JP2019115344A - 核酸増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)標的を含む試料並びに(b)結合剤、結合剤によって結合したイオン、バッファー、及びイオンが結合剤によって結合しているときにイオンの存在下で第1の活性を有し、イオンが結合剤から遊離しているときにイオンの存在下で第2の異なる活性を有する少なくとも1つの構成成分を含む増幅試薬を含む試薬を含む混合物を形成するステップと、
第1の温度から第2の温度まで混合物の温度を増加させることによって、増幅試薬の少なくとも1つの構成成分の活性を第1の活性から第2の活性に変化させるのに十分な量のイオンを結合剤から放出するステップと
を含む方法を提供する。
この開示は、反応混合物中の二価イオンを可逆的に結合することによって、二価イオン補因子を必要とする酵素の活性を制御することができるという発見に少なくとも一部基づく。例示的な方法では、反応混合物は、酵素及び試薬混合物を組み合わせることによって調製され、反応混合物は溶液中で可逆的に結合した二価イオンを含む。次に、反応混合物のpHを調整して可逆的に結合した二価イオンを放出し、それによって酵素を活性化させる。
本開示を考慮すると、当業者は、用いる具体的な核酸増幅方法の特性に基づいて、第1の温度、第2の温度、温度感受性バッファーの条件、及びpH感受性キレート化剤を選択することができる。高い反応温度が必要とされる場合は、用いる酵素は好熱種(例えば、テルムス・アカティクス(Thermus aquaticus))から取り出すことができる。
pH依存性キレート化剤EGTAの有り無しで、NEAR増幅をホットスタート条件下で実施した。0又は100コピーの精製されたインフルエンザA型ウイルスRNA、及び150nMのフォワード鋳型、250nMのリバース鋳型、及び200nMの分子ビーコンプローブを用いてアッセイを設定した。鋳型及び分子ビーコンプローブの配列は、以下の通りであった:フォワード鋳型、5’−AGACTCCACACGGAGTCTACTGACAGCCAGACA−3’(配列番号1);リバース鋳型、5’−AGACTCCATATGGAGTCTTGATGGCCATCCGAA’(配列番号2);及び分子ビーコンプローブ、5’−6−Fam−CTGGTAGCCAGGCA GCGACCAG−BHQ1−3’(配列番号3)。以下の条件下で反応を実行した:100mMトリス−Cl(20℃でpH7.9)、15mM Na2SO4、15mM(NH4)2SO4、15mM MgSO4、14mM EGTA、1mM DTT、0.1% Triton X−100、0.3mMの各dNTP、19.2UのBst DNAポリメラーゼ及び15UのNt.BstNBIニッキング酵素。アッセイの構成成分を室温で組み合わせ、約20分の間室温に維持し、その後反応を56℃に置いた。リアルタイム蛍光を用いて反応を10分の間モニターした。EGTA及び100コピーのウイルスRNAを含む反応だけで、増幅を観察した(図1)。
凍結乾燥された構成成分を用いて、ホットスタート条件下でNEAR反応を実施した。凍結乾燥された反応ペレットに、50mMトリス−HCl(20℃でpH7.75)、15mM (NH4)2SO4、15mM MgSO4及び15mM EGTAを含有する50μLの再構成バッファーを加えた。凍結乾燥されたペレットからの構成成分は、再構成後の50μLに、50nMフォワード鋳型、750nMリバース鋳型、300nM分子ビーコンプローブ、50mMトレハロース、225mMマンニトール、50mMトリス−HCl(20℃でpH8.5)、1mM DTT、5mM Na2SO4、0.1% Triton X−100、0.3mMの各dNTP、0.2×SYBR Green I、120UのManta DNAポリメラーゼ及び15UのNt.BstNBIニッキング酵素を含んでいた。鋳型及び分子ビーコンプローブの配列は、以下の通りであった:フォワード鋳型、5’−CGACTCCATATGGA GTCCTCGTCAGACCCAAAA−3’(配列番号4)、リバース鋳型、5’−TGACTCCATATGGAGTCTCATCTTTCCGTCCCC−3’(配列番号5)、及び分子ビーコン、5’−Rox−TCGGGGCAGACCCAAAACCCCGA−BHQ2−3’(配列番号6)。マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)BCG(ATCC190115株)からの20又は200コピーのゲノムDNAを用いて増幅を実施した。混合物は、15分の間室温に保持した。室温でのインキュベーションの後、反応を56℃に移行し、リアルタイム蛍光を用いて反応を40分の間モニターした。EGTAが反応に存在したとき、鋳型なしの対照と比較して、20又は200コピーの鋳型DNAを用いて有意な増幅が観察された(図2)。
本発明のいくつかの実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な改変を加えることができることが理解されよう。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。
Claims (125)
- (a)ポリヌクレオチド及び増幅試薬混合物を組み合わせて、反応混合物を形成するステップであって、反応混合物が溶液中で可逆的に結合した二価イオンを含む、ステップと、
(b)可逆的に結合した二価イオンを放出するように反応混合物のpHを調整し、
それによってポリヌクレオチドの増幅を開始するステップと
を含む方法。 - 二価イオンが、マグネシウム、カルシウム、銅、亜鉛、マンガン、鉄、カドミウム及び鉛からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 二価イオンがマグネシウムである、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 増幅試薬混合物がpH感受性キレート化剤を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- pH感受性キレート化剤が、エチレングリコール−ビス(2−アミノエチルエーテル)四酢酸、EGTA誘導体及びEDTA誘導体からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 増幅試薬混合物が温度感受性バッファーを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 温度感受性バッファーがトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを含む、請求項6に記載の方法。
- 反応混合物のpHが温度感受性バッファーのpHに従って調整される、請求項6又は7に記載の方法。
- 反応混合物のpHが、第1の温度から第2の温度に反応混合物の温度を変化させることによって調整される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の温度での温度感受性バッファーのpKaが、第1の温度での温度感受性バッファーのpKaより少なくとも0.4低い、請求項9に記載の方法。
- 温度感受性バッファーが−0.04℃−1〜−0.015℃−1のΔpKaを有する、請求項6〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の温度が、約0℃〜約10℃、約10℃〜約20℃、又は約20℃〜約30℃である、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の温度が、約30℃〜約40℃、約40℃〜約50℃、約50℃〜約60℃、約60℃〜約70℃、約70℃〜約80℃、約80℃〜約90℃、又は約90℃〜約100℃である、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物がニッキングエンドヌクレアーゼを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物がDNA又はRNAポリメラーゼを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物が逆転写酵素を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- キレート化剤濃度対二価イオン濃度の比が約0.5〜約2である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の温度での遊離二価イオンの濃度が約0〜約10mMである、請求項9〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の温度での遊離二価イオンの濃度が約5mM〜約50mMである、請求項9〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物が凍結乾燥形態の1つ又は複数の構成成分を含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物が凍結乾燥形態のマグネシウム塩を含む、請求項20に記載の方法。
- 増幅試薬混合物が凍結乾燥形態のpH感受性キレート化剤を含む、請求項20に記載の方法。
- 凍結乾燥されたマグネシウム塩がバッファー中で再構成されて、溶液中でマグネシウムイオンを形成する、請求項21に記載の方法。
- 凍結乾燥されたpH感受性キレート化剤がバッファー中で再構成される、請求項22に記載の方法。
- 溶液中のマグネシウムイオンがpH感受性キレート化剤に可逆的に結合する、請求項23又は24に記載の方法。
- バッファーが温度感受性バッファーである、請求項23又は24に記載の方法。
- pH感受性キレート化剤が溶液中の遊離マグネシウムイオンに可逆的に結合するようにバッファーのpHが作動可能である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの増幅が実質的に等温条件下で起こる、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物と組み合わせる前にポリヌクレオチドが変性していない、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 組み合わせるステップが、約0℃〜約10℃、約10℃〜約20℃、又は約20℃〜約30℃の温度で実施される、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの増幅が、反応混合物の温度が約30℃〜約40℃、約40℃〜約50℃、約50℃〜約60℃、約60℃〜約70℃、約70℃〜約80℃、約80℃〜約90℃、又は約90℃〜約100℃になるまで起こらない、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの増幅が、第1の温度と第2の温度の間での反応混合物の温度の反復サイクルなしで起こる、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物の1つ又は複数の構成成分が、流体装置、カートリッジ又は側方流動装置での使用に適する容器で提供される、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの増幅が、組み合わせるステップ(a)で形成される反応混合物にさらなる試薬を加えずに起こる、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅されたポリヌクレオチドを検出するステップ(c)をさらに含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅されたポリヌクレオチドの検出が、組み合わせるステップ(a)で形成される反応混合物にさらなる試薬を加えずに起こる、請求項35に記載の方法。
- 反応混合物中の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%又は実質的に全ての二価イオンが可溶形態である、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 二価イオンがpH感受性キレート化剤に可逆的に結合する、請求項37に記載の方法。
- 二価イオンが遊離二価イオンを含む、請求項37に記載の方法。
- 二価イオンが結合した二価イオンと遊離二価イオンの両方を含む、請求項37に記載の方法。
- 溶液中の二価イオンが沈殿物の溶解から形成されない、請求項1〜40のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの増幅の前に、二価イオンの20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、1%未満が沈殿物を形成するか又は実質的にいずれも沈殿物を形成しない、請求項1〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅されたポリヌクレオチドの検出の前に、二価イオンの20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、1%未満が沈殿物を形成するか又は実質的にいずれも沈殿物を形成しない、請求項35に記載の方法。
- 反応混合物が、沈殿形態で結合した二価イオンを含まない、請求項1〜43のいずれか一項に記載の方法。
- (a)ポリヌクレオチド及び増幅試薬混合物を組み合わせて反応混合物を形成するステップであって、増幅試薬混合物が溶液中で可逆的に結合したマグネシウムイオン、温度感受性バッファー及びpH感受性キレート化剤を含む、ステップと、
(b)反応混合物の温度を、
(i)ポリヌクレオチドの増幅が阻害されるように、pH感受性キレート化剤が溶液中の遊離マグネシウムイオンに可逆的に結合するように温度感受性バッファーのpHが作動可能である第1の温度から、
(ii)ポリヌクレオチドの増幅が進行することができるように、結合したマグネシウムイオンをpH感受性キレート化剤から放出するように温度感受性バッファーのpHが作動可能である第2の温度に調整し、
それによってポリヌクレオチドの増幅を開始するステップと
を含む方法。 - pH感受性キレート化剤が、エチレングリコール−ビス(2−アミノエチルエーテル)四酢酸、EGTA誘導体及びEDTA誘導体からなる群から選択される、請求項45に記載の方法。
- 温度感受性バッファーがトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを含む、請求項45又は46に記載の方法。
- 第2の温度での温度感受性バッファーのpKaが、第1の温度での温度感受性バッファーのpKaより少なくとも0.4低い、請求項45〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 温度感受性バッファーが−0.04℃−1〜−0.015℃−1のΔpKaを有する、請求項45〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の温度が、約0℃〜約10℃、約10℃〜約20℃、又は約20℃〜約30℃である、請求項45〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の温度が、約30℃〜約40℃、約40℃〜約50℃、約50℃〜約60℃、約60℃〜約70℃、約70℃〜約80℃、約80℃〜約90℃、又は約90℃〜約100℃である、請求項45〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物がニッキングエンドヌクレアーゼを含む、請求項45〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物がDNA又はRNAポリメラーゼを含む、請求項45〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物が逆転写酵素を含む、請求項45〜53のいずれか一項に記載の方法。
- キレート化剤濃度対マグネシウムイオン濃度の比が約0.5〜約2である、請求項45〜54のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の温度での遊離マグネシウムイオンの濃度が約0〜約10mMである、請求項45〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の温度での遊離マグネシウムイオンの濃度が約5mM〜約50mMである、請求項45〜56のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物が凍結乾燥形態の1つ又は複数の構成成分を含む、請求項45〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物が凍結乾燥形態のマグネシウム塩を含む、請求項45〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物が凍結乾燥形態のpH感受性キレート化剤を含む、請求項45〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結乾燥されたマグネシウム塩がバッファー中で再構成されて、溶液中でマグネシウムイオンを形成する、請求項59に記載の方法。
- 凍結乾燥されたpH感受性キレート化剤がバッファー中で再構成される、請求項60に記載の方法。
- 溶液中のマグネシウムイオンがpH感受性キレート化剤に可逆的に結合する、請求項61に記載の方法。
- バッファーが温度感受性バッファーである、請求項61又は62に記載の方法。
- pH感受性キレート化剤が溶液中の遊離マグネシウムイオンに可逆的に結合するようにバッファーのpHが作動可能である、請求項61〜64のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの増幅が実質的に等温条件下で起こる、請求項45〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物と組み合わせる前にポリヌクレオチドが変性していない、請求項45〜66のいずれか一項に記載の方法。
- 組み合わせるステップが、約0℃〜約10℃、約10℃〜約20℃、又は約20℃〜約30℃の温度で実施される、請求項45〜67のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの増幅が、反応混合物の温度が約30℃〜約40℃、約40℃〜約50℃、約50℃〜約60℃、約60℃〜約70℃、約70℃〜約80℃、約80℃〜約90℃、又は約90℃〜約100℃になるまで起こらない、請求項45〜68のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの増幅が、第1の温度と第2の温度の間での反応混合物の温度の反復サイクルなしで起こる、請求項45〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅試薬混合物の1つ又は複数の構成成分が、流体装置、カートリッジ又は側方流動装置での使用に適する容器で提供される、請求項45〜70のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの増幅が、組み合わせるステップ(a)で形成される反応混合物にさらなる試薬を加えずに起こる、請求項45〜71のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅されたポリヌクレオチドを検出するステップ(c)をさらに含む、請求項45〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅されたポリヌクレオチドの検出が、組み合わせるステップ(a)で形成される反応混合物にさらなる試薬を加えずに起こる、請求項73に記載の方法。
- 反応混合物中の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%又は実質的に全てのマグネシウムイオンが可溶形態である、請求項45〜74のいずれか一項に記載の方法。
- マグネシウムイオンがpH感受性キレート化剤に可逆的に結合する、請求項75に記載の方法。
- マグネシウムイオンが遊離マグネシウムイオンを含む、請求項75に記載の方法。
- マグネシウムイオンが、結合したマグネシウムイオンと遊離マグネシウムイオンの両方を含む、請求項75に記載の方法。
- 溶液中のマグネシウムイオンが沈殿物の溶解から形成されない、請求項45〜78のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの増幅の前に、マグネシウムイオンの20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、1%未満が沈殿物を形成するか又は実質的にいずれも沈殿物を形成しない、請求項45〜79のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅されたポリヌクレオチドの検出の前に、マグネシウムイオンの20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、1%未満が沈殿物を形成するか又は実質的にいずれも沈殿物を形成しない、請求項73に記載の方法。
- 反応混合物が、沈殿形態で結合したマグネシウムイオンを含まない、請求項45〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬及び溶液中のpH依存性の可逆的に結合したマグネシウムイオンを含む組成物。
- 温度感受性バッファー及びpH感受性キレート化剤をさらに含む、請求項83に記載の組成物。
- 温度感受性バッファーがトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを含む、請求項84に記載の組成物。
- 温度感受性バッファーが−0.04℃−1〜−0.015℃−1のΔpKaを有する、請求項84又は85に記載の組成物。
- pH感受性キレート化剤がエチレングリコール−ビス(2−アミノエチルエーテル)四酢酸である、請求項84〜86のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬がニッキングエンドヌクレアーゼを含む、請求項83〜87のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬がDNA又はRNAポリメラーゼを含む、請求項83〜88のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬が逆転写酵素を含む、請求項83〜89のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬がリコンビナーゼを含む、請求項83〜90のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬が凍結乾燥形態の1つ又は複数の構成成分を含む、請求項83〜91のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬が凍結乾燥形態のマグネシウム塩を含む、請求項83〜92のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬が凍結乾燥形態のpH感受性キレート化剤を含む、請求項83〜93のいずれか一項に記載の組成物。
- 凍結乾燥されたマグネシウム塩がバッファー中で再構成されて、溶液中でマグネシウムイオンを形成する、請求項93に記載の組成物。
- 凍結乾燥されたpH感受性キレート化剤がバッファー中で再構成される、請求項94に記載の組成物。
- バッファーが温度感受性バッファーである、請求項95又は96に記載の組成物。
- 溶液中のマグネシウムイオンが沈殿物の溶解から形成されない、請求項83〜97のいずれか一項に記載の組成物。
- 沈殿形態で結合したマグネシウムイオンを含まない、請求項83〜98のいずれか一項に記載の組成物。
- 1つ又は複数の構成成分が、流体装置、カートリッジ又は側方流動装置での使用に適する容器で提供される、請求項83〜99のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬、温度感受性バッファー、pH感受性キレート化剤及びマグネシウム塩を含む組成物。
- 温度感受性バッファーがトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを含む、請求項101に記載の組成物。
- 温度感受性バッファーが−0.04℃−1〜−0.015℃−1のΔpKaを有する、請求項101又は102に記載の組成物。
- pH感受性キレート化剤がエチレングリコール−ビス(2−アミノエチルエーテル)四酢酸である、請求項101〜103のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬がニッキングエンドヌクレアーゼを含む、請求項101〜104のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬がDNA又はRNAポリメラーゼを含む、請求項101〜105のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬が逆転写酵素を含む、請求項101〜106のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬がリコンビナーゼを含む、請求項101〜107のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸増幅のための1つ又は複数の試薬が凍結乾燥形態の1つ又は複数の構成成分を含む、請求項101〜108のいずれか一項に記載の組成物。
- マグネシウム塩が凍結乾燥形態である、請求項101〜109のいずれか一項に記載の組成物。
- pH感受性キレート化剤が凍結乾燥形態である、請求項101〜110のいずれか一項に記載の組成物。
- 凍結乾燥されたマグネシウム塩がバッファー中で再構成されて、溶液中のマグネシウムイオンを形成する、請求項110に記載の組成物。
- 凍結乾燥されたpH感受性キレート化剤がバッファー中で再構成される、請求項111に記載の組成物。
- バッファーが温度感受性バッファーである、請求項112又は113に記載の組成物。
- 溶液中のマグネシウムイオンが沈殿物の溶解から形成されない、請求項112に記載の組成物。
- 沈殿形態で結合したマグネシウムイオンを含まない、請求項101〜115のいずれか一項に記載の組成物。
- 1つ又は複数の構成成分が、流体装置、カートリッジ又は側方流動装置での使用に適する容器で提供される、請求項101〜116のいずれか一項に記載の組成物。
- (a)酵素及び試薬混合物を組み合わせて反応混合物を形成するステップであって、反応混合物は溶液中で可逆的に結合した二価イオンを含む、ステップと、
(b)可逆的に結合した二価イオンを放出するように反応混合物のpHを調整し、
それによって酵素を活性化させるステップと
を含む方法。 - 二価イオンが、マグネシウム、カルシウム、銅、亜鉛、マンガン、鉄、カドミウム及び鉛からなる群から選択される、請求項118に記載の方法。
- 試薬混合物がpH感受性キレート化剤を含む、請求項118又は119に記載の方法。
- 試薬混合物が温度感受性バッファーを含む、請求項118〜120のいずれか一項に記載の方法。
- 反応混合物のpHが温度感受性バッファーのpHに従って調整される、請求項121に記載の方法。
- 反応混合物のpHが、第1の温度から第2の温度に反応混合物の温度を変化させることによって調整される、請求項118〜122のいずれか一項に記載の方法。
- 酵素がDNA又はRNAポリメラーゼである、請求項118〜123のいずれか一項に記載の方法。
- 酵素がニッキングエンドヌクレアーゼである、請求項118〜123のいずれか一項に記載の方法。
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