CN113528513B - 原位杂交探针复合体、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种原位杂交探针复合体、其制备方法及应用。本发明揭示了一种优化的原位杂交探针复合体,由杂交探针1和杂交探针2组成;每个探针包括探针结合区、间臂连接区和互补配对区三个部分,并在5’和3’端进行可检测标记物的标记。杂交探针1和杂交探针2通过互补配对区形成探针复合体,该复合体可以和两组目标基因片段结合,并且携带4个可检测标记物。本发明的技术方案既能够显著增加阳性样品的染色强度,又可以有效降低原位杂交染色的背景信号,从而提高样本检测的准确性。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域;更具体地,本发明涉及一种制备用于免疫组织化学检测的原位杂交探针复合体、其制备方法及应用。
背景技术
原位杂交是采用特定标记的已知核酸序列为探针,与细胞或组织切片上的核酸序列发生杂交反应,对核酸进行精确定位的方法。因此可以借助于原位杂交,得到细胞中特定核酸的位置及丰度信息。该方法将与待测核酸分子序列互补的核酸探针溶解到杂交缓冲液中,并滴加到经蛋白酶消化的组织切片上,使核酸探针与目标核酸分子结合。在核酸探针上附加有检测用的标记物(如荧光标记、地高辛标记等),用适当的方法对标记物进行检测,最后在显微镜下观察结果。
对原位杂交探针进行荧光标记的操作相对复杂,荧光标记探针的稳定性差,容易发生降解,导致探针有效期较短,且需要使用相对昂贵的荧光显微镜来观察结果。这些不利因素限制了荧光原位杂交探针在临床上的推广应用。
一般情况下,可以通过体外转录或化学合成的方式制备用于核酸原位杂交的探针。采用体外转录方式制备杂交探针时,可以将Dig-UTP混入转录体系,从而在探针上附加Dig标记。或者先合成寡核苷酸引物链,再通过化学修饰将Dig标记到引物上。采用Dig标记的原位杂交探针,其长度范围多为30-200bp。对于双螺旋的核酸分子,每1个碱基对的长度约为0.3-0.4nm,一个包含30个碱基的核酸探针与目标核酸结合后,总长度大约为10nm。而一个IgG抗体分子的直径也在10nm左右。在原位杂交反应过程中,组织细胞被固定在玻璃片的表面,一个相对较短的杂交探针(比如30bp)与细胞中的目标核酸片段结合后,所携带的地高辛标记与抗地高辛抗体的结合会受到空间位阻的限制。所以,对于短片段的杂交探针,即使增加探针上Dig标记的数量,也不能捕获到更多的抗地高辛抗体,不能增加阳性显色的信号强度。如果使用较长的杂交探针(比如长100~200bp,且携带多个Dig标记),单个杂交分子理论上可以捕获多个抗地高辛抗体,从而增加显色信号强度。但较长的杂交探针在温和的杂交条件下(比如37~50℃温育),容易发生杂交探针的非特异性结合,导致显色的背景信号加深,并影响染色结果的判断。
鉴于此,本领域还需要进一步研究优化核酸原位杂交的探针试剂以及相应的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供用于免疫组织化学检测的原位杂交探针复合体及其制备方法。
在本发明的第一方面,提供一种制备原位杂交探针复合体的方法,包括:
(1)制备杂交探针1,其包括通过间臂连接区连接的探针结合区1和互补配对区1,在5’和3’端标记可检测标记物;
(2)制备杂交探针2,其包括通过间臂连接区连接的探针结合区2和互补配对区2,在5’和3’端标记可检测标记物;
其中,所述探针结合区1与所述探针结合区2分别与目标核酸的两组区段互补;所述互补配对区1和互补配对区2互补形成探针复合体,从而一个复合体能结合两组目标核酸区段、并由四组可检测标记物进行信号报告。
在本发明的另一方面,提供一种原位杂交探针复合体,包括:
(1)杂交探针1,其包括通过间臂连接区连接的探针结合区1和互补配对区1,其5’和3’端标记有可检测标记物;
(2)杂交探针2,其包括通过间臂连接区连接的探针结合区2和互补配对区2,其5’和3’端标记有可检测标记物;
其中,所述探针结合区1与所述探针结合区2分别与目标核酸的两组区段互补;所述互补配对区1和互补配对区2互补形成探针复合体,从而一个复合体能结合两组目标核酸区段、并由四组可检测标记物进行信号报告。
在一个或多个实施方案中,所述杂交探针1和杂交探针2通过复性形成所述探针复合体。
在一个或多个实施方案中,将杂交探针1和杂交探针2混合于含Tris-HCl(pH8.5),KCl,MgCl2的复性缓冲液中,形成杂交探针复合体。
在一个或多个实施方案中,所述复性缓冲液包括:10±2mmol/L Tris-HCl pH8.5,50±5mM KCl,1.5±0.3mM MgCl2。
在一个或多个实施方案中,杂交探针1和杂交探针2混合(如等量混合)后,经过80±5℃孵育10±2分钟,50±3℃孵育20分钟,形成杂交探针复合体。
在一个或多个实施方案中,所述的可检测标记物包括(但不限于):地高辛,生物素、荧光素。
在一个或多个实施方案中,所述的两组区段是序列相同的区段或序列不同的区段。
在一个或多个实施方案中,所述探针结合区1或所述探针结合区2的长度为20-40bp,较佳地25-35bp,碱基序列与所要检测的目标核酸序列互补。
在一个或多个实施方案中,所述互补配对区1或互补配对区2的长度为20-40bp,较佳地25-35bp;所述互补配对区1或互补配对区2的碱基序列反向互补。
在一个或多个实施方案中,所述间臂连接区将杂交探针分隔成两个相对独立的配对区域,所述间臂连接区不携带核苷酸碱基,不发生互补配对。
在一个或多个实施方案中,通过1个或多个(包括两个,如1-2个,较佳地如2-10个,具体如3、4、5、6、7、8、9个)四氢呋喃形成间臂连接区,或者通过至少3个CH2(如3-30个,较佳地如4-20个,具体如5、6、7、8、9、10、12、14、16、18个)形成间臂连接区。
在一个或多个实施方案中,所述的目标核酸为EB病毒编码的小RNA-1(EBER-1)和EB病毒编码的小RNA-2(EBER-2),所述杂交探针1的核苷酸序列如:SEQ ID NO:3-间臂连接区-SEQ ID NO:5所示;所述杂交探针2的核苷酸序列如:SEQ ID NO:4-间臂连接区-SEQ IDNO:6所示。
在一个或多个实施方案中,在用于检测时,所述的杂交探针1和杂交探针2预先形成杂交探针复合体,再与细胞或组织中的目标核酸片段发生原位杂交反应。
在本发明的另一方面,提供前面任一所述的原位杂交探针复合体的应用,用于制备进行免疫组织化学原位杂交检测的检测试剂或检测试剂盒。
在本发明的另一方面,提供一种核酸分子原位杂交检测试剂盒,所述试剂盒中包括:前面任一所述的原位杂交探针复合体;检测所述原位杂交探针复合体上的可检测标记物的物质。
在一个或多个实施方案中,所述可检测标记物为地高辛、生物素、荧光素,针对性检测所述可检测标记物的物质包括:对应地高辛的抗地高辛抗体,对应生物素的亲和素(Avidin),对应荧光素的抗荧光素抗体。
在一个或多个实施方案中,所述的核酸分子原位杂交检测试剂盒中还包括(但不限于):用于溶解探针的溶剂,较佳地包括去离子水;复性缓冲液;杂交缓冲液;免疫组化试剂;洗涤试剂等。
在一个或多个实施方案中,所述的复性缓冲液包括:含Tris-HCl(pH8.5),KCl,MgCl2;该复性缓冲液用于处理探针,形成杂交探针复合体。
在一个或多个实施方案中,所述的免疫组化试剂包括:切片预处理试剂、脱蜡/水化试剂、消化酶、内源性过氧化物酶阻断剂等。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、本发明的用于免疫组织化学检测的原位杂交探针复合体的结构示意图。
图2、当探针复合体与目标核酸片段中的1个或2个结合后,都可以同时捕获多个抗地高辛的抗体分子。
图3、实施例2中,应用光学显微镜进行免疫组织化学实验结果的观察;
(A)传统探针染色及检测图;
(B)本发明探针染色及检测图。
图4、实施例3中,应用光学显微镜进行免疫组织化学实验结果的观察;
(A)传统探针染色及检测图;
(B)本发明探针染色及检测图。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究,提供了一种制备原位杂交探针复合体的方法以及由此获得的复合体。利用本发明制备获得的原位杂交探针复合体,可在不增加探针结合区长度的情况下,增加携带的可检测标记物的数量;另外,同时存在两个探针结合区也增加了探针被捕获的机会。因此,本发明的技术方案有效提高了染色的清晰度,染色效果更好。
如本发明所用,“待测样品”、“待测样本”或“待测核酸(DNA)样本”可互换使用,是指待检测的组织或细胞样本,需要了解其中是否存在感兴趣的目标核酸(目标基因)。
如本发明所用,“目标核酸(目标基因)”是指感兴趣的核酸,可以是DNA或RNA,例如其是一种与病毒相关的核酸,或与细菌相关的核酸;此外,其也可以为一种与疾病相关的核酸。
如本发明所用,“探针”是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸,其具有与目标核酸基本上互补的核苷酸序列结构,可以与“目标核酸”形成双链。所述的“探针”可以携带可检测标记物。
如本发明所用,“第一抗体”、“一抗”是指特异性地识别和结合所述的可检测标记物(如地高辛)的抗体。
如本发明所用,“第二抗体”、“二抗”是指特异性地识别和结合所述的“第一抗体”的抗体。所述的“第二抗体”偶联有酶标记物,从而可进行利用酶标记物的底物显色。
如本发明所用,“互补”是指核苷酸的序列之间可以以一种可预见的方式发生相互作用,如形成二级结构(如茎环结构)。通常,两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的;更优选的,至少有80%或90%的核苷酸是互补的。本发明中,两条足够互补的分子之间可以具有1-2个(较佳地为1个)不配对的核苷酸。优选的,所述的“互补”为“完全互补”。
本发明提供了一种用于免疫组织化学检测的原位杂交探针复合体,包括:(1)杂交探针1,其包括通过间臂连接区连接的探针结合区1和互补配对区1,其5’和3’端标记有可检测标记物;(2)杂交探针2,其包括通过间臂连接区连接的探针结合区2和互补配对区2,其5’和3’端标记有可检测标记物;其中,所述探针结合区1与所述探针结合区2能与目标核酸的两组区段互补;所述互补配对区1和互补配对区2互补形成探针复合体,从而一个复合体能结合两组目标核酸区段、并由四组可检测标记物进行信号报告。
本发明中,所述探针复合体的设计原理图如图1所示,其在进行反应时的示意图如图2所示。可见,本发明的技术方案可在不增加探针结合区长度的情况下,通过探针复合体来增加携带的地高辛标记数量。同时存在两个探针结合区也增加了探针被捕获的机会。
尽管对长片段探针来说,携带更多的地高辛在本领域不难实现,但容易产生非特异结合,加深显色背景。特别是在免疫组织化学检测中,杂交后切片的洗涤仅仅是在TBS缓冲液中室温浸洗3分钟*3次,这么温和的洗涤步骤很难将非特异性结合去除干净。只有短片段探针(30bp左右)能够保证原位杂交反应的特异性。然而,短片段探针存在的问题是形成的杂交双链分子很小,和单个抗体分子的大小差不多。本发明人的前期研究工作中,对比测试了常规的30bp探针,一组只进行5’端地高辛标记,另一组同时在5’和3’端进行地高辛标记,两组通过免疫组织化学染色检测到的原位杂交信号没有差异。所以在短片段探针上标记更多的地高辛,只会大幅增加探针制备的成本,不会增加阳性信号强度。
本发明中,将探针结合区设置在20-40bp、较佳地25-35bp的长度,其优点在于可充分利用短片段探针的高特异性,再通过探针复合体结构来增加携带可检测标记物的数量,实现阳性信号的放大,提高检测的灵敏度。
在复性缓冲液中,两个杂交探针的互补配对区通过碱基配对,形成杂交探针复合体。在后续的原位杂交反应过程中,探针复合体的互补配对区,始终以双链结合的形式存在,所以在杂交探针中引入互补配对区,不会增加探针的非特异性结合。
本发明中,在探针结合区和互补配对区之间,引入了一个间臂连接区,将杂交探针分隔成两个相对独立的配对区域。间臂连接区不携带核苷酸碱基,不发生互补配对,不会影响探针结合区与目标核酸的特异性结合。
本发明人发现,若是探针结合区和互补配对区直接相连,互补配对区预先形成的DNA双螺旋结构会影响探针结合区的碱基配对(尤其是紧邻的几个碱基)。本发明的设计则有效解决了这一问题,间臂连接区的存在,可以为原位杂交探针复合体提供一个相对灵活的空间构象,有利于提高探针复合体与地高辛抗体的结合效率。
本发明中,所述的间臂连接区的特点是不携带核苷酸碱基,不发生碱基配对,这样就可以消除两个配对区之间的干扰。因此,可以使得两条DNA序列之间形成这一方式的连接的一些连接子可被应用于本发明中,优选地为化学合成中的间臂。作为本发明的具体优选方式,使用四氢呋喃或CH2作为连接基团。本领域中,此类化学间臂尚未在原位杂交探针中被应用。
本发明中的杂交探针复合体,包含2个探针结合区,并携带有4个地高辛标记物。2个独立的探针结合区,可以通过碱基互补配对的方式,与2个目标核酸片段特异性结合。当探针复合体与目标核酸片段中的1个或2个结合后,都可以同时捕获多个抗地高辛的抗体分子,最终获得增强的原位杂交显色信号。
作为本发明的优选方式,所述可检测标记物包括(但不限于):地高辛(Dig,digoxigenin),生物素(Biotin),荧光素。针对性检测所述可检测标记物的物质包括:对应地高辛的抗地高辛抗体,对应生物素的亲和素(Avidin),对应荧光素的抗荧光素抗体。本发明也包括这些物质的类似物或衍生物。
作为本发明的优选方式,采用地高辛作为可检测标记物、同时以抗地高辛抗体来识别地高辛。进一步地,利用带有显色识别分子(如HRP)的第二抗体来识别所述抗亲和素抗体,通过显色反应来呈现阳性反应。地高辛,作为一种常用的半抗原标记物,可以和抗地高辛抗体特异性结合。利用抗地高辛抗体来检测地高辛标记的杂交探针,进一步引发基于辣根过氧化物酶-DAB的显色反应,可以实现对核酸分子的原位杂交检测。该方法操作简单,试剂成本相对较低,使用普通光学显微镜即可观察结果,而且显色后的切片非常稳定,可以在室温条件下长期保存备查。
本发明还提供一种用于核酸分子原位杂交检测的试剂盒,所述试剂盒可包括用于存储、运输反应试剂(例如在适当容器中的探针、酶等)和/或配合材料(例如:缓冲液、执行评估的书面说明等)或将其从一个位置递送到另一个位置的系统。例如,试剂盒可包括一个或多个包含相关反应试剂和/或配合材料的外壳(例如:盒子)。这些内容物可以同时或单独地被运用。所述试剂盒中包括本发明所述的用于免疫组织化学检测的原位杂交探针复合体。
更优选的,它还含有(但不限于)下组的试剂:用于溶解探针的溶剂,较佳地包括去离子水;复性缓冲液;杂交缓冲液;免疫组化试剂。
为了便于操作,所述的试剂盒中还可包括用于杂交、显色等所需的其它各种试剂,包括但不限于:杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。
作为本发明的优选方式,所述试剂盒中,还包括样本处理液或保存液,较佳地包括:切片预处理试剂、脱蜡/水化试剂、消化酶、内源性过氧化物酶阻断剂;洗涤试剂等。
作为本发明的优选方式,洗涤液为一定pH值的缓冲液,具有减少非特异性吸附的作用。
此外,所述的试剂盒中还可包括说明本发明所述的探针复合体的制备方法以及检测方法的使用说明书。
此外,所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件等。
本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高,成本低廉,无需DNA扩增,无需特殊试验条件,操作简单易培训,使实验污染的降到最低。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、检测EB病毒中EBER基因表达的原位杂交探针复合体设计
EB病毒是一种普遍存在的人类疱疹病毒,可以感染全球95%左右的成人,其中绝大部分被感染者不会出现任何的临床症状。然而,在某些情况下潜伏感染的EB病毒会导致恶性肿瘤的发生,包括B细胞来源的淋巴瘤,以及上皮细胞来源的鼻咽癌等。EB病毒基因组大小约为170kb,除了可转录一系列蛋白编码基因,还可以编码一些小RNA,其中最主要的是小RNA-1(Epstein-Barr virus encoded small RNA 1,简称EBER-1)和小RNA-2(Epstein-Barr virus encoded small RNA 2,简称EBER-2)。EBER的表达水平与肿瘤患者的复发、转移、以及预后密切相关。
原位杂交的目标基因为EB病毒(Epstein-Barr virus)编码的EBER-1和EBER-2,核酸序列如下:
EBER-1序列(SEQ ID NO:1):
AGGACCUACGCUGCCCUAGAGGUUUUGCUAGGGAGGAGACGUGUGUGGCUGUAGCCACCCGUCCCGGGUACAAGUCCCGGGUGGUGAGGACGGUGUCUGUGGUUGUCUUCCCAGACUCUGCUUUCUGCCGUCUUCGGUCAAGUACCAGCUGGUGGUCCGCAUGUUUU
EBER-2序列(SEQ ID NO:2):
AGGACAGCCGUUGCCCUAGUGGUUUCGGACACACCGCCAACGCUCAGUGCGGUGCUACCGACCCGAGGUCAAGUCCCGGGGGAGGAGAAGAGAGGCUUCCCGCCUAGAGCAUUUGCAAGUCAGGAUUCUCUAAUCCCUCUGGGAGAAGGGUAUUCGGCUUGUCCGCUAUUUUU
针对EBER-1和EBER-2RNA序列分别设计传统探针和本发明探针,具体情况如下:
(1)传统探针组合(作为对照组),包含:
EBER-1Probe:CGGCAGAAAGCAGAGTCTGGGAAGACAACC(SEQ ID NO:3),长度30base,5’和3’末端进行地高辛标记。
EBER-2Probe:GCAAATGCTCTAGGCGGGAAGCCTCTCTTC(SEQ ID NO:4),长度30base,5’和3’末端进行地高辛标记。
(2)本发明探针组合1(用于实施例2),包含:
N1-EBER-1Probe:
CGGCAGAAAGCAGAGTCTGGGAAGACAACC(SEQ ID NO:3)-Spacer-CCAAGACCACTCGTGAAGACAGCACTGAAG(SEQ ID NO:5),探针结合区(SEQ ID NO:3)长度30base,互补配对区(SEQ ID NO:5)长度30base,间臂连接区(Spacer)采用2个四氢呋喃进行连接,5’和3’末端进行地高辛标记。
N1-EBER-2Probe:
GCAAATGCTCTAGGCGGGAAGCCTCTCTTC(SEQ ID NO:4)–Spacer-CTTCAGTGCTGTCTTCACGAGTGGTCTTGG(SEQ ID NO:6)。探针结合区(SEQ ID NO:4)长度30base,互补配对区(SEQ ID NO:6)长度30base(与SEQ ID NO:5互补配对),间臂连接区(Spacer)采用2个四氢呋喃进行连接,5’和3’末端进行地高辛标记。
(3)本发明探针组合2(用于实施例3),包含:
N2-EBER-1Probe:
CGGCAGAAAGCAGAGTCTGGGAAGACAACC(SEQ ID NO:3)-Spacer-CCAAGACCACTCGTGAAGACAGCACTGAAG(SEQ ID NO:5),探针结合区(SEQ ID NO:3)长度30base,互补配对区(SEQ ID NO:5)长度30base,间臂连接区(Spacer)采用6个CH2进行连接,5’和3’末端进行地高辛标记。
N2-EBER-2Probe:
GCAAATGCTCTAGGCGGGAAGCCTCTCTTC(SEQ ID NO:4)-Spacer-CTTCAGTGCTGTCTTCACGAGTGGTCTTGG(SEQ ID NO:6)。探针结合区(SEQ ID NO:4)长度30base,互补配对区(SEQ ID NO:6)长度30base(与SEQ ID NO:5互补配对),间臂连接区(Spacer)采用6个CH2进行连接,5’和3’末端进行地高辛标记。
在以上三组探针组合中,探针结合区的长度和序列完全一致,每个探针都携带2个高地辛标记。在本发明的探针组合1和探针组合2中,探针序列保持一致,探针组合1中的间臂连接区使用2个四氢呋喃作为连接基团,探针组合2中的间臂连接区使用6个CH2作为连接基团。
实施例2、原位杂交检测鼻咽癌组织切片中EBER的表达
1、本实施EBER原位杂交检测的试剂
试剂1:蛋白酶K溶液;
试剂2A:传统探针杂交液(含传统探针组合);
试剂2B:本发明复合探针杂交液(含本发明探针组合1);
试剂3:鼠抗地高辛抗体;
试剂4:内源性过氧化物酶阻断剂;
试剂5:HRP标记二抗;
试剂6A:DAB显色剂(20×);
试剂6B:显色缓冲液。
EBER传统探针杂交液(试剂2A)按下述步骤配制:
将化学合成的EBER-1和EBER-2探针冻干粉,用去离子水分别溶解成20μmol/L的探针溶液,然后将两个20μmol/L的探针溶液与杂交缓冲液(含6×SSC;5×Denhardt;0.5%SDS;100μg/mL Salmon sperm DNA;50%Formamide)按1:1:98配制,制成终浓度为200nmol/L的传统探针杂交液。
本发明EBER复合探针杂交液(试剂2B)按下述步骤配制:
将化学合成的N1-EBER-1和N1-EBER-2探针冻干粉,用复性缓冲液(含10mmol/LTris-HCl pH8.5,50mM KCl,1.5mM MgCl2)分别溶解成20μmol/L的探针溶液,将两个探针溶液按1:1混合,经过80℃孵育10分钟,50℃孵育20分钟,形成杂交探针复合体(浓度10μmol/L)。然后将探针复合体与杂交缓冲液(含6×SSC;5×Denhardt;0.5%SDS;100μg/mL Salmonsperm DNA;50%Formamide)按1:49配制,制成终浓度为200nmol/L的复合探针杂交液。
2、切片预处理
将从鼻咽癌石蜡组织上制备的连续切片放入烤箱60℃烘烤1-2小时。
3、脱蜡和水化
(1)二甲苯依次脱蜡5分钟×2次;
(2)梯度酒精水化,无水乙醇3分钟×2次,95%乙醇3分钟×1次,85%乙醇3分钟×1次,流水冲洗至无酒精气味,再用去离子水3分钟×1次。
(3)消化酶消化
甩干切片,再用吸水纸吸干组织块边缘的液体,用阻水笔圈定玻片上的待测组织区域。每张切片加适量试剂1(约100μl,视切片大小,以完全覆盖切片组织为宜),室温下孵育10分钟。TBS缓冲液冲洗3分钟×1次。
(4)探针杂交
甩去TBS缓冲液,在切片上加20μl试剂2A(传统探针)或试剂2B(本发明探针),并加盖玻片,放置湿盒中,50℃恒温箱孵育90分钟。TBS缓冲液室温浸泡切片3分钟,盖玻片自然滑落,继续冲洗3分钟×3次。
(5)一抗孵育
甩去TBS缓冲液,每张切片加100μl试剂3,室温下孵育30分钟。TBS缓冲液冲洗3分钟×3次。
(6)阻断内源性过氧化物酶
甩去TBS缓冲液,每张切片加100μl试剂4,室温下孵育10分钟。TBS缓冲液冲洗3分钟×3次。
(7)二抗孵育
甩去TBS缓冲液,每张切片加100μl试剂5,室温下孵育20分钟。TBS缓冲液冲洗3分钟×3次。
(8)DAB显色
DAB工作液需要在使用前配制(现配现用)。配制方法:取试剂6A和试剂6B,按照1:20比例稀释混匀,避光保存。
甩去TBS缓冲液,每张切片加100μl新鲜配制的DAB工作液,室温显色5分钟。
(9)自来水冲洗,使用苏木素染液复染;用盐酸酒精溶液分化、返蓝,脱水后,常规封片。
4、结果分析判读
利用EBER原位杂交检测试剂,采用上述具体实验操作方法对鼻咽癌组织切片进行EBER检测,图3为应用光学显微镜进行观察的结果。由图可见,在EBER表达阳性的肿瘤细胞中,显示为棕色染色,主要定位在细胞核。根据染色强度的不同,阳性细胞可划分为强阳(棕褐色)、阳(棕色)和弱阳(浅棕色)三种染色类型。传统探针与本发明探针的染色情况对比汇总如表1。
表1
注:将传统探针检测到的阳性细胞数量设定为100。
在传统探针对照组中,染色结果为弱阳性的细胞数量约占总阳性细胞的60%;而在本发明探针试验组中,弱阳性的细胞数量仅占总阳性细胞的10%,强阳和阳性的细胞数量占90%。
与传统探针(图3A)相比,本发明探针(图3B)对EBER阳性细胞的染色显著增强,强阳性细胞的比例显著提高,而且染色背景更清晰,染色效果更好。
实施例3、原位杂交检测间变性大细胞淋巴瘤组织切片中EBER的表达
1、本实施EBER原位杂交检测的试剂
试剂1:蛋白酶K溶液;
试剂2A:传统探针杂交液(含传统探针组合);
试剂2C:本发明复合探针杂交液(含本发明探针组合2);
试剂3:鼠抗地高辛抗体;
试剂4:内源性过氧化物酶阻断剂;
试剂5:HRP标记二抗;
试剂6A:DAB显色剂(20×);
试剂6B:显色缓冲液。
EBER传统探针杂交液(试剂2A)按下述步骤配制:
将化学合成的EBER-1和EBER-2探针冻干粉,用去离子水分别溶解成20μmol/L的探针溶液,然后将两个20μmol/L的探针溶液与杂交缓冲液(含6×SSC;5×Denhardt;0.5%SDS;100μg/mL Salmon sperm DNA;50%Formamide)按1:1:98配制,制成终浓度为200nmol/L的传统探针杂交液。
本发明EBER复合探针杂交液(试剂2C)按下述步骤配制:
将化学合成的N2-EBER-1和N2-EBER-2探针冻干粉,用复性缓冲液(含10mmol/LTris-HCl pH8.5,50mM KCl,1.5mM MgCl2)分别溶解成20μmol/L的探针溶液,将两个探针溶液按1:1混合,经过80℃孵育10分钟,50℃孵育20分钟,形成杂交探针复合体(浓度10μmol/L)。然后将探针复合体与杂交缓冲液(含6×SSC;5×Denhardt;0.5%SDS;100μg/mL Salmonsperm DNA;50%Formamide)按1:49配制,制成终浓度为200nmol/L的复合探针杂交液。
2、使用传统探针(试剂2A)与本发明的探针(试剂2C)检测间变性大细胞淋巴瘤石蜡组织,具体操作同实施例2。
3、结果分析判读
利用EBER原位杂交检测试剂,采用上述具体实验操作方法对间变性大细胞淋巴瘤切片进行EBER检测,图4为应用光学显微镜观察的结果。由图可见,在EBER表达阳性的肿瘤细胞中,显示为棕色染色,主要定位在细胞核。根据染色强度的不同,阳性细胞可划分为强阳(棕褐色)、阳(棕色)和弱阳(浅棕色)三种染色类型。传统探针与本发明探针的染色情况对比汇总如表2。
表2
注:将传统探针检测到的阳性细胞数量设定为100。
在传统探针对照组中,染色结果为强阳性的细胞数量约占总阳性细胞的50%;而在本发明探针试验组中,染色结果为强阳性的细胞数量约占总阳性细胞的80%。另外,采用本发明的探针,在相同的组织部位,检测到的阳性细胞数量大约增加了25%。
与传统探针(图4A)相比,本发明的探针(图4B)对EBER阳性细胞的染色显著增强,阳性细胞数量更多,而且染色背景更清晰,染色效果更好。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 基因科技(上海)股份有限公司
<120> 原位杂交探针复合体、其制备方法及应用
<130> 215149
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 167
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(167)
<223> EBER-1序列
<400> 1
aggaccuacg cugcccuaga gguuuugcua gggaggagac guguguggcu guagccaccc 60
gucccgggua caagucccgg guggugagga cggugucugu gguugucuuc ccagacucug 120
cuuucugccg ucuucgguca aguaccagcu ggugguccgc auguuuu 167
<210> 2
<211> 173
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(173)
<223> EBER-2序列
<400> 2
aggacagccg uugcccuagu gguuucggac acaccgccaa cgcucagugc ggugcuaccg 60
acccgagguc aagucccggg ggaggagaag agaggcuucc cgccuagagc auuugcaagu 120
caggauucuc uaaucccucu gggagaaggg uauucggcuu guccgcuauu uuu 173
<210> 3
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> EBER-1 Probe
<400> 3
cggcagaaag cagagtctgg gaagacaacc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> EBER-2 Probe
<400> 4
gcaaatgctc taggcgggaa gcctctcttc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 互补配对区
<400> 5
ccaagaccac tcgtgaagac agcactgaag 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 互补配对区
<400> 6
cttcagtgct gtcttcacga gtggtcttgg 30
Claims (20)
1.一种制备原位杂交探针复合体的方法,其特征在于,包括:
(1) 制备杂交探针1,其包括通过间臂连接区连接的探针结合区1和互补配对区1,在5’和3’端标记可检测标记物;所述探针结合区1或所述互补配对区1的长度为20-40bp;
(2) 制备杂交探针2,其包括通过间臂连接区连接的探针结合区2和互补配对区2,在5’和3’端标记可检测标记物;所述探针结合区2或所述互补配对区2的长度为20-40bp;
其中,所述探针结合区1与所述探针结合区2分别与目标核酸的两组区段互补;所述互补配对区1和互补配对区2互补形成探针复合体,从而一个复合体能结合两组目标核酸区段、并由四组可检测标记物进行信号报告;所述杂交探针1和杂交探针2通过复性形成所述探针复合体;
所述间臂连接区将杂交探针分隔成两个相对独立的配对区域,所述间臂连接区不携带核苷酸碱基,不发生互补配对。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,将杂交探针1和杂交探针2混合于含Tris-HCl,KCl,MgCl2的复性缓冲液中,形成杂交探针复合体。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述复性缓冲液包括:10±2 mmol/L Tris-HCl pH8.5,50±5 mM KCl,1.5±0.3 mM MgCl2。
4.如权利要求2所述的方法,其特征在于,杂交探针1和杂交探针2混合后,经过80±5℃孵育10±2分钟,50±3℃孵育20分钟,形成杂交探针复合体。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的可检测标记物包括:地高辛,生物素、荧光素。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的目标核酸的两组区段是序列相同的区段或序列不同的区段。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述探针结合区1或所述探针结合区2的长度为25-35bp,碱基序列与所要检测的目标核酸序列互补;和/或
所述互补配对区1或互补配对区2的长度为25-35bp;所述互补配对区1或互补配对区2的碱基序列反向互补。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,通过1个或多个四氢呋喃形成间臂连接区,或者通过至少3个CH2形成间臂连接区。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的目标核酸为EB病毒编码的小RNA-1和EB病毒编码的小RNA-2,所述杂交探针1的核苷酸序列如:SEQ ID NO:3-间臂连接区-SEQ IDNO:5所示;所述杂交探针2的核苷酸序列如:SEQ ID NO:4-间臂连接区-SEQ ID NO:6所示。
10.一种原位杂交探针复合体,其特征在于,包括:
(1) 杂交探针1,其包括通过间臂连接区连接的探针结合区1和互补配对区1,其5’和3’端标记有可检测标记物;所述探针结合区1或所述互补配对区1的长度为20-40bp;
(2) 杂交探针2,其包括通过间臂连接区连接的探针结合区2和互补配对区2,其5’和3’端标记有可检测标记物;所述探针结合区2或互补配对区2的长度为20-40bp;
其中,所述探针结合区1与所述探针结合区2分别与目标核酸的两组区段互补;所述互补配对区1和互补配对区2互补形成探针复合体,从而一个复合体能结合两组目标核酸区段、并由四组可检测标记物进行信号报告;
所述间臂连接区将杂交探针分隔成两个相对独立的配对区域,所述间臂连接区不携带核苷酸碱基,不发生互补配对。
11.如权利要求10所述的复合体,其特征在于,所述的可检测标记物包括:地高辛,生物素、荧光素。
12.如权利要求10所述的复合体,其特征在于,所述的目标核酸的两组区段是序列相同的区段或序列不同的区段。
13.如权利要求10所述的复合体,其特征在于,所述探针结合区1或所述探针结合区2的长度为25-35bp,碱基序列与所要检测的目标核酸序列互补;和/或
所述互补配对区1或互补配对区2的长度为25-35bp;所述互补配对区1或互补配对区2的碱基序列反向互补。
14.如权利要求10所述的复合体,其特征在于,通过1个或多个四氢呋喃形成间臂连接区,或者通过至少3个CH2形成间臂连接区。
15.如权利要求10所述的复合体,其特征在于,所述的目标核酸为EB病毒编码的小RNA-1和EB病毒编码的小RNA-2,所述杂交探针1的核苷酸序列如:SEQ ID NO:3-间臂连接区-SEQID NO:5所示;所述杂交探针2的核苷酸序列如:SEQ ID NO:4-间臂连接区-SEQ ID NO:6所示。
16.权利要求10~15任一所述的原位杂交探针复合体的应用,用于制备进行免疫组织化学原位杂交检测的检测试剂或检测试剂盒。
17.一种核酸分子原位杂交检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括:
权利要求10~15任一所述的原位杂交探针复合体;
检测所述原位杂交探针复合体上的可检测标记物的物质。
18.如权利要求17所述的核酸分子原位杂交检测试剂盒,其特征在于,所述可检测标记物为地高辛、生物素、荧光素,针对性检测所述可检测标记物的物质包括:对应地高辛的抗地高辛抗体,对应生物素的亲和素,对应荧光素的抗荧光素抗体。
19.如权利要求17所述的核酸分子原位杂交检测试剂盒,其特征在于,其中还包括:
用于溶解探针的溶剂;
复性缓冲液;该复性缓冲液用于处理探针,形成杂交探针复合体;
杂交缓冲液;
免疫组化试剂;
洗涤试剂。
20.如权利要求19所述的核酸分子原位杂交检测试剂盒,其特征在于,所述用于溶解探针的溶剂为去离子水;或
所述复性缓冲液包括:含Tris-HCl,KCl,MgCl2;或
所述免疫组化试剂包括:切片预处理试剂、脱蜡/水化试剂、消化酶、内源性过氧化物酶阻断剂。
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