CN109022616A - 一种检测溶瘤病毒的探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测溶瘤病毒的探针，所述探针序列如SEQ ID No：1所示，且所述探针带有荧光标记物。所述探针首先与溶瘤病毒遗传物质结合，再进行定性、定位、相对定量分析。本发明的探针具有安全、快速、灵敏度高、能长期保存。本发明还提供了此探针在制备检测溶瘤病毒遗传物质在肿瘤组织中的表达位置和/或量变化的试剂盒中的应用，以及在检测生物样本是否感染溶瘤病毒系统中的应用，本系统不仅能检测生物样本是否感染溶瘤病毒，还能准确定位溶瘤病毒感染的位置与含量，具有快速、灵敏度等优点。

Description

一种检测溶瘤病毒的探针及其应用

技术领域

本发明涉及癌症治疗领域及，具体涉及一种检测溶瘤病毒的探针及其应用。

背景技术

溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，其原理是通过对自然界存在的一些致病力较弱的病毒进行基因改造制成特殊的溶瘤病毒，利用靶细胞中抑癌基因的失活或缺陷从而选择性地感染肿瘤细胞，在其内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞，但无法在正常机体细胞内复制而不具有杀伤作用，理论上具有更高的抗肿瘤效应和更低的副作用，同时它还能激发免疫反应，吸引更多免疫细胞来继续杀死残余癌细胞。

然而，本行业人员都明确地知道，有时造成条件型增殖的结构可能使溶瘤病毒在正常细胞内增殖。即溶瘤病毒具有可在癌细胞内特异性增殖的结构，如在癌细胞内特异性地表现出启动子活性的启动子，因此可在癌细胞内特异性增殖，但正常细胞中也可能有能使此启动子发挥功能的细胞(如白细胞)。在将溶瘤病毒增殖的细胞作为癌细胞的癌细胞检测方法中，这种正常细胞可能会被作为癌细胞检测出来，因此有可能得出假阳性结果。

因此，本发明以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，带有荧光标记的探针与溶瘤病毒遗传物质结合，杂交后可直接荧光显微镜观察。进行定性、定位、相对定量分析。原位杂交具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能选择不同颜色标记等优点，能显示中期分裂相，还能显示于间期核。同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种利用荧光标记取代同位素标记检测溶瘤病毒的探针及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:一种检测溶瘤病毒的探针，所述探针的序列如SEQ ID No.1所示。

优选地，所述探针的5’端带有荧光标记物。

优选地，所述荧光标记物为Cy3、HEX、VIC、JOE、Cal Red 610、ROX、FITC、FAM或TEXAS RED中的任意一种。

优选地，所述荧光标记物为Cy3。

优选地，所述探针与溶瘤病毒的DNA或mRNA结合。

优选地，包含如权利要求1～4任一项所述的检测溶瘤病毒的探针。

本发明还提供一种用于确定生物样本感染溶瘤病毒的系统，包括：

制样单元，用于制备符合检测条件的生物样本；

检测单元，所述检测单元与所述制样单元相连，用于检测具有本发明所述的溶瘤病毒的探针的生物样本中是否具有荧光信号来确定所述生物样本是否感染溶瘤病毒；

分析单元，所述分析单元与检测单元相连，用于分析具有本发明所述的溶瘤病毒的探针的生物样本感染溶瘤病毒的位置。

优选地，所述检测单元适于将所述生物样本中具有本发明所述的溶瘤病毒的探针的荧光信号强弱在生物样本间进行比较，作为相对定量，或已知浓度阳性对照样品及阴性对照样进行比较，确定所述生物样本感染溶瘤病毒的含量。

荧光定量分析常采用直接比较法，将检测样品与已知物质放在激发光源下，根据它们所发荧光的性质、颜色和强度，鉴定它们是否含有同一荧光物质。检测样品在加入探针试剂后，其杂交上产物会产生荧光，测定荧光强度而推算被测样品浓度的检测方法。

本发明的检测系统通过本发明设计的荧光探针来检测和相对定量定位生物样本所感染的溶瘤病毒的含量，如果有荧光信号，则表示样品中存在溶瘤病毒；如果没有荧光信号出现，则表示样品中不存在溶瘤病毒，未被溶瘤病毒感染。

优选地，所述分析单元适于将所述生物样本连接上荧光染料后，将所述生物样本中具有本发明所述的溶瘤病毒的探针的荧光信号与所述生物样本上连接的荧光染料的荧光信号进行重叠，以其重叠的位置来确定所述生物样本中感染溶瘤病毒的位置。

本发明的设计思路如下：

E1作为溶瘤病毒的特征序列，有较高的特异性，以E1序列为设计模板，以碱基互补配对原则为基础，设计靶向E1序列原位杂交检测探针。经过排除错配，避免产生稳定二级结构，选取最优序列等筛选优化，得到一条特异性高，与人DNA或mRNA无非特异杂交的E1原位杂交探针。靶点为溶瘤病毒，通过荧光标记原位杂交方法获得其探针杂交体，被检测样品的靶DNA与所用荧光标记的核苷酸探针碱基互补，二者经杂交，即可形成靶DNA与核苷酸探针的杂交体。从而实现定性定量定位检测。

避开溶瘤病毒与人基因组中相同位点，最终得到一条特异性高的不产生二级结构的核苷酸序列：5'–TACCTCAAGCTGTAGGGTCATCGGGGAGAAG-3'。

本发明的有益效果在于：本发明通过原位杂交具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期分裂相，还能显示于间期核。同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术。本发明还提供了此探针在制备检测溶瘤病毒遗传物质在肿瘤组织中的表达位置和/或量变化的试剂盒中的应用，以及在检测生物样本是否感染溶瘤病毒系统中的应用，本系统不仅能检测生物样本是否感染溶瘤病毒，还能准确定位溶瘤病毒感染的位置与含量，具有快速、灵敏度等优点。

附图说明

图1为实施例1中感染溶瘤病毒细胞的阳性结果荧光图。

图2为实施例1中未感染溶瘤病毒细胞的阴性结果荧光图。

图3为实施例1中本发明的探针正确检测出样品细胞感染溶瘤病毒的位置与含量荧光图。

图4为实施例2中本发明的探针正确检测出肝癌组织感染溶瘤病毒的位置与含量荧光图。

图5为实施例3中本发明的探针正确检测出肠癌组织感染溶瘤病毒的位置与含量荧光图。

图6为实施例4中本发明的探针正确检测出穿刺组织感染溶瘤病毒的位置与含量荧光图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例以及附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

步骤一：溶液准备

(1)通透液(1×PBS/0.5％Triton X-100)：配置50ml通透液：加入5ml 10×PBS于40ml水中，再加入250ul Triton X-100并充分混匀；预杂交液(3％BSA in 4×SSC)：配置100ml预杂交液：加入3g BSA于100ml 4×SSC中，实验当天新鲜配置。

(2)杂交液(10％硫酸葡聚糖in 4×SSC)：配置10ml杂交液：4ml水中加入2ml 20×SSC、4ml 25％硫酸葡聚糖。注意充分混匀，实验当天新鲜配置。

(3)洗液I(4×SSC 0.1％Tween-20)：配置1L洗液I：799ml水中加入200ml 20×SSC，1ml Tween-20。

(4)洗液II(2×SSC)：配置1L洗液II：900ml DEPC水中加入100ml 20×SSC。

(5)洗液III(1×SSC)：配置1L洗液III：950ml DEPC水中加入50ml 20×SSC。

(6)探针稀释的参考：如5’端标记Cy3的探针，每ml杂交液中加入1～2ng，浓度为25uM的5’端荧光标记探针，用DEPC水按照1:10稀释为2.5uM，然后每1ml杂交液中加入1ul稀释好的探针(标记好的探针需分装保存，以免反复冻融导致效率降低)。

(7)DAPI储存液(5mg/ml)：2ml dH₂O中加入10mg DAPI。长期保存可以避光置于-20℃，短期保存可以避光置于4℃。

(8)DAPI工作液(0.5ul DAPI储存液in 0.2％BSA/1×PBS)：配置50mlDAPI工作液：50ml 1×PBS中加入200mg BSA，0.5ulDAPI储存液。实验当天新鲜配置，注意避光。

(9)Incubation Chamber的制备：塑料盒加水，底部放置充分浸泡的滤纸(防止光透入)，将切片置于滤纸上，然后盒子加盖，最后将盒子置于所需温度的培养箱中，适用于实验过程中的孵育培养。

步骤二：制备细胞样品

其中将已感染溶瘤病毒的细胞作为阳性对照，未感染的作为阴性对照，选取任意部位的细胞作为样品进行检测

(1)制备细胞爬片。

(2)爬片在PBS中平衡洗涤3次，每次5min。

(3)0.2N HCl处理3～5min。

(4)擦去0.2N HCl，用含0.3％Trition X-100的PBS室温孵育20min。

(5)擦去含0.3％Trition X-100的PBS，PBS洗涤5min。

(6)4％多聚甲醛室温孵育20min，其后PBS洗涤2次，每次5min。

(7)预杂交：加入足量杂交缓冲液覆盖爬片，55℃孵育2h。

步骤三：探针变性

(1)用杂交缓冲液稀释探针，稀释比例为1:50～200，常用比例为1:100。稀释后的探针工作液，于85℃变性5分钟。

(2)探针工作液于37℃保温2min。

步骤四：杂交

(1)拭去预杂交的杂交缓冲液。

(2)加入变性后的探针工作液(通常10～20ul，视细胞爬片或组织大小)。

(3)立即轻轻覆盖盖玻片，使探针工作液完全覆盖组织/爬片，或用薄膜盖上，玻片于湿盒中37～42℃杂交过夜。

(4)滴加2×SSC使盖玻片漂浮脱落，掀去盖玻片后PBS洗涤3次，每次5min。

步骤五：核染色

(1)用PBS是盖玻片脱落，PBS洗涤2次，每次5min，避光，甩去残留PBS。

(2)加入DAPI，室温孵育5min。

(3)甩去DAPI，PBS洗涤3次，每次5min，其后蒸馏水适当冲洗。

(4)甩去多余水分，加入适量抗荧光猝灭封片剂，盖玻片封片，避光保存待观察。

(5)镜检。

实验结果

1、阳性对照感染溶瘤病毒细胞

如图1a～1c所示，图1a表示，感染溶瘤病毒肿瘤细胞中的DNA或mRNA与本发明的探针核苷酸序列杂交，在荧光显微镜下由于探针带有cy3荧光染料，因此显示红色荧光，图1b显示经DAPI核染色的肿瘤细胞，呈蓝色，图1c表示感染溶瘤病毒肿瘤细胞中的DNA或mRNA与本发明的探针核苷酸序列杂交。

2、阴性对照感染溶瘤病毒细胞

如图2a～2c所示，图2a表示，未检测到本发明的探针的存在，图2b显示经DAPI核染色的细胞，呈蓝色，图2c表示未有细胞感染溶瘤病毒。

3、检测样品感染溶瘤病毒细胞

如图3a～3c所示，图3a表示，感染溶瘤病毒肿瘤细胞中的DNA或mRNA与本发明的探针核苷酸序列杂交，在荧光显微镜下由于探针带有cy3荧光染料，因此显示红色荧光，图3b显示经DAPI核染色的肿瘤细胞，图3c表示检测样品已感染溶瘤病毒。因此红色与蓝色荧光重叠，说明本发明的探针能检测并定位感染溶瘤病毒的细胞。

实施例2

本实施例除步骤二与实施例1不同外，其余步骤和参数均与实施例1相同，本实施例步骤二具体操作如下：

步骤二：肠癌组织切片

(1)石蜡切片置于100％二甲苯，3次，每次5min。

(2)其后依次100％乙醇、90％乙醇、70％乙醇，每个梯度5min。

(3)0.2N HCl室温处理15(常用3～5)min。

(4)擦去0.2N HCl，用含0.3％Trition X～100的PBS室温孵育20min。

(5)擦去含0.3％Trition X～100的PBS，PBS洗涤5min。

(6)4％多聚甲醛室温孵育20min，其后PBS洗涤2次，每次5min。

(7)预杂交：加入适量杂交缓冲液覆盖爬片，55℃孵育2h。

实验结果

如图4a～4c所示，图4a表示，肠癌组织中感染溶瘤病毒肿瘤细胞中的DNA或mRNA与本发明的探针核苷酸序列杂交，在荧光显微镜下由于探针带有cy3荧光染料，因此显示红色荧光，图4b显示经DAPI核染色的肿瘤细胞，图4c表示肠癌组织中已感染溶瘤病毒。因此红色与蓝色荧光重叠，说明本发明的探针能检测并定位感染溶瘤病毒的细胞。

实施例3

本实施例除步骤二与实施例1不同外，其余步骤和参数均与实施例1相同，本实施例步骤二具体操作如下：

步骤二：肝癌组织切片

(1)石蜡切片置于100％二甲苯，3次，每次5min。

(2)其后依次100％乙醇、90％乙醇、70％乙醇，每个梯度5min。

(3)0.2N HCl室温处理15(常用3～5)min。

(4)擦去0.2N HCl，用含0.3％Trition X～100的PBS室温孵育20min。

(5)擦去含0.3％Trition X～100的PBS，PBS洗涤5min。

(6)4％多聚甲醛室温孵育20min，其后PBS洗涤2次，每次5min。

(7)预杂交：加入适量杂交缓冲液覆盖爬片，55℃孵育2h。

实验结果：

如图5a～5c所示，图5a表示，肺癌组织中感染溶瘤病毒肿瘤细胞中的DNA或mRNA与本发明的探针核苷酸序列杂交，在荧光显微镜下由于探针带有cy3荧光染料，因此显示红色荧光，图5b显示经DAPI核染色的肿瘤细胞，图5c表示肺癌组织中已感染溶瘤病毒。因此红色与蓝色荧光重叠，说明本发明的探针能检测并定位感染溶瘤病毒的细胞。

实施例4

本实施例除步骤二与实施例1不同外，其余步骤和参数均与实施例1相同，本实施例步骤二具体操作如下：

步骤二：样品穿刺组织切片

(1)石蜡切片置于100％二甲苯，3次，每次5min。

(2)其后依次100％乙醇、90％乙醇、70％乙醇，每个梯度5min。

(3)0.2N HCl室温处理15(常用3～5)min。

(4)擦去0.2N HCl，用含0.3％Trition X～100的PBS室温孵育20min。

(5)擦去含0.3％Trition X～100的PBS，PBS洗涤5min。

(6)4％多聚甲醛室温孵育20min，其后PBS洗涤2次，每次5min。

(7)预杂交:加入适量杂交缓冲液覆盖爬片，55℃孵育2h。

实验结果：

如图6a～6c所示，图6a表示，样品穿刺组织中感染溶瘤病毒肿瘤细胞中的DNA或mRNA与本发明的探针核苷酸序列杂交，在荧光显微镜下由于探针带有cy3荧光染料，因此显示红色荧光，图6b显示经DAPI核染色的肿瘤细胞，图6c表示肺癌组织中已感染溶瘤病毒。因此红色与蓝色荧光重叠，说明本发明的探针能检测并定位感染溶瘤病毒的细胞。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种检测溶瘤病毒的探针，其特征在于，所述探针的序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的检测溶瘤病毒的探针，其特征在于，所述探针的5’端带有荧光标记物。

3.如权利要求2所述的检测溶瘤病毒的探针，其特征在于，所述荧光标记物为Cy3、HEX、VIC、JOE、Cal Red 610、ROX、FITC、FAM或TEXAS RED中的任意一种。

4.如权利要求3所述的检测溶瘤病毒的探针，其特征在于，所述荧光标记物为Cy3。

5.如权利要求1～4任一项所述的检测溶瘤病毒的探针，其特征在于，所述探针与溶瘤病毒的DNA或mRNA结合。

6.一种用于确定生物样本感染溶瘤病毒的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1～4任一项所述的检测溶瘤病毒的探针。

7.一种用于确定生物样本感染溶瘤病毒的系统，其特征在于，包括：

制样单元，用于制备符合检测条件的生物样本；

检测单元，所述检测单元与所述制样单元相连，用于检测具有如权利要求2所述的溶瘤病毒的探针的生物样本中是否具有荧光信号来确定所述生物样本是否感染溶瘤病毒；

分析单元，所述分析单元与检测单元相连，用于分析具有如权利要求2所述的溶瘤病毒的探针的生物样本感染溶瘤病毒的位置。

8.如权利要求7所述的用于确定生物样本感染溶瘤病毒的系统，其特征在于，所述检测单元适于将所述生物样本中具有如权利要求2所述的溶瘤病毒的探针的荧光信号强弱在生物样本间进行比较，作为相对定量，确定所述生物样本感染溶瘤病毒的含量。

9.如权利要求7所述的用于确定生物样本感染溶瘤病毒的系统，其特征在于，所述分析单元适于将所述生物样本连接上荧光染料后，将所述生物样本中具有如权利要求2所述的溶瘤病毒的探针的荧光信号与所述生物样本上连接的荧光染料的荧光信号进行重叠，以其重叠位置来确定所述生物样本中感染溶瘤病毒的位置。