CN102409110A - 一种人乳头瘤病毒型原位杂交检测试剂盒及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术检测领域，目的是提供一种高灵敏度，可信度和直观的人乳头瘤病毒原位杂交检测试剂盒及其方法。本发明一个技术方案为提供一种人乳头瘤病毒原位杂交检测试剂盒，所述试剂盒包括玻片、杂交液、原位杂交试剂，所述杂交液包括标记物标记的杂交探针，所述杂交探针序列如SEQ ID NO：9到SEQ ID NO：12所示。本发明的有益效果为本发明通过对玻片的特殊处理，解决了原位杂交检测样本必须为石蜡切片或冰冻切片的局限性，在原位杂交检测过程中，引入了杂交增强液及显色增效液，提高了检测结果的信噪比，结果易于判读。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种用于人乳头瘤病毒原位杂交检测试剂盒及其方法。
背景技术
宫颈癌是第二大女性恶性肿瘤，世界范围内每年大约有50万左右的新发病例，我国的患病率及病死率约占世界的1/3，其发病以每年2％～3％的速度增长随着宫颈癌病因学的研究发展，其防治方法也在不断地提高和发展。各国的实践均证明普查可以降低宫颈浸润癌的发生和死亡，原因在于宫颈癌有一系列的前驱病变，它的发生、发展是由量变到质变、渐变到突变，通常是由子宫颈不典型增生(轻→中→重)→原位癌→早期浸润癌→浸润癌的连续发展过程。这些前驱病变可存在多年，而且子宫颈具有有利的解剖学基础，易于暴露，便于观察、触诊及取材，如能在前驱病变阶段被确诊，即可进行进一步治疗或监测。早期宫颈病变的治疗效果远比宫颈癌的治疗效果好得多，据报道宫颈浸润癌的五年生存率是67％，宫颈早期癌是90％，而宫颈原位癌则几乎达100％。因此通过普查可以达到早诊早治，降低宫颈浸润癌的发病率和死亡率。
研究显示，人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN)的直接和主要病因。宫颈癌患者的HPV检出率可达99.17％，其归因危险百分比达90％以上。HPV有100多种亚型，其中与泌尿生殖道感染相关的有40余种。根据其对生殖系统的致癌性可分为低危型和高危型，前者主要引起尖锐湿疣等良性病变，后者常引起宫颈癌等恶性病变。生殖道感染HPV最常见的型别即16，18，6，11型。HPV6和11型经常感染外阴、肛门、阴道等部位，属于低危型别，湿疣或宫颈上皮内低度病变妇女中多常见，与宫颈浸润癌无明显关联；而16和18型则属于高危型别，来自世界各国的宫颈癌组织标本的研究发现，HPV16和18型感染率最高，在检出的所有型别中，HPV16占50％，HPV18占14％，HPV45占8％，HPV31占5％，其它型别的HPV占23％。HPV的型别与宫颈癌的病理类型有关，在宫颈鳞状上皮细胞癌中HPV16占主要地位(51％的鳞状上皮细胞癌标本)，而在宫颈腺状上皮细胞癌(56％腺状上皮细胞癌标本)和宫颈腺鳞细胞癌(39％腺鳞细胞癌标本)中HPV18占主要地位。有些HPV型别有地理位置的差异，但HPV16、18型感染很普遍，没有明显的地区差异。
因此对宫颈组织的病理学检测以及对HPV16，18型其进行检测，对于临床诊断、癌变预防与治疗具有重要意义。
1.病理学检测
自1941年Papanicolaou发现采取阴道及宫颈脱落细胞制成涂片，经染色可观察细胞的变异，世界各国都将该法(巴氏涂片)作为宫颈癌筛查的一种手段引入临床，并被许多国家作为常规筛查项目。虽然从未有一种随机化前瞻性研究证明巴氏涂片可以降低宫颈癌发病率，许多国家和地区的调查资料显示，自引入巴氏涂片，筛查人群宫颈浸润癌的发病率降低了70％-90％，而未筛查人群的发病水平变化不大。
1998年，Markovics发表了关于宫颈脱落上皮酸性磷酸酶检测的结果和进展，并研究出了一个新的CAP-PAP染色法。该方法能将巴氏染色结果中的异常子宫颈细胞内的酸性磷酸酶明显着色，可作为天然的子宫颈鳞状细胞异型增生的生物标记物。2003年，Markovic发表了1000例宫颈细胞染色的结果，测试了CAP-PAP的灵敏度为81％，特异性为97％，与传统巴氏染色相比较显著地提高了阳性检出率(p＜0.05)。由此得出结论是：CAP染色的能增加巴氏染色的敏感性，使细胞检验员筛查标本时能显著提高检阳性/异常标本检出率和减少假阴性率。在次基础上，我们进一步改良了该方法的配方和操作技术，使之能更方便和廉价地运用于液基薄层细胞沉降法制片染色中。
2.HPV的检测
2.1Southern印迹杂交或斑点杂交法
该方法是将HPV-DNA从临床标本中直接分离出来，通过Southern印迹或斑点杂交进行检测。但检测不能达到临床所需的灵敏度，且操作繁琐，费时耗力，不适合于大通量临床样品的筛查，目前较少使用。
2.2HPV-DNA直接捕获法
杂交捕获(HC，Hybride Capture systems，DigeneCorp，US)采用分子杂交+化学发光+信号放大原理，此系统应用两组不同的混合RNA探针(即所谓的鸡尾酒探针)，一组含有HPV6、11、42、43和44型5种低危型探针，而另一组则含有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型13种高危型探针。利用一种非同位素信号放大系统并基于HPV-DNA杂交到溶液中标记RNA探针的方法，结合后的DNA-RNA杂交体被微孔板所捕获并被随后所加的特异性单克隆抗体和化学发光底物所检测。该法为目前唯一以商品化试剂盒提供的检测方法，且有足够的科学证据支持其应用于临床的检测系统，并得到美国FDA认证，已成为许多国家的标准方法被广泛应用于临床研究中。
但此方法也有一些不足。最近，Poljka等采用PCR-RFLP法对HC进行了方法学评价。结果发现，两法的诊断符合率为89.7％，HC漏检率为10.3％。此外，HC的检测下限约为5000个基因组HPV-DNA，且只能进行分组鉴定而不能进行个体基因分型，两组混合探针间存在的交叉反应也影响其检测的准确性。由于HPV感染的状态要求对特定基因型HPV进行鉴定，故该法不能用于诸如具体分型、型特异性疫苗或型特异性药物的研究和疗效观察。
杂交捕获方法虽然成熟，但灵敏度不高且有较高的漏诊率。由于HPV载量对于疾病的预测和疗效的观察是一个很有价值的指标，加之很难建立起一种足够灵敏的、总的HPV-DNA定量分析方法。因此，HPV的基因分型将在正确选择型特异的定量方法中起着重要的作用。
发明内容
本发明目的是提供一种高灵敏度，可信度和直观的人乳头瘤病毒(HPV16、18型)原位杂交检测试剂盒及其方法。
本发明的技术方案为提供一种人乳头瘤病毒原位杂交检测试剂盒，所述试剂盒包括玻片、杂交液、原位杂交试剂，所述杂交液包括标记物标记的杂交探针，所述杂交探针序列如SEQ ID NO：9到SEQ ID NO：12所示。
优选的，上述试剂盒中所述玻片为在玻片处理液中进行了浸泡的玻片，浸泡时间大于12小时，所述玻片处理液以DEPC水为溶剂配制，所述玻片处理液各组分质量浓度为：多聚赖氨酸：5-15％、黄油：5-15％、聚乙烯：5-15％。
优选的，上述试剂盒中所述原位杂交试剂包括杂交增强液，显色底物，还包括碱性磷酸酶标记的地高辛抗体或辣根过氧化物酶标记的抗地高辛Fab片段，所述杂交增强液各组分为：质量浓度45％去离子甲酰胺、质量浓度10％硫酸葡聚糖、100ug/mL鲑鱼精DNA、4×SSC、5×Denhardts溶液、50mM Tris-HCl溶液。
优选的，上述试剂盒中的原位杂交试剂还包括显色增强液，所述显色增强液为质量浓度为10％的甲酰胺。
原位杂交试剂所述标记物可以为为放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶、地高辛或纳米材料。
本发明的另一技术方案为提供一种人乳头瘤病毒原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：
a、制备特异性探针：设计引物并PCR扩增所述的HPV病毒核酸，以地高辛进行标记，制备特异性检测HPV的探针，所述引物序列如SEQ IDNO：1到SEQ ID NO：8所示，所述探针序列如SEQ ID NO：9到SEQ ID NO：12所示；
检测样本的制备：对玻片进行预处理，将玻片在玻片处理液中进行浸泡，浸泡时间大于12小时，所述玻片处理液以DEPC水为溶剂配制，所述玻片处理液各组分质量浓度为：多聚赖氨酸：5-15％、黄油：5-15％、聚乙烯：5-15％，然后制作样本的切片或液基薄层细胞涂片；
b、原位杂交检测：将上述地高辛标记的探针与制备好的样本涂片或切片进行原位杂交，所述地高辛标记的探针与样本的目的片段结合；
c、信号放大与检测：上述步骤b中的探针进一步结合辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗地高辛Fab片段，通过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶显色系统进行信号放大检测。
优选的，上述方法中所述步骤b杂交检测具体为：
S10、杂交预处理：
甩干步骤a所述切片，将组织周围液体用滤纸吸干，每张切片滴加蛋白酶K工作液，孵育5分钟，将切片放入杂交增强液，微波加热30分钟，冷却，蒸馏水洗涤1分钟，小心擦干组织周围液体。
S20、杂交：
S21、每张切片滴加杂交液，并加盖玻片；
S22、变性：将切片放置杂交加热器上，95℃变性5分钟；
S23、切片放入含30％湿盒增效液的湿盒中，37℃下孵育4-16小时；
S24、PBS缓冲液48℃预温浸泡切片，小心移去盖玻片，PBS缓冲液继续浸泡5分钟；
S25、振荡容器48℃PBS缓冲液洗涤15分钟；
优选的，上述方法中所述步骤c信号放大与检测具体为：
S10、取经原位杂交后的组织切片，滴加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗地高辛Fab片段，37℃，水湿盒中孵育30分钟；37℃PBS缓冲液浸泡6分钟，振荡容器；
S20、滴加试剂酶稀释液，所述试剂酶稀释液为质量浓度为50％甘油、50mM KCl，37℃水湿盒中孵育20分钟；37℃PBS缓冲液浸泡6分钟，振荡容器；
S30、滴加试剂C，所述试剂C为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶溶液，37℃水湿盒中孵育30分钟；37℃下PBS缓冲液浸泡6分钟，振荡容器；
S40、滴加底物DAB/H2O2或BCIP/NBT底物，避光显色，显微镜下观察15-30分钟，当显色为蓝黑色时终止显色。
优选的，上述方法中所述PCR扩增的样本来自宫颈拭子、刮取物、液体悬浮物、冻存材料、石蜡包埋组织。
本发明的有益效果为本发明通过对玻片的特殊处理，解决了原位杂交检测样本必须为石蜡切片或冰冻切片的局限性，利用进行液基薄层细胞检测的涂片也可进行原位杂交检测而不会发生细胞脱落，大大减轻了患者取样的痛苦。在原位杂交检测过程中，引入了杂交增强液及显色增效液，提高了检测结果的信噪比，结果易于判读。
附图说明
图1：采用引物：16F1和16R1制备探针的PCR扩增产物电泳图；
图2：采用引物：16F2和16R2制备探针的PCR扩增产物电泳图；
图3：采用引物：18F1和18R1制备探针的PCR扩增产物电泳图；
图4：采用引物：18F2和18R2制备探针的PCR扩增产物电泳图；
图5：HPV阳性样本检测结果图；
图6：HPV阳性样本检测结果图；
图7：HPV阳性样本检测结果图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。本发明的目的在于提供一种可以对常规宫颈组织切片及用于液基薄层细胞涂片的样本进行HPV16、18进原位杂交检测的试剂盒和检测方法。
本发明的技术原理：
本发明的试剂盒以用于液基薄层细胞检测的涂片或组织切片作为检测对象，利用原位杂交技术对涂片或切片进行HPV16、18型的检测。其主要的基本原理如下：
探针为含有待检病毒特定DNA序列的片段，其末端带有地高辛标记。宫颈脱落细胞涂片或宫颈组织切片经与上述制备的探针通过碱基互补配对杂交，并经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶检测系统显色，在显微镜下观察，即可判断HPV16、18型的感染。
目前国内外基于原位杂交的商品化试剂均采用上述的原理，本发明在该技术平台的基础上，通过对玻片的特殊处理，解决了原位杂交检测样本必须为石蜡切片或冰冻切片的局限性，利用进行液基薄层细胞检测的涂片也可进行原位杂交检测而不会发生细胞脱落，大大减轻了患者取样的痛苦。本发明人通过反复的实验探索，在原位杂交检测过程中，引入了杂交增强液及显色增效液，提高了检测结果的信噪比，结果易于判读。
根据HPV16、18型序列的型特异性区域进行检测探针设计，探针设计可以在正义链和/或反义链。选择HPV16、18病毒L1区及E6区共4条探针。
设计上述探针的扩增引物，由专业的合成公司如Invitrogen公司。探针通过所设计的引物经PCR方法进行制备，并在PCR过程中进行标记物标记。所述标记物可以为为放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶、地高辛或纳米材料。
将标记的探针与制备好的样本涂片或切片进行原位杂交，通过杂交液及杂交增强液的盐离子与样本中的目的片段结合，通过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶显色系统进行信号放大检测。
实施例1本发明试剂盒组成
本发明提供的液基薄层细胞的原位杂交(人乳头瘤病毒16、18型)检测试剂盒由玻片、杂交液、原位杂交试剂三部分组成。所述杂交液包括Dig-探针(地高辛标记的特异性杂交探针)。
HPV16、18型特异性的Dig-探针通过4对引物PCR制备，分别为HPV16、18L1区及E6区。引物序列如表1。
表1
优选的，PCR制备探针所使用的酶可以是热启动酶或Taq酶。热启动酶和PCR反应的其它常规组分均可以使用市售产品，如NEB公司生产的产品，并参照市售产品的说明书配制。Taq酶和PCR反应的其它常规组分均可以使用市售产品，如Fermentas公司生产的产品，并参照市售产品的说明书配制。其中dNTPs中掺入一定比例的Dig-dUTP，掺入量与dNTPs比例为1∶5-1∶15。探针制备使用的模板为测序确认的HPV16、18样本DNA。
四条探针分别扩增后，经切胶纯化按一定比例混合制备成HPV(16/18)杂交液，其使用浓度为1-3ng/ul。合成的Dig-探针可特异性的与HPV16、18病毒核酸进行碱基互补配对，其特征在于特异性探针的序列如：SEQ ID NO：9到SEQ ID NO：12。
SEQ ID NO：9：
TATCATGATATAAGTCCTATTGCACCTTCCCCAGAATATATTGAACTGCAGCCTTTAGTATCTGCCACGGAGGACAATGACTTGTTTGATATATATGCAGATGACATGGACCCTGCAGTGCCTGTACCATCGCGTTCTACTACCTCCTTTGCATTTTCTAAATATTCGCCCACTATATCTTCTGCCTCTTCCTATAGTAATGTAACGGTCCCTTTAACCTCCTCTTGGGATGTGCCTGTATACACGGGTCCTGATATTACATTACCATCTACTACCTCTGTATGGCCCATTGTATCACCCACAGCCCCTGCCTCTACACAGTATATTGGTATACATGGTACACATTATTAT
SEQ ID NO：10：
ATGAAAAACGACGATTTCACAACATAGCTGGGCACTATAGAGGCCAGTGCCATTCGTGCTGCAACCGAGCACGACAGGAACGACTCCAACGACGCAGAGAAACACAAGTATAATATTAAGTATGCATGGACCTAAGGCAACATTGCAAGACATTGTATTGCATTTAGAGCCCCAAAATGAAATTCCGGTTGACCTTCTATGTCACGAGCAATTAAGCGACTCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAGATGGAGTTAATCATCAACATTTACCAGCCCGACGAGCCGAACCACAACGTCACACAATGTTGTGTATGTGTTGTAAGTGTGAAGCCAGAATTGAGCTAGTAGTAGAAAGCTCAGCAGACGACCTTCGAGCATTCCAGCAGCTGTTTCTGAACACCCTGTCCTTTGTGTGTCCGTGGTGTGCATCCCAGCAGTAAGCA
SEQ ID NO：11：
TCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATACACTTTTTGGGAAGTAAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAAATTTTTACTACAAGCAGGATTGAAGGCCAAACCAAAATTTACATTAGGAAAACGAAAAGCTACACCCACCACCTCATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACGTAAGCTGTAAGTATTGTATGTATGTTGAATTAGTGTTGTTTGTTGTTTATATGTTTGTATGTGCTTGTATGTGCTTGTAAATATTAAGTTGTATGTGTGTTTGTATGTATGGTATAATAAACACGTGTGTATGTGTTTTTAAATGCTTGTGTAACTATTGTGTCATGCAACATAAATAAACTTATTGTTTCAACACCTACTAATTGTGTT
SEQ ID NO：12：
CAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAATCATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAAT
b、玻片：玻片为市售玻片经处理后改善其粘附力及侵润性。对常规的载玻片进行预处理，增强其对细胞的黏附性及侵润性，解决常规涂片进行原位杂交时细胞容易脱落的问题。将洁净的玻片处理液处理液中浸泡12h以上，晾干保存。玻片处理液的各组分浓度为多聚赖氨酸、黄油、聚乙烯，浓度均在5-15％，以DEPC(焦碳酸二乙酯)水配制。多聚赖氨酸、黄油、聚乙烯可使用市售商品，如Sigma公司产品。利用上述预处理的玻片进行液基薄层细胞涂片或组织切片的制备。涂片制备方法可用美国新柏氏(Tinpreper TCT)或其他厂家的仪器进行涂片制备。组织切片可采用石蜡或冰冻切片。
c、原位杂交试剂：由杂交液增强液、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的地高辛抗体、显色底物组成。
杂交增强液：为质量浓度为45％去离子甲酰胺、质量浓度为10％硫酸葡聚糖、100ug/mL鲑鱼精DNA、1-8×SSC(其中优选的方案是4×SSC)、5×Denhardts溶液、50mM Tris-HCl溶液；(1*SSC(1000ml)：0.15M Nacl0.015M柠檬酸三钠；1*Denhardt′s(100ml)：0.02％Ficoll 400，0.02％PVP-40、0.02％BSA)。
碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的地高辛抗体：用于原位杂交的酶标二抗为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的抗地高辛Fab片段，购自Roche公司，用量为1∶100-1∶500倍稀释，优选的用量为1∶250倍稀释；
用于原位杂交的信号放大的检测系统为Dig-HRP(辣根过氧化物酶)检测系统或Dig-AKP(碱性磷酸酶)检测系统，使用不同的酶需要使用与之相匹配的显色系统，使用Dig-HRP的显色液底物为DAB/H2O2，底物优选方案是，使用Dig-AKP的显色底物为NBT/BCIP，底物优选方案为NBT、BCIP以70％的二甲基甲酰胺溶解，终浓度为5％(质量体积比)，临用前以0.1M Tris-HCl(pH9.5)配置成0.4％(体积比)工作液；用于增加显色效果的湿盒增效液，其组分为：甲酰胺。
实施例2
(1)制备靶Dig-探针所用样品的准备：
6例临床收集的HPV阳性样本，经测序验证分别为HPV16、18型。将试管中样本液转入1.5ml离心管，用Mark笔在管盖做好标记。10，000rpm离心5分钟，弃上清，留沉淀；
样本沉淀50μlDNA提取液(成分为：25mM NaOH、10mMTris-HCl(pH8.0)、1％TritonX-100、1％NP-40、2％Chelex-100、0.1mM EDTA(pH8.0))混匀，煮沸10分钟，10,000rpm离心5分钟，上清备用。
(2)Dig-探针的制备：
PCR试剂分别使用热启动酶或者Taq酶配制，其中Taq酶由NEB公司生产，热启动酶由Fermentas生产，10×热启动PCR缓冲液和为市售，反应体系的制备如表2和表3下：
表2
表3
PCR反应试剂中，直接加入2μl提取的DNA模板，瞬时(3秒)离心后，将各反应管放入PCR仪中。
PCR试剂扩增条件为：95℃5min，然后94℃30s，68℃90s，运行5个循环，然后94℃30s，55℃45s，72℃60s，运行40个循环，最后72℃7min。
扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果参见附图1、2、3、4。
图1为制备探针的PCR扩增产物电泳图，图中1-7泳道包含两种不同的酶配制的PCR反应液扩增结果。采用引物为：16F1，16R1。1-3泳道为3例不同的HPV样本，经测序确认为HPV16型，使用热启动酶进行扩增的产物，4-6泳道为3例不同的样本，使用Taq酶进行扩增的产物，标本同1-3泳道，7泳道DNA marker为100bp Ladder(TaKaRa公司生产)。
图2为制备探针的PCR扩增产物电泳图，图中1-7泳道包含两种不同的酶配制的PCR反应液扩增结果。采用引物为：16F2，16R2。1-3泳道为3例不同的HPV样本，经测序确认为HPV16型，使用热启动酶进行扩增的产物，4-6泳道为3例不同的样本，使用Taq酶进行扩增的产物，标本同1-3泳道，7泳道DNA marker为100bp Ladder(TaKaRa公司生产)。
图3为制备探针的PCR扩增产物电泳图，图中1-7泳道包含两种不同的酶配制的PCR反应液扩增结果。采用引物为：18F1，18R1。1-3泳道为3例不同的HPV样本，经测序确认为HPV18型，使用热启动酶进行扩增的产物，4-6泳道为3例不同的样本，使用Taq酶进行扩增的产物，标本同1-3泳道，7泳道DNA marker为100bp Ladder(TaKaRa公司生产)。
图4为制备探针的PCR扩增产物电泳图，图中1-7泳道包含两种不同的酶配制的PCR反应液扩增结果。采用引物为：18F2，18R2。1-3泳道为3例不同的HPV样本，经测序确认为HPV18型，使用热启动酶进行扩增的产物，4-6泳道为3例不同的样本，使用Taq酶进行扩增的产物，标本同1-3泳道，7泳道DNA marker为100bp Ladder(TaKaRa公司生产)。
从电泳结果可以得出结论：加入热启动酶和Taq酶的PCR试剂均可成功扩增出目的条带，其中16F1和16R1扩增条带为235bp，16F2&16R2扩增条带为364bp，18F1和18R1扩增条带为427bp，18F2&18R2扩增条带为327bp。以上4种PCR产物经纯化，纯化可采用TaKaRa公司的割胶纯化试剂盒进行。纯化的PCR产物经紫外分光光度计测定OD260/280，计算核酸含量。将四种PCR产物按照1∶1∶1∶1的比例混合，配置成终浓度为1-3ng/uL的杂交液。其中优选的方案是1.5ng/uL。
(3)高粘附力载玻片的制备：
本发明所用的载玻片经过处理后，粘附力和侵润性较普通玻片大为提高，可避免在原位杂交操作过程中发生细胞脱落现象。制备方法为：用纯化水配置多聚赖氨酸、黄油、聚乙烯溶液，浓度均为10％，将洁净的市售玻片浸泡于溶液中12h以上，取出，晾干。
(4)检测样本的制备：
本试剂盒的检测样本为液基薄层细胞涂片，也可对常规的组织蜡切片或冰冻切片进行检测。制备方法参照相应的仪器设备，选用本试剂盒提供的载玻片。
(5)原位杂交检测：
1.杂交预处理
甩干切片，将组织周围液体用滤纸吸干，每张切片滴加适量1×蛋白酶K工作液(约50ul，根据组织大小增、减量)，室温孵育5分钟。将切片放入杂交增强液，300℃微波加热30min，冷却，蒸馏水洗涤1×1分钟，小心擦干组织周围液体。
2.杂交：
2.1每张切片滴加适量上述步骤(2)杂交液(约20ul，根据组织大小增、减量)，并加盖玻片；
2.2变性：
放置杂交加热器上，95℃变性5min；
2.3切片放入含30％湿盒增效液的湿盒中，37℃下孵育4-16小时。建议过夜(＜16小时)以保证低拷贝样本的杂交效果；
2.448℃(PBS预温)浸泡切片，小心移去盖玻片，PBS继续浸泡5分钟；
2.548℃PBS洗涤3×5分钟(轻微振荡容器)；
(盖玻片规格应与杂交液量匹配，切片在整个试验过程中要保持湿润状态，防止干片。)
3.信号放大与显色：
3.1取经原位杂交后的组织切片，小心擦去组织周围液体，滴加适量酶(辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗地高辛Fab片段)(约50ul)，37℃，水湿盒中孵育30分钟；37℃PBS浸泡3×2分钟(轻微振荡容器)；
3.2小心擦去组织周围液体，滴加适量试剂酶稀释液(约50ul)，室温，水湿盒中孵育20分钟；PBS室温浸泡3×2分钟(轻微振荡容器)；
3.3小心擦去组织周围液体，滴加适量试剂C(约50ul)，室温，水湿盒中孵育30分钟；PBS室温浸泡3×2分钟(轻微振荡容器)。
3.4小心擦去组织周围液体，滴加适量底物(根据所用的酶选择DAB或BCIP/NBT底物)(约50ul)，避光显色，显微镜下观察15-30分钟，根据显色(蓝黑色)确定终止时间。
3.5自来水冲洗，苏木精或核固红复染；苏木素复染若有必要，可用0.1％HCL分化，自来水冲洗，PBS返蓝。
3.6用BCIP/NBT显色，切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。
4、结果分析：
请参阅图5、图6、图7、三张图为使用本发明试剂盒对三例HPV阳性对照标本的杂交显色结果图，图1：高危-弥散型40×8，图2：高危-弥散型40×4图3：高危整合40×4，三张图为进行杂交显色的玻片在荧光显微镜下观察到的，三张图杂交信号明显且无病原体凝结成团的现象。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种人乳头瘤病毒原位杂交检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括玻片、杂交液、原位杂交试剂，所述杂交液包括标记物标记的杂交探针，所述杂交探针序列如SEQ ID NO：9到SEQ ID NO：12所示。
2.按权利要求1所述的人乳头瘤病毒原位杂交检测试剂盒，其特征在于，所述玻片为在玻片处理液中进行了浸泡的玻片，浸泡时间大于12小时，所述玻片处理液以DEPC水为溶剂配制，所述玻片处理液各组分质量浓度为：多聚赖氨酸：5-15％、黄油：5-15％、聚乙烯：5-15％。
3.按权利要求1所述的人乳头瘤病毒原位杂交检测试剂盒，其特征在于，所述原位杂交试剂包括杂交增强液，显色底物，还包括碱性磷酸酶标记的地高辛抗体或辣根过氧化物酶标记的抗地高辛Fab片段，所述杂交增强液各组分为：质量浓度45％甲酰胺、质量浓度10％硫酸葡聚糖、100ug/mL鲑鱼精DNA、4×SSC、5×Denhardts溶液、50mM Tris-HCl溶液。
4.按权利要求1所述的人乳头瘤病毒原位杂交检测试剂盒，其特征在于，还包括显色增强液，所述显色增强液为质量浓度为10％的甲酰胺。
5.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒型原位杂交检测试剂盒，其特征在于，所述标记物可以为为放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶、地高辛或纳米材料。
6.一种人乳头瘤病毒原位杂交检测方法，其特征在于，
该方法包括以下步骤：
a、特异性探针的制备：设计引物并PCR扩增所述的HPV病毒核酸，以地高辛进行标记，制备特异性检测HPV的探针，所述引物序列如SEQ IDNO：1到SEQ ID NO：8所示，所述探针序列如SEQ ID NO：9到SEQ ID NO：12所示；
检测样本的制备：对玻片进行预处理，将玻片在玻片处理液中进行浸泡，浸泡时间大于12小时，所述玻片处理液以DEPC水为溶剂配制，所述玻片处理液各组分质量浓度为：多聚赖氨酸：5-15％、黄油：5-15％、聚乙烯：5-15％，然后制作样本的切片或液基薄层细胞涂片；
b、原位杂交检测：将上述地高辛标记的探针与制备好的样本涂片或切片进行原位杂交，所述地高辛标记的探针与样本的目的片段结合；
c、信号放大与检测：上述步骤b中的探针进一步结合辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗地高辛Fab片段，通过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶显色系统进行信号放大检测。
7.根据权利要求6所述的人乳头瘤病毒原位杂交检测方法，其特征在于，所述步骤b杂交检测具体为：
S10、杂交预处理：
甩干步骤a所述切片，将组织周围液体用滤纸吸干，每张切片滴加蛋白酶K工作液，孵育5分钟，将切片放入杂交增强液，微波加热30分钟，冷却，蒸馏水洗涤1分钟，小心擦干组织周围液体；
S20、杂交：
S21、每张切片滴加杂交液，并加盖玻片；
S22、变性：将切片放置杂交加热器上，95℃变性5分钟；
S23、切片放入含30％湿盒增效液的湿盒中，37℃下孵育4-16小时；
S24、PBS缓冲液48℃预温浸泡切片，小心移去盖玻片，PBS缓冲液继续浸泡5分钟；
S25、振荡容器48℃PBS缓冲液洗涤15分钟。
8.根据权利要求6所述的人乳头瘤病毒原位杂交检测方法，其特征在于，所述步骤c信号放大与检测具体为：
S10、取经原位杂交后的组织切片，滴加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗地高辛Fab片段，37℃，水湿盒中孵育30分钟；37℃PBS缓冲液浸泡6分钟，振荡容器；
S20、滴加试剂酶稀释液，37℃水湿盒中孵育20分钟；37℃PBS缓冲液浸泡6分钟，振荡容器；
S30、滴加试剂C，所述试剂C为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶溶液，37℃水湿盒中孵育30分钟；37℃下PBS缓冲液浸泡6分钟，振荡容器；
S40、滴加底物DAB/H2O2或BCIP/NBT底物，避光显色，显微镜下观察15-30分钟，当显色为蓝黑色时终止显色。
9.根据权利要求6所述的人乳头瘤病毒原位杂交检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的样本来自宫颈拭子、刮取物、液体悬浮物、冻存材料、石蜡包埋组织。
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