos 100 veces mayor en presencia de la cantidad liberada de iones que cuando la cantidad de iones está unida por el agente de unión. La actividad puede ser con respecto a la amplificación de la diana.

[0138] En cualquier realización del procedimiento anterior en la que se amplifica la diana, la velocidad de amplificación puede ser al menos 10 veces mayor en presencia de la cantidad liberada de iones que si la cantidad de iones estuviera unida por el agente de unión, al menos 20 veces mayor en presencia de la cantidad liberada de iones que si la cantidad de iones estuviera unida por el agente de unión, al menos 50 veces mayor en presencia de la cantidad liberada de iones que si la cantidad de iones estuviera unida por el agente de unión, o al menos 100 veces mayor en presencia de la cantidad liberada de iones que si la cantidad de iones estuviera unida por el agente de unión.

[0139] En cualquier realización del procedimiento anterior en la que se amplifica la diana, la velocidad de amplificación puede ser al menos 10 veces mayor cuando el al menos un componente se encuentra en el segundo estado en comparación con cuando el primer componente se encontraba en el primer estado, al menos 20 veces mayor cuando el al menos un componente se encuentra en el segundo estado en comparación con cuando el primer componente se encontraba en el primer estado, al menos 50 veces mayor cuando el al menos un componente se encuentra en el segundo estado en comparación con cuando el primer componente se encontraba en el primer estado, o al menos 100 veces mayor cuando el al menos un componente se encuentra en el segundo estado en comparación con cuando el primer componente se encontraba en el primer estado.

[0140] En cualquier realización del procedimiento anterior que comprende amplificar, al menos el 50%, al menos el 75 %, al menos el 90 % al menos el 95 % o esencialmente toda la cantidad total de amplificación se puede realizar sin elevar la temperatura de la mezcla a una temperatura a la cual más del 50 %, más del 30 %, más del 20 %, más del 10 % o más del 5 % de los polinucleótidos de cadena doble presentes en la mezcla están completamente desnaturalizados. Por ejemplo, el primer procedimiento se puede realizar amplificando, al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos el 90 % al menos el 95 % o esencialmente toda la cantidad total de amplificación realizada sin desnaturalizar primero completamente más del 50 %, más del 30 %, más del 20 %, más del 10 % o más del 5 % de los polinucleótidos de cadena doble presentes en la mezcla.

[0141] Todos los intervalos descritos en esta invención, por ejemplo, como "entre X e Y", incluyen los extremos.

[0142] Los detalles de una o más realizaciones se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0143]

La figura 1 es una gráfica que representa la fluorescencia de reacciones NEAR que no contienen plantilla (NTC), 100 copias de plantilla (100 cp), ninguna plantilla con EGTA (NTC EGTA) y 100 copias de plantilla con EGtA (100 cp EGTA).

La figura 2 es una gráfica que representa la fluorescencia de reacciones NEAR que no contienen plantilla (ntc), 20 copias de plantilla (20 cp) y 200 copias de plantilla (200 cp), en todos los casos con EGTA. Las líneas sólidas son datos de fluorescencia de baliza molecular marcada con Rox y las líneas discontinuas son datos de fluorescencia SyBr II.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0144] La presente descripción se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la actividad de una enzima que requiere un cofactor de iones divalentes puede controlarse mediante la unión reversible de los iones divalentes en la mezcla de reacción. En procedimientos ejemplares, se prepara una mezcla de reacción mediante la combinación de una enzima y una mezcla de reactivos, donde la mezcla de reacción incluye iones divalentes unidos de forma reversible en solución. El pH de la mezcla de reacción puede ajustarse a continuación para liberar los iones divalentes unidos de forma reversible, activando así la enzima.

[0145] La descripción es aplicable a cualquier reacción que implique una enzima que requiera un cofactor de iones divalentes. Los cofactores de iones divalentes que son esenciales para las enzimas incluyen magnesio, calcio, cobre, zinc, manganeso, hierro, cadmio y plomo.

[0146] Una aplicación ejemplar se encuentra en las denominadas reacciones de "arranque en caliente", donde al menos un componente implicado en una reacción (por ejemplo, una enzima o cofactor de iones divalentes) se separa de la mezcla de reacción o se mantiene en un estado inactivo hasta que la temperatura de la mezcla de reacción alcanza la temperatura adecuada.

[0147] La presente descripción proporciona reacciones novedosas de amplificación de ácido nucleico de "arranque en caliente" que incluyen un tampón sensible a la temperatura y un agente quelante sensible al pH. En procedimientos ejemplares, las mezclas de reacción se preparan a una primera temperatura (por ejemplo, temperatura ambiente) a la cual el pH del tampón sensible a la temperatura es operable para que el agente quelante sensible al pH se una de forma reversible a los iones de magnesio libres necesarios como cofactores para uno o más componentes enzimáticos de la reacción, y se inhibe el progreso de la reacción. La temperatura de la mezcla de reacción se ajusta a continuación a una segunda temperatura a la cual el pH del tampón sensible a la temperatura es operable para liberar los iones de magnesio divalentes unidos del agente quelante sensible al pH, y para que la reacción continúe.

[0148] En vista de la presente descripción, el experto en la materia puede seleccionar la primera temperatura, la segunda temperatura, las condiciones del tampón sensible a la temperatura y un agente quelante sensible al pH en función de las propiedades del procedimiento de amplificación de ácido nucleico específico utilizado. Cuando se requieren temperaturas de reacción elevadas, las enzimas utilizadas pueden derivar de una especie termófila (por ejemplo, Thermus aquaticus).

[0149] A modo de ejemplo, la reacción de amplificación de corte y extensión (NEAR) se puede operar a una temperatura de 56 °C. La mezcla de reacción se prepara normalmente a temperatura ambiente e incluye un ácido nucleico diana, oligonucleótidos, una ADN polimerasa, una endonucleasa de corte, tampón de tris(hidroximetil)aminometano (pH 8), ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter) tetraacético (EGTA), una o más sales (por ejemplo, una o más sales de magnesio monovalentes y/o divalentes) y dNTP. A este pH, el EGTA se une a los iones de magnesio relativamente fuertes, evitando así la unión de los iones de magnesio a las enzimas de corte y polimerasa. En general, sin iones de magnesio, las enzimas en la reacción no muestran actividad enzimática y la reacción se detiene eficazmente. La temperatura se aumenta a 56 °C, a la que el pH del tampón sensible a la temperatura disminuye a menos de pH 7,4. A este pH, la unión efectiva de EGTA a iones de magnesio disminuye, lo que resulta en la disociación de iones de magnesio del complejo EGTA de magnesio. Los iones de magnesio son libres de interactuar con las enzimas de corte y polimerasa que forman holoenzimas, y la reacción de amplificación continúa.

[0150] Un tampón o agente tampón tal como se usa en esta invención es un ácido o base débil que se puede utilizar para regular el pH de una solución. Los tampónes, que incluyen tampónes que son generalmente compatibles con las reacciones de amplificación de ácido nucleico, son conocidos en la técnica. El pH de muchos tampónes depende en parte de la temperatura de la solución, de modo que el pH de la solución amortiguada variará de forma predecible con la temperatura. La dependencia a la temperatura del tampón tris(hidroximetil)aminometano (Tris) se muestra en la tabla 1.

Tabla 1 D n n i l H l m r r l m ón Tris

continuación

[0151] Las propiedades de tampónes ejemplares comercialmente disponibles de ácido 3­ {[tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfónico (TAPS), glicilglicina,N,N-bis(2-hidroxietil)glicina (Bicina), Tris, glicinamida, N-tris(hidroximetil) metilglicina (Tricina), ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazina-etanosulfónico (HEPES), ácido 2-{[tris(hidroximetil)metil]amino} etanosulfónico (TES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES), ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES), piperazina-N, ácido N'-bis(2-etanosulfónico) (PIPES) y ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) se muestran en la tabla 2.

T l 2. Pr i l m n

[0152] En algunas realizaciones, el tampón sensible a la temperatura incluye uno o más de, por ejemplo, tricina, glicina, bicina, glicilglicina, TES (ácido tris-hidroximetil)metil-aminoetanosulfónico), ACES (ácido ((N-2-acetomida-2-ami-noetanosulfónico) y tris(hidroximetil)aminometano.

[0153] En algunas realizaciones, el pKa del tampón sensible a la temperatura a la segunda temperatura es al menos 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5 o 0,4 menor que el pKa del tampón sensible a la temperatura a la primera temperatura. En algunas realizaciones, el pH de la mezcla de reacción a la segunda temperatura es al menos 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0. 5 o 0,4 menor que el pH de la mezcla de reacción a la primera temperatura.

[0154] En algunas realizaciones, el tampón sensible a la temperatura tiene un ApKa (por ejemplo, entre la primera y segunda temperatura) de -0,010 °C'1 o menos, por ejemplo, -0,015 °C'1 o menos, -0,020 °C'1 o menos, -0,025 °C'1 o menos, o -0,030 °C'1 o menos. En algunas realizaciones, el tampón sensible a la temperatura tiene un ApKa (por ejemplo, entre la primera y segunda temperatura) de entre -0,040 °C'1 y cualquiera de -0,010 °C-1, -0,015 °C-1, -0,020 °C'1, -0,025 °C'1 y -0,030 °C'1.

[0155] Un agente quelante sensible al pH, tal como se usa en esta invención, es un producto químico que forma complejos solubles con iones divalentes, por ejemplo, iones de magnesio, de modo que los iones divalentes no pueden participar en reacciones químicas, por ejemplo, como cofactores de enzimas. Maguire y col., 2002, Biometals, 15:203-210, proporciona una revisión de la bioquímica del magnesio. Muchos agentes quelantes sensibles al pH que se unen a iones de magnesio son conocidos en la técnica. Las clases ejemplares de agentes quelantes sensibles al pH incluyen ácidos poliamino-carboxílicos (por ejemplo, ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido nitrilotriacético (NTA), derivados de NTA, ácido iminodiacético (IDA), derivados de IDA, ácido cítrico, ácido oxalato, ácido N-(hidroxietil)-etilendiaminotriacético (HEDTA) y ácido dietiltriaminapentaacético (DTPA)), azobencenos (véase, por ejemplo, Momotake y col., 2003, Tetrahedron Lett., 44:7277-80) y ácidos alcoxiacéticos (véase, por ejemplo, Starek y col., 2006, Acta Pol. Pharm., 63:89-94). En esta invención se describen ejemplos no limitantes de agentes quelantes sensibles al pH. La unión de la mayoría de los agentes quelantes sensibles al pH a los iones de magnesio depende del pH de la solución. A medida que el pH disminuye, los iones de hidrógeno compiten exitosamente con los iones de magnesio por la unión al agente quelante (por ejemplo, la constante de estabilidad efectiva o constante de estabilidad condicional del agente quelante dependiente del pH y el complejo de magnesio disminuye a medida que el pH disminuye).

[0156] En algunas realizaciones, el agente quelante dependiente del pH es un agente quelante dependiente del pH monodentado (por ejemplo, cualquiera de los agentes quelantes dependientes del pH monodentado descritos en esta invención o conocidos en la técnica). En algunas realizaciones, el agente quelante monodentado sensible al pH es ácido cítrico.

[0157] En algunas realizaciones, el agente quelante dependiente del pH es un agente quelante dependiente del pH multidentado (por ejemplo, cualquiera de los agentes quelantes dependientes del pH multidentado descritos en esta invención o conocidos en la técnica). Los agentes quelantes multidentados sensibles al pH generalmente forman complejos de magnesio más estables que aquellos formados por agentes quelantes monodentados sensibles al pH similares, y son más dependientes del pH debido a la presencia de múltiples grupos funcionales sensibles al pH. Estos grupos funcionales forman diferentes estados protonados a medida que cambia el pH. Como resultado, la constante de estabilidad efectiva o constante de estabilidad condicional disminuye a medida que disminuye el pH. En algunas realizaciones, el agente quelante multidentado sensible al pH contiene uno o más (por ejemplo, al menos dos, tres o cuatro) grupos funcionales carboxilato y/o amino (por ejemplo, ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter) tetraacético (EGTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), derivados de EGTA, derivados de EDTA, ácido N-metiliminodiacético, ácido nitrilotriacético (NTA), derivados de NTA, ácido DL-2-(2-metiltioetil)nitriloacético, ácido (2-hidroxitrimetileno)dinitrilotetraacético, ácido DL-1-etiletilendinitrilotetraacético N,N-diamida, ácido DL-1-metiletilendinitrilotetraacético N,N-diamida, ácido etilendiiminodipropanodioico (EDDM), ácido etilendiiminodi-2-propanoico, ácido etilendiiminodiacético (EDDA), ácido N-(2-piridilmetil)iminodiacético, ácido 1,3­ fenilendinitrilotetraacético, etilendinitrilotetra(ácido 3-propanoico), ácido iminodiacético (IDA), derivados de IDA, ácido oxálico, ácido o,p-EDDHA (ácido etilendiamino-N-(o-hidroxifenilacético)-N-(p-hidroxifenilacético), o,o-EDDHA y p,p-EDDHA).

[0158] La tabla 3 muestra los logaritmos de la constante de estabilidad del ligando de magnesio y la constante de disociación ácida de algunos agentes quelantes sensibles al pH ejemplares no limitantes.

Tabla 3. Logaritmos de constantes de estabilidad de ligandos de magnesio y constantes de disociación ácida para agentes quelantes multidentados sensibles al pH ejemplares

Ligando sensible al pH log K pKal1 pKa2 pKa3 pKa4 pKa4

Etilenodinitrilotetra(ácido 3-propanoico) 1,81

Ácido 1,3-fenilendinitrilotetraacético 2

Ácido N-(2-piridilmetil)iminodiacético 4

EDDA (ácido etilendiiminodiacético) 4

Ácido etilendiiminodi-2-propanoico EDDM 2,8

(Ácido etilendiiminodipropanodioico) 4.9

Ácido DL-1-metiletilendinitrilotetraacético

N,N-diamida 5,1

Ácido DL-1-etiletilendinitrilotetraacético N,N

diamida 4.9

Ácido (2-hidroxitrimetileno)

dinitrilotetraacético 5,3

(continuación)

Ligando sensible al pH log K pKal1 pKa2 pKa3 pKa4 pKa4 ÁcidoDL-2-(2-metiltioetil)nitriloacético 1,5

EDTA (ácido etilendinitrilotetraacético) 8,8 1,5 2 2,69 6,13 10,4 EGTA (Ácido etileno bis(oxietilenonitrilo)

_{tetraacético)} 5,3 <2 2,7 8,8 9,5

IDA (ácido iminodiacético) 2,9 1,8 2,6 9,5

MIDA (ácido N-metiliminodiacético) 3,4 1,4 2,1 9,6

Ácido cítrico 3,4 3,1 4,8 6,4

NTA (ácido nitrilotriacético) 5,4 1,9 2,5 9,7

1Ka1 = [HL]/[H+][L], Ka2 = [H2L]/[H+][HL], Ka3 = [H3L]/[H+][H2L], Ka4 = = [H4L]/[H+][H3L], Ka5 = [H5L]/[H+][H4L].

2Los datos se compilan de Smith y Martell, 1976 y 2001; 2005 IUPAC , Pure and Applied Chemistry 77, 1445-1495; y Pure Appl. Chem., 1982, vol. 54, n.° 12, págs. 2693-2758.

[0159] En algunas realizaciones, el logaritmo de la constante de estabilidad para el complejo de ion magnesio y el agente quelante sensible al pH está entre 1 y 9 (por ejemplo, entre 2 y 9, entre 2 y 6 y entre 3 y 6).

[0160] En algunas realizaciones, la primera temperatura está entre 10 °C y 30 °C (por ejemplo, entre 10 °C y 15 °C, entre 15 °C y 20 °C, entre 20 °C y 25 °C o entre 25 °C y 30 °C). En algunas realizaciones, la segunda temperatura está entre 40 °C y 70 °C (por ejemplo, entre 40 °C y 50 °C, entre 50 °C y 60 °C, entre 60 °C y 70 °C).

[0161] En vista de la presente descripción, un experto en la materia puede seleccionar un par de uno o más tampónes sensibles a la temperatura y uno o más agentes quelantes dependientes del pH para proporcionar una cantidad deseada de unión a iones de magnesio a una primera temperatura y una segunda temperatura de modo que una o más reacciones enzimáticas en una reacción de amplificación de ácido nucleico se inhiban a la primera temperatura y se permitan a la segunda temperatura. Se describen algoritmos para ayudar en la predicción de unión a iones de magnesio y concentración de iones de magnesio libre en función de factores tales como el pH y la concentración de agente quelante dependiente del pH, por ejemplo, en Schoenmakers y col., 1992, Biotechniques, 12:870-874 y Fujishiro y col., 1995, Comput. Biol. Med., 25:61-80. Las versiones de dichos algoritmos se pueden obtener en www.ru.nl/organphy/chelator/Chel-main.html y maxchelator.stanford.edu.

[0162] En algunas realizaciones, la relación entre la concentración del agente quelante y la concentración del ion magnesio es de 0,1 a 10 (por ejemplo, 0,1 a 0,5, 0,2 a 1, 0,5 a 2, 1 a 5 o 2 a 10).

[0163] En algunas realizaciones, la concentración de iones de magnesio libre a la primera temperatura está entre 0 y 10 mM (por ejemplo, entre 0 y 0,1 mM, entre 0 y 0,2 mM, entre 0 y 0,5 mM, entre 0 y 1 mM, entre 0 y 2 mM o entre 0 y 5 mM).

[0164] En algunas realizaciones, la concentración de iones de magnesio libre a la segunda temperatura está entre 5 y 50 mM (por ejemplo, entre 5 y 10 mM, entre 5 y 20 mM, entre 10 y 20 mM o entre 10 y 50 mM).

[0165] Se conocen numerosas técnicas de amplificación isotérmica de ácido nucleico, que incluyen, por ejemplo, reacción de amplificación de corte y extensión (NEAR), amplificación de polimerasa recombinasa (RPA), amplificación de ácidos nucleicos iniciada por cebador isotérmico y quimérico (ICAN), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), amplificación mediada por señal de tecnología de ARN (SMART), amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), amplificación de círculo rodante (RCAT), reacción de amplificación de ligasa, amplificación isotérmica mediada por bucle de ADN (LAMP), amplificación de desplazamiento múltiple isotérmico, amplificación dependiente de helicasa (HDA), amplificación isotérmica de cebador único (SPIA) y amplificación dependiente de helicasa circular. También se puede usar la reacción en cadena de la polimerasa y sus variantes. Estas reacciones no isotérmicas típicamente utilizan ciclos térmicos para causar la separación de cadenas de ácido nucleico. Los procedimientos de amplificación isotérmica y no isotérmica se analizan, por ejemplo, en Gill y col., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 200827:224-243; Mukai y col., 2007, J. Biochem.

142:273-281; Van Ness y col., PNAS 2003100:4504-4509; Tan y col., Anal. Chem. 2005, 77:7984-7992; Lizard y col., Nature Biotech. 1998, 6:1197-1202; Mori y col., J. Infect. Chemother. 200915:62-69; Notomi y col., NAR 2000, 28:e63; y Kurn y col., Clin. Chem. 2005, 51:10, 1973-1981. Otros antecedentes para estas técnicas generales de amplificación incluyen, por ejemplo, las patentes estadounidenses n .° 7.112.423; 5.455.166; 5.712.124; 5.744.311; 5.916.779; 5.556.751; 5.733.733; 5.834.202; 5.354.668; 5.591.609; 5.614.389; y 5.942.391; y las publicaciones de patentes estadounidenses números US20030082590; US20030138800; US20040058378; US20060154286; US20090081670; y US 20090017453.

[0166] Las reacciones de amplificación anteriores utilizan típicamente una o más enzimas que requieren iones de magnesio divalentes como cofactor, por ejemplo, ADN polimerasas, endonucleasas de restricción de tipo II (por ejemplo, endonucleasas de tipo IIS o de corte), recombinasas (por ejemplo, RecA, UvsX), transcriptasas inversas, ARN polimerasas dirigidas por ADN, ARN polimerasas dirigidas por ^a Rⁿ , enzimas de ribonucleasa H o ADN ligasas. Por lo tanto, las reacciones se pueden inhibir cuando el ion magnesio libre se reduce por la acción de un agente quelante dependiente del pH.

[0167] Las reacciones de amplificación proporcionadas por esta descripción incluyen aquellas reacciones que se producen en condiciones sustancialmente isotérmicas. También se incluyen en esta descripción reacciones de amplificación en las que el polinucleótido no se desnaturaliza antes de combinarse con la mezcla de reactivos de amplificación. Adicionalmente, se proporcionan reacciones de amplificación en las que el polinucleótido se amplifica sin ciclos repetidos de la temperatura de la mezcla de reacción entre una primera temperatura y una segunda temperatura.

[0168] La amplificación del polinucleótido puede producirse sin reactivos adicionales agregados a la mezcla de reacción inicial formada a partir de la combinación del polinucleótido con una mezcla de reactivos de amplificación. Los polinucleótidos amplificados se pueden detectar, también en algunos casos sin reactivos adicionales agregados a la mezcla de reacción inicial.

[0169] NEAR es un procedimiento ejemplar para la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos. La reacción NEAR utiliza endonucleasas de corte (también conocidas como endonucleasas de restricción de corte o enzimas de corte) en combinación con una ADN polimerasa que desplaza la cadena para amplificar secuencias diana cortas. Los procedimientos NEAR se describen, por ejemplo, en los documentos US 2009/0017453 y US 2009/0081670.

[0170] RPA es un procedimiento ejemplar para la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos. RPA emplea enzimas conocidas como recombinasas que son capaces de emparejar cebadores de oligonucleótidos con secuencia homóloga en ADN dúplex. De esta manera, la síntesis de ADN se dirige a puntos definidos en un ADN diana de doble cadena. Usando dos cebadores específicos del gen, se inicia una reacción de amplificación exponencial si la secuencia diana está presente. La reacción progresa rápidamente y resulta en una amplificación específica de sólo unas pocas copias diana a niveles detectables. Los procedimientos RPA se describen, por ejemplo, en los documentos US 7.270.981; US 7.399.590; US 7.777.958; US 7.435.561; US 2009/0029421; y WO 2010/141940.

[0171] Los componentes de una reacción de amplificación isotérmica se pueden proporcionar en una solución y/o en forma seca (por ejemplo, liofilizada). Cuando uno o más de los componentes se proporcionan en forma seca, también se puede proporcionar un tampón de resuspensión o reconstitución (por ejemplo, un tampón sensible a la temperatura).

[0172] En función del tipo particular de reacción de amplificación, la mezcla de reacción puede contener tampónes (por ejemplo, un tampón sensible a la temperatura), sales, nucleótidos y otros componentes según sea necesario para que la reacción continúe.

[0173] El magnesio puede proporcionarse como una sal, tal como sulfato de magnesio y cloruro de magnesio. El magnesio, por ejemplo, en forma de una sal, también puede proporcionarse en una solución y/o en forma seca (por ejemplo, liofilizada). Cuando se reconstituye a partir de un tampón, una sal de magnesio liofilizada se disocia para formar iones de magnesio libres (Mg++) que están disponibles para actuar como un cofactor enzimático.

[0174] En algunas realizaciones, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o sustancialmente todos los iones divalentes, por ejemplo, iones de magnesio, en la mezcla de reacción están en forma soluble. Los iones divalentes solubilizados pueden estar libres o unidos de forma reversible a un agente quelante sensible al pH.

[0175] Se sabe que algunos iones divalentes en solución, por ejemplo, iones de magnesio en solución, pueden precipitarse como sólidos tras la adición de un ácido, por ejemplo, ácido fosfórico, a la solución. Esta reacción de precipitación se utiliza comúnmente en PCR de "arranque en caliente" para secuestrar, a temperatura ambiente, los iones de magnesio que se requieren para PCR. Al elevar la temperatura a 95 °C o más en la etapa de inicialización para PCR, se disuelven los precipitados de magnesio, liberando los iones de magnesio para que actúen como cofactores para enzimas.

[0176] En cualquiera de los procedimientos y composiciones de la invención, los iones divalentes (por ejemplo, iones de magnesio) en solución no se forman a partir de la disolución de un precipitado, tal como un precipitado de magnesio que se forma a partir de la precipitación de iones de magnesio en condiciones ácidas. En cualquier realización de los procedimientos y composiciones de la invención, la mezcla de reacción no incluye iones divalentes unidos en forma precipitada. En realizaciones adicionales, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 % o sustancialmente ninguno de los iones divalentes forma precipitados antes de la amplificación del polinucleótido. A los efectos de esta invención, un componente de la mezcla de reactivos que se proporciona en forma seca o liofilizada, tal como una sal de magnesio que se proporciona en forma liofilizada, no es un precipitado y una forma liofilizada no es una forma precipitada.

[0177] El ácido nucleico diana puede ser un ácido nucleico presente en un mamífero (por ejemplo, humano), una planta, un hongo (por ejemplo, una levadura), un protozoo, una bacteria o un virus. Por ejemplo, el ácido nucleico diana puede estar presente en el genoma de un organismo de interés (por ejemplo, en un cromosoma) o en un ácido nucleico extracromosómico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ARN, por ejemplo, un ARNm. En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana es ADN (por ejemplo, ADN de cadena doble). En realizaciones particulares, el ácido nucleico diana es específico para el organismo de interés, es decir, el ácido nucleico diana no se encuentra en otros organismos o no se encuentra en organismos similares al organismo de interés.

[0178] El ácido nucleico diana puede estar presente en una bacteria, por ejemplo, una bacteria Gram-positiva o Gram-negativa. Las especies bacterianas ejemplares no limitantes incluyen Acinetobacter sp. cepa ATCC 5459, Acinetobacter calcoaceticus, Aero- coccus viridans, Bacteroides fragilis, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Campylobacter jejuni, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Corynebacterium spp., Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterococcus gallinarum, Enterococcus faecium, Enterobacter faecalis (por ejemplo, ATCC 29212), Escherichia coli (por ejemplo, ATCC 25927), Gardnerella vaginalis, Helicobacterpylori, Haemophilus influenzae (por ejemplo, ATCC 49247), Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila (por ejemplo, ATCC 33495), Listeria monocytogenes (por ejemplo, ATCC 7648), Micrococcus sp. cepa ATCC 14396, Moraxella catarrhalis, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium fortuitum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Neisseria meningitis (por ejemplo, ATCC 6250), Neisseria gonorrhoeae, Oligella urethralis, Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa (por ejemplo, ATCC 10145), Propionibacterium acnes, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Salmonella sp. cepa ATCC 31194, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens (por ejemplo, ATCC 8101), Staphylococcus aureus (por ejemplo, ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (por ejemplo, ATCC 12228), Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pneumoniae (por ejemplo, ATCC 49619), Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae (por ejemplo, ATCC 13813), Treponema palliduma, Viridans estreptococos del grupo (por ejemplo, ATCC 10556), Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Francisella philomiragia (GAO1-2810), Francisella tularensis (LVSB), Yersinia pseudotuberculosis (PB1/+), Yersinia enterocolitica, serotipo O:9 y Yersinia pestis (P14-). En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana está presente en una especie de un género bacteriano seleccionado de Acinetobacter, Aerococcus, Bacteroides, Bordetella, Campylobacter, Clostridium, Corynebacterium, Chlamydia, Citrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Helicobacter, Haemophilus, Klebsiella, Legionella, Listeria, Micrococcus, Mobilincus, Moraxella, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Oligella, Pasteurella, Prevotella, Porphyromonas, Pseudomonas, Propionibacterium, Proteus, Salmonella, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema, Bacillus, Francisella o Yersinia. En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana se encuentra en Streptococcus del grupo A o Streptococcus del grupo B.

[0179] Los ácidos nucleicos diana clamidiales ejemplares incluyen secuencias que se encuentran en plásmidos crípticos clamidiales.

Los ácidos nucleicos diana de M. tuberculosis ejemplares incluyen secuencias que se encuentran en IS6110 (véase el documento US 5.731.150) y/o IS1081 (véase, por ejemplo, Bahador y col., 2005, Res. J. Agr. Biol. Sci., 1:142-145).

Los ácidos nucleicos diana de N. gonorrhea ejemplares incluyen secuencias que se encuentran en NGO0469 (véase, por ejemplo, Piekarowicz y col., 2007, BMC Microbiol., 7:66) y NGO0470.

Los ácidos nucleicos diana de Streptococcus del grupo A ejemplares incluyen secuencias que se encuentran en Spy1258 (véase, por ejemplo, Liu y col., 2005, Res. Microbiol., 156:564-567), Spy0193, lytA, psaA y ply (véase la publicación de solicitud de patente estadounidense n .° 2010/0234245).

Los ácidos nucleicos diana de Streptococcus del grupo B ejemplares incluyen secuencias que se encuentran en el gen cfb (véase, por ejemplo, Podbielski y col., 1994, Med. Microbiol. Immunol., 183:239-256).

[0180] En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ácido nucleico viral. Por ejemplo, el ácido nucleico viral se puede encontrar en el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), un virus de influenza (por ejemplo, un virus de influenza A, un virus de influenza B o un virus de influenza C) o un virus de dengue. Los ácidos nucleicos diana de VIH ejemplares incluyen secuencias que se encuentran en la región Pol.

[0181] En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ácido nucleico protozoario. Por ejemplo, el ácido nucleico protozoario se puede encontrar en Plasmodium spp., Leishmania spp., Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma brucei rhode-siense, Trypanosoma cruzi, Entamoeba spp., Toxoplasma spp., Trichomonas vaginalis y Giardia duodenalis.

[0182] En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ácido nucleico mamífero (por ejemplo, humano). Por ejemplo, el ácido nucleico de mamífero se puede encontrar en células tumorales circulantes, células epiteliales o fibroblastos.

[0183] En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ácido nucleico fúngico (por ejemplo, levadura). Por ejemplo, el ácido nucleico fúngico se puede encontrar en Candida spp. (por ejemplo, Candida albicans).

[0184] La detección del producto amplificado en cualquiera de los aspectos y realizaciones de la invención típicamente incluye el uso de sondas marcadas que son suficientemente complementarias e hibridan con el producto amplificado correspondiente al ácido nucleico diana. Por lo tanto, la presencia, cantidad e/o identidad del producto amplificado se puede detectar hibridando una sonda marcada, tal como una sonda marcada fluorescentemente, que es complementaria al producto amplificado. En algunas realizaciones, la detección de una secuencia de ácido nucleico diana de interés incluye el uso combinado de un procedimiento de amplificación isotérmica y una sonda marcada de modo que el producto se mida en tiempo real. En otra realización, la detección de una secuencia de ácido nucleico diana amplificada de interés incluye la transferencia del ácido nucleico diana amplificado a un soporte sólido, tal como una membrana, y sondear la membrana con una sonda, por ejemplo, una sonda marcada, que es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana amplificada. En otra realización más, la detección de una secuencia de ácido nucleico diana amplificada de interés incluye la hibridación de un ácido nucleico diana amplificado marcado con sondas que están dispuestas en un conjunto predeterminado con una ubicación direccionable y que son complementarias al ácido nucleico diana amplificado.

[0185] Típicamente, uno o más cebadores se utilizan en una reacción de amplificación. La amplificación de un ácido nucleico diana implica poner en contacto el ácido nucleico diana con uno o más cebadores que son capaces de hibridar y dirigir la amplificación del ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, la muestra se pone en contacto con un par de cebadores que incluyen un cebador directo e inverso que se hibridan con el nucleico diana.

[0186] La amplificación en tiempo real monitorea la fluorescencia emitida durante la reacción como un indicador de la producción de amplicones en oposición a la detección de puntos finales. El progreso en tiempo real de la reacción se puede ver en algunos sistemas. Típicamente, los procedimientos en tiempo real implican la detección de un reportero fluorescente. Típicamente, la señal del reportero fluorescente aumenta en proporción directa a la cantidad del producto de amplificación en una reacción. Al registrar la cantidad de emisión de fluorescencia en cada ciclo, es posible monitorear la reacción de amplificación durante la fase exponencial donde el primer aumento significativo en la cantidad de producto amplificado se correlaciona con la cantidad inicial de plantilla diana. Cuanto mayor sea el número de copias iniciales de la diana de ácido nucleico, más pronto se observa un aumento significativo en la fluorescencia.

[0187] En algunas realizaciones, las sondas marcadas fluorescentemente dependen de la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), o en un cambio en la longitud de onda de emisión de fluorescencia de una muestra, como un procedimiento para detectar la hibridación de una sonda de ADN con el ácido nucleico diana amplificado en tiempo real. Por ejemplo, EL FRET que se produce entre marcadores fluorogénicos en diferentes sondas (por ejemplo, usando HybProbes) o entre un fluoróforo y un inactivador no fluorescente en la misma sonda (por ejemplo, usando una baliza molecular o una sonda TAQMAN®) puede identificar una sonda que se hibrida específicamente con la secuencia de ADN de interés y de esta manera puede detectar la presencia y/o cantidad del ácido nucleico diana en una muestra. En algunas realizaciones, las sondas de ADN marcadas fluorescentemente utilizadas para identificar productos de amplificación tienen longitudes de onda de emisión espectralmente distintas, que permiten distinguirlas dentro del mismo tubo de reacción, por ejemplo, en reacciones multiplexadas. Por ejemplo, las reacciones multiplexadas permiten la detección simultánea de los productos de amplificación de dos o más ácidos nucleicos diana, tales como un ácido nucleico de control.

[0188] En algunas realizaciones, una sonda específica para el ácido nucleico diana se marca de forma detectable, ya sea con un marcador isotópico o no isotópico; en realizaciones alternativas, el ácido nucleico diana amplificado está marcado. La sonda se puede detectar como un indicador de la especie de ácido nucleico diana, por ejemplo, un producto amplificado de la especie de ácido nucleico diana. Los marcadores no nisotópicos pueden, por ejemplo, comprender una molécula fluorescente o luminiscente, o una enzima, cofactor, sustrato enzimático o hapteno. La sonda se puede incubar con una preparación de cadena simple o de cadena doble de ARN, ADN o una mezcla de ambos, y se puede determinar la hibridación. En algunos ejemplos, la hibridación da como resultado un cambio detectable en la señal, tal como en el aumento o disminución de la señal, por ejemplo, de la sonda marcada. Por lo tanto, detectar la hibridación puede incluir detectar un cambio en la señal de la sonda marcada durante o después de la hibridación con respecto a la señal del marcador antes de la hibridación.

[0189] En algunos procedimientos, el producto amplificado se puede detectar usando una tira de flujo. En algunas realizaciones, un marcador detectable produce un color y el segundo marcador es un epítopo que es reconocido por un anticuerpo inmovilizado o fragmento de anticuerpo. Un producto que contiene ambos marcadores se unirá a un anticuerpo inmovilizado y producirá un color en la ubicación del anticuerpo inmovilizado. Un ensayo basado en este procedimiento de detección puede ser, por ejemplo, una tira de flujo (varilla de inmersión) que se puede aplicar a toda la reacción de amplificación isotérmica. Una amplificación positiva producirá una banda en la tira de flujo como un indicador de amplificación del ácido nucleico diana, mientras que una amplificación negativa no produciría ninguna banda de color.

[0190] En algunas realizaciones, la cantidad (por ejemplo, número de copias) de un ácido nucleico diana puede cuantificarse aproximadamente usando los procedimientos descritos en esta invención. Por ejemplo, una cantidad conocida del ácido nucleico diana se puede amplificar en una reacción paralela y la cantidad de producto amplificado obtenido de la muestra se puede comparar con la cantidad de producto amplificado obtenido en la reacción paralela. En algunas realizaciones, varias cantidades conocidas del ácido nucleico diana se pueden amplificar en múltiples reacciones paralelas y la cantidad de producto amplificado obtenido de la muestra se puede comparar con la cantidad de producto amplificado obtenido en las reacciones paralelas. Suponiendo que el ácido nucleico diana en la muestra esté disponible de manera similar para los componentes de reacción como el ácido nucleico diana en las reacciones paralelas, la cantidad de ácido nucleico diana en la muestra se puede cuantificar aproximadamente usando estos procedimientos.

[0191] Los componentes de reacción para los procedimientos descritos en esta invención pueden suministrarse en forma de un kit para su uso en la detección de un ácido nucleico diana. En dicho kit, se proporciona una cantidad adecuada de uno o más componentes de reacción en uno o más recipientes o se mantiene en un sustrato (por ejemplo, mediante interacciones electrostáticas o unión covalente). También se puede proporcionar una sonda de ácido nucleico y/o cebador específico para un ácido nucleico diana. Los componentes de reacción, sonda de ácido nucleico y/o cebador se pueden suspender en una solución acuosa o como un polvo congelado en seco o liofilizado, pastilla o perla, por ejemplo. El recipiente o los recipientes en los que se suministran los componentes, etc. pueden ser cualquier recipiente convencional que sea capaz de contener la forma suministrada, por ejemplo, tubos de microfuga, ampollas, frascos o dispositivos de prueba integrales, tales como dispositivos fluídicos, cartuchos, flujo lateral u otros dispositivos similares. Los kits pueden incluir sondas de ácido nucleico marcadas o no marcadas para su uso en la detección de ácidos nucleicos diana. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir además instrucciones para usar los componentes en cualquiera de los procedimientos descritos en esta invención, por ejemplo, un procedimiento que utiliza una matriz bruta sin extracción y/o purificación de ácido nucleico.

[0192] En algunas aplicaciones, uno o más componentes de reacción pueden proporcionarse en cantidades de un solo uso pre-medidas en tubos individuales, típicamente desechables o recipientes equivalentes. Con dicha disposición, la muestra que se analizará para determinar la presencia de un ácido nucleico diana se puede agregar a los tubos individuales y la amplificación se puede llevar a cabo directamente.

[0193] La cantidad de un componente suministrado en el kit puede ser cualquier cantidad apropiada, y puede depender del mercado diana al que se dirige el producto. Las pautas generales para determinar las cantidades apropiadas se pueden encontrar, por ejemplo, en Joseph Sambrook y David W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; y Frederick M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 2003.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Reacciones de amplificación con EGTA

[0194] Se realizaron amplificaciones NEAR en condiciones de arranque en caliente con o sin quelación dependiente del pH agent_EGTA. Los ensayos se establecieron usando 0 o 100 copias de ARN viral de influenza A purificado y plantilla directa 150 nM, plantilla inversa 250 nM y sonda de baliza molecular 200 nM. Las secuencias de las plantillas y la sonda de baliza molecular fueron las siguientes: plantilla directa, 5'-AGACTCCACACGGAGTCTACTGACAGCCAGACA-3' (SEQ ID NO: 1); plantilla inversa, 5'-AGACTCCATATGGAGTCTTGATGGCCATCCGAA' (SEQ ID NO: 2); y sonda de baliza molecular, 5'-6-Fam-CTGGTAGCCAGGCA GCGACCAG-BHQ1-3' (SEQ ID NO: 3). Las reacciones se llevaron a cabo en las siguientes condiciones: Tris-Cl 100 mM (pH 7,9 a 20 °C), Na²SO⁴15 mM, (NH^SO ⁴15 mM MgSO⁴15 mM, EGTA 14 mM, DTT 1 mM, Triton X-100 al 0,1 %, 0,3 mM de cada dNTP, ADN polimerasa Bst 19,2 U y enzima de corte Nt.BstNBI 15 U. Los componentes del ensayo se combinaron a temperatura ambiente y se mantuvieron a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos, después de lo cual las reacciones se colocaron a 56 °C. Las reacciones se monitorizaron durante 10 minutos utilizando fluorescencia en tiempo real. La amplificación se observó solo en las reacciones que incluyeron tanto EGTA como 100 copias de ARN viral (figura 1).

[0195] Este ejemplo demuestra que la inclusión de un tampón sensible a la temperatura y un agente quelante dependiente del pH en una reacción de amplificación mejora la amplificación en condiciones de arranque en caliente. Ejemplo 2. Amplificación con EGTA y componentes liofilizados

[0196] Se realizaron reacciones NEAR en condiciones de arranque en caliente utilizando componentes liofilizados. A las pastillas de reacción liofilizadas, se agregaron 50 ml de tampón de reconstitución que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,75 a 20 °C), (NH⁴)²SO⁴ 15 mM, MgSO⁴15 mM y EGTA 15 mM. Los componentes de las pastillas liofilizadas incluyeron plantilla delantera 50 nM, plantilla inversa 750 nM, sonda de baliza molecular 300 nM, trehalosa 50 mM, manitol 225 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 8,5 a 20 °C), DTT 1 mM, Na²SO⁴5 mM, Tritón X-100 al 0,1 %, 0,3 mM de cada dNTP, SYBR Green I 0,2X, ADN polimerasa Manta 120 U y enzima de corte Nt.BstNBI 15 U en 50 ml después de la reconstitución. Las secuencias de las plantillas y la sonda de baliza molecular fueron las siguientes: plantilla directa, 5'- CGACTCCATGGA GTCCTCGTCAGACCCAAAA-3' (SEQ ID NO: 4), plantilla inversa, 5'-TGACTCCATATGGAGTCTCATCTTTCCGTCCCC-3' (SEQ ID NO: 5), y baliza molecular, 5'-Rox-TCGGGGCAGACCCAAAACCCCGA-BHQ2-3' (SEQ ID N^o : 6). La amplificación se realizó utilizando 20 o 200 copias de ADN genómico de Mycobacterium bovis BCG (cepa ATCC 190115). Las mezclas se mantuvieron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la incubación a temperatura ambiente, las reacciones se cambiaron a 56 °C y la reacción se monitorizó durante 40 minutos usando fluorescencia en tiempo real. Cuando EGTA estuvo presente en las reacciones, se observó amplificación significativa usando 20 o 200 copias de ADN plantilla en comparación con el control sin plantilla (figura 2).

[0197] Este ejemplo demuestra que, en condiciones de arranque en caliente, la inclusión de un tampón sensible a la temperatura y un agente quelante dependiente del pH en una reacción de amplificación permitió la amplificación.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento que comprende:

(a) combinar un polinucleótido y una mezcla de reactivos de amplificación a una primera temperatura para formar una mezcla de reacción, donde

(i) la mezcla de reactivos de amplificación comprende un agente quelante sensible al pH, iones divalentes, una endonucleasa de corte, una ADN o ARN polimerasa y un tampón sensible a la temperatura y

(ii) los iones divalentes se unen de forma reversible al agente quelante sensible al pH en solución a la primera temperatura de modo que no se produzca la amplificación del polinucleótido, y

(b) ajustar el pH de la mezcla de reacción cambiando la temperatura de la mezcla de reacción de la primera temperatura a una segunda temperatura para liberar los iones divalentes unidos de forma reversible, iniciando así la amplificación del polinucleótido;

donde la primera temperatura está entre 10 °C y 30 °C y la segunda temperatura está entre 40 °C y 70 °C.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el agente quelante sensible al pH se selecciona del grupo que consiste en: ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter) tetraacético (EGTA), derivados de EGTA, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y derivados de EDTA.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el ion divalente se selecciona del grupo que consiste en: magnesio, calcio, cobre, zinc, manganeso, hierro, cadmio y plomo.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el tampón sensible a la temperatura comprende tris(hidroximetil)aminometano.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, donde el tampón sensible a la temperatura tiene un ApKa de entre -0,04 °C 1 y -0,015 °C-1.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la primera temperatura está entre 20 °C y 30 °C y/o la segunda temperatura está entre 50 °C y 60 °C.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la mezcla de reactivos de amplificación comprende una transcriptasa inversa.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la mezcla de reactivos de amplificación comprende uno o más componentes en forma liofilizada y/o uno o más componentes de la mezcla de reactivos de amplificación se proporciona en un recipiente adecuado para su uso en un dispositivo fluídico, cartucho o dispositivo de flujo lateral.

9. Un procedimiento que comprende:

formar una mezcla que comprende:

(a) una muestra que comprende un polinucleótido diana y

(b) reactivos que comprenden un agente de unión, un ion unido por el agente de unión en solución, un tampón y reactivos de amplificación que comprenden al menos un componente que tiene una primera actividad en presencia del ion cuando el ion está unido por el agente de unión y una segunda actividad diferente en presencia del ion cuando el ion está libre del agente de unión; y

liberar una cantidad del ion del agente de unión suficiente para cambiar la actividad del al menos un componente de los reactivos de amplificación de la primera actividad a la segunda actividad mediante el aumento de la temperatura de la mezcla de una primera temperatura a una segunda temperatura,

donde el procedimiento se realiza sin ciclar la temperatura de la mezcla entre una temperatura más baja a la que se hibridan sustancialmente los polinucleótidos de cadena doble presentes en la mezcla y una segunda temperatura a la que se desnaturalizan sustancialmente los polinucleótidos de cadena doble presentes en la mezcla;

donde la primera temperatura está entre 10 °C y 30 °C y la segunda temperatura está entre 40 °C y 70 °C.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, donde la etapa de formación de la mezcla se realiza sin aumentar sustancialmente una temperatura de los reactivos por encima de una temperatura de los reactivos inmediatamente antes de la etapa de formación.1

11. El procedimiento de la reivindicación 10, donde la temperatura de los reactivos inmediatamente antes de la etapa de formación es aproximadamente la misma que la temperatura ambiente que rodea los reactivos.

12. El procedimiento de la reivindicación 9, donde el procedimiento se realiza sin poner en contacto la mezcla con (a) reactivos adicionales que participan en la amplificación y/o detección de la diana o (b) cualquier reactivo adicional, en cada caso después de que la temperatura de la mezcla se ha aumentado por encima de la primera temperatura.

13. El procedimiento de la reivindicación 9, donde la primera temperatura es una temperatura ambiente adyacente a la mezcla.

14. El procedimiento de la reivindicación 9, donde el agente de unión se selecciona del grupo que consiste en EGTA, derivados de EGTA, EDTA y derivados de EDTA.

15. El procedimiento de la reivindicación 9, donde el al menos un componente es una enzima de corte.

16. El procedimiento de la reivindicación 9, donde aumentar la temperatura de la mezcla de la primera temperatura a la segunda temperatura inicia la amplificación del polinucleótido diana.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, que comprende además detectar polinucleótidos amplificados después de que la temperatura de la mezcla aumenta de la primera temperatura a la segunda temperatura.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, donde la detección se realiza después de amplificar una cantidad del polinucleótido al menos 106 veces, al menos 107 veces, al menos 108 veces, al menos 109 veces, al menos 1010 veces, al menos 1011 veces, o al menos 1012 veces.

19. El procedimiento de la reivindicación 2, donde el agente quelante sensible al pH se selecciona del grupo que consiste en EGTA y derivados de EGTA.

20. El procedimiento de la reivindicación 14, donde el agente de unión se selecciona del grupo que consiste en EGTA y derivados de EGTA.