CN101983245B - 判断是否已适当进行非甲基化胞嘧啶转化处理的试剂盒和方法及用其分析甲基化dna的方法 - Google Patents
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Abstract
用由数条引物组成的第一引物组和由数条引物组成的第二引物组判断非甲基化胞嘧啶转化处理是否成功，其中，第一引物组的数条引物与作为非甲基化胞嘧啶转化处理的目标的生物体DNA的碱基序列中由不含胞嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物组的数条引物与通过将含胞嘧啶而不含CpG位点的生物体DNA碱基序列中的胞嘧啶转化为胞嘧啶以外碱基而获得的碱基序列构成的核酸杂交。
Description
技术领域：
本发明涉及一种判断是否已适当进行非甲基化胞嘧啶转化处理的试剂盒及方法以及用其分析甲基化DNA的分析方法。
背景技术：
在人类等高等真核生物的染色体DNA中，由CG双核苷酸序列构成的CpG部位的胞嘧啶常会被甲基化。此CpG部位的胞嘧啶甲基化起到了调控基因表达的作用。比如，在基因启动子区有含有大量CpG部位的区域，此基因启动子区中有无胞嘧啶甲基化，控制着该基因从DNA转录的开与关。
通过DNA的甲基化来控制基因表达在早期胚胎发育、组织特异性基因表达、基因印记、X染色体失活、染色体稳定化、DNA复制的分型等事件上发挥着重要作用。有报告称DNA甲基化有可能强烈参与癌症等疾病。
分析所述DNA甲基化的方法一般常用甲基化特异性PCR法和亚硫酸氢盐测序法。这些方法都是进行用可将非甲基化胞嘧啶转化成其他碱基的试剂(非甲基化胞嘧啶转化剂)亚硫酸氢盐将待分析DNA的未被甲基化的胞嘧啶(非甲基化胞嘧啶)转化成其他碱基的处理(非甲基化胞嘧啶转化处理)。甲基化特异性PCR法用非甲基化胞嘧啶转化处理后的DNA，分别通过胞嘧啶转化成其他碱基时的引物组及胞嘧啶未转化成其他碱基时的引物组，进行聚合酶链式反应，调查有无扩增产物，以此分析DNA的甲基化。
因此，在甲基化特异性PCR法和亚硫酸氢盐测序法中，如果非甲基化胞嘧啶转化处理未适当进行，就不能正确检出甲基化DNA。为此，判断非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行，在正确检出甲基化DNA上很有必要。
专利文献1中公开了一种确认是否适当进行重亚硫酸盐处理的引物，该引物基于不含CG序列的区域设计，且有将碱基序列中胞嘧啶转化为胸腺嘧啶的碱基序列。
专利文献1：专利公开2005-58217号公报
发明内容：
本发明的目的之一是提供一种能够正确判断是否适当进行非甲基化胞嘧啶转化处理的试剂盒及方法。本发明的另一目的是提供一种能够准确、高效地分析甲基化DNA的甲基化DNA分析方法。
即本发明涉及：
(1)一种用于判断是否适当进行了将非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的非甲基化胞嘧啶转化处理的试剂盒，该试剂盒包括：
第一引物组，由数条引物构成，其中所述数条引物与非甲基化胞嘧啶转化处理的目标-生物体DNA的碱基序列中由不含胞嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交，
第二引物组，由数条引物构成，其中所述数条引物与通过将含胞嘧啶而不含CpG位点的生物体DNA碱基序列中的胞嘧啶转化为胞嘧啶以外碱基而获得的碱基序列构成的核酸杂交；
(2)上述(1)所述试剂盒，其特征在于：所述不含胞嘧啶的碱基序列和所述含胞嘧啶而不含CpG位点的碱基序列是存在于所述生物体的同一染色体上的碱基序列；
(3)上述(2)所述试剂盒，其特征在于：所述不含胞嘧啶的碱基序列和所述含胞嘧啶而不含CpG位点的碱基序列在所述生物体DNA的碱基序列中均包含在300bp以内的碱基序列中；
(4)上述(2)或(3)所述试剂盒，其特征在于：第一引物组所含至少一条引物与使用第二引物组的核酸扩增所扩增的核酸杂交；
(5)上述(2)或(3)所述试剂盒，其特征在于：第二引物组所含至少一条引物与使用第一引物组的核酸扩增所扩增的核酸中由胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的碱基序列构成的核酸杂交；
(6)上述(1)所述试剂盒，其特征在于：非甲基化胞嘧啶转化处理是用亚硫酸氢盐对DNA进行处理；
(7)上述(1)所述试剂盒，其特征在于：胞嘧啶以外的碱基是尿嘧啶；
(8)上述(1)所述试剂盒，其特征在于：所述生物体DNA是人类基因组DNA；
(9)上述(1)所述试剂盒，其特征在于：所述生物体DNA包含癌细胞的DNA；
(10)上述(1)所述试剂盒，其特征在于：第一引物组包括由序列号：1所示碱基序列构成的引物和由序列号：2所示碱基序列构成的引物；
(11)上述(1)所述试剂盒，其特征在于：第二引物组包括由序列号：3所示碱基序列构成的引物和由序列号：4所示碱基序列构成的引物；
(12)一种判断使非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行的方法，包括以下步骤：
(A)将试样中所含生物体DNA的非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基，获得非甲基化胞嘧啶转化试样，
(B)进行以下(i)、(ii)所述核酸扩增反应：
(i)用上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样和数条引物组成的第一引物组进行核酸扩增反应，其中所述数条引物与上述生物体DNA的碱基序列中由不含胞嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交，
(ii)用上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样和数条引物组成的第二引物组进行核酸扩增反应，所述数条引物与通过将含胞嘧啶而不含CpG位点的生物体DNA碱基序列中的胞嘧啶转化为胞嘧啶以外碱基而获得的碱基序列构成的核酸杂交；
(C)测定上述步骤(B)的核酸扩增反应(i)所获得的扩增产物数量和核酸扩增反应(ii)所获得的扩增产物数量，
(D)根据上述步骤(C)所得测定结果，算出在上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样所含所有核酸中、所述生物体DNA的非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的核酸的比例，及
(E)根据上述步骤(D)所得计算结果，判断上述步骤(A)是否适当进行；
(13)一种甲基化DNA的分析方法，包括以下步骤：
(A)将试样中所含生物体DNA的非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基，获得非甲基化胞嘧啶转化试样，
(B)进行以下(i)、(ii)所述核酸扩增反应：
(i)用上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样和数条引物组成的第一引物组进行核酸扩增反应，其中所述数条引物与上述生物体DNA的碱基序列中由不含胞嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交，
(ii)用上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样和数条引物组成的第二引物组进行核酸扩增反应，所述数条引物与通过将含胞嘧啶而不含CpG位点的生物体DNA碱基序列中的胞嘧啶转化为胞嘧啶以外碱基而获得的碱基序列构成的核酸杂交，
(C)测定上述步骤(B)的核酸扩增反应(i)所获得的扩增产物数量和核酸扩增反应(ii)所获得的扩增产物数量，
(D)根据上述步骤(C)所得测定结果，算出在上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样所含所有核酸中、所述生物体DNA的非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的核酸的比例，及
(E)根据上述步骤(D)所得计算结果，判断上述步骤(A)是否适当进行，
(F)当在上述步骤(E)判断上述步骤(A)适当进行时，用在上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样分析甲基化DNA。
附图说明：
图1为本发明的判断方法一实施方式的流程图。
图2为本发明的分析方法一实施方式的流程图。
图3为在实施例1算出分析试样中所有核酸所含转化核酸的比例的计算结果图。
图4(A)为序列号：7所示碱基序列中核酸量确认用引物组1和转化处理确认用引物组2的各引物结合区域的简要说明图。(B)为序列号：8所示碱基序列中核酸量确认用引物组1和转化处理确认用引物组2的各引物结合区域的简要说明图。
图5为在试验例1算出分析试样中所有核酸所含转化核酸的比例的计算结果图。
图6为在实施例2算出分析试样中所有核酸所含转化核酸的比例的计算结果图。
图7为在实施例3算出分析试样中所有核酸所含转化核酸的比例的计算结果图。
具体实施方式：
本发明在一个层面涉及一种判断使非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行的试剂盒，该试剂盒包含第一引物组和第二引物组，其中第一引物组由多条引物组成，所述多条引物与进行非甲基化胞嘧啶转化处理目标-生物体DNA的碱基序列中由不含胞嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交；第二引物组，由多条引物构成，所述数条引物与通过将含胞嘧啶而不含CpG位点的生物体DNA碱基序列中的胞嘧啶转化为胞嘧啶以外碱基而获得的碱基序列构成的核酸杂交。
本发明的试剂盒含有上述第一引物组和第二引物组。上述第一引物组能够实际上不受非甲基化胞嘧啶转化处理影响地正确求出有关非甲基化胞嘧啶转化试样中所有核酸数量的信息。上述第二引物组能够正确求出有关上述非甲基化胞嘧啶转化试样的所有核酸中由于非甲基化胞嘧啶转化处理而使非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的核酸数量的信息。。因此，本发明的试剂盒因为能够正确求出在全部核酸中非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的核酸的比例，故能够正确判断非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行，效果卓越。
在本说明书中，所谓“甲基化胞嘧啶”指胞嘧啶的5位被甲基化的胞嘧啶。所谓“非甲基化胞嘧啶”指胞嘧啶的5位未被甲基化的胞嘧啶。
在本说明书中，胞嘧啶以外的碱基比如有尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤等。在后述用亚硫酸氢盐进行非甲基化胞嘧啶转化处理中，所述胞嘧啶以外的碱基为尿嘧啶。
在本说明书中，所谓“非甲基化胞嘧啶转化处理”指使DNA所含非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的处理。非甲基化胞嘧啶转化处理通过使让非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的非甲基化转化剂与DNA接触来进行。下面将经上述非甲基化胞嘧啶转化处理，非甲基化胞嘧啶转化成胞嘧啶以外的碱基的核酸也称为转化核酸。
在本说明书中，所谓“非甲基化胞嘧啶转化试样”指经非甲基化胞嘧啶转化处理获得的试样。非甲基化胞嘧啶转化剂无特别限定，只要是能将非甲基化胞嘧啶转化成胞嘧啶以外的碱基的试剂即可。比如有亚硫酸氢盐类等。亚硫酸氢盐类包括亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾等。当使用亚硫酸氢盐作为非甲基化胞嘧啶转化剂时，非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。
在本说明书中，生物体DNA只要是从生物体配制的DNA即可，无特别限定。生物体DNA可以由从血液、淋巴细胞、尿液及活检摘取的组织等配制。在本发明中，所述生物体DNA以人的基因组DNA为宜，特别以癌细胞的DNA为佳。癌细胞的DNA中往往可以观察到DNA甲基化异常。通过上述非甲基化胞嘧啶转化处理检测DNA甲基化异常时，如果使用本发明的试剂盒就可以确认上述非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行，从而可以更正确地分析癌细胞DNA的甲基化DNA。
在本说明书中，所谓“杂交”指引物在严格(stringent)条件下与核酸杂交。引物与核酸杂交的状态是引物与核酸在互补型碱基序列退火的状态。通过引物与核酸杂交可以达到更适于进行核酸扩增反应的状态。在此，所谓“严格条件”指进行多核苷酸的杂交、即引物与靶核酸的杂交时该行业人士通常使用的条件。更具体而言，只要是第一引物和第二引物能够与非甲基化胞嘧啶转化处理后的生物体DNA杂交的条件即可，无特别限定。杂交时的严格度已知有温度、盐浓度、引物链长、引物碱基序列的GC含量及杂交缓冲液中的离液剂浓度的函数。严格条件可以使用如Sambrook，J.et al.(1998)分子克隆：实验室手册(第二版)冷泉港实验室，纽约[Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.)，ColdSpringHarborLaboratory Press，NewYork]上记述的条件等。
第一引物组和第二引物组是通过核酸扩增反应使核酸扩增的引物组。核酸扩增反应可以通过核酸扩增法进行。这种核酸扩增法只要是能定量测定扩增产物量的方法即可，无特别限定。上述核酸扩增法比如可以列举出聚合酶链式反应(PCR)法、链置换反应法、连接酶链反应(LCR)法及转录扩增法等。PCR法可以用通用手法实施。链置换反应法比如有LAMP法、ICAN(注册商标)法及SMAP法等。转录扩增法比如有TAS法等。此外，在用第一引物组进行的核酸扩增反应和用第二引物组进行的核酸扩增反应中，经亚硫酸氢盐的非甲基化胞嘧啶转化处理产生的尿嘧啶可变为胸腺嘧啶。
第一引物组和第二引物组可根据所用核酸扩增法的种类，以公认的方法设计。比如将后述各引物组的条件输入市场出售的引物设计用软件中，可以很容易地设计出各引物组。设计用于定量PCR法--实时PCR法的引物组的软件，比如有GENETYX和primer3等。设计用于链置换反应法-LAMP法的引物组的软件比如有Primer Explorer等。通过以公认方法合成由所设计的碱基序列构成的寡核苷酸，即可获得各引物组的引物。组成各引物组的引物数因所用核酸扩增法的种类而不同。比如如果是聚合酶链式反应法的话，各引物组分别由二条引物构成。如果是LAMP法的话，则各引物组分别至少由四条引物构成。
当所述引物组是用于PCR法的引物组时，正向引物和反向引物的Tm值的差最好在2℃以内。引物组的各引物的碱基序列的GC含量最好在40-60％。引物组的一条引物的碱基序列中鸟嘌呤最好未连续四个以上。引物组的各引物长度最好为10-40核苷酸长，15-35核苷酸长更好。用这种引物组进行PCR法时，PCR时的退火温度最好设定为接近引物组各引物的Tm的温度。
本发明中的第一引物组由多条引物构成，这些引物与进行非甲基化胞嘧啶转化处理目标-生物体DNA的碱基序列中由不含胞嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交。由不含胞嘧啶的碱基序列构成的核酸不存在经非甲基化胞嘧啶转化处理而转化的胞嘧啶，碱基序列不会转化。因此，第一引物组所含引物可不受非甲基化胞嘧啶转化处理的影响地与上述核酸杂交。因此，以非甲基化胞嘧啶转化试样所含核酸为模板，测定用第一引物组进行核酸扩增反应所获得的扩增产物量，可以获得有关非甲基化胞嘧啶转化试样所含全部核酸量的正确信息。当生物体DNA使用的是人类基因组DNA时，具体的第一引物组比如可列举出包含序列号：1所示碱基序列构成的引物和序列号：2所示碱基序列构成的引物的引物组等。
本发明中的第二引物组由多条引物构成，其中所述数条引物与通过将含胞嘧啶而不含CpG位点的生物体DNA碱基序列中的胞嘧啶转化为胞嘧啶以外碱基而获得的碱基序列构成的核酸杂交。如上所述，胞嘧啶的甲基化发生在CpG位点的胞嘧啶中，因此，在生物体DNA中，含胞嘧啶而不含CpG位点的碱基序列不会含有甲基化胞嘧啶。因此，由含胞嘧啶而不含CpG位点的碱基序列构成的生物体DNA经非甲基化胞嘧啶转化处理，所有胞嘧啶转化成胞嘧啶以外的碱基，碱基序列发生转化。由此，第二引物组中所含引物可以与因非甲基化胞嘧啶转化处理，杂交目标-生物体DNA的胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的核酸互补性杂交。但是，对于杂交目标-生物体DNA的胞嘧啶未转化为胞嘧啶以外的碱基的核酸，第二引物组中所含引物不能与胞嘧啶未转化为胞嘧啶以外的碱基的部分互补性杂交。结果，当因非甲基化胞嘧啶转化处理，杂交目标-生物体DNA的胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基时，用第二引物组与非甲基化胞嘧啶转化试样进行核酸扩增反应会有效地生成扩增产物。另一方面，当杂交目标-生物体DNA的胞嘧啶未转化为胞嘧啶以外的碱基时，不能有效地生物扩增产物。据此，可以非甲基化胞嘧啶转化试样所含核酸为模板，测定用第二引物组进行核酸扩增反应所获得的扩增产物量，以获得有关非甲基化胞嘧啶转化试样所含转化核酸数量的正确信息。当生物体DNA使用的是人类基因组DNA时，具体的第二引物组比如可列举出包含序列号：3所示碱基序列构成的引物和序列号：4所示碱基序列构成的引物的引物组等。
第二引物组的引物的3’末端一侧序列、最好3’末端与通过非甲基化胞嘧啶转化处理而转化的碱基互补。引物的3’末端一侧如果存在与作为模板的核酸非互补的部分，则核酸扩增反应的效率下降。即如果将第二引物组的引物的3’末端一侧设计为与经非甲基化胞嘧啶转化处理而转化的碱基互补，当以生物体DNA的胞嘧啶未转化成胞嘧啶以外的碱基的核酸为模板时，核酸扩增反应的效率就会降低。因此，采用第二引物组，可以使核酸扩增反应以非甲基化胞嘧啶转化试样所含转化核酸为模板，更具特异性。结果，使用有如上设计的引物的第二引物组进行核酸扩增，通过测定所获得的扩增产物数量，就可以获取更正确的有关非甲基化胞嘧啶转化试样中所含转化核酸数量的信息。
在癌细胞中，有时会发生一部分染色体数量异常增加的染色体异常。因此，如果第一引物组及第二引物组是分别以对不同染色体DNA进行非甲基化胞嘧啶转化处理所获得的核酸为模板的话，可能无法正确判断非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行。因此，最好对所述生物体的同一染色体的DNA进行非甲基化胞嘧啶转化处理，将该处理获得的核酸作为第一引物组及第二引物组双方的模板。即，在本发明中，生物体DNA的碱基序列中不含胞嘧啶的碱基序列和所述生物体DNA中含胞嘧啶而不含CpG位点的碱基序列最好是在该生物体的同一染色体上存在的碱基序列。如此，当第一引物组及第二引物组是以来自同一染色体的核酸为模板的引物组时，即使所用核酸是引起染色体数量异常的癌细胞DNA进行非甲基化胞嘧啶转化处理所获得的核酸，也能够正确判断非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行。
在癌细胞中，有时会发生其他染色体异常，比如缺失、倒位、特定序列的复制数增减等。因此，如果第一引物组及第二引物组其中之一的模板核酸来源于引起染色体异常的区域的话，可能无法正确判断非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行。因此，最好第一引物组及第二引物组在核酸扩增反应中以非甲基化胞嘧啶转化试样所含核酸中相互邻近的区域为模板。具体而言，在非甲基化胞嘧啶转化处理目标的生物体DNA的碱基序列中，最好在300bp以内的碱基序列内包含与第一引物组所含至少一条引物有互补性的、不含上述胞嘧啶的碱基序列以及与第二引物组所含至少一条引物有互补性的、含有上述胞嘧啶而不含CpG位点的碱基序列中由胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的碱基序列。即，在非甲基化胞嘧啶转化试样所含核酸的碱基序列中，最好在300bp以内的碱基序列内包含与第一引物组所含至少一条引物杂交的碱基序列以及与第二引物组所含至少一条引物杂交的碱基序列。
在用第一引物组进行核酸扩增所扩增的核酸与用第二引物组进行核酸扩增所扩增的核酸之间有重复区域，可以进一步减少染色体异常对判断非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行的影响。即，最好用非甲基化胞嘧啶转化试样和第一引物组进行核酸扩增时所扩增的核酸的碱基序列与用非甲基化胞嘧啶转化试样和第二引物组进行核酸扩增时所扩增的核酸的碱基序列中存在同一碱基序列。更具体地说就是最好：
[1]第一引物组所含至少一条引物是能与用第二引物组进行核酸扩增时所扩增的核酸杂交的引物；
[2]第二引物组所含至少一条引物是能与用第一引物组进行核酸扩增时所扩增的核酸的胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的碱基序列构成的核酸杂交的引物。
在本发明的试剂盒中，第一引物组的各引物及第二引物组的各引物可以分别装在不同的容器中提供。引物可以以干燥状态提供，也可以以溶解于溶剂中的状态提供。溶解引物的溶剂可列举出无核酸酶纯水(比如PCR级水)以及适于使核酸保持稳定的缓冲液。适于使核酸保持稳定的缓冲液比如有经热处理、使核酸酶及微生物等失活的TE缓冲液[组分：10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mM EDTA]等。
本发明试剂盒所包含的第一引物组及第二引物组非常适合用于判断非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行。本发明还包括用该第一引物组和第二引物组判断是否适当进行了非甲基化胞嘧啶转化处理的方法。
本发明的判断是否适当进行了非甲基化胞嘧啶转化处理的方法(以下也称“本发明的判断方法”)其特征在于包括以下步骤：
(A)将试样中所含生物体DNA的非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基，获得非甲基化胞嘧啶转化试样，
(B)进行以下(i)、(ii)所述核酸扩增反应：
(i)用上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样和数条引物组成的第一引物组进行核酸扩增反应，其中所述数条引物与上述生物体DNA的碱基序列中由不含胞嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交，
(ii)用上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样和数条引物组成的第二引物组进行核酸扩增反应，其中所述数条引物与通过将含胞嘧啶而不含CpG位点的生物体DNA碱基序列中的胞嘧啶转化为胞嘧啶以外碱基而获得的碱基序列构成的核酸杂交，
(C)测定上述步骤(B)的核酸扩增反应(i)所获得的扩增产物数量和核酸扩增反应(ii)所获得的扩增产物数量，
(D)根据上述步骤(C)所得测定结果，算出在上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样所含所有核酸中、所述生物体DNA的非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的核酸(转化核酸)的比例，及
(E)根据上述步骤(D)所得计算结果，判断上述步骤(A)是否适当进行。
本发明的判断方法的一大特征在于：在为了测定非甲基化胞嘧啶转化试样中的DNA含量而用非甲基化胞嘧啶转化试样和第一引物组进行核酸扩增反应的同时，还为测定非甲基化胞嘧啶转化试样中的转化核酸数量而用非甲基化胞嘧啶转化试样和第二引物组进行核酸扩增反应。
图1所示为本发明的判断方法一实施方式的流程图。
本发明的判断方法首先将试样中所含生物体DNA的非基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基，获得非甲基化胞嘧啶转化试样(步骤S1)。步骤S1相当于上述步骤(A)。
含有生物体DNA的试样可以通过众所周知的方法获得。比如可以从生物体的组织和细胞提取DNA，溶解到水或缓冲液中制备含有生物体DNA的试样。提取DNA除可以使用苯酚提取法、苯酚-氯仿提取法等公知的方法外，还可以使用市场出售的DNA提取试剂盒。溶解DNA的水或缓冲液最好能稳定保存溶解的DNA。上述溶解DNA的水或缓冲液比如可以是不含核酸酶的PCR级水和TE缓冲液〔组分：10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mM EDTA〕等。
试样中所含生物体DNA的非甲基化胞嘧啶的转化可以通过使前述非甲基化胞嘧啶转化剂和生物体DNA接触的非甲基化胞嘧啶转化处理进行。使用亚硫酸氢盐作为非甲基化胞嘧啶转化剂时，如前所述，甲基化胞嘧啶不转化，非甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶。
在步骤S1，比如当使用亚硫酸氢盐类的亚硫酸氢钠进行非甲基化胞嘧啶转化处理时，可以在含有生物体DNA的试样中添加亚硫酸氢钠溶液，在适当的温度条件下培养，使生物体DNA的非甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶。亚硫酸氢盐在含有生物体DNA的试样中的添加量最好是使亚硫酸氢盐在含亚硫酸氢盐和生物体DNA的未反应混合物中的浓度达到3M以上。在上述非甲基化胞嘧啶转化处理中，比如当在含有2μg生物体DNA的试样中添加亚硫酸氢钠溶液使其最终浓度达到5M时，亚硫酸氢钠溶液与含生物体DNA的试样的反应时间可以设为40分钟-16小时，反应温度为50℃-80℃。非甲基化胞嘧啶转化处理的反应条件不受上述反应条件的限制，可以适当设定。
接着，用在步骤S1获得的非甲基化胞嘧啶转化试样进行第一引物组的核酸扩增反应(步骤S2)及第二引物组的核酸扩增反应(步骤S3)。步骤S2相当于步骤(B)的核酸扩增反应(i)。步骤S3相当于步骤(B)的核酸扩增反应(ii)。上述步骤S2的核酸扩增反应目的是确认总核酸量，上述步骤S3的核酸扩增反应的目的是确认转化核酸的数量。
步骤S2和步骤S3的核酸扩增反应可以采取上述核酸扩增法、如PCR法、链置换反应法、LCR法、转录扩增法等进行。在这些核酸扩增法中从测定后述扩增产物的便捷性来说，上述PCR法之一的实时PCR及上述链置换反应法之一的实时LAMP最好。用PCR法或LAMP法扩增核酸，反应液的光学状态(浊度、吸光度和荧光强度等)会随核酸的扩增而变化。因此，用上述实时PCR及实时LAMP法可以通过实时测定其光学状态，定量测定扩增产物量。
接下来，测定在步骤S2和步骤S3的核酸扩增反应所获得的扩增产物的数量(步骤S4)。步骤S4相当于步骤(C)。
当使用实时PCR法作为上述步骤S2及步骤S3的核酸扩增法时，由于是实时监视扩增产物DNA，在指数函数的增幅区域进行该DNA的定量，因此，能够根据聚合酶链式反应中的扩增速度论正确地定量该DNA。实时PCR法可以列举出用发荧光的夹层的夹层法以及使用由对扩增产物序列有特异性的荧光色素标记寡核苷酸构成的探针(如TaqMan探针、环状探针(CyclingProbe))的探针法。这些方法中从能够简便地进行扩增产物检测及定量的角度看，以夹层法为好。在夹层法中，夹层是一种能与通过聚合酶链式反应合成的双链DNA结合、在励起光的照射下发荧光的物质。在夹层法中，通过检测基于与扩增产物双链DNA结合的夹层所发荧光的荧光强度，即可监视扩增产物的生成量。夹层比如有(Molecular Probes公司)生产的SYBR(注册商标)绿等。
当上述步骤S2和步骤S3中的核酸扩增法使用的是实时LAMP法时，可以以伴随核酸扩增生成的副产品焦磷酸镁(magnesium pyrophosphate)作为扩增产物的指标进行测定。具体而言，焦磷酸镁不溶于水，随着焦磷酸镁的增多，反应液变白浊。通过实时光学测定反应液的浊度(或吸光度)就可定量测定扩增产物量。在实时LAMP法中也可以用上述夹层法。
在步骤S4，根据检量线算出扩增产物的数量。上述检量线可以通过众所周知的方法绘制。上述检量线比如可以使用标准DNA与各引物组进行核酸扩增反应，根据实时监测各扩增产物量获得的扩增曲线、标准DNA的拷贝数、反应的周期等绘制而成。
基于步骤S4对扩增产物量的测定结果，算出转化核酸在非甲基化胞嘧啶转化试样所含全部核酸中所占的比例(步骤S5)。步骤S5相当于步骤(D)。
转化核酸在非甲基化胞嘧啶转化试样所含全部核酸中所占的比例可以按照下列公式(1)算出：
〔用第二引物组的核酸扩增反应(ii)的扩增产物量〕/〔用第一引物组的核酸扩增反应(i)的扩增产物量〕×100(％)(1)
根据步骤S5算出的结果，判断非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行(步骤S6)。步骤S6相当于步骤(E)。
在上述公式(1)中，当算出转化核酸在非甲基化胞嘧啶转化试样所含全部核酸中所占的比例时，计算结果越接近100％，越可以判断非甲基化胞嘧啶转化处理适当进行。另一方面，计算结果越接近0％，越可以判断非甲基化胞嘧啶转化处理未适当进行。也可以设定阈值，当计算结果比阈值高时，判断非甲基化胞嘧啶转化处理适当进行，当计算结果比阈值低时，判断非甲基化胞嘧啶转化处理未适当进行。在此，阈值可以从转化核酸在非甲基化胞嘧啶转化试样所含全部核酸中所占比例和有关使用该非甲基化胞嘧啶转化试样进行的甲基化DNA分析结果的数据累积导出。阈值可随数据累积量、核酸扩增反应种类、所用各引物组种类以及非甲基化胞嘧啶转化处理的反应条件等变动，比如可以设定为5％-25％，最好设定为10％-20％。
本发明的判断方法可以通过使用本发明的试剂盒轻松实施。
采用本发明的试剂盒和本发明的判断方法，可以判断在分析甲基化DNA时进行的非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行。因此，通过使用本发明的试剂盒和本发明的判断方法，可以正确地分析甲基化DNA。因此，本发明还包含甲基化DNA的分析方法。
本发明的甲基化DNA分析方法包括以下步骤：
(A)将试样中所含生物体DNA的非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基，获得非甲基化胞嘧啶转化试样，
(B)进行以下(i)、(ii)所述核酸扩增反应：
(i)用上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样和数条引物组成的第一引物组进行核酸扩增反应，其中所述数条引物与上述生物体DNA的碱基序列中由不含胞嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交，
(ii)用上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样和数条引物组成的第二引物组进行核酸扩增反应，其中所述数条引物与通过将含胞嘧啶而不含CpG位点的生物体DNA碱基序列中的胞嘧啶转化为胞嘧啶以外碱基而获得的碱基序列构成的核酸杂交，
(C)测定上述步骤(B)的核酸扩增反应(i)所获得的扩增产物数量和核酸扩增反应(ii)所获得的扩增产物数量，
(D)根据上述步骤(C)所得测定结果，算出在上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样所含所有核酸中、所述生物体DNA的非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的核酸的比例，及
(E)根据上述步骤(D)所得计算结果，判断上述步骤(A)是否适当进行，
(F)当在上述步骤(E)判断上述步骤(A)适当进行时，用在上述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样分析甲基化DNA。
本发明的甲基化DNA分析方法的一大特征在于：在分析甲基化DNA之前，先用上述判断方法判断非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行，当非甲基化胞嘧啶转化处理适当进行时才分析甲基化DNA。本发明的甲基化DNA分析方法在进行甲基化分析中使用的是适当经非甲基化胞嘧啶转化处理的非甲基化胞嘧啶转化试样，因此具有能正确、高效地分析甲基化DNA的卓越效果。
图2所示为本发明分析方法一实施方式的流程图。
上述步骤(A)-(E)与本发明的判断方法的操作相同。图2的步骤S7-S12与图1所步骤S1-S6的操作相同。
在本发明的甲基化DNA分析方法中，当在步骤S12[步骤(E)]判断非甲基化胞嘧啶转化处理已适当进行时，用非甲基化胞嘧啶转化试样分析甲基化DNA(步骤S13)。当非甲基化胞嘧啶转化处理未适当进行时，返回步骤S7[步骤(A)]，从获得非甲基化胞嘧啶转化试样的操作重新开始即可。
甲基化DNA的分析比如可以采取甲基化特异性PCR法、分析非甲基化胞嘧啶转化试样中核酸的碱基序列的方法以及用固定有疾病相关基因的DNA、转录因子的DNA、表达调控因子的DNA和启动子区的DNA等的DNA芯片进行分析的方法等。作为DNA芯片最好是铺瓦式地固定有从基因的表达信息中业已解读的基因组数据等间隔抽取的碱基序列作为检测用探针的平铺阵列(Tiling Array)。
本发明的甲基化DNA分析方法中，可以用适当的非甲基化胞嘧啶转化试样分析甲基化DNA。因此，可以对生物体内活动状态因CpG位点的甲基化而改变的基因、作为疾病发作和病情发展的指标的因子、药物靶因子等进行高处理量分析和高通量筛选(High-Throughput Screening)。
下面用实施例详细说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
实施例
(实验例1)
根据人类基因组DNA碱基序列，设计以部分该人类基因组DNA构成的碱基序列(序列号：7)为靶序列的引物组，合成各引物，其中该引物组由二种引物组成，这两种引物能与不含胞嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交。
其结果，获得了包含由序列号：1所示碱基序列构成的正向引物和由序列号：2所示碱基序列构成的反向引物的引物组。将所得引物组作为确认来自人的试样中所含的全部核酸量的引物组(以下称“核酸量确认用引物组1”)。将所得核酸量确认用引物组1的正向引物和反向引物分别溶于无核酸酶纯水，制备到最终浓度为10μM，获得核酸量确认用引物组1的正向引物水溶液和反向引物水溶液。
再根据人类基因组DNA碱基序列，设计由二种引物组成的引物组，并合成各引物，其中所述这二种引物与含胞嘧啶而不含CpG位点的碱基序列中胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的其他碱基(尿嘧啶)的碱基序列构成的核酸杂交。
其结果，获得了包含由序列号：5所示碱基序列构成的正向引物和由序列号：6所示碱基序列构成的反向引物的引物组。将所得引物组作为通过确认全部核酸中所含转化核酸的量来确认非甲基化胞嘧啶转化处理已适当进行的引物组(以下称“转化处理确认用引物组1”)。将所得转化处理确认用引物组1的正向引物和反向引物分别溶于无核酸酶纯水，制备到最终浓度为10μM，获得转化处理确认用引物组的正向引物水溶液和反向引物水溶液。
将核酸量确认用引物组1的正向引物水溶液和反向引物水溶液分别封存于无核酸酶的容器中。再将转化处理确认用引物组1的正向引物水溶液和反向引物水溶液分别封存于无核酸酶的容器中。以核酸量确认用引物组1和转化处理确认用引物组1的组合作为实验例1的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒。
(实施例1)
(配制分析用试样)
在2μg来自人的正常乳腺组织的基因组DNA(BioChain公司制)中添加0.3M氢氧化钠水溶液300μL，所得混合物在37℃培养10分钟。在培养后的产物中添加10M亚硫酸氢钠溶液300μL，所得混合物在80℃培养40分钟，进行亚硫酸氢盐处理。然后，用核酸纯化试剂盒(QIAGEN公司制，商品名：Qiaquick PCR纯化试剂盒)提纯经亚硫酸氢盐处理获得的产物中所含核酸。在所得核酸中添加氢氧化钠至最终浓度为0.3M，室温培养5分钟。用核酸纯化用离心柱(GE医疗集团制，商品名：MicroSpin S-300HR柱)提纯，获得分析用试样1。
用不同于上述分析用试样1制备方法中所用来自人正常乳腺组织的基因组DNA的另一种来自人正常乳腺组织的基因组DNA(BioChain公司制)，进行同样操作，获得分析用试样2。
(测定定量PCR的扩增产物量，以确认核酸量)
用实验例1的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒如下定量PCR，以判断在分析用试样1和2是否分别适当进行亚硫酸氢盐处理。
在1μL分析用试样1或分析用试样2中，添加12.5μL核酸扩增用试剂(Roche Diagnostics公司制，商品名：FastStart SYBR Green Master Mix)、实验例1的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒所含核酸量确认用引物组1的正向引物水溶液(10μM)1μL、此核酸量确认用引物组1的反向引物水溶液(10μM)1μL和水9.5μL，配制PCR用反应液。用该PCR用反应液进行定量PCR。定量PCR的反应条件是95℃保温10分钟后，以95℃30秒、62℃30秒、72℃30秒为一周期，反应40个周期，再在95℃60秒、62℃30秒、95℃30秒的条件下进行反应。
根据用核酸量确认用引物组1和序列号：9所示碱基序列构成的标准DNA进行的定量PCR所生成的检量线，算出用核酸量确认用引物组1进行的定量PCR所得扩增产物量。
(测定定量PCR的扩增产物量，以确认转化核酸量)
接着，除用实验例1的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒所含转化处理确认用引物组1取代核酸量确认用引物组1外，以同样操作进行了定量PCR。
根据用转化处理确认用引物组和序列号：10所示碱基序列构成的标准DNA进行的定量PCR所生成的检量线，算出用转化处理确认用引物组1进行定量PCR获得的扩增产物量。
(算出全部核酸中所含转化核酸量的比例)
从核酸总量确认用定量PCR的扩增产物量和转化核酸量确认用定量PCR的扩增产物量，根据以下公式(2)：
[转化核酸量确认用定量PCR的扩增产物量]/[核酸总量确认用定量PCR的扩增产物量]×100(％)(2)
算出分析试样中所有核酸中所含转化核酸的比例，作为“转化核酸量在分析用试样1或分析用试样2所含核酸总量中的比例”。其结果见图3。图3中，条1表示使用分析用试样1及实验例1的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒时的结果。条2表示使用分析用试样2及实验例1的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒时的结果。
从图3所示结果可以看出，使用实验例1的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒可以针对来源于组织的DNA求出经亚硫酸氢盐处理后的试样中的全部核酸中所含转化核酸的比例。由此结果表明，根据上述分析试样中的所有核酸中所含转化核酸的比例，可以判断DNA的亚硫酸氢盐处理等非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行。
(实验例2)
根据序列号：7所示碱基序列，设计由二种引物组成的引物组，合成各引物，其中所述二种引物能与不含CpG位点含胞嘧啶的碱基序列中由胞嘧啶已转化为胞嘧啶以外的其他碱基(尿嘧啶)的碱基序列构成的核酸杂交。
其结果，获得了包含由序列号：3所示碱基序列构成的正向引物和由序列号：4所示碱基序列构成的反向引物的引物组。将所得引物组作为通过确认全部核酸中所含转化核酸量来确认非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行的引物组(以下称“转化处理确认用引物组2”)。
将所得转化处理确认用引物组2的正向引物和反向引物分别溶于无核酸酶纯水，制备到最终浓度为10μM，获得转化处理确认用引物组2的正向引物水溶液和反向引物水溶液。
将核酸量确认用引物组1的正向引物水溶液和反向引物水溶液分别封存于无核酸酶的容器中。再将转化确认用引物组2的正向引物水溶液和反向引物水溶液分别封存于无核酸酶的容器中。以核酸量确认用引物组1和转化确认用引物组2的组合作为实验例2的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒。
序列号：7所示碱基序列中核酸量确认用引物组1和转化处理确认用引物组2的各个引物的结合区域见图4(A)。图4(A)中，Gec-F结合区域表示核酸量确认用引物组1的正向引物的结合区域。Gec-R结合区域表示核酸量确认用引物组1的反向引物的结合区域。BSc-F结合区域表示转化处理确认用引物组2的正向引物的结合区域。BSc-R结合区域表示转化处理确认用引物组2的反向引物的结合区域。另外，转化处理确认用引物组2的各引物的结合区域显示为各引物与靶序列中的胞嘧啶转化为尿嘧啶的核酸杂交的区域。
(制备例1)
用DNA提取试剂盒(QIAGEN公司制，商品名：硅胶膜柱血液大提试剂盒(QIAmp Blood Maxi Kit))从乳癌细胞株MCF7提取基因组DNA。在2μg所得基因组DNA中添加0.3M氢氧化钠水溶液300μL，所得混合物在37℃培养10分钟。在培养后的产物中添加10M亚硫酸氢钠溶液300μL，所得混合物在80℃培养40分钟，进行亚硫酸氢盐处理。然后，所得产物中所含核酸用核酸纯化试剂盒(QIAGEN公司制，商品名：Qiaquick PCR纯化试剂盒)提纯。在所得核酸中添加氢氧化钠至最终浓度0.3M，室温培养5分钟。所得产物用核酸纯化用离心柱(GE医疗集团制，商品名：MicroSpin S-300HR柱)提纯，获得制备例1的分析用试样。
(制备例2)
通过与制备例1同样的操作从乳癌细胞株MCF7提取出基因组DNA2μg，在2μg所得基因组DNA中添加0.2M氢氧化钠水溶液56μL，所得混合物在37℃培养10分钟。在培养后的产物中添加0.11g/L对苯二酚水溶液30μL和3M亚硫酸氢钠溶液520μL，所得混合物在50℃培养16小时，进行亚硫酸氢盐处理。然后，所得产物中所含核酸用核酸纯化试剂盒(QIAGEN公司制，商品名：Qiaquick PCR纯化试剂盒)提纯。在所得核酸中添加氢氧化钠至最终浓度0.3M，室温培养5分钟。所得产物用核酸纯化用离心柱(GE医疗集团制，商品名：MicroSpin S-300HR柱)提纯，获得制备例2的分析用试样。
(试验例1)
为确认制备例1分析用试样和制备例2分析用试样的亚硫酸氢盐处理是否适当进行，用实验例1的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒或实验例2的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒进行了确认核酸量的定量PCR和测定转化核酸量的定量PCR。
(测定定量PCR扩增产物量，以确认核酸量)
测定核酸量的定量PCR，除用制备例1分析用试样或制备例2分析用试样取代实施例1中使用的分析用试样1或分析用试样2外，其他操作与实施例1相同。
根据用核酸量确认用引物组1和序列号：8所示碱基序列构成的标准DNA进行的定量PCR所生成的检量线，算出用核酸量确认用引物组1进行的定量PCR所得扩增产物量。上述序列号：8所示碱基序列构成的标准DNA中核酸量确认用引物组1的各引物的结合区域见图4(B)。图4(B)中，Gec-F结合区域表示核酸量确认用引物组1的正向引物的结合区域。Gec-R结合区域表示核酸量确认用引物组1的反向引物的结合区域。
(测定定量PCR的扩增产物量，以确认转化核酸量)
确认转化核酸量的定量PCR，除用制备例1分析用试样或制备例2分析用试样取代实施例1中使用的分析用试样1或分析用试样2外，其他操作与实施例1相同。
根据用转化处理确认用引物组2和序列号：8所示碱基序列构成的标准DNA进行的定量PCR所生成的检量线，算出用转化处理确认用引物组2进行定量PCR获得的扩增产物量。上述序列号：8所示碱基序列构成的标准DNA中转化处理确认用引物组2的各引物的结合区域见图4(B)。图4(B)中，BSc-F结合区域表示转化处理确认用引物组2的正向引物的结合区域。BSc-R结合区域表示转化处理确认用引物组2的反向引物的结合区域。
(算出转化核酸量在核酸总量中所占的比例)
从核酸量确认用定量PCR的扩增产物量和转化核酸量确认用定量PCR的扩增产物量，根据上述公式(2)算出分析试样中所有核酸中所含转化核酸的比例，其结果见图5。
图5中，条1表示使用制备例1分析用试样及实验例1的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒时的结果。条2表示使用制备例1分析用试样及实验例2的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒时的结果。条3表示使用制备例2的分析用试样及实验例1的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒时的结果。条4表示使用制备例2分析用试样及实验例2的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒时的结果。
实验例1的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒的转化处理确认用引物组1所含引物的结合区域存在于不同于序列号：7所示区域所在染色体的另一种染色体中。因此，当被实验例1的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒的核酸量确认用引物组1及转化处理确认用引物组1所含引物扩增的区域的任何一个复制数因染色体异常而发生变化时，使用核酸量确认用引物组1的核酸扩增反应所生成的扩增产物及使用转化处理确认用引物组2的核酸扩增反应所生成的扩增产物其各自绝对量变化的程度会有所不同。因此，当使用实验例1的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒时，如果转化核酸在总核酸中的比例呈异常值，则认为其原因在于癌细胞中的染色体异常。
与此相对，实验例2的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒的核酸量确认用引物组1及转化处理确认用引物组2所含所有引物的结合区域均在人基因组DNA中序列号：7所示极为有限的靶序列构成的区域(224bp)中(参照图4)。即，在实验例2的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒中，核酸量确认用引物组1所含引物杂交部分的碱基序列和转化处理确认用引物组2所含引物杂交部分的碱基序列均包含在224bp的碱基序列中。
因此，即使在上述靶序列构成的区域中出现染色体异常，该染色体异常对使用核酸量确认用引物组1的核酸扩增反应及使用转化处理确认用引物组2的核酸扩增反应都同样有影响。即，即使使用核酸量确认用引物组1的核酸扩增反应所生成的扩增产物和使用转化处理确认用引物组2的核酸扩增反应所生成的扩增产物其各自的绝对量有变化，总核酸中所含转化核酸的比例不会变。
显然，使用实验例2的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒可以正确判断染色体往往发生异常的癌细胞的基因组DNA的非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行。
(制备例3)
以与制备例1同样的操作从乳癌细胞株MCF7提取基因组DNA2μg，在提取的2μg基因组DNA中添加健康人的血清300μL，配制含血清的试样。将配制的含血清的试样中所含DNA用DNA纯化试剂盒(QIAGEN公司制，商品名Qiaquick PCR纯化试剂盒)提纯。在纯化的DNA中添加0.3M氢氧化钠水溶液300μL，所得混合物在37℃培养10分钟。在培养后的产物中添加10M亚硫酸氢钠溶液300μL，所得混合物在80℃培养40分钟，进行亚硫酸氢盐处理。然后，所得产物中所含核酸用核酸纯化试剂盒(QIAGEN公司制，商品名：Qiaquick PCR纯化试剂盒)提纯。在所得核酸中添加氢氧化钠至最终浓度0.3M，室温培养5分钟。所得产物用核酸纯化用离心柱(GE医疗集团制，商品名：MicroSpin S-300HR柱)提纯，获得制备例3的分析用试样。
(制备例4)
以与制备例1同样的操作从乳癌细胞株MCF7提取基因组DNA2μg，在提取的2μg基因组DNA中添加健康人的血清300μL，配制含血清的试样。将配制的含血清的试样中所含DNA用DNA纯化试剂盒(QIAGEN公司制，商品名：Qiaquick PCR纯化试剂盒)提纯。在纯化的DNA中添加0.3M氢氧化钠水溶液300μL，所得混合物在37℃培养10分钟。培养后的产物中添加0.11g/L对苯二酚水溶液30μL和3M亚硫酸氢钠溶液520μL，所得混合物在50℃培养16小时，进行亚硫酸氢盐处理。然后，所得产物中所含核酸用核酸纯化试剂盒(QIAGEN公司制，商品名：Qiaquick PCR纯化试剂盒)提纯。在所得核酸中添加氢氧化钠至最终浓度为0.3M，室温培养5分钟。所得产物用核酸纯化用离心柱(GE医疗集团制，商品名：MicroSpin S-300HR柱)提纯，获得制备例4的分析用试样。
(制备例5)
以与制备例1同样的操作从乳癌细胞株MCF7提取基因组DNA2μg，在提取的2μg基因组DNA中添加健康人的血清300μL、18M胍-HCl300μL和20mg/mL蛋白酶K(希格玛公司制)20μL，所得混合物在50℃培养60分钟。培养后所得产物中添加10M氢氧化钠水溶液20μL，所得混合物37℃培养10分钟。培养后所得产物中添加10M亚硫酸氢钠溶液640μL，所得混合物在80℃培养40分钟，进行亚硫酸氢盐处理。然后，所得产物中所含核酸用核酸纯化试剂盒(QIAGEN公司制，商品名：Qiaquick PCR纯化试剂盒)提纯。在所得核酸中添加氢氧化钠至最终浓度为0.3M，室温培养5分钟。所得产物用核酸纯化用离心柱(GE医疗集团制，商品名：MicroSpin S-300HR柱)提纯，获得制备例5的分析用试样。
(实施例2)
除使用制备例3-5的分析用试样之一取代实施例1所用分析用试样1或分析用试样2之外，进行与实施例1同样的操作，用实验例2的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒算出分析试样中总核酸中所含转化核酸的比例。其结果见图6。图6中，条1表示使用制备例3分析用试样时的结果。条2表示使用制备例4分析用试样时的结果。条3表示使用制备例5分析用试样时的结果。
从图6所示结果可以看出，使用实验例2的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒可以针对来自染色体往往异常的乳腺癌细胞株的DNA，求出经亚硫酸氢盐处理后的试样中所有核酸中所含转化核酸的比例。显然，使用实验例2的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒无论采取什么方式进行亚硫酸氢盐处理，都能求出经亚硫酸氢盐处理后的试样中所有核酸中所含转化核酸的比例。由此结果表明，根据上述分析试样中所有核酸中所含转化核酸的比例，在各种非甲基化胞嘧啶转化处理的情况下，都能够判断该非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行。
(制备例6-8)
用从不同患者获得的三种人乳腺癌组织基因组DNA1-3[分别为BioChain公司制]如下获得制备例6-8的分析用试样。
在2μg上述人乳腺癌组织基因组DNA中添加0.3M氢氧化钠水溶液300μL，在37℃培养10分钟。在培养后的产物中添加10M亚硫酸氢钠溶液300μL，所得混合物在80℃培养40分钟，进行亚硫酸氢盐处理。然后，所得产物中所含核酸用核酸纯化试剂盒(QIAGEN公司制，商品名：Qiaquick PCR纯化试剂盒)提纯。在所得核酸中添加氢氧化钠至最终浓度为0.3M，室温培养5分钟。所得产物用核酸纯化用离心柱(GE医疗集团制，商品名：MicroSpinS-300HR柱)提纯，获得制备例6-8的分析用试样。
(实施例3)
除使用制备例6-8的分析用试样之一取代实施例1所用分析用试样1或分析用试样2之外，用实验例2的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒，进行与实施例1同样的操作，算出各分析试样中总核酸中所含转化核酸的比例。其结果见图7。图7中，条1表示使用制备例6分析用试样时的结果。条2表示使用制备例7分析用试样时的结果。条3表示使用制备例8分析用试样时的结果。
从图7所示结果可以看出，使用实验例2的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒，不仅对来源于细胞的DNA试样，对来源于乳腺癌组织的DNA试样也可以求出经亚硫酸氢盐处理后的试样中所有核酸中所含转化核酸的比例。
显然，如果使用实验例2的非甲基化胞嘧啶转化处理判断用试剂盒，无论用什么种类的生物体试样、无论采取什么方式进行亚硫酸氢盐处理，都能求出经亚硫酸氢盐处理后的试样中所有核酸中所含转化核酸的比例。由此结果表明，根据上述分析试样中所有核酸中所含转化核酸的比例，在各种非甲基化胞嘧啶转化处理的情况下，都能够判断该非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行。
序列表
序列号：1为引物序列。
序列号：2为引物序列。
序列号：3为引物序列。
序列号：4为引物序列。
序列号：5为引物序列。
序列号：6为引物序列。
序列号：7为靶序列。
序列号：8为标准DNA序列。
序列号：9为确定核酸量的引物组1相应的标准DNA序列。
序列号：10为确认转化处理的引物组1相应的标准DNA的序列。
Claims (11)
1.一种用于判断是否适当进行了使非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的非甲基化胞嘧啶转化处理试剂盒，该试剂盒包括：
第一引物组，由数条引物构成，其中所述数条引物与作为非甲基化胞嘧啶转化处理的目标的生物体DNA的碱基序列中由不含胞嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交，
第二引物组，由数条引物构成，其中所述数条引物与通过将含胞嘧啶而不含CpG位点的生物体DNA碱基序列中的胞嘧啶转化为胞嘧啶以外碱基而获得的碱基序列构成的核酸杂交；
所述不含胞嘧啶的碱基序列和所述含胞嘧啶而不含CpG位点的碱基序列是存在于所述生物体的同一染色体上的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述不含胞嘧啶的碱基序列和所述含胞嘧啶而不含CpG位点的碱基序列在所述生物体DNA的碱基序列中均包含在300bp以内的碱基序列中。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：第一引物组所含的至少一条引物与使用第二引物组的核酸扩增所扩增的核酸杂交。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：第二引物组所含的至少一条引物与使用第一引物组的核酸扩增所扩增的核酸中由胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的碱基序列构成的核酸杂交。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：非甲基化胞嘧啶转化处理是用亚硫酸氢盐对DNA进行处理。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：胞嘧啶以外的碱基是尿嘧啶。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述生物体DNA是人类基因组DNA。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述生物体DNA包含癌细胞的DNA。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：第一引物组包括由序列号：1所示碱基序列构成的引物和由序列号：2所示碱基序列构成的引物。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：第二引物组包括由序列号：3所示碱基序列构成的引物和由序列号：4所示碱基序列构成的引物。
11.一种包括第一引物组和第二引物组的试剂盒，其中第一引物组含有与试样中所含有的生物体DNA的碱基序列中由不含胞嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交的引物，第二引物组含有与通过将含胞嘧啶而不含CpG位点的所述生物体DNA碱基序列中的胞嘧啶转化为胞嘧啶以外碱基而获得的碱基序列构成的核酸杂交的引物，所述不含胞嘧啶的碱基序列和所述含胞嘧啶而不含CpG位点的碱基序列是存在于所述生物体的同一染色体上的碱基序列，该试剂盒用在包括下述步骤的方法中：
(A)将所述生物体DNA的非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基，获得非甲基化胞嘧啶转化试样；
(B)进行以下(i)、(ii)所述核酸扩增反应：
(i)用所述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样和所述第一引物组进行核酸扩增反应；
(ii)用所述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样和所述第二引物组进行核酸扩增反应；
(C)测定所述步骤(B)的核酸扩增反应(i)所获得的扩增产物数量和核酸扩增反应(ii)所获得的扩增产物数量；
(D)根据所述步骤(C)所得测定结果，算出在所述步骤(A)获得的非甲基化胞嘧啶转化试样所含所有核酸中所述生物体DNA的非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基的核酸的比例；及
(E)根据所述步骤(D)所得计算结果，判断所述步骤(A)是否适当进行。
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