JPWO2017039002A1 - 5−ヒドロキシメチルシトシン酸化剤及び5−ヒドロキシメチルシトシン解析方法 - Google Patents
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Abstract
DNA構造の不安定化や副反応を抑制し、DNA上の5-ヒドロキシメチルシトシンを選択的に酸化して5-ホルミルシトシンに変換することのできる、安価で新規な5-ヒドロキシメチルシトシン酸化剤、及びその酸化剤を用いてDNA脱メチル化の脱メチル化部位を高い精度で検出する方法を開発し、提供することである。ニトロキシルラジカル分子及び銅塩又は銅錯体、及び/又はニトロキシルラジカル分子−銅複合体からなる5-ヒドロキシメチルシトシン酸化剤を提供する。
Description
本発明は、DNA脱メチル化等に際して生じる5-ヒドロキシメチルシトシン(5-hydroxymethylcytosine;本明細書ではしばしば「5hmC」と表記する)を酸化する薬剤、5hmCの酸化によって生じる5-ホルミルシトシン(5-formylcytosine;本明細書ではしばしば「5fC」と表記する)を検出し、DNA脱メチル化部位を同定するDNA脱メチル化解析試薬、及びその検出試薬を用いてDANの脱メチル化の指標となる5hmCを解析する方法に関する。
DNA修飾の一形態であるDNAのメチル化は、DNA上のシトシンとグアニンのホスホジエステル結合からなるCpG配列において、シトシンの5位の炭素がDNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)によりメチル化され、5-メチルシトシン(5-methylcytosine;本明細書ではしばしば「5mC」と表記する)に変換されることによって生じる(図1)。5mCにおけるメチル基は、塩基対間における水素結合の形成には関与しないが、タンパク質とDNAの相互作用に影響を及ぼすため、メチル化されたDNAでは遺伝子発現が不活性化され得る。それ故、生物は、DNAのメチル化によって遺伝子の発現、並びに細胞や組織の分化及び老化をエピジェネティックに制御している(非特許文献1〜6)。
一方、DNAの脱メチル化は、5mCのメチル基がTET(Ten-Eleven-Translocation)等の酵素の触媒活性によって除去され、元のシトシンへと変換されることによって完了する(図1)。生体内における脱メチル化反応は、メチル基が一度に除去されるのではなく、5mCから、5hmC、5fC、及び5-カルボキシルシトシン(5caC:5-carboxylcytsine)へと多段階的なヒドロキシル化反応を介してシトシンに変換されることが明らかになっている(非特許文献7〜10)。しかし、各反応の具体的な機序については不明な点も多い。DNA脱メチル化は、生殖細胞等の細胞の初期化を含めた遺伝子機能の再活性化において極めて重要なDNA上の変化である。
DNAメチル化及びDNA脱メチル化によるエピジェネティックな制御機構を解明できれば、遺伝子発現や細胞の分化又は老化のモニタリング、及びプロファイリングが可能となり、iPS細胞やES細胞を用いた再生医療分野、癌治療分野、及びエピジェネティクスの基礎研究分野等にも応用できる。それ故にDNAメチル化やDNA脱メチル化の効率的な解析方法の開発が求められている。
DNAメチル化の場合、バイサルファイトシークエンス法、qAMP(quantitative analysis of DNA methylation using real-time PCR)法、COBRA(combined bisulfite restriction analysis)法、メチル化DNA免疫沈降法等の比較的低コストで精度の高い解析方法が開発されている。一方、DNA脱メチル化の場合、そのような解析方法が未だに開発されていない。DNA脱メチル化では、多段階ヒドロキシル化反応の初期中間産物である5hmCの検出が解析の鍵であり、この物質を低コストで特異的に検出する方法の開発が重要となる。
5hmCを検出する方法として、これまでに酵素を用いて5hmCの水酸基に糖を修飾する方法(非特許文献11〜13)、抗5hmC抗体で捕捉する方法(非特許文献14)、及びルテニウム酸塩を用いる方法(非特許文献15)が知られている。
しかし、糖修飾方法は、糖修飾を触媒する酵素活性によって左右されやすいという問題や解析精度が低いという問題があった。
また、抗体捕捉方法は、5hmCを含むDNA断片は回収できるものの、そのDNA断片中における5hmCの位置までは特定できない。したがって、DNA断片回収後、別途、5hmCの位置を特定する作業を行わなければならないという問題があった。
ルテニウム酸塩を用いる方法は、5hmCを検出する方法として、現在最も一般的に使用されている方法である。この方法では、過ルテニウム酸カリウム等のルテニウム酸塩により5hmCの水酸基を酸化して、生じた5fCを検出することを原理としている。ところが、ルテニウムはレアメタルのためルテニウム酸塩が高価というコスト的な問題があった。またルテニウム酸塩は非特異的に水酸基を酸化することから生体分子における他の水酸基に対する副反応が多いという問題があった。さらに、DNA構造の不安定化や分解等の副作用も示唆されている。
以上のように、従来の5hmC検出方法は、いずれの方法も検出精度が十分ではなく、偽陽性率が高かった。DNA上の脱メチル化部位を特異的に検出することができれば、遺伝子特異的操作による分化誘導や疾病に対する遺伝子標的療法をデザインしやすくなる。それ故、低コストで、より精度の高いDNA脱メチル化検出方法の開発が求められている。
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本発明は、副反応を抑制し、かつDNA上の5hmCを選択的に酸化して5fCに変換することのできる、安価で新規な5hmC酸化剤を開発し、提供することである。
本発明は、DNA脱メチル化の検出において偽陽性率を低減し、高い精度で脱メチル化部位を検出することができるDNA脱メチル化解析方法を開発し、提供することである。
5hmCは、アリルアルコール構造(図1破線枠内)を包含する。膨大な種類の生体分子においてアリルアルコール構造を有する分子は極めて稀な存在である。
そこで、本発明者らは、アリルアルコール構造が5hmC特異的な反応の標的部位となり得ると考え、当該構造中の水酸基を選択的に酸化することのできる、入手が容易で安価な試薬を探索した。その結果、ニトロキシルラジカル分子と銅イオンを5hmC酸化剤として用いることで、5hmCのアリルアルコール構造における水酸基を選択的に酸化し、5fCに変換できる新規方法を開発した。本発明は、当該開発結果に基づくもので、以下を提供する。
(1)以下の(a)及び/又は(b)からなる5hmC酸化剤。
(a)ニトロキシルラジカル分子及び銅塩又は銅錯体
(b)ニトロキシルラジカル分子−銅複合体
(2)以下の(c)をさらに含む、(1)に記載の5hmC酸化剤。
(c)ピリジン、ピピリジン、フェナンスロリン、エチレンジアミン、プロパンジアミン、イミダゾール、及びそれらの誘導体からなる群から選択される一以上の反応促進剤
(3)前記ニトロキシルラジカル分子が2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル、3-カルバモイル-2,2,5,5-テトラメチル-3-ピロリン-1-イルオキシ、2-アザアダマンタン-N-オキシル、9-アザビシクロ[3.3.1]ノナンN'-オキシル又はそれらの誘導体である、(1)に記載の5hmC酸化剤。
(4)前記(1)〜(3)のいずれかに記載の5hmC酸化剤を含むDNA脱メチル化解析試薬。
(5)亜硫酸水素塩をさらに含む、(4)に記載のDNA脱メチル化解析試薬。
(6)前記(5)に記載のDNA脱メチル化解析試薬を含むDNA脱メチル化解析キット。
(7)5hmCを酸化する方法であって、5hmCを含み得る被検物質と(1)〜(3)のいずれかに記載の5hmC酸化剤を反応溶液中で混合する混合工程、及び前記反応溶液を4〜90℃にて1〜100時間インキュベートして5hmCに含まれるアリルアルコール構造の水酸基を酸化する酸化工程、を含む前記方法。
(8)5hmCを解析する方法であって、DNAと(1)〜(3)のいずれかに記載の5hmC酸化剤を反応溶液中で混合する混合工程、前記反応溶液を4〜90℃にて1〜100時間インキュベートして5hmCを構成するアリルアルコール構造の水酸基を酸化する酸化工程、及び前記酸化工程で生成した5fCを検出する検出工程を含む前記方法。
(9)前記混合工程に先立ち、DNAに含まれる水素結合を切断する水素結合切断工程を含む、(8)に記載の方法。
(10)前記水素結合切断工程に先立ち、生物試料からDNAを抽出するDNA抽出工程を含む、(9)に記載の方法。
(11)前記水素結合切断工程でDNAを塩基性溶液に溶解して水素結合を切断する、(9)又は(10)に記載の方法。
(12)前記検出工程で5fCをバイサルファイトシーケンシング法で検出する、(8)〜(11)のいずれかに記載の方法。
(a)ニトロキシルラジカル分子及び銅塩又は銅錯体
(b)ニトロキシルラジカル分子−銅複合体
(2)以下の(c)をさらに含む、(1)に記載の5hmC酸化剤。
(c)ピリジン、ピピリジン、フェナンスロリン、エチレンジアミン、プロパンジアミン、イミダゾール、及びそれらの誘導体からなる群から選択される一以上の反応促進剤
(3)前記ニトロキシルラジカル分子が2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル、3-カルバモイル-2,2,5,5-テトラメチル-3-ピロリン-1-イルオキシ、2-アザアダマンタン-N-オキシル、9-アザビシクロ[3.3.1]ノナンN'-オキシル又はそれらの誘導体である、(1)に記載の5hmC酸化剤。
(4)前記(1)〜(3)のいずれかに記載の5hmC酸化剤を含むDNA脱メチル化解析試薬。
(5)亜硫酸水素塩をさらに含む、(4)に記載のDNA脱メチル化解析試薬。
(6)前記(5)に記載のDNA脱メチル化解析試薬を含むDNA脱メチル化解析キット。
(7)5hmCを酸化する方法であって、5hmCを含み得る被検物質と(1)〜(3)のいずれかに記載の5hmC酸化剤を反応溶液中で混合する混合工程、及び前記反応溶液を4〜90℃にて1〜100時間インキュベートして5hmCに含まれるアリルアルコール構造の水酸基を酸化する酸化工程、を含む前記方法。
(8)5hmCを解析する方法であって、DNAと(1)〜(3)のいずれかに記載の5hmC酸化剤を反応溶液中で混合する混合工程、前記反応溶液を4〜90℃にて1〜100時間インキュベートして5hmCを構成するアリルアルコール構造の水酸基を酸化する酸化工程、及び前記酸化工程で生成した5fCを検出する検出工程を含む前記方法。
(9)前記混合工程に先立ち、DNAに含まれる水素結合を切断する水素結合切断工程を含む、(8)に記載の方法。
(10)前記水素結合切断工程に先立ち、生物試料からDNAを抽出するDNA抽出工程を含む、(9)に記載の方法。
(11)前記水素結合切断工程でDNAを塩基性溶液に溶解して水素結合を切断する、(9)又は(10)に記載の方法。
(12)前記検出工程で5fCをバイサルファイトシーケンシング法で検出する、(8)〜(11)のいずれかに記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-175121号の開示内容を包含する。
本発明の5hmC酸化剤は、安価であり、また5hmCに存在するアリルアルコール構造の水酸基のみを選択的に酸化して、5fCに変換することができる。
本発明のDNA脱メチル化解析試薬及びそれを用いた5hmC解析方法によれば、DNA脱メチル化によって生じる5hmCをDNA構造に影響を及ぼすことなく5fCに変換し、それを検出することができる。また、その結果からDNA脱メチル化部位を高い精度で検出できる。
1.5-ヒドロキシメチルシトシン酸化剤
1−1.概要
本発明の第1の態様は、5-ヒドロキシメチルシトシン酸化剤(5hmC酸化剤)である。本発明の酸化剤は、5hmCに含まれるアリルアルコール構造の水酸基のみを酸化して5fCに変換することを特徴とする。本発明の酸化剤により、DNA分解等の副反応を生じることなく、低コストで生物試料に含まれ得る5hmCを選択的に酸化して、5fCに変換することができる。したがって、本発明の5hmC酸化剤は、5hmCから5fCへの変換剤と解することもできる。
1−1.概要
本発明の第1の態様は、5-ヒドロキシメチルシトシン酸化剤(5hmC酸化剤)である。本発明の酸化剤は、5hmCに含まれるアリルアルコール構造の水酸基のみを酸化して5fCに変換することを特徴とする。本発明の酸化剤により、DNA分解等の副反応を生じることなく、低コストで生物試料に含まれ得る5hmCを選択的に酸化して、5fCに変換することができる。したがって、本発明の5hmC酸化剤は、5hmCから5fCへの変換剤と解することもできる。
1−2.用語の定義
本明細書で頻用する用語について以下で定義する。
本明細書で頻用する用語について以下で定義する。
「5-ヒドロキシメチルシトシン」(5hmC)は、ピリミジン塩基の一つであるシトシンの修飾体で、生体内では前述のように5mCのメチル基がTET等の酵素の触媒活性によってヒドロキシル化されて生じる。DNA脱メチル化反応における起点物質であり、それ故に、DNA脱メチル化の指標となり得る。5hmCは、本発明の5hmC酸化剤の選択的な酸化対象となる標的分子である。
「アリルアルコール構造」は、アリルアルコール(2-プロペン-1-オール)の基本骨格を包含する分子内構造である。生体分子中には非常に稀にしか存在しない構造であるが、図1に示すように本発明の標的分子である5hmCは、分子内にアリルアルコール構造(図1の破線枠内)を有している。
「アリルアルコール」は、最も単純な構造を有する不飽和アルコールとして知られている。本発明の5hmC酸化剤は、アリルアルコール又はアリルアルコール構造中の水酸基を選択的に酸化する。前述のようにアリルアルコール構造は生体分子の中で稀にしか存在しないことから、本発明の5hmC酸化剤は、実質的に5hmCのみを選択的に酸化することが可能となる。
「5-ホルミルシトシン」(5fC)は、シトシンの修飾体であって、5hmCのアリルアルコール構造における水酸基の酸化によって生じる。生体内では、DNA脱メチル化反応において5hmCに続く中間産物として知られている(図1)。5hmCは直接的な検出が困難であるのに対して、5fCはバイサルファイト法をはじめとする様々な検出方法が確立しており、直接的な検出が容易である。それ故に、5hmCの化学的検出方法では、ルテニウム法のように5hmCを酸化して5fCに変換した後に、その5fCを検出する間接的検出方法が用いられている。後述する本発明の第5態様でも、この原理を応用している。
「生物試料」とは、生物由来の試料である。本明細書では、後述する第5態様の5-ヒドロキシメチルシトシン解析方法における被検物質であるDNA、好ましくは脱メチル化されたDNAを含み得る試料が該当し得る。具体的には、例えば、細胞(組織、器官を含む)及び細胞を含み得る体液等である。本明細書において「体液」とは、個体から直接採取される流体試料をいう。例えば、血液(全血、血清、血漿及び間質液を含む)、リンパ液、脳脊髄液、神経根周囲液、滑液、涙液、鼻汁、唾液、尿、汗、乳、痰、膣液、精液、胸水、腹水等が該当する。本発明で使用する生物試料は、いずれの組織や器官の細胞、又は前記いずれの体液であってもよい。また、生体由来、すなわち生きている個体から採取した生物試料を用いる場合には、採取の際に個体に対する侵襲性の低い細胞又は体液であることが好ましい。例えば、細胞であれば、口腔粘膜、鼻粘膜、膣粘膜及び腸粘膜を構成する上皮細胞、毛母細胞、及び角質細胞が挙げられる。また、体液であれば、血液、唾液、鼻汁、痰、膣液、及び精液が挙げられる。
本明細書において、直接的な標的となる5hmCは、アリルアルコール構造を保持する限り、いかなる状態で存在していてもよい。例えば、ピリミジン塩基としての遊離状態、ペプチドや有機高分子と結合した状態、又は核酸の構成塩基状態が挙げられる。通常はDNA及びRNA等の核酸の構成単位であるヌクレオチド(リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドを含む)又はヌクレオチドを構成するヌクレオシド(リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含む)の構成塩基として存在する。生体試料に含まれる場合、5hmCを含む核酸は天然由来であるが、本発明の対象となる核酸は、天然由来である必要はなく、人工合成した核酸も含む。例えば、5hmCを含む化学合成したDNAであってもよい。
1−3.構成
1−3−1.構成成分
本発明の5hmC酸化剤は、ニトロキシルラジカル分子及び銅塩又は銅錯体、及び/又はニトロキシルラジカル分子−銅複合体で構成される。これらはいずれも比較的安価で入手することが可能である。また、必要に応じて反応促進剤を本発明の酸化剤の構成成分として追加することもできる。
1−3−1.構成成分
本発明の5hmC酸化剤は、ニトロキシルラジカル分子及び銅塩又は銅錯体、及び/又はニトロキシルラジカル分子−銅複合体で構成される。これらはいずれも比較的安価で入手することが可能である。また、必要に応じて反応促進剤を本発明の酸化剤の構成成分として追加することもできる。
本明細書において「ニトロキシルラジカル分子」とは、分子内にニトロキシルラジカル(-NO・)を1以上有する化合物をいう。ニトロキシルラジカルは、ニトロキシドラジカルとも呼ばれ、窒素原子を中心ラジカルとするラジカル分子である。活性酸素や酸化還元物質に対して高い反応性を有するものの、酸素原子上のラジカル種と窒素原子中心のカチオンラジカル種との共鳴構造により比較的安定なラジカルとして知られている。ニトロキシルラジカル分子は、本発明の5hmC酸化剤における必須の構成成分である。
本発明で使用するニトロキシルラジカル分子は、有機ニトロキシルラジカル分子及び無機ニトロキシルラジカル分子のいずれであってもよいが、好ましくは有機ニトロキシルラジカル分子である。
ニトロキシルラジカル分子の種類は、限定はしないが、例えば、2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル(TEMPO:以下、しばしば「TEMPO」と表記する)、3-カルバモイル-2,2,5,5-テトラメチル-3-ピロリン-1-イルオキシ(3-Carbamoyl-PROXYL:以下、しばしば「3-Carbamoyl-PROXYL」と表記する)、2-アザアダマンタン-N-オキシル(AZADO:以下、しばしば「AZADO」と表記する)、9-アザビシクロ[3.3.1]ノナンN'−オキシル(ABNO:以下、しばしば「ABNO」と表記する)、及びそれらの誘導体が挙げられる。
本明細書において「銅塩」とは、陽イオンである銅(Cu)イオンと酸由来の陰イオンが結合した化合物をいう。無機化合物及び有機化合物のいずれであってもよいが、通常は、無機化合物である。銅イオンは1価の銅イオン(Cu+:銅(I)イオン)、2価の銅イオン(Cu2+:銅(II)イオン)を問わないが、2価の銅イオンが好ましい。銅(I)イオンを有する銅塩の具体例としては、塩化銅(I)(CuCl)、過塩素酸銅(I)(CuClO4)、酸化銅(I)(Cu2O)、銅(I)トリフラート等が挙げられる。また、銅(II)イオンを有する銅塩の具体例としては、塩化銅(II)(CuCl2)、過塩素酸銅(I)(Cu(ClO4)2)、酸化銅(II)(CuO)、銅(II)トリフラート、硫化銅(CuS)、硫酸銅(CuSO4)等が挙げられる。塩化銅(I)イオンを有する銅塩を用いる場合、ニトロキシルラジカル分子や酸化剤によって、反応系中で銅(II)イオンを生じさせてもよい。「銅塩」及び後述する「銅錯体」は、少なくとも一方が本発明の5hmC酸化剤における必須の構成成分となる。
本明細書において「銅錯体」とは、銅イオンとそれに結合した配位子の複合体をいう。銅イオンと結合する配位子は特に制限はしない。銅錯体の例としては、アンモニアが配位子の銅テトラアンミン銅(II)錯体が挙げられる。後述するニトロキシルラジカル分子−銅複合体前述の銅錯体の一つである。
本明細書において「ニトロキシルラジカル分子−銅複合体」とは、ニトロキシルラジカル分子を配位子として銅イオンと結合して形成される複合体で、5hmCにおけるアリルアルコール基の酸化に直接寄与する化合物である。ニトロキシルラジカル分子−銅複合体は、前述のニトロキシルラジカル分子と銅塩又は銅錯体を溶液中で混合することで形成される。つまり、ニトロキシルラジカル分子−銅複合体は、5hmC酸化剤において、ニトロキシルラジカル分子と銅塩又は銅錯体よりも反応が一段階進んだ化合物と言える。したがって、ニトロキシルラジカル分子−銅複合体は、それ単独で本発明の5hmC酸化剤として機能し得る。
本発明の5hmC酸化剤は、ニトロキシルラジカル分子と銅塩又は銅錯体の組み合わせ、ニトロキシルラジカル分子−銅複合体単独、並びにニトロキシルラジカル分子と銅塩又は銅錯体の組み合わせ、及びニトロキシルラジカル分子−銅複合体の混合物であってもよい。
本明細書において「反応促進剤」とは、本発明の5hmC酸化剤を構成する選択成分であって、ニトロキシルラジカル分子−銅複合体によるアリルアルコール構造の水酸基の酸化を促進する酸化補助剤としての機能を有する化合物である。前記機能を有する限り、反応促進剤の種類は特に限定はしない。例えば、ピリジン、ピピリジン、フェナンスロリン、エチレンジアミン、プロパンジアミン、イミダゾール、及びそれらの誘導体が挙げられる。5hmC酸化剤を構成する反応促進剤は、単一種であってもよいし、複数種の組み合わせであってもよい。
1−3−2.形態
本発明の5hmC酸化剤の形態は、特に限定はしない。固体形態(粉末、顆粒、ゲルを含む)、又は液体形態のいずれであってもよい。構成成分ごとに異なる形態とすることもできる。例えば、ニトロキシルラジカル分子を粉末とし、銅塩はイオン状態で存在する水溶液とすることも可能である。
本発明の5hmC酸化剤の形態は、特に限定はしない。固体形態(粉末、顆粒、ゲルを含む)、又は液体形態のいずれであってもよい。構成成分ごとに異なる形態とすることもできる。例えば、ニトロキシルラジカル分子を粉末とし、銅塩はイオン状態で存在する水溶液とすることも可能である。
また、各構成成分は全てを、又は一部を、個別に分けておくことができる。この場合、5hmCの酸化反応時に全ての構成成分を混合することで、5hmC酸化剤としての効果を発揮し得る。
一方、各構成成分を予め一体化していてもよい。例えば、ニトロキシルラジカル分子と銅塩のそれぞれの粉末を混合した状態や、溶液中にニトロキシルラジカル分子と銅塩を溶解した混合溶液状態が挙げられる。
2.DNA脱メチル化解析試薬
2−1.概要
本発明の第2の態様は、DNA脱メチル化解析試薬である。本発明の解析試薬は、第1態様の5hmC酸化剤を含む。本発明の解析試薬によれば、DNA脱メチル化の起点物質であり、5hmC酸化剤の標的物質である5hmCの酸化によって生じる5fCを検出することでDNA上に生じた脱メチル化部位を同定することができる。
2−1.概要
本発明の第2の態様は、DNA脱メチル化解析試薬である。本発明の解析試薬は、第1態様の5hmC酸化剤を含む。本発明の解析試薬によれば、DNA脱メチル化の起点物質であり、5hmC酸化剤の標的物質である5hmCの酸化によって生じる5fCを検出することでDNA上に生じた脱メチル化部位を同定することができる。
2−2.定義
本明細書において「解析」は、しばしば間接的な検出及び/又は同定を意味する用語として用いる。例えば、本態様のDNA脱メチル化解析試薬は、DNA上の脱メチル化の有無を第1態様の5hmC酸化剤によって生じる5fCの検出を介して間接的に検出し、DNA上の脱メチル化部位を5fCのDNA上での位置情報として間接的に同定することのできる試薬をいう。また、後述する第3態様のDNA脱メチル化解析キットは、DNAの脱メチル化の有無を間接的に検出し、DNA上の脱メチル化部位を間接的に同定することのできるキットをいい、さらに第5態様の5hmC解析方法は、DNAにおける5hmCの有無を5fCの検出を介して間接的に検出し、及び/又は5hmCを含む場合には5hmCのDNA上での位置情報を5fCの位置情報として間接的に同定することをいう。
本明細書において「解析」は、しばしば間接的な検出及び/又は同定を意味する用語として用いる。例えば、本態様のDNA脱メチル化解析試薬は、DNA上の脱メチル化の有無を第1態様の5hmC酸化剤によって生じる5fCの検出を介して間接的に検出し、DNA上の脱メチル化部位を5fCのDNA上での位置情報として間接的に同定することのできる試薬をいう。また、後述する第3態様のDNA脱メチル化解析キットは、DNAの脱メチル化の有無を間接的に検出し、DNA上の脱メチル化部位を間接的に同定することのできるキットをいい、さらに第5態様の5hmC解析方法は、DNAにおける5hmCの有無を5fCの検出を介して間接的に検出し、及び/又は5hmCを含む場合には5hmCのDNA上での位置情報を5fCの位置情報として間接的に同定することをいう。
2−3.構成
2−3−1.構成成分
本発明のDNA脱メチル化解析試薬は、5hmC酸化剤と、5hmCの酸化によって生じた5fCを検出する5fC検出剤を必須の構成成分を包含する。
(5hmC酸化剤)
5hmC酸化剤は、前述の第1態様に記載の5hmC酸化剤である。したがって、5hmC酸化剤の具体的な構成は、第1態様に準ずることから、ここではその説明を省略する。
(5fC検出剤)
5fC検出剤の具体的な構成は、DNA上の5fCを検出可能な方法で用いる試薬であれば限定はしない。例えば、バイサルファイトシーケンシング法に用いられる亜硫酸水素塩が挙げられる。亜硫酸水素塩の具体例としては、亜硫酸水素ナトリウム(NaHSO3)、亜硫酸水素カリウム(KHSO3)、亜硫酸水素アンモニウム((NH4)HSO4)等が挙げられる。
2−3−1.構成成分
本発明のDNA脱メチル化解析試薬は、5hmC酸化剤と、5hmCの酸化によって生じた5fCを検出する5fC検出剤を必須の構成成分を包含する。
(5hmC酸化剤)
5hmC酸化剤は、前述の第1態様に記載の5hmC酸化剤である。したがって、5hmC酸化剤の具体的な構成は、第1態様に準ずることから、ここではその説明を省略する。
(5fC検出剤)
5fC検出剤の具体的な構成は、DNA上の5fCを検出可能な方法で用いる試薬であれば限定はしない。例えば、バイサルファイトシーケンシング法に用いられる亜硫酸水素塩が挙げられる。亜硫酸水素塩の具体例としては、亜硫酸水素ナトリウム(NaHSO3)、亜硫酸水素カリウム(KHSO3)、亜硫酸水素アンモニウム((NH4)HSO4)等が挙げられる。
2−3−2.形態
本発明のDNA脱メチル化解析試薬における各構成成分の形態は、特に限定はしない。固体形態(粉末、顆粒、ゲルを含む)、又は液体形態のいずれであってもよい。構成成分ごとに異なる形態とすることもできる。例えば、5hmC酸化剤は液体で、5fC検出剤は粉末とすることができる。
本発明のDNA脱メチル化解析試薬における各構成成分の形態は、特に限定はしない。固体形態(粉末、顆粒、ゲルを含む)、又は液体形態のいずれであってもよい。構成成分ごとに異なる形態とすることもできる。例えば、5hmC酸化剤は液体で、5fC検出剤は粉末とすることができる。
本発明のDNA脱メチル化解析試薬における各構成成分は、原則として個別に分離されている。例えば、5hmC酸化剤と5fC検出剤は、個別包装されており、DNA上の5hmCを検出する際には、それぞれの構成成分を使用する適切な反応工程において個別に使用すればよい。
3.DNA脱メチル化解析キット
3−1.概要
本発明の第3の態様は、DNA脱メチル化解析キットである。本発明のキットにはDNA脱メチル化を解析する上で必要な試薬等が組み込まれている。本発明のキットを用いることで、DNA脱メチル化解析を簡便に実施することが可能となる。
3−1.概要
本発明の第3の態様は、DNA脱メチル化解析キットである。本発明のキットにはDNA脱メチル化を解析する上で必要な試薬等が組み込まれている。本発明のキットを用いることで、DNA脱メチル化解析を簡便に実施することが可能となる。
3−2.構成
本発明のDNA脱メチル化解析キットは、DNA脱メチル化解析試薬を必須構成要素として含み、DNA脱メチル化反応に必要な選択試薬、反応容器、及び使用説明書等を必要に応じて含んでいる。以下、上記各構成要素について説明をする。
本発明のDNA脱メチル化解析キットは、DNA脱メチル化解析試薬を必須構成要素として含み、DNA脱メチル化反応に必要な選択試薬、反応容器、及び使用説明書等を必要に応じて含んでいる。以下、上記各構成要素について説明をする。
「DNA脱メチル化解析試薬」は、前述の第2態様に記載のDNA脱メチル化解析試薬である。DNA脱メチル化解析試薬の具体的構成は第2態様に記載した通りであり、ここではその説明を省略する。
「選択試薬」は、本発明のキットにおける選択的構成要素であり、必要に応じて適宜選択し、キットに加えることができる。選択試薬には、例えば、バッファ、標識試薬等が挙げられるがこれに限定されない。「バッファ」は、各工程において、DNAの分離、精製のような試料の適切な処理や、又は円滑な反応に使用される溶媒又は溶液であって、その成分やpHは、適宜定めればよい。「標識試薬」は、核酸や塩基の標識に用いられる試薬であって、当該分野で公知の標識試薬を用いることができる。例えば、蛍光色素(例えば、フルオレサミン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、FITC、cy3、cy5、FAM、HEX、VIC)、クエンチャー物質(TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、又はBHQ-3)、ビオチン、アビジン若しくはストレプトアビジン、又は磁気ビーズ等の修飾物質、あるいは放射性同位元素(例えば、32P、33P、35S)等が挙げられる。
「反応容器」は、DNA脱メチル化解析を実施する際に、試料の処理や反応を行うために使用される容器をいう。試料の処理や反応に用いるものであればよく、大きさ、形状、容量は特に限定はしない。例えば、50mLチューブ、1.5mLチューブ、0.2mLチューブ、96穴マイクロタイタープレートが挙げられる。素材もDNA脱メチル化解析の反応に影響しなければ特に限定はしない。例えば、ポリプロピレンやポリエチレンのようなプラスチック、ガラス、陶器、金属等が挙げられる。また、内容物を保持する容器ではないが、フィルターやチップ等の周辺器材も含まれる。
「使用説明書」は、本発明のキット内に包含された試料を用いてDNA脱メチル化解析を行う上で適切な反応条件(用量、反応時間、反応温度等)を記載したものである。
4.5-ヒドロキシメチルシトシン酸化方法
4−1.概要
本発明の第4の態様は、5hmCを酸化する方法(5hmC酸化方法)である。本発明の酸化方法は、第1態様に記載の5hmC酸化剤を用いる方法で、5hmCに含まれるアリルアルコール構造の水酸基を選択的に酸化して、5hmCを5fCに変換することができる。
4−1.概要
本発明の第4の態様は、5hmCを酸化する方法(5hmC酸化方法)である。本発明の酸化方法は、第1態様に記載の5hmC酸化剤を用いる方法で、5hmCに含まれるアリルアルコール構造の水酸基を選択的に酸化して、5hmCを5fCに変換することができる。
4−2.方法
本発明の酸化方法は、「混合工程」及び「酸化工程」を必須の工程として含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
(1)混合工程
「混合工程」とは、被検物質と第1態様に記載した5hmC酸化剤を反応溶液中で混合する工程である。
本発明の酸化方法は、「混合工程」及び「酸化工程」を必須の工程として含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
(1)混合工程
「混合工程」とは、被検物質と第1態様に記載した5hmC酸化剤を反応溶液中で混合する工程である。
「被検物質」とは、本方法に供される5hmCを含み得る物質をいう。通常は被検対象である生体由来の核酸、特にDNA、より好ましくはゲノムDNAが該当するが、それに限られない。なお、生体内でDNAは、通常、二本鎖で存在するが、本方法に供する場合には、5hmCが他の塩基と対合していない状態でなければならない。したがって、本工程で使用する被検物質がDNAである場合、そのDNAは、原則として一本鎖である。
「被検対象」とは、本発明の5hmC解析方法に供される生物個体、生物組織(器官を含む)、又は細胞である。生物種は、動物、植物、真菌、又は細菌のいずれであってもよい。限定はしないが、動物は本発明の被検対象として好ましく、脊椎動物はより好ましい。哺乳動物、特にヒトは本発明の被検対象として好適である。
「混合」とは、性質の異なる2以上の物質が互いに接触するように混ぜ合わせることをいう。なお、本工程において混合は、反応溶液中、すなわち液体中で行われる。
5hmC酸化剤を構成するニトロキシルラジカル分子、銅塩又は銅錯体、及びニトロキシルラジカル分子−銅複合体は、反応溶液中にいずれも1〜10000当量、好ましくは10〜1000当量が含まれていることが望ましい。
第1態様に記載した5hmC酸化剤が2以上の構成成分、例えば、ニトロキシルラジカル分子及び銅塩又は銅錯体からなる場合、本工程で5hmC酸化剤の構成成分と被検物質とを混合する順序は問わない。被検物質、ニトロキシルラジカル分子、及び銅塩又は銅錯体の順序で加えて混合してもよいし、被検物質、銅塩又は銅錯体、及びニトロキシルラジカル分子の順序で加えて混合してもよい。また、ニトロキシルラジカル分子、銅塩又は銅錯体、及び被検物質の順序で加えて混合することもできるし、被検物質、ニトロキシルラジカル分子、及び銅塩又は銅錯体を同時に加えて混合することもできる。
本工程において混合方法は特に限定はしない。撹拌子や撹拌棒を用いて反応溶液を撹拌してもよいし、反応槽を反転、回転、振動することによって混合してもよい。
(2)酸化工程
「酸化工程」とは、混合工程後の前記反応溶液を4〜90℃、好ましくは15〜70℃、より好ましくは25〜60℃にて1〜100時間、好ましくは5〜50時間、より好ましくは10〜24時間インキュベートして5hmCに含まれるアリルアルコール構造の水酸基を酸化する工程である。
「酸化工程」とは、混合工程後の前記反応溶液を4〜90℃、好ましくは15〜70℃、より好ましくは25〜60℃にて1〜100時間、好ましくは5〜50時間、より好ましくは10〜24時間インキュベートして5hmCに含まれるアリルアルコール構造の水酸基を酸化する工程である。
本工程の期間中、反応溶液は、静置状態であってもよいし、溶液中の温度を均一化するために撹拌してもよい。インキュベーター内のように周囲の温度が一定の場所で本工程を行う場合には、通常は静置状態で足りる。
本工程後の反応溶液は、第1態様の5hmC酸化剤によって5hmCにおけるアリルアルコール構造の水酸基が選択的に酸化されて生じた、5fCを包含するDNAを含み得る。
5.5-ヒドロキシメチルシトシン解析方法
5−1.概要
本発明の第5の態様は、5-ヒドロキシメチルシトシンを解析する方法(5hmC解析方法)である。本発明の方法は、脱メチル化反応によって生体試料中のDNA上に生じた5hmCを前記第4態様の5hmC酸化方法によって5fCに変換した後に、その5fCを検出することで5hmCを間接的に検出する方法である。本方法によって、DNA上の脱メチル化部位を同定することができる。
5−1.概要
本発明の第5の態様は、5-ヒドロキシメチルシトシンを解析する方法(5hmC解析方法)である。本発明の方法は、脱メチル化反応によって生体試料中のDNA上に生じた5hmCを前記第4態様の5hmC酸化方法によって5fCに変換した後に、その5fCを検出することで5hmCを間接的に検出する方法である。本方法によって、DNA上の脱メチル化部位を同定することができる。
5−2.方法
本発明の解析方法は、「混合工程」、「酸化工程」及び「検出工程」を必須の工程として、また「DNA抽出工程」、及び「水素結合切断工程」を選択工程として含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
(1)DNA抽出工程
「DNA抽出工程」とは、後述する水素結合切断工程に先立ち、生物試料からDNA、特にゲノムDNAのような高分子DNAを抽出する工程である。DNAを抽出する方法は、生物試料から高分子DNAを抽出できれば特に限定はない。例えば、生物試料をプロテイナーゼKでタンパク質分解した後、フェノール及びクロロホルム溶液で処理する方法や、hot-shot法等が挙げられる。高分子DNAの具体的な抽出方法については、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法を参考にすればよい。生物試料からゲノムDNA等の高分子DNAを抽出するキットが各メーカーから市販されており、それらを利用することもできる。その場合、具体的な抽出方法は、キットに添付の説明書に従えばよい。
本発明の解析方法は、「混合工程」、「酸化工程」及び「検出工程」を必須の工程として、また「DNA抽出工程」、及び「水素結合切断工程」を選択工程として含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
(1)DNA抽出工程
「DNA抽出工程」とは、後述する水素結合切断工程に先立ち、生物試料からDNA、特にゲノムDNAのような高分子DNAを抽出する工程である。DNAを抽出する方法は、生物試料から高分子DNAを抽出できれば特に限定はない。例えば、生物試料をプロテイナーゼKでタンパク質分解した後、フェノール及びクロロホルム溶液で処理する方法や、hot-shot法等が挙げられる。高分子DNAの具体的な抽出方法については、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法を参考にすればよい。生物試料からゲノムDNA等の高分子DNAを抽出するキットが各メーカーから市販されており、それらを利用することもできる。その場合、具体的な抽出方法は、キットに添付の説明書に従えばよい。
(2)水素結合切断工程
「水素結合切断工程」とは、DNAが二本鎖の場合に塩基間の水素結合を切断して一本鎖DNAに変性させる工程である。
「水素結合切断工程」とは、DNAが二本鎖の場合に塩基間の水素結合を切断して一本鎖DNAに変性させる工程である。
生物由来のDNAは、通常、二本鎖状態である。しかし、第4態様に記載の5hmC酸化方法によりDNA中の5hmCを酸化する場合、上述のようにDNAは自己折り畳み構造のない一本鎖状態でなければならない。そこで、本工程では、二本鎖DNAの水素結合を切断し、一本鎖DNAにすることを目的とする。ただし、前記DNA抽出工程により得られたDNAが一本鎖の場合、本工程は不要である。
水素結合を切断する方法は、DNAにおける他の化学結合に影響を与えない方法であれば特に限定はなく、当該分野の常法に従えばよい。例えば、NaOH等の強アルカリによって切断するアルカリ処理や、高温処理、又はDNAヘリカーゼ処理等が挙げられる。水素結合の切断方法については、前述のGreen, M.R. and Sambrook, J.(2012)に記載の方法を参考にすることもできる。
(3)混合工程
「混合工程」は、前記第4態様の5hmC酸化方法における混合工程に準ずる工程である。工程の具体的な説明は第4態様に記載した通りであることから、ここでの説明は省略する。
「混合工程」は、前記第4態様の5hmC酸化方法における混合工程に準ずる工程である。工程の具体的な説明は第4態様に記載した通りであることから、ここでの説明は省略する。
(4)酸化工程
「酸化工程」は、前述の混合工程と同様に、前記第4態様の5hmC酸化方法における酸化工程に準ずる工程である。工程の具体的な説明は第4態様に記載した通りであることから、ここでの説明は省略する。
「酸化工程」は、前述の混合工程と同様に、前記第4態様の5hmC酸化方法における酸化工程に準ずる工程である。工程の具体的な説明は第4態様に記載した通りであることから、ここでの説明は省略する。
(5)検出工程
「検出工程」とは、前記酸化工程で生成した5fCを検出する工程である。5fCを検出する方法は、当該分野で公知の方法を使用すればよく、特に限定はしない。例えば、酵素処理による同定方法、化学分解反応による同定方法、標識試薬を用いた同定方法、バイサルファイトシーケンシング法等が挙げられる。
「検出工程」とは、前記酸化工程で生成した5fCを検出する工程である。5fCを検出する方法は、当該分野で公知の方法を使用すればよく、特に限定はしない。例えば、酵素処理による同定方法、化学分解反応による同定方法、標識試薬を用いた同定方法、バイサルファイトシーケンシング法等が挙げられる。
酵素処理による同定方法は、例えば、アルカリフォスファターゼ(AP)及びヌクレアーゼP1(P1)等の酵素を用いる方法が挙げられる。この方法では、酸化工程後に得られた核酸を前記酵素によってヌクレオシドまで分解する。分解時に、さらにフォスフォジエステラーゼを添加することで、より効率的にヌクレオシドに分解することもできる。続いて、得られたヌクレオシドをHPLCやTLC等で解析し、5fCを検出することができる。
化学分解反応による同定方法は、例えば、ピペリジンを用いた5fCを含むDNAの切断反応が挙げられる。5fCを含むDNAにピペリジンで処理した場合、5fCの3’側、続いて5’側で切断反応が生じる。一方、5hmC、シトシン、5-メチルシトシンでは切断反応は生じない。反応後のDNAをゲル電気泳動等で分解し、DNAサイズの差に基づく切断の有無を確認することによって5fCを検出できる。その際、分解前のDNAの末端部を適当な標識試薬で標識しておくと検出が容易になり便利である。また、DNAの塩基配列における5fCの正確な位置を同定した場合には、分解反応前のDNAと分解反応後のDNAについてそれぞれの塩基配列を決定して両配列を比較すればよい。
標識試薬を用いた同定方法は、ヒドラジド基を有する標識試薬、例えば、ビオチンヒドラジドやフルオレセインヒドラジドで5hmCを標識化し、その後、標識試薬の性質に基づいて5fCを検出することができる。
バイサルファイトシーケンシング法は、バイサルファイト処理による非メチル化シトシンからウラシル(U)への塩基変換を利用した方法で、5fCの検出方法として最も一般的な方法の一つである。5mC及び5hmCでは、バイサルファイト処理後も上記Uへの塩基変換が起きないため、処理後のDNAに対してPCR等の核酸増幅反応を行った場合、その位置はCとなる。一方、C、5fC及び5caCは、バイサルファイト処理後にUに変換されるため、核酸増幅反応後にその位置はチミン(T)に変化する。ここで、バイサルファイト処理に先立ち、本発明の第4態様に記載の5hmC酸化方法でDNAを処理した場合、5hmCは5fCに変換されるため、その後のバイサルファイト処理と核酸増幅反応後には、Tとなる。つまり、C、5mC、5hmC、5fC、及び5caCにおいて、5hmCのみがバイサルファイト処理後、及びバイサルファイト処理と本発明の本発明の5hmC酸化方法の組み合わせの処理後で、核酸増幅反応の塩基が変化する。したがって、DNAに対してバイサルファイト処理の有無と本発明の5hmC酸化方法処理の有無の各組み合わせを行い、得られたそれぞれのDNAを核酸増幅して塩基配列を決定し、比較することで5hmCの位置を容易に同定することができる。
<実施例1>
(目的)
本発明の5hmC酸化方法によって、DNA中の5hmCが特異的に酸化され、5fCに変換されることを、ピペリジンを用いた切断反応によって検証する。
(目的)
本発明の5hmC酸化方法によって、DNA中の5hmCが特異的に酸化され、5fCに変換されることを、ピペリジンを用いた切断反応によって検証する。
(方法)
標的DNAとして、配列番号3で示す塩基配列(5’-Fluo-aaaaaagxgaaaaaa-3';x=5hmC)からなるヌクレオチドを合成した(株式会社ジーンデザインに合成を委託)。この標的DNAは、5’末端をフルオレセイン(Fluorescein)で蛍光標識している。
標的DNAとして、配列番号3で示す塩基配列(5’-Fluo-aaaaaagxgaaaaaa-3';x=5hmC)からなるヌクレオチドを合成した(株式会社ジーンデザインに合成を委託)。この標的DNAは、5’末端をフルオレセイン(Fluorescein)で蛍光標識している。
続いて、2μLの100μM標的DNA(15mer)、55μLのMilliQ、10μLの50mM Cu(ClO4)2、10μLの50mM TEMPO/アセトニトリル溶液、10μLの50mM NaOH、及び15μL 50mMのビピリジン/アセトニトリル溶液を1.5mLサンプルチューブに入れて混合し(混合工程)。TEMPO及びCu(ClO4)2が本発明の5hmC酸化剤を構成するニトロキシルラジカル分子及び銅塩にそれぞれ該当する。対照用として、TEMPO/アセトニトリル溶液、又はCu(ClO4)2の一方を加えないサンプルを調製した。混合後、50℃で44.5時間放置した(酸化工程)。
次に、溶液をバイオスピンカラム(BioRad社)に移し、1000 rpmで4分間遠心してCuを除き、ピぺリジンを8.9μL加えた。この時点におけるピぺリジン濃度は15%である。なお、対照用として、ピペリジンを加えないサンプルも調製した。90℃で2時間インキュベートした後、溶液を減圧濃縮装置(EYELA社;遠心エバポレーターCVE3100)で40分間濃縮乾燥し、溶媒を除去した。
配列番号3で示す塩基配列からなる標的DNAにおいてxで示す5hmCが本発明の5hmC酸化剤によって5fCに変換された場合、ピペリジン処理によって、まず5fCの3’側で切断が生じ、続いて5fCの5’側でも切断が生じる。その結果、5fCは除去され、2本の7merからなる切断DNA断片が生じる(図2参照)。
得られた核酸を20%アクリロアミドビスゲル電気泳動により分解した。DNAサイズのマーカー用として、未処理の15mer標的DNA及び切断後のDNAに相当する7merのDNAを同時に泳動した。泳動後、DNAをフルオレセインによって検出し、DNAバンドの蛍光強度を画像処理ソフトウェアImageJ(http://imagej.nih.gov/ij/)で解析した。
(結果)
図3にゲル電気泳動図を、また図4には、図3のDNAバンドの蛍光強度をグラフ化した図を示す。TEMPO及びCu(ClO4)2を加えたレーン7でのみ7merのDNAバンドが確認された。一方、TEMPO及びCu(ClO4)2を加えたサンプルであっても、ピペリジンを添加していないレーン6では7merのDNAバンドは確認できなかった。以上の結果は、レーン7の7merのDNAは、本発明の5hmC酸化剤であるTEMPO及びCu(ClO4)2によって標的DNA中の5hmCが5fCに変換された結果、ピペリジンによって切断されたことを示唆している。
図3にゲル電気泳動図を、また図4には、図3のDNAバンドの蛍光強度をグラフ化した図を示す。TEMPO及びCu(ClO4)2を加えたレーン7でのみ7merのDNAバンドが確認された。一方、TEMPO及びCu(ClO4)2を加えたサンプルであっても、ピペリジンを添加していないレーン6では7merのDNAバンドは確認できなかった。以上の結果は、レーン7の7merのDNAは、本発明の5hmC酸化剤であるTEMPO及びCu(ClO4)2によって標的DNA中の5hmCが5fCに変換された結果、ピペリジンによって切断されたことを示唆している。
<実施例2>
(目的)
本発明の5hmC酸化剤によるデオキシ5-ヒドロキシメチルシチジンの特異的酸化を検証した。
(目的)
本発明の5hmC酸化剤によるデオキシ5-ヒドロキシメチルシチジンの特異的酸化を検証した。
(方法)
検証用ヌクレオシドにはデオキシ5-ヒドロキシメチルシチジン(d5hmC)を、また対照用ヌクレオシドにはデオキシ5-メチルシチジン(d5mC)を用いた。17μMヌクレオシド、4.3mM Cu(ClO4)2、4.3mM TEMPO、4.3mM NaOH、及び6.5mMのビピリジンを含む溶液を室温で1〜3日放置した。その後、水で5倍希釈した後、HPLCで解析した。HPLCは、逆相カラム(Thermo BioBasic-18,180x4.6)を用いて、流速1mL/minで溶出し、254nmの光を用いてシグナル検出をした。溶出液は、2%から10%の酢酸トリエチルアンモニウムのアセトニトリル溶液を用いた。
検証用ヌクレオシドにはデオキシ5-ヒドロキシメチルシチジン(d5hmC)を、また対照用ヌクレオシドにはデオキシ5-メチルシチジン(d5mC)を用いた。17μMヌクレオシド、4.3mM Cu(ClO4)2、4.3mM TEMPO、4.3mM NaOH、及び6.5mMのビピリジンを含む溶液を室温で1〜3日放置した。その後、水で5倍希釈した後、HPLCで解析した。HPLCは、逆相カラム(Thermo BioBasic-18,180x4.6)を用いて、流速1mL/minで溶出し、254nmの光を用いてシグナル検出をした。溶出液は、2%から10%の酢酸トリエチルアンモニウムのアセトニトリル溶液を用いた。
(結果)
本実施例の結果を図5に示す。
本実施例の結果を図5に示す。
図5Aは、第1態様の5hmC酸化剤を用いたときの(a)d5hmC、及び(b)d5mCにおける酸化反応前、反応1日目及び反応3日目のHPLC解析結果を示している。
(a)から、d5hmCは、反応後の時間経過と共に減少し、反応3日目では完全に消失した。これに対して、デオキシ5-ホルミルシチジン(d5fC)は、反応後の時間経過と共に増加し、反応3日目にはd5hmCと完全に置き換わった。この結果は、d5hmCが第1態様の5hmC酸化剤によって酸化されてd5fCに変化したこと、つまり、d5hmCにおけるメチルアルコール構造の水酸基のみが特異的に酸化され、リボース部分のアルコール構造は酸化されていないことを示唆している。
一方、(b)から、d5mCは、反応前と反応後のHPLCのピークパターンにほとんど変化が認められず、第1態様の5hmC酸化剤による影響を受けないことが示唆された。
図5Bは、第1態様の5hmC酸化剤を用いたときのデオキシシチジン(dC)、デオキシチミジン(dT)、デオキシグアノシン(dG)、及びデオキシアデノシン(dA)における酸化反応前、及び反応3日目のHPLC解析結果を示している。いずれのデオキシヌクレオシドも反応前と反応後のHPLCのピークパターンにほとんど変化が認められなかった。この結果は、d5hmC以外の他の主要なデオキシヌクレオシドは、本発明の5hmC酸化剤によって酸化されないことを示唆している。したがって、本発明の5hmC酸化剤は、DNA中のd5hmCを特異的に酸化できることが立証された。
<実施例3>
(目的)
5hmCを検出する方法は、ルテニウム酸塩を用いる方法が現在のところ最も一般的である。しかし、この方法はDNA構造を不安定化し、非特異的分解を生じる等の副作用が問題となっている。そこで、本実施例では、本発明の5hmC酸化剤によるDNA構造への影響、及びそれによるDNAの非特異的分解の有無について検証した。
(目的)
5hmCを検出する方法は、ルテニウム酸塩を用いる方法が現在のところ最も一般的である。しかし、この方法はDNA構造を不安定化し、非特異的分解を生じる等の副作用が問題となっている。そこで、本実施例では、本発明の5hmC酸化剤によるDNA構造への影響、及びそれによるDNAの非特異的分解の有無について検証した。
(方法)
標的DNAには、実施例1で用いた配列番号3で示す塩基配列からなる15merのDNAを用いた。
(1)本発明の5hmC酸化方法:2μLの100μM標的DNA、55μLのMilliQ、10μLの50mM Cu(ClO4)2、10μLの50mM TEMPO/アセトニトリル溶液、10μLの50mM NaOH、及び15μL 50mMのビピリジン/アセトニトリル溶液を1.5mLサンプルチューブに入れて混合した。その後、室温で1日間放置した。
(2)対照:2μLの100μM標的DNA、100μLのMilliQを1.5mLサンプルチューブに入れて混合した。0℃で1時間放置した。
(3)ルテニウム酸塩法:ルテニウム実験:2μLの100μM標的DNA、3μLの3mM KRuO4、97μLの50mM NaOH溶液を1.5mLサンプルチューブに入れて混合した。0℃で1時間放置した。
標的DNAには、実施例1で用いた配列番号3で示す塩基配列からなる15merのDNAを用いた。
(1)本発明の5hmC酸化方法:2μLの100μM標的DNA、55μLのMilliQ、10μLの50mM Cu(ClO4)2、10μLの50mM TEMPO/アセトニトリル溶液、10μLの50mM NaOH、及び15μL 50mMのビピリジン/アセトニトリル溶液を1.5mLサンプルチューブに入れて混合した。その後、室温で1日間放置した。
(2)対照:2μLの100μM標的DNA、100μLのMilliQを1.5mLサンプルチューブに入れて混合した。0℃で1時間放置した。
(3)ルテニウム酸塩法:ルテニウム実験:2μLの100μM標的DNA、3μLの3mM KRuO4、97μLの50mM NaOH溶液を1.5mLサンプルチューブに入れて混合した。0℃で1時間放置した。
次に、溶液をバイオスピンカラムに移し、1000 rpmで4分間遠心してCuを除去した。続いて、エタノール沈殿法によってDNAを回収した後、得られたDNAを鋳型DNAとしてリアルタイムPCRを行った。PCR溶液は、回収後、1000倍希釈したDNAを鋳型DNAとして、配列番号1及び配列番号2で示す塩基配列からなる100μMプライマーを各々2μL、100mM dNTPを2μL、KOD Dash DNAポリメラーゼ(TOYOBO社)を0.2μL、1000倍希釈したSYBR Green(BioRad社)を2μL混合して調製した。PCR条件として、95℃15秒、55℃15秒、及び75℃15秒からなるサイクルを、50サイクル繰り返した。
PCRのサイクル数とSYBR Greenの蛍光強度の経時的変化によって、本発明の5hmC酸化方法及びルテニウム酸塩方法の酸化による非特異的DNA分解の程度を見積もることができる。具体的には、PCRで得られるシグモイド曲線の中間点のサイクル数(本実施例では、2/50=25サイクル)から、予め用意した濃度とサイクル数の相関を示す検量線を用いて、PCR前の初期濃度、つまり酸化反応後のDNA濃度を明らかにすることができる。
(結果)
実施例3の結果を図6に示す。BはAの枠内の拡大図である。破線で示す本発明の5hmC酸化方法は、蛍光強度が対照とほぼ重なっており、酸化反応後も90%のDNAが損傷せずに残っていた。それに対して、点線で示す従来法のルテニウム酸塩法では、蛍光強度が総じて対照よりも低く、また元のDNAが38%しか残らなかった。この結果は、本発明の5hmC酸化方法が、非特異的なDNA分解を抑制しつつ、標的の5hmCだけを選択的に酸化できることを示唆している。
実施例3の結果を図6に示す。BはAの枠内の拡大図である。破線で示す本発明の5hmC酸化方法は、蛍光強度が対照とほぼ重なっており、酸化反応後も90%のDNAが損傷せずに残っていた。それに対して、点線で示す従来法のルテニウム酸塩法では、蛍光強度が総じて対照よりも低く、また元のDNAが38%しか残らなかった。この結果は、本発明の5hmC酸化方法が、非特異的なDNA分解を抑制しつつ、標的の5hmCだけを選択的に酸化できることを示唆している。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
<実施例4>
(目的)
本発明の5hmC酸化方法による検出精度の再現性について検証した。
(目的)
本発明の5hmC酸化方法による検出精度の再現性について検証した。
(方法)
2mgのヒト脳由来ゲノムDNAを用いて、図7で示す様々な5hmC検出方法をそれぞれ同一条件下で独立に2回実行した。BのCu/TEMPOは本願発明の5hmC酸化方法を、CのRuは従来法であるルテニウム法を、DのTABは従来法であるTAB-Seq法を、そしてAは5hmC酸化方法を行わない陰性対照(Negative Control)を示す。
2mgのヒト脳由来ゲノムDNAを用いて、図7で示す様々な5hmC検出方法をそれぞれ同一条件下で独立に2回実行した。BのCu/TEMPOは本願発明の5hmC酸化方法を、CのRuは従来法であるルテニウム法を、DのTABは従来法であるTAB-Seq法を、そしてAは5hmC酸化方法を行わない陰性対照(Negative Control)を示す。
5hmC酸化方法及びルテニウム法は、前述の実施例2及び3に記載の方法に準じた。また、TAB-Seq法は、5hmC TAB-Seq kit(WiseGene社)を用いて、添付のプロトコルに従い実行した。
「TAB-Seq法」とは、図8のCで示すようにゲノムDNA上の5hmCをグルコシル化した後、Tet1処理により5mCのみをカルボキシル化する方法である。従来のバイサルファイトシークエンシング法では、ゲノムDNAをバイサルファイト処理(BS処理)することによって、図8のAで示すようにゲノムDNA上のメチル化部位を検出することはできたが、メチル化部位の5mCと5hmCを区別することができなかった。TAB-Seq法では、ゲノムDNA上の5hmCがグルコシル化によってTet1によるカルボキシル化から保護されるので、5mCのみがカルボキシルシトシン(caC)に変換される。したがって、BS処理前のゲノムDNAにTAB-Seq法を行えば、5mCのみがウラシル(U)に変換されることから、シークエンシングにより5mCはTとして、また5hmCはCとして検出されることとなる。それ故、同一サンプルでバイサルファイトシークエンシング法とTAB-Seq法を実行することでゲノムDNA上の5mCと5hmCを識別することができる。一方、本発明の5hmC酸化方法やルテニウム法は、図8のBで示すように、5hmCを過ルテニウム酸カリウム等のルテニウム酸塩やCu/TEMPOで酸化して5fCに変換した後に、BS処理によってウラシルに変換し、シークエンシングによりTとして検出する方法である。
上記各5hmC検出方法で処理したゲノムDNA上のメチル化部位(CpG部位)におけるメチル化状態は、Infinium MethylationEPIC BeadChip(illumina社)を用いて検証した。Infinium MethylationEPIC BeadChipは、ヒト全ゲノム上の85万箇所以上のメチル化部位を1塩基の解像度で定量することのできるメチル化アレイ解析キットである。具体的な方法については、キットに添付のプロトコルに従った。
(結果)
図9に各5hmC検出方法における再現精度の検出結果を示す。このデータは、ゲノムDNA上の85万カ所以上のメチル化部位に関して、2回の独立したアレイ解析における同一メチル化部位の検出結果をX軸とY軸にプロットしたものである。AはBS処理のみの陰性対照、Bは本発明の5hmC酸化方法、Cはルテニウム法、そしてDはTAB-seq法の結果を示す。2回の結果における同一メチル化部位のメチル化状態が同じであるほどプロットは対角線上に集まる。したがって、プロットが対角線に近い形状を形成するほど、再現性が高い方法であることを示唆している。図9より、Bの本発明の5hmC酸化方法では、各プロットがほぼ対角線上に落ち、比較的きれいな対角線を形成した。この結果は、本発明の5hmC酸化方法による検出結果の再現性が高いことを示している。一方、Cのルテニウム法は、プロットがほとんど対角線形状を成さず、再現性が低いことが示唆された。またTAB-Seq法は、プロットがほぼ対角線形状を形成したが、若干の広がりが認められ、本発明の5hmC酸化方法よりも再現性が劣ることが示唆された。
図9に各5hmC検出方法における再現精度の検出結果を示す。このデータは、ゲノムDNA上の85万カ所以上のメチル化部位に関して、2回の独立したアレイ解析における同一メチル化部位の検出結果をX軸とY軸にプロットしたものである。AはBS処理のみの陰性対照、Bは本発明の5hmC酸化方法、Cはルテニウム法、そしてDはTAB-seq法の結果を示す。2回の結果における同一メチル化部位のメチル化状態が同じであるほどプロットは対角線上に集まる。したがって、プロットが対角線に近い形状を形成するほど、再現性が高い方法であることを示唆している。図9より、Bの本発明の5hmC酸化方法では、各プロットがほぼ対角線上に落ち、比較的きれいな対角線を形成した。この結果は、本発明の5hmC酸化方法による検出結果の再現性が高いことを示している。一方、Cのルテニウム法は、プロットがほとんど対角線形状を成さず、再現性が低いことが示唆された。またTAB-Seq法は、プロットがほぼ対角線形状を形成したが、若干の広がりが認められ、本発明の5hmC酸化方法よりも再現性が劣ることが示唆された。
<実施例5>
(目的)
各5hmC検出方法によるゲノムDNA上のメチル化部位の変換率を検証した。
(方法)
実施例4で得られた各5hmC検出方法のアレイ解析結果を用いて、それぞれ2回行った実験結果のいずれか一方をX軸に、また陰性対照であるBS処理のみの結果をY軸に、プロットした。図8で示したように、バイサルファイトシークエンシング法では、ゲノム上の5mCと5fmCはCとして検出されるが、本発明の5hmC酸化方法やルテニウム法では、5mCはCとして、また5hmCはTとして検出される。さらに、TAB-seq法では5mCはTとして、また5hmCはCとして検出される。つまり、それぞれの5hmC検出方法の処理によってゲノムDNA上のメチル化部位が適切に変換されていれば、同一メチル化部位であってもBS処理のみの結果との間で違いを生じ、それは対角線からズレた広がりとして現れるはずである。
(目的)
各5hmC検出方法によるゲノムDNA上のメチル化部位の変換率を検証した。
(方法)
実施例4で得られた各5hmC検出方法のアレイ解析結果を用いて、それぞれ2回行った実験結果のいずれか一方をX軸に、また陰性対照であるBS処理のみの結果をY軸に、プロットした。図8で示したように、バイサルファイトシークエンシング法では、ゲノム上の5mCと5fmCはCとして検出されるが、本発明の5hmC酸化方法やルテニウム法では、5mCはCとして、また5hmCはTとして検出される。さらに、TAB-seq法では5mCはTとして、また5hmCはCとして検出される。つまり、それぞれの5hmC検出方法の処理によってゲノムDNA上のメチル化部位が適切に変換されていれば、同一メチル化部位であってもBS処理のみの結果との間で違いを生じ、それは対角線からズレた広がりとして現れるはずである。
(結果)
図10にプロット結果を示す。Aは本発明の5hmC酸化方法(X軸)とBS処理のみ(Y軸)の結果を、Bはルテニウム法(X軸)とBS処理のみ(Y軸)の結果を、そしてCはTAB-seq法(X軸)とBS処理のみ(Y軸)の結果を示す。
図10にプロット結果を示す。Aは本発明の5hmC酸化方法(X軸)とBS処理のみ(Y軸)の結果を、Bはルテニウム法(X軸)とBS処理のみ(Y軸)の結果を、そしてCはTAB-seq法(X軸)とBS処理のみ(Y軸)の結果を示す。
Aでは破線よりも上のプロットが5hmC由来のTに、またCでは破線よりも上のプロットが5mC由来のTに相当する。この結果から、本発明の5hmC酸化方法とTAB-seq法は、それぞれの処理によりゲノムDNA上のメチル化部位が適切に変換されていることが示唆された。一方、ルテニウム法は対角線からの広がりが示されず変換反応が適切に完了していないことが示唆された。
Claims (12)
- 以下の(a)及び/又は(b)からなる5-ヒドロキシメチルシトシン酸化剤。
(a)ニトロキシルラジカル分子及び銅塩又は銅錯体
(b)ニトロキシルラジカル分子−銅複合体 - 以下の(c)をさらに含む、請求項1に記載の5-ヒドロキシメチルシトシン酸化剤。
(c)ピリジン、ピピリジン、フェナンスロリン、エチレンジアミン、プロパンジアミン、イミダゾール、及びそれらの誘導体からなる群から選択される一以上の反応促進剤 - 前記ニトロキシルラジカル分子が2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル、3-カルバモイル-2,2,5,5-テトラメチル-3-ピロリン-1-イルオキシ、2-アザアダマンタン-N-オキシル、9-アザビシクロ[3.3.1]ノナンN'-オキシル又はそれらの誘導体である、請求項1に記載の5-ヒドロキシメチルシトシン酸化剤。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の5-ヒドロキシメチルシトシン酸化剤を含むDNA脱メチル化解析試薬。
- 亜硫酸水素塩をさらに含む、請求項4に記載のDNA脱メチル化解析試薬。
- 請求項5に記載のDNA脱メチル化解析試薬を含むDNA脱メチル化解析キット。
- 5-ヒドロキシメチルシトシンを酸化する方法であって、
5-ヒドロキシメチルシトシンを含み得る被検物質と請求項1〜3のいずれか一項に記載の5-ヒドロキシメチルシトシン酸化剤を反応溶液中で混合する混合工程、及び
前記反応溶液を4〜90℃にて1〜100時間インキュベートして5-ヒドロキシメチルシトシンに含まれるアリルアルコール構造の水酸基を酸化する酸化工程、
を含む前記方法。 - 5-ヒドロキシメチルシトシンを解析する方法であって、
DNAと請求項1〜3のいずれか一項に記載の5-ヒドロキシメチルシトシン酸化剤を反応溶液中で混合する混合工程、
前記反応溶液を4〜90℃にて1〜100時間インキュベートして5-ヒドロキシメチルシトシンを構成するアリルアルコール構造の水酸基を酸化する酸化工程、及び
前記酸化工程で生成した5-ホルミルシトシンを検出する検出工程
を含む前記方法。 - 前記混合工程に先立ち、DNAに含まれる水素結合を切断する水素結合切断工程を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記水素結合切断工程に先立ち、生物試料からDNAを抽出するDNA抽出工程を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記水素結合切断工程でDNAを塩基性溶液に溶解して水素結合を切断する、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記検出工程で5-ホルミルシトシンをバイサルファイトシーケンシング法で検出する、請求項8〜11のいずれか一項に記載の方法。
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松下卓、岡本晃充: "Cu/TEMPO酸化を用いた新規5-ヒドロキシメチルシトシン検出法の開発", 日本化学会第96春季年会(2016)講演予稿集DVD, vol. Vol.96, JPN6016043653, 10 March 2016 (2016-03-10), pages p.4C5-32 * |
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