CN113430255A - 基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法 - Google Patents

基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肺癌检测技术领域，尤其涉及基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法。本发明使用靶向捕获技术进行5hmC高通量测序的检测方法，通过机器学习相关算法，实现通过对ctDNA多表观遗传组学进行免疫检查位点抑制剂响应的预测。这种无创、实时的检测方法将为免疫检查位点抑制剂的应答提供重要分子靶标，便于后续的研究、诊断。

Description

基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法
技术领域
本发明涉及肺癌检测技术领域，尤其涉及基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法。
背景技术
目前，使用的生物标志物主要有PD-L1的表达量以及肿瘤突变负荷(TMB)。前者是使用免疫组化检测组织样本的PD-L1蛋白表达，但是这个评估指标并不是绝对的，PD-L1阳性的癌症病人对PD-1药物的应答率是36％-100％，但是PD-L1阴性的癌症病人也有对治疗产生应答的，应答率是0％-17％。但是PD-L1表达阳性的标准难以界定，而且有时PD-L1不仅在癌细胞表达，也在围绕病灶的微环境中的非癌细胞表达，这势必会造成一定的干扰。最后一点是，PD-L1检测，仅适用于PD-1或PD-L1药物的预测，对于其他免疫药物的疗效预测则无能为力。
TMB是肿瘤组织每兆碱基中突变的数目，一般这个指标是通过组织样本进行检测的，目前也有基于血液来源的TMB(bTMB)进行检测的。肿瘤突变负荷(TMB)作为一个潜在的生物标志物而出现。在不同的癌症中体细胞突变的数量从0.01突变/Mb到超过400突变/Mb不等。而这些突变中有些会转录表达多肽抗原表位或肿瘤新抗原。早期关于TMB的研究都是采用全外显子(WES)测序方法对肿瘤DNA和对照的胚系DNA进行分析。虽然TMB目前已被FDA批准用于免疫检查位点抑制剂指导用药，但其依然存在很多缺陷，如随着检测平台不同，所检测的基因panel不同，会导致Cut-off值出现差异，不同的算法也会影响TMB的预测值，因为算法在不同的基因检测panel中差异非常大，并且用于评估TMB的突变类型在各种检测方法中也有所差异。在很多采用WES的分析中，TMB只包含错义突变，而没有纳入其他突变类型。特别是，在福尔马林固定石蜡包埋样品处理方法的不同也能够很大程度上影响TMB的值10。此外，不同的算法也会影响TMB的预测值，因为算法在不同的基因检测panel中差异非常大，并且用于评估TMB的突变类型在各种检测方法中也有所差异。在很多采用WES的分析中，TMB只包含错义突变，而没有纳入其他突变类型。特别是，在福尔马林固定石蜡包埋样品处理方法的不同也能够很大程度上影响TMB的值10。
DNA的表观遗传修饰与肿瘤的发生、发展密切相关，肿瘤与健康人的DNA表观修饰不同，不同类型肿瘤的DNA表观修饰也不同，同类型肿瘤不同时期也差别很大。cfDNA是细胞释放到血液循环系统的DNA片段，来自与肿瘤的cfDNA称为ctDNA，这些片段保留了肿瘤DNA表观遗传修饰等信息。理论上，通过液体活检技术检测cfDNA表观遗传修饰能够用于免疫检查位点抑制剂的应答效率预测。
随着免疫治疗研究进展及免疫抑制剂的临床应用，免疫检查位点抑制剂在很大程度上改变了非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗方式。包含PD-1/PD-L1、CTLA4的免疫治疗是肿瘤治疗的趋势所在，但并不是所有的肿瘤患者都适合免疫治疗，研究显示，在非小细胞肺癌中，PD-1单药的应答效率只有25％左右，因此如何使用合适的肿瘤标准物来预测PD-1等免疫检查位点抑制剂的响应是一个急需解决的问题。
发明内容
针对背景技术中存在的需要合适的肿瘤标准物来预测PD-1等免疫检查位点抑制剂的响应问题，提出基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法。本发明使用靶向捕获技术进行5hmC高通量测序的检测方法，通过机器学习相关算法，实现通过对ctDNA多表观遗传组学进行免疫检查位点抑制剂响应的预测。这种无创、实时的检测方法将为免疫检查位点抑制剂的应答提供重要分子靶标，便于后续的研究、诊断。
本发明提出基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法，方法步骤如下：
步骤1：提取cfDNA；
步骤2：将cfDNA片段进行末端修复并补齐；
步骤3：将末端补齐的DNA与测序接头进行连接，得到连接产物；
步骤4：通过葡糖基转移酶T4-β-GT，将含叠氮修饰基团的糖UDP-6-N3-glucose的修饰基团转移到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上；
步骤5：在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素DBCO-PEG4-Biotin；
步骤6：将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上；
步骤7：利用缓冲液多次洗涤所述固相材料去除未结合的DNA片段；
步骤8：以结合在链霉素亲和素免疫磁珠上的DNA为模板，进行PCR扩增从而制备测序文库；在制备测序文库过程中包含多个纯化步骤，选择使用磁珠法进行纯化；
步骤9：对测序文库进行质量检查；
步骤10：将含有不同barcode的文库按相同摩尔浓度混匀，根据二代测序仪器使用标准方法进行上机测序，获得测序结果；
步骤11：5hmC生物标志物的选择和模型构建；
步骤12：数据分析。
优选的，在步骤2中，首先将提取的cfDNA进行片段长度检测；再将筛选的cfDNA进行末端修复并补齐。
优选的，在步骤5中，通过点击化学方法在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素。
优选的，在步骤6中，通过固相亲和反应将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上。
优选的，在步骤7中，所述缓冲液包括Tris-HCl、EDTA、NaCl和表面活性剂Tween20。
与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：
本发明使用靶向捕获技术进行5hmC高通量测序的检测方法，通过机器学习相关算法，实现通过对ctDNA多表观遗传组学进行免疫检查位点抑制剂响应的预测。这种无创、实时的检测方法将为免疫检查位点抑制剂的应答提供重要分子靶标，便于后续的研究、诊断。
具体实施方式
本发明提出的一种基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmC含量的方法，步骤如下：
S1、提取cfDNA：从108例Ⅲ期和Ⅳ期肺癌患者样本中抽提10ng血浆cfDNA，可通过本领域技术人员熟知的任何适用于提取血浆cfDNA的方法进行抽提。
S2、将cfDNA片段进行末端修复并补齐，将末端补齐的DNA与测序接头进行连接，得到连接产物；方法如下：
根据Vazyme DNA Library Prep Kit说明书，在PCR管里制备含有10ng cfDNA、15μL的End-prep mix 4、1μL spikein以及用Nuclease-free water补齐到总体积为50μL的体系，在20℃孵育30分钟，然后在65℃孵育15分钟；向反应混合物中加入25μL的RapidLigation buffer2、5μL的Rapid DNA Ligase、1μL的adapter以及用Nuclease-free water补齐到总体积为100μL的体系，在20℃孵育15分钟，然后保持在4℃；使用AmpureXP beads对反应产物进行纯化，用21μL的Nuclease-free water进行洗脱获得最终DNA连接样品。
S3、通过T4-β-葡萄糖转移酶，将含叠氮修饰基团的糖UDP-6-N3-glucose的修饰基团转移到连接产物中5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上；再在5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素DBCO-PEG4-Biotin；方法如下：
制备总体积为25μL的标记反应混合液，包括T4-β-葡萄糖转移酶、带有叠氮修饰基团的糖UDP-6-N3-glucose、10×Buffer和上述21μL的纯化产物；将混合液在37℃孵育2小时；向反应产物中加入2.5μL的二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素，在37℃孵育2小时；向反应混合物中加入10μg的sheared salmon sperm DNA(鲑鱼精DNA)，使用Bio-Rad的MicroBio-spin 30 column对上述反应混合液进行纯化，将纯化产物定容至50μL。
S4、将含有上述5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上；利用缓冲液多次洗涤所述固相材料，去除未结合的DNA片段；方法如下：
首先，进行磁珠准备步骤：取出5μL的链霉素亲和素免疫磁珠C1 streptadvinbeads(life technoiogy)吹打均匀后置于磁力架上，待澄清后吸走上清液，加50μL的2*buffer1(1M PH7.5 Tris，0.5M EDTA，5M Nacl，Tween20)在旋转架上孵育3min后，置于磁力架上待澄清后吸走上清液，再加50μL的2*buffer1吹打均匀重悬磁珠；然后，将磁珠与上述纯化定容的标记产物1:1混合(各50μL)，在旋转混匀仪中混匀30分钟，使其充分结合；最后，分别用100μL的buffer1(1x)、buffer2(1x)、buffer3和buffer4洗脱，每种buffer洗涤两次，每次洗时置于旋转架上5min(旋转之后先瞬离一下避免损失盖上液体)。
S5、以结合在链霉素亲和素免疫磁珠上的DNA为模板，进行PCR扩增从而制备测序文库；在制备测序文库过程中包含多个纯化步骤，选择使用磁珠法进行纯化；制备总体积为50μL的反应体系，包含25μL的VAHTS HiFi Amplication Mix、2μL的PCR Primer Mix 3 forIllumina以及23μL的Nuclease-free water，将反应混合物加入到上述已洗涤的磁珠中，根据表1的PCR反应条件进行扩增：
Figure BDA0003169914100000061
表1
使用AmpureXP beads纯化扩增产物，获得最终测序文库。
S6、对测序文库进行质量检查后进行高通量测序，方法如下：
使用Qubit对获得的测序文库进行浓度测定，并使用LabChip GX Touch对文库DNA片段大小含量进行确定。通过质检的测序文库可用于高通量测序，将一定数量(1-96个)含有不同barcode的文库按相同浓度混匀，根据二代测序仪器使用标准方法进行上机测序。
S7、5hmC生物标志物的选择和模型构建:选择Rpackage glmnet(version 2.0-18)进行特征选择和预测模型构建，依赖于logistic线性回归模型上的弹性网正则化。5hmC数据集中，70％有应答者(n＝52)和70％无应答者(n＝22)随机放入训练集，剩余样本放入验证集。为了避免过拟合，将训练集随机分成5倍交叉验证。每次交叉选择4个褶皱作为交叉训练集，左侧为交叉检验集。在交叉训练组中，有反应者和无反应者之间的DMPs(p值小于0.001和log2FoldChange绝对值大于0.5，仍然作为候选项。然后进行100次重复，以进一步选择出现在95％以上的标记。最后，利用至少5个杂交组合中观察到的最终标记建立最终预测模型。
S8、将7个5hmC生物标志物聚在一起进行弹性网模型训练和预测。根据整合模型的生物标志物系数计算每个样本的EI-score，如下所示：
EI-score＝sum(coef(k)*log2CPM(k)),(k represents the marker)使用R包切割点选择ei评分的截止点。为了使灵敏度最大化，同时满足足够的特异性，我们选择spec_constraint作为度量。
在验证队列中，具有7个特征的5hmC预测模型具有较好的预测能力，AUC为0.7913(敏感性为0.8261；特异性，0.7)。
在一个可选的实施例中，首先将提取的cfDNA进行片段长度检测，再将筛选的cfDNA进行末端修复并补齐。
在一个可选的实施例中，通过点击化学方法在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素
DBCO-PEG4-Biotin。
在一个可选的实施例中，通过固相亲和反应将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上。
上面对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于此，在所属技术领域的技术人员所具备的知识范围内，在不脱离本发明宗旨的前提下还可以作出各种变化。

Claims (5)

1.基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法，其特征在于，方法步骤如下：
步骤1：提取cfDNA；
步骤2：将cfDNA片段进行末端修复并补齐；
步骤3：将末端补齐的DNA与测序接头进行连接，得到连接产物；
步骤4：通过葡糖基转移酶T4-β-GT，将含叠氮修饰基团的糖UDP-6-N3-glucose的修饰基团转移到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上；
步骤5：在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素DBCO-PEG4-Biotin；
步骤6：将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上；
步骤7：利用缓冲液多次洗涤所述固相材料去除未结合的DNA片段；
步骤8：以结合在链霉素亲和素免疫磁珠上的DNA为模板，进行PCR扩增从而制备测序文库；在制备测序文库过程中包含多个纯化步骤，选择使用磁珠法进行纯化；
步骤9：对测序文库进行质量检查；
步骤10：将含有不同barcode的文库按相同摩尔浓度混匀，根据二代测序仪器使用标准方法进行上机测序，获得测序结果；
步骤11：5hmC生物标志物的选择和模型构建；
步骤12：数据分析。
2.根据权利要求1所述的基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法，其特征在于，在步骤2中，首先将提取的cfDNA进行片段长度检测；再将筛选的cfDNA进行末端修复并补齐。
3.根据权利要求1所述的基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法，其特征在于，在步骤5中，通过点击化学方法在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素。
4.根据权利要求1所述的基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法，其特征在于，在步骤6中，通过固相亲和反应将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上。
5.根据权利要求1所述的基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法，其特征在于，在步骤7中，所述缓冲液包括Tris-HCl、EDTA、NaCl和表面活性剂Tween20。
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