JP2023071698A - 標識された2’-o-メチルrnaオリゴヌクレオチドプローブ及びシグナル増幅系を使用する自動rna検出 - Google Patents
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Abstract
【課題】がん細胞又は腫瘍微小環境にあるその周りの正常組織における所定のmiRNAの差次的発現を検出するためのシステムを提供する。【解決手段】細胞のRNA標的の明視野インサイチュー検出のためのシステムであって、標的RNAに特異的な一意的2’-O-メチルRNAプローブを含む標的プローブであって、2’-O-メチルRNAプローブが少なくとも一つの検出可能部分とコンジュゲートされている、標的プローブと;シグナル増幅に効果的な反応性色原体コンジュゲート系であって、標的プローブの検出可能部分に結合するように適合化されている、反応性色原体コンジュゲート系とを含むシステムを提供する。【選択図】図2
Description
この開示は、マイクロRNA、メッセンジャーRNA及びノンコーディングRNAを含む任意の細胞性RNA分子の自動化された高感度で特異的な検出方法に関する。該技術は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPET)サンプル中のRNA分子の検出のためのプローブ設計並びに自動化方式でのプローブ使用を含む。
ヒトゲノムは、多様な細胞機能を調節する千を超える短い(17-24塩基)ノンコーディングマイクロRNA分子をコードしている。これらの機能の幾つかは、細胞増殖、運動性、及び免疫監視を含み、腫瘍形成に関与していることが知られている。驚くことではないが、多くのマイクロRNAが乳がん、結腸直腸がん、肺がん、及び前立腺がんを含む様々な疾患に対する強力な予後及び/又は予測バイオマーカーとなるであろうことを数多くの臨床研究が示唆している。しかしながら、それらの短い配列長のため、これらの潜在的なバイオマーカー標的の検出に対して技術的な障害が存在する:短いプローブは可視シグナルを生じさせるために著しい増幅技術を必要とするので(i)限られた標的配列がプローブ長と続く標的特異性、並びに(ii)検出感度を制限し;最後に(iii)低分子マイクロRNA標的は組織中で安定性が少ない場合がある(リボヌクレアーゼ感度の増加及び/又は細胞性成分への架橋の制限)。
マイクロRNAは、主に翻訳を阻害し、及び/又はmRNA分解を促進することによってタンパク質発現を調節する(Lin He及びGregory J. Hannon Nat. Rev. Genetics 5, 522-531)。mRNAの50%以上が一又は複数のmiRNAによって調節されると推定され、単一のmiRNAが数個から数十の遺伝子を調節しうる。miRNAは多くの生理的及び病理過程において機能することが証明されている。miRNAは腫瘍抑制因子又は癌遺伝子として機能しうる(Esquela-Kerscher等 Nat. Rev. Cancer 6, 259-269.)。
商業的に利用できる幾つかのRNA検出技術がある。ヴェンタナメディカルシステムズ社には、市販の検出化学品(ISH iVIEWブループラス検出キットカタログ番号:760-097)と共にFFPET中の自動カッパ(カッパDNPプローブカタログ番号:495-524)及びラムダ(ラムダDNPプローブカタログ番号:664-693)軽鎖mRNA発現のための製品がある。この技術は2’-O-メチルRNAオリゴヌクレオチドプローブ又は増幅(例えば、チラミドシグナル増幅)を使用しない。アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(ACD)には、そのRNAScope技術を用いたmRNAの手動検出のための幅広い製品群がある。ハイブリダイゼーション後に分岐DNA技術によって媒介された広範な増幅が、シグナルを検出のために十分に増幅させるために使用される。分岐DNA増幅後に色原体インサイチューハイブリダイゼーション(CISH)と蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)の双方の検出がACDによって提案されている。この技術は、ヴェンタナ・ディスカバリー機器によって提供される限られた部分的な自動化を伴い、手動で主に使用される。ここに開示される技術によって克服される実質的な制約は、それが、最小300塩基のRNA標的長を必要とすることである;従って、ACD技術は、マイクロRNA標的を検出することができない。Exiqon社はマイクロRNA検出のためにロックド核酸オリゴヌクレオチドプローブを提供する;該技術はプローブデザインと合成に限られており、如何なる特定の手動又は自動検出能力(色原体又はフルオロフォア発現又は沈着)ももたらさない。
この開示は、組織、特にホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPET)中の、分泌性因子のメッセンジャーRNA、ノンコーディングRNA、及びマイクロRNAを含む全てのRNA種のインサイチュー検出のための、新規で高感度の完全に自動化されたアッセイを記載する。検出可能部分(例えばハプテン)で標識された2’-O-メチル修飾RNAオリゴヌクレオチドを、RNA標的分子に対するインサイチューハイブリダイゼーションのプローブとして使用できることが発見された。そのプローブは、DNAプローブ、RNAオリゴヌクレオチドプローブ、又はリボプローブと比較して標的RNA分子に対して増加したインサイチュー結合親和性を有しており、よって増加したアッセイ感度を提供することが発見された。更に、2’-O-メチル修飾RNAオリゴヌクレオチドが組織染色の点でRNAプローブより又は更にはDNAプローブよりも優れたヌクレアーゼ耐性を有していることが発見された。
而して、新技術によって与えられる二つの利益は、2’-O-メチルRNAオリゴヌクレオチドプローブがDNA又はRNAプローブよりもRNA標的に対してより高親和性を有していることと、メチル基がRNアーゼ及び他のリボヌクレアーゼに対する耐性を付与することである。特定の実施例では、miRNAに対するプローブが開発された。幾つかの実施態様では、各miRNAプローブは、直接合成されたか(DNP)又はアミン修飾とついでハプテン化NHSを使用する何れかの二つのハプテンで標識される。
本技術は、堅牢で効率的なツールで、がん細胞又は腫瘍微小環境におけるそれらの周囲の正常組織中でのある種のmiRNAの差次的発現を探索することを可能にしようとするものである。このツールでそのようなことを可能にすると、本技術は、がんの診断と治療のための効果的なツールとして使用可能となる。
本開示では、より長いRNA標的の検出のために設計された修飾RNAオリゴヌクレオチドプローブと高感度のチラミド-ハプテン/銀検出を含む、新しいRNA検出技術を、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織中のマイクロRNA標的の自動検出に採用した。
例証的な実施態様では、組織サンプル中の標的RNAを検出するための方法が開示される。該方法は、サンプルを抗原回収試薬と接触させ;サンプルを、プローブがサンプル中の標的RNAにハイブリダイズするのに十分な条件下で標識された合成2’-O-メチルオリゴヌクレオチドプローブと接触させ;未結合プローブを除くようにサンプルをすすぎ;標的RNAの近位に複数の増幅標識を沈着させるようにサンプルを増幅試薬に接触させ;標的RNAの近位に検出可能標識を沈着させるようにサンプルを検出試薬に接触させ;検出可能標識を可視化することにより標的RNAを検出することを含む。一実施態様では、標識された合成2’-O-メチルオリゴヌクレオチドプローブは、約20から約200、約20から約100ヌクレオチド長である。他の実施態様では、該方法は、細胞形態を保つ条件を使用する。
また開示されるのは、ここに開示されたプローブ又はプローブセットの一又は複数を含むキットである。場合によっては、キットは更なる試薬、例えばシグナル増幅試薬(例えば、反応性色原体コンジュゲート系試薬)を含みうる。
本発明の方法は一を超える(例えば、2、3、4等の)異なった標的の検出を可能にしうる。幾つかの実施態様では、異なった検出可能な標識及び/又は検出系は、それぞれが単一のサンプル中で個々に検出されうるように標的のそれぞれに対して使用されうる。任意の適切な検出可能な標識及び/又は検出系が使用されうる。
より特定的には、本発明は明視野インサイチューハイブリダイゼーションのためのシステムを特徴付ける。幾つかの実施態様では、該システムは、標的RNAに特異的なX個の一意的2’-O-メチルRNAプローブを含むプローブセットを含み、ここで、X≧2(例えば、X=2、X=3、X=4、X=5等)であり、該プローブは標的RNA内のX個の個別の部分を標的とする。各2’-O-メチルRNAプローブは少なくとも一つの検出可能部分とコンジュゲートされうる。検出可能部分は、シグナル増幅のための反応性色原体コンジュゲート系(例えばチラミド色原体コンジュゲート系)に結合するように適合化されうる。幾つかの実施態様では、2’-O-メチルRNAプローブは、それぞれ長さが15から30のヌクレオチド、20から50のヌクレオチド、40から80のヌクレオチド、20から100のヌクレオチド、又は20から200のヌクレオチドを含む。
幾つかの実施態様では、2’-O-メチルRNAプローブは、それぞれ少なくとも二つの検出可能部分、少なくとも三つの検出可能部分、少なくとも四つの検出可能部分、又は少なくとも五つの検出可能部分とコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、検出可能部分はハプテンを含む。幾つかの実施態様では、ハプテンはジニトロフェノール(DNP)を含む。幾つかの実施態様では、反応性色原体コンジュゲート系は、チラミド-ハプテンコンジュゲート、又は他の適当なコンジュゲート系を含む。幾つかの実施態様では、プローブはそれぞれプローブの20塩基対当たり少なくとも一つの検出可能部分を含む。
幾つかの実施態様では、該システムは、標的マイクロRNAを可視状態にする手段を更に含む。幾つかの実施態様では、標的マイクロRNAを可視状態にする手段は、プローブの検出可能部分に特異的な反応性色原体コンジュゲート系にプローブを接触させる工程を含み、反応性色原体コンジュゲート系は色を発する。幾つかの実施態様では、該システムは標的マイクロRNAを可視化する手段を更に含み、ここで、検出可能部分は反応性色原体コンジュゲート系によって可視状態にされ、検出可能部分の可視性が標的マイクロRNAを示す。幾つかの実施態様では、標的マイクロRNAを可視化する手段は明視野顕微鏡を含む。
本発明はまたマイクロRNA標的の明視野インサイチュー検出のためのシステムを特徴付ける。幾つかの実施態様では、該システムは、標的マイクロRNAに特異的な一意的2’-O-メチルRNAプローブを含む標的プローブであって、2’-O-メチルRNAプローブがプローブの3’端又は5’端の何れかに配された少なくとも一つの検出可能部分とコンジュゲートされている標的プローブと;シグナル増幅に効果的な反応性色原体コンジュゲート系であって、標的プローブの検出可能部分に結合するように適合化されている反応性色原体コンジュゲート系とを含む。
幾つかの実施態様では、2’-O-メチルRNAプローブは15から30のヌクレオチドを含む。幾つかの実施態様では、プローブは、プローブの3’端に配された第一検出可能部分とプローブの5’端に配された第二検出可能部分とを含む。幾つかの実施態様では、検出可能部分はハプテンを含む。幾つかの実施態様では、ハプテンはジニトロフェノール(DNP)を含む。幾つかの実施態様では、反応性色原体コンジュゲート系はチラミド-ハプテンコンジュゲートを含む。
幾つかの実施態様では、システムは標的マイクロRNAを可視状態にする手段を更に含む。幾つかの実施態様では、標的マイクロRNAを可視状態にする手段は、プローブの検出可能部分に特異的な反応性色原体コンジュゲート系にプローブを接触させる工程を含み、反応性色原体コンジュゲート系が色を発する。幾つかの実施態様では、該システムは標的マイクロRNAを可視化する手段を更に含み、検出可能部分は反応性色原体コンジュゲート系によって可視状態にされ、検出可能部分の可視性が、標的マイクロRNAを示している。幾つかの実施態様では、標的マイクロRNAを可視化する手段は明視野顕微鏡を含む。
本発明はまた標的RNAに対して発色性に染色がなされた複数の細胞を含むスライドを特徴付け、該スライドは、ここに開示されたシステム(例えば、標的マイクロRNAに特異的な一意的2’-O-メチルRNAプローブを含む標的プローブ、一意的2’-O-メチルRNAプローブのプローブセット等々)を使用して作製される。
本発明はまた明視野インサイチューハイブリダイゼーション法を特徴付ける。幾つかの実施態様では、該方法は、サンプルを抗原回収試薬と接触させる工程;プローブがサンプル中の標的RNAにハイブリダイズするのに十分な条件下でここに開示されたプローブ又はプローブセットとサンプルを接触させる工程;サンプルをすすいで未結合プローブを除去する工程;及び検出可能部分を可視状態にすることにより標的RNAを検出する工程を含む。
幾つかの実施態様では、該方法は、プローブセットがサンプル中の標的RNAにハイブリダイズするのに十分な条件下で標的RNAに特異的なプローブとサンプルを接触させる工程であって、プローブセットがX個の一意的2’-O-メチルRNAプローブを含み、X≧2であり、2’-O-メチルRNAプローブが標的RNA内のX個の別個の部分を標的にし、各2’-O-メチルRNAプローブが少なくとも一つのハプテンにコンジュゲートされている工程;第一酵素にコンジュゲートされた第一抗ハプテン抗体とサンプルを接触させる工程であって、第一抗ハプテン抗体がX個の一意的RNAプローブに特異的である工程;反応性色原体コンジュゲート系(例えばチラミド-ハプテンコンジュゲート又は任意の他の適当なコンジュゲート)にサンプルを接触させる工程であって、第一抗ハプテン抗体の第一酵素が反応性色原体コンジュゲート系の第一抗ハプテン抗体に結合する工程(チラミドハプテンコンジュゲートがまた組織に結合する);第二酵素にコンジュゲートされた第二抗ハプテン抗体とサンプルを接触させる工程であって、第二抗ハプテン抗体が反応性色原体コンジュゲート系に対して特異的であり、第二酵素が色原体の可視性を触媒し、色原体の可視性が標的RNAを示す工程を含む。
幾つかの実施態様では、該方法は、2’-O-メチルRNAプローブがサンプル中の標的RNAにハイブリダイズするのに十分な条件下で標的RNAに特異的な2’-O-メチルRNAプローブとサンプルを接触させる工程であって、2’-O-メチルRNAプローブが少なくとも一つのハプテンにコンジュゲートされ、長さが15から30のヌクレオチドである工程;第一酵素にコンジュゲートされた第一抗ハプテン抗体とサンプルを接触させる工程であって、第一抗ハプテン抗体が2’-O-メチルRNAプローブに特異的である工程;反応性色原体コンジュゲート系(例えばチラミド-ハプテンコンジュゲート又は任意の他の適当なコンジュゲート)にサンプルを接触させる工程であって、第一抗ハプテン抗体の第一酵素が反応性色原体コンジュゲート系の第一抗ハプテン抗体に結合する工程;第二酵素にコンジュゲートされた第二抗ハプテン抗体とサンプルを接触させる工程であって、第二抗ハプテン抗体が反応性色原体コンジュゲート系に対して特異的であり、第二酵素が色原体の可視性を触媒し、色原体の可視性が標的RNAを示す工程を含む。
幾つかの実施態様では、2’-O-メチルRNAプローブは二つのハプテンとコンジュゲートされている。幾つかの実施態様では、ハプテンはジニトロフェノール(DNP)を含む。幾つかの実施態様では、第一ハプテンがプローブの3’端に位置させられ、第二ハプテンがプローブの5’端に位置させられる。
幾つかの実施態様では、該方法は、その内容の全体がここに援用されるヴェンタナメディカルシステムズ社に譲渡された2012年2月13日に出願され、US20120214195(’195)として公開された米国特許出願第13/372040号に記載された2+2系を利用する固定を含む。
例えばMCF-7異種移植片組織の染色に対する固定の影響を詳細に説明する図5-9を参照のこと。図5-9に詳細に示されたデータは、’195特許出願に記載されクレームされた2+2法を利用する室温及び様々な他の温度における影響を示している。簡単に述べると、’195特許出願に開示された一般的方法は、組織サンプルのホルマリン固定によって例証されたアルデヒド固定の方法であって、第一の期間の間、第一の温度でアルデヒド溶液と組織サンプルを適用、浸漬又は別の接触をさせ、ついで第二の期間の間、第一の温度より高い第二の温度まで組織サンプルの温度を上昇させることを含む方法を提案している。
’195特許出願に詳細に記載されここで適用されるように、一般に組織サンプルの第二の温度は第一の温度よりも高い。組織サンプルの温度の上昇は、組織サンプルの温度を第二の温度まで急速に又は突然に上昇させることを含みうる。サンプル温度の上昇は、根底にあるサンプル反応性を尚も保ちながら架橋を増加させるためになされる。別法では、第二の温度への組織サンプルの上昇は、組織サンプルを第二の温度の溶液に浸漬することによって達成され得、ここで、その溶液は同じ又は異なったアルデヒド溶液でありうる。第二の温度は、典型的には周囲温度より高く、より典型的には約22℃より高く、更により典型的には約22℃より高い温度から少なくとも約50℃までであり、更により典型的には約22℃より高い温度から約45℃までである。第二の期間は内在的分子及び構造の実質的に完全な架橋を起こさせるのに効果的である。第二の期間は変動しうるが、典型的には15分を超える時間から少なくとも約5時間までの範囲であり、典型的には約1時間から約4時間までであり、更により典型的には約2時間から約3時間までである。温度の上昇に使用される速度及び方法は、マイクロRNA/RNAのような分解の傾向がある生体分子及び翻訳後修飾の最適な保存が達成されるように設計される。’195特許出願を参照のこと。
第一の期間は組織厚に応じて変動しうるが、4mm厚までのASCO CAPガイドラインでは、典型的には約15分から約4時間までの範囲であり、より典型的には15分より長く、約3時間まで、更により典型的には約1時間から約2時間までである。より厚いサンプルでは、第一の期間は拡散速度に支配されるであろうことが認められる。第一の温度は、少なくとも-20℃から約15℃まで、典型的には少なくとも0℃から約15℃まで、より典型的には少なくとも0℃から約10℃まで、更により典型的には約3℃から約5℃までである。
’195特許出願に開示された方法のある実施態様は、第一の温度の第一のアルデヒド溶液を組織サンプルに適用し、ついで第二のアルデヒド溶液を組織サンプルに適用することを含む。第二のアルデヒド溶液は第一のアルデヒド溶液とは異なっていてもよい。例えば、溶液は異なった濃度のものであり得、又は第二のアルデヒド溶液は第一のアルデヒドとは異なったアルデヒドを含んでいてもよい。アルデヒドは、典型的には低級アルキルアルデヒド、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、又はその組合せである。
’195出願において述べられているように、2+2法は従来の既存の方法に対して少なくとも3つの改善を提供する。第一に、低温環境下でホルマリンを組織片中に浸透させることによって酵素活性を顕著に低下させることができる。第二に、組織サンプル温度を速く上昇させて架橋速度を増大させることによって、室温で観察されるであろうよりも迅速に細胞成分が所定位置に「ロック」される。この組合せは、この技術を既存の方法より優れたものにし、FFPE組織において修飾状態を保存することを始めて可能にする。第三に、これは、広い範囲の修飾状態及び酵素に適用可能であると信じられる一般的な方法である。他の方法は特定のセットの修飾酵素をターゲットにするが、この方法は全ての修飾酵素を迅速に無能にし、よって一般的な細胞状態をゴールドの標準的な室温手順よりも更に良好に保存する。’195特許の教示は、
i.本発明は特定の生体分子のセット又は特定の翻訳後修飾を含んでいる生体分子に限定されないので、この方法は任意の生体分子又は修飾状態の保存のための一般的方法であると考えられる。よって、この発明は多量の生体分子及び特定の翻訳後修飾を含む生体分子を高品質で保存することができる。(段落0021)
と続く。
i.本発明は特定の生体分子のセット又は特定の翻訳後修飾を含んでいる生体分子に限定されないので、この方法は任意の生体分子又は修飾状態の保存のための一般的方法であると考えられる。よって、この発明は多量の生体分子及び特定の翻訳後修飾を含む生体分子を高品質で保存することができる。(段落0021)
と続く。
従って、同じ効果が本発明の方法に備わっていると考えられる。
本開示の前述並びに他の特徴は、添付図面を参照して進む次の詳細な説明から更に明らかになるであろう。
次の図面はカラーで提出される。
I.用語
他に説明されない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、開示された発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を持つ。単数形の用語「a」、「an」及び「the」は、明らかに別のものを示していない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「又は(or)」なる語は、明らかに別のものを示していない限り、「及び(and)」を含むことが意図される。「含む(comprising)」は「含む(including)」を意味する。よって、「A又はBを含む(comprising A or B)」は、「Aを含む(including A)」又は「Bを含む(including B)」又は「A及びBを含む(including A and B)」を意味する。
他に説明されない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、開示された発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を持つ。単数形の用語「a」、「an」及び「the」は、明らかに別のものを示していない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「又は(or)」なる語は、明らかに別のものを示していない限り、「及び(and)」を含むことが意図される。「含む(comprising)」は「含む(including)」を意味する。よって、「A又はBを含む(comprising A or B)」は、「Aを含む(including A)」又は「Bを含む(including B)」又は「A及びBを含む(including A and B)」を意味する。
開示の実施態様の実施及び/又は試験のための適切な方法と材料は以下に記載される。このような方法と材料は例示だけのためのものであり、限定することを意図していない。ここに記載されたものと同様又は均等の他の方法と材料も使用することができる。例えば、本開示が関連する技術分野においてよく知られた一般的な方法は、その開示の全体が出典明示によりここに援用される、例えば、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989;Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3版, Cold Spring Harbor Press, 2001;Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992(及び追補版2000);Ausubel等, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4版, Wiley & Sons, 1999;Harlow及びLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990;及びHarlow及びLane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999を含む、様々な一般文献及びより特定の文献に記載されている。
ここで述べられる全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の文献は、全ての目的のためにその全体が出典明示により援用される。矛盾がある場合、用語の説明を含む本明細書が優先するであろう。
ここに記載されたものと同様又は均等の方法と材料を開示された技術を実施し又は試験するために使用することができるが、好適な方法と材料が以下に記載される。材料、方法、及び実施例は例示のためだけのものであり、限定することを意図していない。
開示の様々な実施態様のレビューを容易にするために、次の特定の用語の説明が提供される。
抗体: 少なくとも軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を含み、抗原(例えばCD79aタンパク質)のエピトープに特異的に結合するポリペプチド。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は抗体の断片を含む。抗体は、酵素、ハプテン、又はフルオロフォアのような検出可能標識とコンジュゲートされ又は標識等されうる。
検出可能標識(又は検出可能部分): 他の分子(例えば核酸プローブ)にその分子の検出を容易にするために直接的又は間接的にコンジュゲートされる化合物又は組成物。標識の特定の非限定的な例は、蛍光及び蛍光発生部分、発色性部分、ハプテン、アフィニティタグ、及び放射性同位元素を含む。標識は、直接的に検出可能(例えば光学的に検出可能)であるか又は間接的に検出可能(例えば、順に検出可能である一又は複数の更なる分子との相互作用を介して)でありうる。ここに開示されたプローブの文脈で例示的な標識は以下に記載される。核酸を標識するための方法と様々な目的に有用な標識の選択におけるガイダンスは、例えばSambrook及びRussell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)及びAusubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987,改訂版を含む)において検討されている。
検出可能標識は、発色性、蛍光、リン光及び/又は発光分子、ある物質を他の物質に転化させて(例えば無色の物質を有色の物質に転化させるか又はその逆により、あるいは沈殿物を生成するか又はサンプルの濁度を増加させることによって)検出可能なシグナルをもたらす触媒(例えば酵素)、更なる検出可能に標識された抗体コンジュゲートを使用して抗体-ハプテン結合相互作用を通して検出されうるハプテン、及び常磁性及び磁性分子又は材料を含みうる。検出可能標識の特定の例は、酵素、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ又はβ-グルクロニダーゼ;フルオロフォア、例えばフルオレセイン、発光団、クマリン、BODIPY色素、レゾルフィン、及びローダミン(蛍光分子の多くの更なる例は、The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, ORに見出すことができる);ナノ粒子、例えば量子ドット(その各々の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第6815064号、同第6682596号及び同第6649138号);金属キレート、例えば放射性又はGd3+のような常磁性金属イオンのDOTA及びDPTAキレート;及びリポソーム、例えば捕捉蛍光分子を含むリポソームを含む。検出可能標識が酵素を含む場合、検出可能な基質、例えば色原体、蛍光発生化合物、又は発光(luminogenic)化合物が、検出可能なシグナルを生じさせるために酵素との組合せで使用される(多種多様なこのような化合物が例えばLife Technologies, Carlsbad, CAから市販されている)。
別法では、酵素を金属組織検出スキームで使用することができる。幾つかの例では、金属組織検出法は、水溶性金属イオンと酵素の酸化還元不活性基質と組合せて、アルカリホスファターゼのような酵素を使用することを含む。基質は酵素によって酸化還元活性剤に転換され、酸化還元活性剤が金属イオンを還元し、検出可能な沈殿物を形成させる(例えば米国特許第7642064号;同第7632652号を参照;その各々が出典明示によりここに援用される)。他の例では、金属組織検出法は、再び検出可能な沈殿物を形成するために水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共にオキシド-レダクターゼ酵素(例えば西洋わさびペルオキシダーゼ)を使用することを含む(例えば、その全体が出典明示によりここに援用される米国特許第6670113号を参照)。ハプテンは抗体によって結合されうる小分子である。例示的なハプテンは、ジニトロフェニル(DNP)、ビオチン、ジゴキシゲニン(DIG)、及びフルオレセインを含む。更なるハプテンは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリペルペン(triperpene)、尿素、チオ尿素、ロテノイド、クマリン及びシクロリグナンハプテン、例えばその全体が出典明示によりここに援用される米国特許第7695929号に開示されたものを含む。
ハイブリダイゼーション: DNA、RNA、又はDNAとRNA間の二つのストランドの相補領域間に塩基対を形成し、それによって二本鎖分子を形成すること。特定のストリンジェンシーの度合いを生じるハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション法の性質及びハイブリダイズする核酸配列の組成と長さに応じて変動するであろう。一般に、ハイブリダイゼーションの温度とハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度(例えばNa+濃度)がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するであろう。ハイブリダイゼーションバッファー中のハイブリダイゼーションを減少させる化学物質(例えばホルムアミド)の存在もまたストリンジェンシーを決定するであろう(Sadhu等, J. Biosci. 6:817-821, 1984)。特定のストリンジェンシーの度合いを達成するためのハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook等, (1989) Molecular Cloning, 2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (第9及び11章)において検討されている。ISHに対するハイブリダイゼーション条件はまたLandegent等, Hum. Genet. 77:366-370, 1987;Lichter等, Hum. Genet. 80:224-234, 1988;及びPinkel等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9138-9142, 1988において検討されている。
インサイチューハイブリダイゼーション(ISH): 組織の一部又は切片において(インサイチュー)、あるいは組織が十分に小さい(例えば植物種、ショウジョウバエ胚)ならば全組織において(ホールマウントISH)、特定のDNA又はRNA配列を局在化させるために標識された核酸プローブのハイブリダイゼーションを使用して、サンプル中の核酸の存在又は分布を決定する方法。DNA ISHは、例えば、染色体完全性を評価し及び/又はサンプル中の遺伝子コピー数を決定する医療診断における使用のように、染色体の構造を決定するために使用することができる。RNA ISHは、組織切片又はホールマウント内のmRNAと他の転写物を測定し局在化する。
ISHでは、サンプル細胞及び組織が通常処理されて、標的核酸を所定位置に固定し、標的分子へのプローブの接近性を増大させる。検出可能に標識されたプローブは高温で標的配列にハイブリダイズし、ついで過剰のプローブが洗い流される。溶液パラメータ、例えば温度、塩及び/又は洗浄剤濃度を操作して、あらゆる同一でない相互作用を取り除くことができる(例えば、その結果、正確な配列一致物のみが結合したまま残るであろう)。ついで、標識されたプローブは局在化され、それぞれオートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡法又は免疫組織化学的検査の何れかを使用して、組織中で潜在的に定量される。ISHはまた二つ以上のプローブを使用することができ、それらは典型的には二以上の核酸を同時に検出するために異なって標識される。
単離された: 「単離された」生物学的成分(例えば、核酸分子、タンパク質、又は細胞)は、例えば他の染色体及び染色体外DNA及びRNA、タンパク質及び細胞など、該成分が生じる調製物、生物の細胞、又は生物自体中の他の生物学的成分から実質的に分離され又は精製されている。「単離された」核酸分子及びタンパク質は、標準的な精製方法により精製された核酸分子及びタンパク質を含む。該用語はまた宿主細胞中で組換え発現により調製された核酸分子及びタンパク質、並びに化学的に合成された核酸分子及びタンパク質を包含する。幾つかの例では、ここで開示された核酸プローブは、単離された核酸プローブである。
プローブ: 標的核酸分子(例えばゲノム標的核酸分子)とハイブリダイズすることができ、標的にハイブリダイズされると、直接的又は間接的に検出することが可能である核酸分子。従って、プローブは、標的核酸分子の検出と、幾つかの例では定量を可能にする。特定の例では、プローブは標的核酸分子の一意的に特異的な核酸配列に相補的な少なくとも二つのセグメントを含み、よって標的核酸分子の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズすることができる。一般的に、少なくとも一つのセグメント又はセグメントの一部がひとたび標的核酸分子にハイブリダイズすれば(そしてそのままであれば)、プローブの他の部分は、標的中のその他の部分の同族結合部位へのハイブリダイズが物理的に制約されうる(必要ではないが)(例えば、そのような他の部分はその同族結合部位からあまりにも遠く離れている);しかし、プローブ中に存在する他の核酸分子は互いに結合することができ、よってプローブからのシグナルを増幅させる。プローブは、「標識された核酸プローブ」と称され得、これは、プローブを検出可能にする検出可能部分又は「標識」にプローブが直接的又は間接的に結合されていることを示している。
サンプル: 被験体から得られたDNA(例えば、ゲノムDNA)、RNA(mRNAを含む)、タンパク質、又はその組合せを含む検体。例としては、限定されないが、染色体調製物、末梢血、尿、唾液、組織生検、微細針吸引、外科検体、骨髄、羊水穿刺サンプル、及び剖検材料を含む。一例では、サンプルはゲノムDNAを含む。幾つかの例では、サンプルは、例えば顕微鏡スライド上に置くことができる、細胞遺伝学的調製物である。特定の例では、サンプルは直接使用されるか、又は例えば固定(例えばホルマリンを使用)によって、使用前に操作されうる。
配列同一性: 二以上の核酸配列間の同一性(又は類似性)は、配列間の同一性又は類似性によって表される。配列同一性は同一性パーセントによって測定されうる;パーセントが高いと、配列はより同一である。配列類似性は類似性パーセント(保存的アミノ酸置換を考慮に入れる)によって測定されうる;パーセントが高いと、配列はより類似している。
比較のための配列のアラインメント法は当該分野でよく知られている。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、Smith及びWaterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981;Needleman及びWunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970;Pearson及びLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988;Higgins及びSharp, Gene, 73:237-44, 1988;Higgins及びSharp, CABIOS 5:151-3, 1989;Corpet等, Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988;Huang等 Computer Appls. in the Biosciences 8:155-65, 1992;及びPearson等, Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994に記載されている。Altschul等, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990は、配列アラインメント法及び相同性計算の詳細な考察を提供する。
NCBIベーシックローカルアラインメント検索ツール(BLAST)(Altschul等, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)は、配列解析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn及びtblastxと関連した使用に対して、国立バイオテクノロジーセンター及びインターネットを含む幾つかのソースから入手可能である。更なる情報はNCBIのウェブサイトに見出すことができる。
BLASTNが核酸配列を比較するために使用されうる一方、BLASTPがアミノ酸配列を比較するために使用されうる。二つの比較される配列が相同性を有しているならば、指定された出力ファイルは相同性領域を整列配列として提示するであろう。二つの比較される配列が相同性を有していないならば、指定された出力ファイルは整列配列を提示しないであろう。
BLAST様アラインメントツール(BLAT)をまた核酸配列を比較するために使用してもよい(Kent, Genome Res. 12:656-664, 2002)。BLATは、Kent Informatics(Santa Cruz, CA)及びインターネット(genome.ucsc.edu)を含む幾つかのソースから入手可能である。
ひとたび整列されれば、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基が双方の配列に提示されている位置の数をカウントすることによって、一致数が決定される。配列同一性パーセントは、一致数を、特定された配列に規定される配列の長さか又は分節された長さ(例えば特定された配列に規定された配列からの100の連続ヌクレオチド又はアミノ酸残基)の何れかによって割り、ついで得られた値に100を乗ずることによって、決定される。例えば、1554ヌクレオチドを有する試験配列と整列されたときに1166の一致を持つ核酸配列は、試験配列と75.0パーセント同一である(1166÷1554*100=75.0)。配列同一性パーセント値は小数第2位で四捨五入される。例えば、75.11、75.12、75.13、及び75.14は75.1に四捨五入される一方、75.15、75.16、75.17、75.18、及び75.19は75.2に四捨五入される。長さの値は常に整数であろう。他の例では、次のように特定された配列からの15の連続ヌクレオチドと整列する20ヌクレオチド領域を含む標的配列は、その特定された配列に対して75パーセントの配列同一性(つまり、15÷20*100=75)を有する領域を含む。
被験体: 任意の多細胞脊椎生物、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物(例えば、獣医学的被験体)。
標的核酸配列又は分子: 核酸分子の定まった領域又は特定の部分、例えばゲノムの一部(例えば遺伝子又は興味ある遺伝子を含む哺乳動物ゲノムDNAの領域)。標的核酸配列が標的ゲノム配列である例では、そのような標的は、例えば、細胞遺伝学的命名法に従い、染色体上の特定の位置を参照することにより;遺伝子地図上のその位置を参照することにより;仮想的又は集合したコンティグを参照することにより;その特異的配列又は機能により;その遺伝子又はタンパク質名により;又はゲノムの他の遺伝子配列の中からそれを一意的に特定する任意の他の手段により、(例えば、正常細胞内で)染色体上のその位置により定義することができる。幾つかの例では、標的核酸配列は哺乳動物ゲノム配列(例えばヒトゲノム配列)である。
幾つかの例では、標的核酸配列(例えばゲノム核酸配列)の変化は、疾患又は病態と「関連する」。幾つかの例では、標的核酸配列の検出を、疾患又は病態に関してサンプルの状態を推論するために使用することができる。例えば、標的核酸配列は2つ(又はそれ以上の)区別可能な形態で存在し得、第一の形態は疾患又は病態の非存在と相関し、第二(又は異なる)形態は疾患又は病態の存在と相関する。二つの異なる形態は、例えばポリヌクレオチド多型などによって、定性的に区別することができ、及び/又は二つの異なる形態は、例えば細胞内に存在する標的核酸配列のコピー数などによって、定量的に区別することができる。
一意的に特異的な配列: 生物の一倍体ゲノムに一度だけ存在する核酸配列(例えば、少なくとも20bp(例えば少なくとも20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp又はそれ以上)の配列)。特定の例では、一意的に特異的な核酸配列とは、標的核酸と100%の配列同一性を有する標的核酸からの核酸配列であり、標的核酸を含む特異的一倍体ゲノムに存在する任意の他の核酸配列に対して有意な同一性を持たない。
ベクター: ベクターに対して天然型ではない他の(外来の)核酸配列のための担体として働く任意の核酸。適切な宿主細胞に導入されると、ベクターはそれ自身(よって、外来の核酸配列)を複製し得、又は外来核酸配列の少なくとも一部を発現しうる。一文脈では、ベクターは、複製(例えば生産)及び/又は標準的な組換え核酸技術(例えば制限酵素消化)を使用する操作の目的で興味ある核酸配列がその中へ導入(例えば、クローニング)される直鎖状又は環状核酸である。ベクターは、宿主細胞内で複製することを可能とする核酸配列、例えば複製起点などを含みうる。ベクターはまた一又は複数の選択マーカー遺伝子及び当該分野で知られている他の遺伝的要素を含みうる。一般的なベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、人工染色体(例えば、BAC、PAC、HAC、YAC)、及びこれらの型のベクターの一を超える特徴を取り込んだハイブリッドを含む。典型的には、ベクターは、標的核酸配列の挿入を容易にする一又は複数の一意的制限部位(及び幾つかの場合にはマルチクローニングサイト)を含む。
II.詳細なプローブデザイン:
2’-O-メチルRNAオリゴヌクレオチド(2’OMe)は、FFPE組織中の任意のRNA標的のインサイチュー検出のためのプローブとして少しの望ましい性質を有している:1)2’OMeプローブはDNA又はRNAプローブよりもRNAに対して高い親和性を有している;2)2’OMeプローブはヌクレアーゼに耐性である;3)化学合成中のカップリング効率がDNAより高いので、完全長産物の収量がより高い。以下、図1には、ここに記載された2’-O-メチルRNAオリゴヌクレオチドの例示的な構造が示されている。mRNA及びノンコーディングRNA標的に対して、80ヌクレオチド(nt)長の2’OMeプローブを、プローブ当たりのハプテン数と特異性をバランスさせるために選択した。各80nt2’OMeプローブは、化学合成によって20ヌクレオチド毎に一つのハプテンを導入することによって5つのハプテンを含んでいる。一つの2’OMeプローブでRNA標的を検出することができるが、我々は、一つのRNA標的に対して3つの独立した2’OMeプローブの混合物を使用すると特異性を犠牲にすることなく検出感度を更に増大させることを実験的に決定した。各RNA標的に対して、6つの2’OMeプローブを選択し、合成を試みた。合成された6つの中から最良の3つを選択することによって、低収量、低配列特異性、又は他の予見できない問題を軽減することができた。殆どの標的に対して、6つの内の任意の3つのプローブを互換的に使用することができることが見出された。あるRNA標的に対しては、2つ又は3つの80ntプローブだけが選択される。
2’-O-メチルRNAオリゴヌクレオチド(2’OMe)は、FFPE組織中の任意のRNA標的のインサイチュー検出のためのプローブとして少しの望ましい性質を有している:1)2’OMeプローブはDNA又はRNAプローブよりもRNAに対して高い親和性を有している;2)2’OMeプローブはヌクレアーゼに耐性である;3)化学合成中のカップリング効率がDNAより高いので、完全長産物の収量がより高い。以下、図1には、ここに記載された2’-O-メチルRNAオリゴヌクレオチドの例示的な構造が示されている。mRNA及びノンコーディングRNA標的に対して、80ヌクレオチド(nt)長の2’OMeプローブを、プローブ当たりのハプテン数と特異性をバランスさせるために選択した。各80nt2’OMeプローブは、化学合成によって20ヌクレオチド毎に一つのハプテンを導入することによって5つのハプテンを含んでいる。一つの2’OMeプローブでRNA標的を検出することができるが、我々は、一つのRNA標的に対して3つの独立した2’OMeプローブの混合物を使用すると特異性を犠牲にすることなく検出感度を更に増大させることを実験的に決定した。各RNA標的に対して、6つの2’OMeプローブを選択し、合成を試みた。合成された6つの中から最良の3つを選択することによって、低収量、低配列特異性、又は他の予見できない問題を軽減することができた。殆どの標的に対して、6つの内の任意の3つのプローブを互換的に使用することができることが見出された。あるRNA標的に対しては、2つ又は3つの80ntプローブだけが選択される。
mRNA又はノンコーディングRNA標的に対して6つのプローブのセットを効果的に選択するために、バイオインフォマティックスツールセットを構築して全プロセスを半/自動化した。バイオインフォマティックスツールは、入力の一つとして配列ファイル又はGenBank IDの何れかを取込み、後者の場合、ソフトウェアがGenBankから直接、配列を検索する。ついで、ツールは反復データベース検索を実行し、任意の反復配列を、これら配列がゲノム中に非常に豊富であるとしてマスクする。反復をマスクしないと、得られるプローブは望まれないバックグラウンド(特異性の欠如)を生成するであろう。ついで、ツールは、反復データベース検索によってマスクを避ける予め定められたGC量及び融解温度範囲で、全ての潜在的なプローブを生成した。また、RNAの特定の領域が標的とされる場合の配列中の範囲及び出力形式等々のような他の入力を取り込むためにツールを使用した。再び、ツールは全ての生成されたプローブを取込み、興味あるローカルゲノム、mRNA、及びESTデータベースに対してショートオリゴヌクレオチドのために設計された特殊なBLASTN検索を実施し、ヒット数及び関連BLASTビットスコア及びe値(「NSE」)に基づいて、プローブを選択し又は廃棄した。残りの配列をフォールディング構造予測解析に供した。プローブを、優れたオープンソースのRNA分子フォールディングソフトウェアであるRNAfoldで折り畳み、ヘアピン構造又は低ΔG(カットオフ-25kcal/mol)を持つプローブを更なる検討から除外した。6つのプローブを残りのプールから化学合成のために選択した。
2’-O-メチルRNAオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成機MerMadeモデル192を用いて合成した。80nt長の30プローブのセットは仕上げるのに約48時間かかる。合成のスケールは通常50nMであったが、これは、ここに記載された濃度でFFPETの約5百万スライドを染色するのに十分なプローブをつくり出す。
合成された2’-O-メチルRNAプローブの品質は、成功したISHアッセイに対する決定因子の一つであった。幾つかの手順が合成機からの2’OMeオリゴヌクレオチドプローブの品質を向上させたことが発見された:1)G50カラムを通しての精製;2)導入されたハプテンの数が設計と一致しているかどうかを決定するためのスペクトル測定;及び3)プローブのサイズ分布を分析するためのゲル電気泳動。80ntの2’OMeプローブのG50カラム精製の収率は、50-90%の範囲で、平均が約65%であった。成功したプローブは、例えば5DNPを持つ80ntの2’OMeプローブに対して、+/-10%の予想ハプテン負荷を含んでおり、スペクトル測定に基づく計算した数はプローブ分子当たり4.5-5.5DNPの範囲にあるべきである。
幾つかの実施態様では、2’OMeプローブは標的RNA配列に対して100%の配列同一性を有する。幾つかの実施態様では、2’OMeプローブは標的RNA配列に対して99%-100%の間の配列同一性を有する。幾つかの実施態様では、2’OMeプローブは標的RNA配列に対して95%-100%の配列同一性を有する。幾つかの実施態様では、2’OMeプローブは標的RNA配列に対して90%-100%の配列同一性を有する。幾つかの実施態様では、2’OMeプローブは標的RNA配列に対して80%-100%の配列同一性を有する。幾つかの実施態様では、2’OMeプローブは標的RNA配列に対して75%-100%の配列同一性を有する。
本発明は標的RNAを可視状態にする手段をまた特徴とする。幾つかの実施態様では、標的RNAを可視状態にする手段は、プローブに特異的な検出試薬にプローブを接触させる工程を含む。検出試薬は当該分野でよく知られている。例えば、検出試薬は、コントロールプローブに結合する抗体又は他のプローブを含みうる。検出試薬は、プローブの第一標識を可視状態にする分子(例えば酵素、基質、タグ)を含みうる。検出試薬は、プローブを可視状態にするのに効果的な複数の試薬(例えば、一を超える抗体、酵素、基質、色原体等々)を含みうる。幾つかの実施態様では、検出試薬は色を発する。更なる検出試薬(標識、タグ、酵素、基質、色原体、抗体等々)はここに更に開示される。本発明はまた標的RNAを可視化する手段を特徴とし、ここで、プローブ(例えば、検出可能部分)は検出試薬によって可視状態にされ、検出可能部分の可視性が標的RNAを示している。標識されたプローブを可視化する手段は当業者によく知られている。例えば、幾つかの実施態様では、標的RNAを可視化する手段は、顕微鏡(例えば、明視野顕微鏡、蛍光顕微鏡、倒立顕微鏡)を含む。幾つかの実施態様では、標的RNAを可視化する手段は、ルミノメーターを含む。幾つかの実施態様では、標的RNAを可視化する手段は、放射検出機(例えば、ガンマカウンター等)を含む。幾つかの実施態様では、標的RNAを可視化する手段は、分光計を含む。幾つかの実施態様では、標的RNAを可視化する手段は、リアルタイムPCR機を含む。幾つかの実施態様では、標的RNAを可視化する手段は、シンチレーション及び/又はルミネセンスカウンターを含む。幾つかの実施態様では、標的RNAを可視化する手段は、比色計を含む。標的RNAを可視化する他の手段は当該分野で知られている。
本発明が如何なる理論や機構にも制約されることを望まないが、本発明のプローブは、効果的なハイブリダイゼーションに必要とされるプローブ濃度を減じることを可能にし得、例えばハイブリダイゼーション及び十分なシグナルに必要とされるプローブが少ないと考えられる。よって、本発明のシステムはアッセイのコストを低減させるのに役立ちうる。
開示された方法は自動化することができる。自動IHC及び/又はISHのためのシステムは市販されており、例えばBENCHMARK ULTRAスライド染色システム、BENCHMARK XTスライド染色システム、及びDISCOVERY XTスライド染色システム(ヴェンタナメディカルシステムズ, Tucson, AZ)、BOND-MAX及びBOND-IIIスライドステイナー(Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL)、及びIQ Kineticスライドステイナー(Biocare Medical, Concord, CA)である。ヴェンタナメディカルシステムズ社は、その各々の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第5650327号;同第5654200号;同第6296809号;同第6352861号;同第6582962号;同第6827901号及び同第6943029号を含む、自動分析を実施するためのシステム及び方法を開示する多くの米国特許の譲受人である。
開示された方法において使用されうる色原体の非限定的な例は、(限定されるものではないが)当業者によく知られたもの、例えばその双方の全体が出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第2013/0260379号及び2013年6月5日出願の米国仮特許出願第61/831552号に記載されたものを含む。
ここに開示された核酸プローブは、例えば標的核酸分子の検出を可能にするために、一又は複数の標識を含みうる。インサイチューハイブリダイゼーション手順のような様々な応用では、核酸プローブは標識(例えば、検出可能な標識)を含む。「検出可能な標識」は、サンプル中のプローブ(特に結合した又はハイブリダイズしたプローブ)の存在又は濃度を示す検出可能なシグナルを作り出すために使用されうる分子又は材料である。よって、標識された核酸分子は、サンプル中の(標識された一意的に特異的な核酸分子が結合し又はハイブリダイズした)標的核酸の存在又は量(例えば、遺伝子コピー数)の指標を提供する。具体例が提供されるが、開示は特定の標識の使用には限定されない。
一又は複数の核酸分子(例えば、開示されたプローブ)に関連した標識は直接的に又は間接的に検出することができる。標識は、(無線周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視周波数及び紫外線周波数の光子を含む)光子の吸収、放出及び/又は散乱を含む、任意の既知の又は未発見の機構により検出することができる。検出可能な標識は、有色、蛍光、リン光及び発光分子及び材料、ある物質を他の物質に変換させて、(例えば無色の物質を有色の物質に変換させるか又はその逆によって、あるいは沈殿物をつくるか又はサンプル濁度を増大させることによって)検出可能な差をもたらす触媒(例えば酵素)、抗体結合相互作用によって検出することができるハプテン、及び常磁性及び磁性分子又は材料を含む。
蛍光分子(又は蛍光色素)の特定の例がここに記載される。多数の蛍光色素が、当業者に知られており、例えば、Life Technologiesから選択することができ、例えば、The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologiesを参照のこと。核酸分子(例えば一意的に特異的な結合領域)に結合され(例えば、化学的にコンジュゲートされ)うる特定のフルオロフォアの例は、(その全体が出典明示によりここに援用される)Nazarenko等の米国特許第5866366号に提供されており、例えば、4-アセトアミド-4’-イソチオシアナトスチルベン-2,2’-ジスルホン酸、アクリジンと誘導体、例えばアクリジンとアクリジンイソチオシアネート、5-(2’-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS)、4-アミノ-N-[3-(ビニルスルホニル)フェニル]ナフタルイミド-3,5ジスルホネート(ルシファーイエローVS)、N-(4-アニリノ-1-ナフチル)マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリンと誘導体、例えばクマリンと7-アミノ-4-メチルクマリン(AMC、クマリン120)、7-アミノ-4-トリフルオロメチルクルアリン(7-amino-4-trifluoromethylcouluarin)(クマリン151);シアノシン;4’,6-ジアミニジノ-2-フェニルインドール(DAPI);5’,5”-ジブロモピロガロール-スルホンフタレイン(ブロモピロガロールレッド);7-ジエチルアミノ-3-(4’-イソチオシアナトフェニル)-4-メチルクマリン;ジエチレントリアミンペンタアセテート;4,4’-ジイソチオシアナトジヒドロ-スチルベン-2,2’-ジスルホン酸;4,4’-ジイソチオシアナトスチルベン-2,2’-ジスルホン酸;5-[ジメチルアミノ]ナフタレン-1-スルホニルクロリド(DNS、塩化ダンシル);4-(4’-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL);4-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4’-イソチオシアネート(DABITC);エオシンと誘導体、例えばエオシンとエオシンイソチオシアネート;エリスロシンと誘導体、例えばエリスロシンBとエリスロシンイソチオシアネート;エチジウム;フルオレセインと誘導体、例えば5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、5-(4,6-ジクロロトリアジン-2-イル)アミノフルオレセイン(DTAF)、2’7’-ジメトキシ-4’5’-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、及びQFITC(XRITC);2’,7’-ジフルオロフルオレセイン(OREGON GREEN(登録商標));フルオレスカミン;IR144;IR1446;マラカイトグリーンイソチオシアネート;4‐メチルウンベリフェロン;オルト‐クレゾールフタレイン;ニトロチロシン;パラローザニリン;フェノールレッド;B-フィコエリトリン;o-フタルジアルデヒド;ピレンと誘導体、例えばピレン、ピレンブチレート及び1-ピレン酪酸スクシンイミジル;リアクティブレッド4(Cibacronブリリアントレッド3B-A);ローダミンと誘導体、例えば6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、6-カルボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンBスルホニルクロリド、ローダミン(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンXイソチオシアネート、ローダミングリーン、スルホローダミンB、スルホローダミン101及びスルホローダミン101の塩化スルホニル誘導体(テキサスレッド);N,N,N’,N’-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA);テトラメチルローダミン;テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC);リボフラビン;ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体である。他の適切なフルオロフォアは、およそ617nmで発光するチオール反応性ユーロピウムキレート(Heyduk及びHeyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997;J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999)、並びにGFP、Lissamine(リサミン)TM、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、4,7-ジクロロローダミン及びキサンテン(その全体が出典明示によりここに援用されるLee等の米国特許第5800996号に記載)及びそれらの誘導体を含む。例えば、Life Technologies(Carlsbad, CA)から入手可能なものと、ALEXA FLUOR(登録商標)色素シリーズ(例えば、米国特許第5696157号、同第6130101号及び同第6716979号に記載)、BODIPY色素シリーズ(ジピロメテンボロンジフルオリド色素(dipyrrometheneboron difluoride dyes)、例えば、米国特許第4774339号、同第5187288号、同第5248782号、同第5274113号、同第5338854号、同第5451663号及び同第5433896号に記載)、カスケードブルー(米国特許第5132432号に記載されるスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体)及びマリーナブルー(米国特許第5830912号)を含む(その開示はその全体が出典明示によりここに援用される)、当業者に知られている他のフルオロフォアもまた使用することができる。上記の蛍光色素に加えて、蛍光標識は、半導体ナノ結晶などの蛍光ナノ粒子、例えば、量子ドット(例えば、Life Technologiesから入手される;その開示の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第6815064号;同第6682596号;及び同第6649138号も参照)でありうる。半導体ナノ結晶は、サイズ依存性の光学的及び/又は電気的特性を有する微細粒子である。半導体ナノ結晶に一次エネルギー源が照射されると、半導体ナノ結晶で使用される半導体材料のバンドギャップに対応する周波数のエネルギー二次放出が生じる。この放出は、特定の波長の有色光又は蛍光として検出することができる。異なるスペクトル特性を持つ半導体ナノ結晶は、例えば、米国特許第6602671号に記載されている。半導体ナノ結晶は、例えば、その開示の全体が出典明示によりここに援用されるBruchez等, Science 281:2013-2016, 1998;Chan等, Science 281:2016-2018, 1998;及び米国特許第6274323号に記載された技術によって、様々な生体分子(dNTP及び/又は核酸を含む)又は基質に結合されうる。様々な組成の半導体ナノ結晶の形成は、その開示の全体が出典明示によりここに援用される、例えば米国特許第6927069号;同第6914256号;同第6855202号;同第6709929号;同第6689338号;同第6500622号;同第6306736号;同第6225198号;同第6207392号;同第6114038号;同第6048616号;同第5990479号;同第5690807号;同第5571018号;同第5505928号;同第5262357号及び米国特許出願公開第2003/0165951号並びにPCT公開番号第99/26299号に開示されている。その異なるスペクトル特性に基づいて識別可能である半導体ナノ結晶の別個の集団を製造することができる。例えば、その組成、サイズ又はサイズと組成に基づいて異なる色の光を発する半導体ナノ結晶を製造することができる。例えば、サイズに基づいて異なった波長(565nm、655nm、705nm、又は800nmの発光波長)で発光する量子ドットは、ここに開示されたプローブにおける蛍光標識として適しているが、Life Technologies(Carlsbad, CA)から入手可能である。
更なる標識は、例えば、放射性同位元素(3Hなど)、Gd3+などの放射性又は常磁性金属イオンのDOTA及びDPTAキレートなどの金属キレート、及びリポソームを含む。
核酸分子(例えば、開示されたプローブ)と共に使用することができる検出可能な標識はまた酵素、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、又はβ-ラクタマーゼを含む。検出可能な標識が酵素を含む場合、色原体、蛍光発生化合物、又は発光性(luminogenic)化合物を、酵素と組み合わせて使用することができ、検出可能なシグナルを生成する(多くのそうした化合物が、例えば、Life Technologiesから市販されている)。発色性化合物の特定の例としては、ジアミノベンジジン(DAB)、4-ニトロフェニルホスフェート(pNPP)、ファストレッド、ファストブルー、ブロモクロロインドリルホスフェート(BCIP)、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、BCIP/NBT、APオレンジ、APブルー、テトラメチルベンジジン(TMB)、2,2’-アジノ-ジ-[3-エチルベンゾチアゾリンスルホネート](ABTS)、o-ジアニシジン、4-クロロナフトール(4-CN)、ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(ONPG)、o-フェニレンジアミン(OPD)、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-ガラクトピラノシド(X-Gal)、メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトピラノシド(MU-Gal)、p-ニトロフェニル-α-D-ガラクトピラノシド(PNP)、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-β-D-グルクロニド(X-Gluc)、3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム(INT)、テトラゾリウムブルー、及びテトラゾリウムバイオレットが含まれる。
あるいは、酵素は金属組織学的検出スキームで使用されうる。例えば、銀インサイチューハイブリダイゼーション(SISH)手順は、ハイブリダイズしたゲノムの標的核酸配列の同定及び局在化についての金属組織学的検出スキームを含む。金属組織学的検出方法は、水溶性金属イオン及び酵素の酸化還元に不活性な基質と組み合わせて、アルカリホスファターゼ等の酵素を使用することを含む。基質は酵素により酸化還元活性剤に変換され、その酸化還元活性剤は金属イオンを還元し、それに検出可能な沈殿物を形成させる。(例えば、その開示の全体が出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第2005/0100976号、PCT公開第2005/003777号及び米国特許出願公開第2004/0265922号を参照)。金属組織学的検出方法には、また、オキシドレダクターゼ酵素(例えば西洋わさびペルオキシダーゼ)を、水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共に使用し、再び検出可能な沈殿物を形成することを含む。(例えば、米国特許第6670113号を参照)。
非限定的な例では、開示された核酸プローブは、ハプテン分子(例えば、ニトロ芳香族化合物(例えば、2,4-ジニトロフェニル(DNP))、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン等々)で標識される。開示されたプローブを標識するために適した更なるハプテンは、ニトロピラゾール、3-ヒドロキシキノキサリン、チアゾールスルホンアミド、ニトロケイ皮酸、ロテノン、7-(ジエチルアミノ)クマリン-3-カルボン酸、ベンゾジアゼピン、又はベンゾフランハプテン(例えば、出典明示によりここに援用される国際公開第2012/003476号を参照)を含む。(例えば、標識されたプローブ中への導入を容易にするために)ハプテン及び他の標識をdNTPにコンジュゲートさせるための方法は当該技術分野でよく知られている。手順の例については、例えば、その開示の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第5258507号、同第4772691号、同第5328824号、及び同第4711955号を参照のこと。実際、数多くの標識されたdNTPが、例えばLife Technologies(Carlsbad, CA)から市販されている。標識は、dNTP上の任意の位置、例えば、リン酸(例えば、α、β又はγリン酸)や糖へ直接的又は間接的に結合させることができる。
標識された核酸分子の検出は、ゲノム標的配列に結合したハプテンで標識された核酸分子を一次抗ハプテン抗体と接触させることによって達成することができる。一例では、一次抗ハプテン抗体(例えば、マウス抗ハプテン抗体)が酵素で直接的に標識される。他の例では、酵素にコンジュゲートされた二次抗抗体がシグナル増幅のために使用される。CISHでは、発色基質が添加され、SISHでは、銀イオン及び参照特許/出願で概説されたような他の試薬が添加される。
幾つかの例では、プローブは、酵素(重合)反応を使用して一又は複数の標識dNTPを導入することにより標識される。例えば、(例えばプラスミドベクターに組込まれた)開示された核酸プローブは、(例えば、ビオチン、DNP、ジゴキシゲニン等を使用する)ニックトランスレーションによって、又はターミナルトランスフェラーゼでのランダムプライマー伸長(例えば、3’末端テーリング)によって、標識することができる。幾つかの例では、核酸プローブは、DNAポリメラーゼIのデオキシリボヌクレアーゼI(DNaseI)に対する比率が出発原料の100%を超えて生成するように修正されている修正ニックトランスレーション反応によって標識される。特定の例では、ニックトランスレーション反応は、DNAポリメラーゼIをDNaseIに対して、少なくとも約800:1の比率で、例えば、少なくとも2000:1、少なくとも4000:1、少なくとも8000:1、少なくとも10000:1、少なくとも12000:1、少なくとも16000:1など、例えば約800:1から24000:1の比率で含み、反応は、実質的に等温の温度で、例えば約16℃から25℃(例えば室温)で一晩(例えば、約16-22時間)実施される。プローブがプローブセット(例えば、複数のプラスミド、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、又はそれ以上のプラスミド)に含まれる場合、プラスミドは、標識反応(例えば、ニックトランスレーション又は修正ニックトランスレーション)を実施する前に、等モル比で混合されうる。
他の例では、化学的標識手順を用いることもできる。開示された核酸プローブを含む、核酸の酵素標識のために、多数の試薬(ハプテン、フルオロフォア、及び他の標識ヌクレオチドを含む)や他のキットが市販されている。当業者には明らかなように、プローブの標識化の点で、例えば、インサイチューハイブリダイゼーション反応での使用に対して、上に開示された標識及び検出手順の任意のものが適用可能である。例えば、AmershamのMULTIPRIME(登録商標)DNA標識システム、Molecular Probes/Life Technologiesから入手可能な様々な特定の試薬及びキット、又は任意の他の類似の試薬又はキットを使用して、ここに開示される核酸を標識することができる。特定の例では、開示されたプローブは、ハプテン、リガンド、蛍光部分(例えば、フルオロフォア又は半導体ナノ結晶)、色原体部分、又は放射性同位元素で直接的又は間接的に標識することができる。例えば、間接標識では、標識はリンカー(例えば、PEG又はビオチン)を介して核酸分子に結合させることができる。プローブ核酸分子を標識するために使用できる更なる方法は、その開示の全体が出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第2005/0158770号に提供されている。
ハプテンの更なる例は、その開示の全体が出典明示によりここに援用される米国特許第8846320号と関連特許(例えば米国特許第7695929号;米国仮出願第60/856133号)に記載されている。
本発明を如何なる理論又は機構にも限定することは望まないが、チラミド-ハプテンコンジュゲートの性能はハプテン自体に関連しているかも知れないと思われる。例えば、ハプテンは、反応性チラミド-中間体の生成及び/又は試薬の全体の性能に(例えば予期せぬ形で)影響を及ぼしうる。
本発明を如何なる理論又は機構にも限定することは望まないが、どのハプテンがチラミド増幅系と最も良好に作用するかは必ずしも予測できないと考えられる。
マイクロRNAは非常に短いので、マイクロRNAの検出には単一プローブの使用が必要となるであろうことが予想される。チラミド-ハプテン増幅系及び‘2-O-メチルRNAオリゴヌクレオチドプローブがマイクロRNA標的を検出するのに十分に強いことが驚いたことに発見された。
III.RNAインサイチューハイブリダイゼーションとチラミド-色原体検出の詳細:
SUPERFROSTスライドにマウントされたホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPET)を脱パラフィン処理し、CC1試薬及びプロテアーゼ3(ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ#:760-2020)を使用して抗原回復させた。回復後、一滴(100μL)のハプテン標識2’O-メチル修飾合成実験アンチセンス又はコントロールスクランブルプローブをスライド上に分配し、8分間80℃で変性させ、標的RNAに対して80ヌクレオチドのプローブでは75℃で2時間、あるいはmiRNA(マイクロRNA)に対して25ヌクレオチドのプローブでは45℃で2時間、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、スライドを、RNA80ヌクレオチドプローブでは75℃で8分間、EZ Prep(ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ#:950-102)を使用して3回洗浄し、あるいはmiRNAに対して25ヌクレオチドプローブでは45℃で4分間2X SSCを使用して4回洗浄し、非特異的にハイブリダイズしたプローブを除去した。
SUPERFROSTスライドにマウントされたホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPET)を脱パラフィン処理し、CC1試薬及びプロテアーゼ3(ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ#:760-2020)を使用して抗原回復させた。回復後、一滴(100μL)のハプテン標識2’O-メチル修飾合成実験アンチセンス又はコントロールスクランブルプローブをスライド上に分配し、8分間80℃で変性させ、標的RNAに対して80ヌクレオチドのプローブでは75℃で2時間、あるいはmiRNA(マイクロRNA)に対して25ヌクレオチドのプローブでは45℃で2時間、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、スライドを、RNA80ヌクレオチドプローブでは75℃で8分間、EZ Prep(ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ#:950-102)を使用して3回洗浄し、あるいはmiRNAに対して25ヌクレオチドプローブでは45℃で4分間2X SSCを使用して4回洗浄し、非特異的にハイブリダイズしたプローブを除去した。
一連の増幅は明視野顕微鏡でmiRNAを(例えば発色的に)検出するのに有利であることが発見された。検出ではチラミド-色原体コンジュゲートが使用された。検出化学に関する開示について出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第2013/0260379号が参照される。チラミド-色原体コンジュゲートの沈着を触媒するために抗ハプテンHRPコンジュゲートを含む一段の増幅方策の使用は、識別可能なシグナルを生成しなかった。ここで図2には、検出アプローチを説明する概略図が示される。特に、標的20は、ハプテン22で標識されたプローブ21によって検出される。ついで、酵素24にコンジュゲートされた抗ハプテン抗体23がサンプルに接触させられて、抗体23がプローブ21に結合し、酵素24を標的20に結合させる。酵素24はチラミド-ハプテンコンジュゲート25の沈着を触媒する。複数のチラミド-ハプテンコンジュゲート25が標的20の近くでサンプルに結合し、よって標的20に関連するシグナルを実質的に増幅させる。ついで、第二の酵素コンジュゲート抗ハプテン抗体26がサンプルに接触させられ、チラミド-ハプテンコンジュゲート25への結合が許容される。ついで、第二の酵素27が、チラミド-色原体コンジュゲートの沈着、銀沈着(ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ#:780-001)、又は所望される任意の他の色原体を触媒するために使用されうる。最終の色原体沈着は、シグナル20と比較した増幅レベルが非常に大きいので、矢印28として示される。
ここで図3には、アッセイにおいて2’-O-メチルRNAプローブを使用するための例示的工程を示すフローチャートが示される。FFPETサンプル31の脱パラフィンの後に、検出のためのRNAの回復32(例えばマイルドなCC1又はCC2)、標的へのプローブのハイブリダイズ33、ストリンジェンシーでの洗浄34、シグナルの増幅35、及び色原体の検出36が続く。
各ハプテン化プローブの増幅と検出は次の通りに達成された。内在性組織ペルオキシダーゼ活性を、一滴のPO阻害剤(ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ#:760-4143)を三回分配し、反応を12分間インキュベートすることによって、不活化させた。数回の洗浄後、一滴のTSAブロック(ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ#:760-4142)をスライド上に分配し、4分インキュベートした後、一滴のHRPコンジュゲート抗ハプテンモノクローナル抗体(2.5ug/ml、アビジン希釈剤プラスB5ブロッカー,パーツ番号90040中で調製)を分配した;混合物を28分インキュベートした。
チラミド媒介ハプテン増幅は、スライド上に一滴のチラミド-ハプテンコンジュゲートとついで一滴のTSA-H2O2(ヴェンタナメディカルシステムズ社カタログ#:760-4141)を分配し、反応物を32分間インキュベートすることによって、達成された。十分な洗浄後、もう一滴のTSAブロックとついで28分間インキュベートされた一滴の同族抗ハプテンHRPコンジュゲート抗体が分配された。洗浄後、このHRPコンジュゲートが製造者(ヴェンタナメディカルシステムズカタログ#:780-001)によって示された通りに銀色原体付着を触媒した。ついで、ヘマトキシリンII及びブルーイング試薬を使用して組織核を染色した;ついで、スライドを、勾配アルコールを使用して脱水し、カバーガラスをつけた。
IV.方法と結果
記載された自動化技術は、以下に簡単に記載されるモジュール化されたデザインを有している。
記載された自動化技術は、以下に簡単に記載されるモジュール化されたデザインを有している。
1)ガラススライド上のホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPET)サンプルを処理して、ワックスを除去し、架橋タンパク質を変性させ、限られた量のプロテアーゼを用いてプローブ及び検出試薬の浸透を可能にする。
2)ハプテン標識プローブがハイブリダイゼーションバッファー中で標的にハイブリダイズされ、ストリンジェントな洗浄が続いて遊離プローブが除去される。
3)HRPコンジュゲート抗ハプテンマウスモノクローナル抗体がハイブリダイズされたプローブと共にインキュベートされ、ついで、十分な洗浄がなされて、プローブ上のハプテンに結合しなかった抗体が除去される。
4)チラミド増幅工程はハプテン標識チラミド化合物を用いて実施され、遊離のチラミドは洗浄除去される。
5)第二のHRPコンジュゲート抗ハプテンマウスモノクローナル抗体がチラミド反応によって沈着されたハプテンと共にインキュベートされ、結合していない過剰の抗体が洗浄除去される。
6)インサイチュー結合HRPは銀又は代替の色原体沈着を触媒し、シグナルがRNA発現の検出及び半定量のためにスライド上に顕微鏡下で可視化される。
実施例1
アレイ定量と一致したマイクロRNA ISH染色
既知の濃度を有する組織中のmiRNAを半定量的に検出するためにプローブを使用することができることを樹立するために、MCF-7異種移植片を分析した。miRNAプローブは、Fix等 Cancer Genomics & Proteomics 7:261-278によるレポートに基づいて選択された。著者は、ポリフェノン-60を用いて又は用いないで処理されたMCF-7培養細胞から871のヒトmiRNAの特性を明らかにし定量するためにマイクロRNAマイクロアレイを使用した。MCF-7組織は、miR-200c(これは、サンプル当たり10000-20000コピーを有すると報告された)、miR-21(これは、サンプル当たり>20000コピーを有すると報告された)、miR-25(これは、サンプル当たり5000-10000コピーを有すると報告された)に対してアッセイされた。
アレイ定量と一致したマイクロRNA ISH染色
既知の濃度を有する組織中のmiRNAを半定量的に検出するためにプローブを使用することができることを樹立するために、MCF-7異種移植片を分析した。miRNAプローブは、Fix等 Cancer Genomics & Proteomics 7:261-278によるレポートに基づいて選択された。著者は、ポリフェノン-60を用いて又は用いないで処理されたMCF-7培養細胞から871のヒトmiRNAの特性を明らかにし定量するためにマイクロRNAマイクロアレイを使用した。MCF-7組織は、miR-200c(これは、サンプル当たり10000-20000コピーを有すると報告された)、miR-21(これは、サンプル当たり>20000コピーを有すると報告された)、miR-25(これは、サンプル当たり5000-10000コピーを有すると報告された)に対してアッセイされた。
MCF-7細胞において様々なレベルで発現された4つのマイクロRNA標的に対して向けられたDNP標識(5’及び3’端)された22塩基の2’-O-メチルRNAオリゴヌクレオチドプローブを合成し、修正VENTANA OptiView増幅検出キット及び銀検出と組み合わせた;十分に自動化された染色アッセイが、VENTANA Benchmark XTR機器を使用して達成された。プローブ及び新規検出系は、MCF-7異種移植片FFPE組織中の各マイクロRNA標的の感度がよく特異的な検出を触媒した。結果は図4に示されており、図4Aはバックグラウンド染色を樹立するためにコントロールとしてスクランブルプローブを使用して染色されたサンプルである。図4BはmiR-200cプローブでの染色を示し;図4CはmiR-21プローブでの染色を示し;図4DはmiR-25プローブでの染色を示す。刊行物の結果と一致して、miR-21が最も暗い染色を示し、miR-200cが続き、ついでmiR-25であった。スクランブルプローブは実質的なバックグラウンドを生じなかった。結果は、ここに記載されたプローブと方法を使用してmiRNAをFFPET中において半定量的に検出することができることを示している。注目すべきは、染色の感度を変更するように検出を更に増幅させ又は示されたものより少なく増幅させることができることである。
ある勾配の細胞質マイクロRNAシグナルが正常な固定された異種移植片組織において観察されたが(組織周辺に強いシグナル;組織中心に行くほど弱いシグナル)、これは、マイクロRNA検出に対する固定の影響を示唆している。より一様なシグナルパターンが「2+2」固定MCF-7異種移植片組織を使用して観察されたが、これは、この新規固定方法の有用性がマイクロRNA標的を含むように拡張されるかも知れないことを示唆している。
染色に対する固定の影響を試験するために、MCF-7異種移植片組織を収集し、様々な条件下で即座に室温に又は冷10%NBF中に配した。図5-9は、(A)ネガティブコントロールのスクランブルプローブ、(B)miR-21プローブ、及び(C)miR-200cプローブのmiRNA染色の顕微鏡写真を示す。図5は、24時間の間、室温10%NBF(中性緩衝ホルマリン)を使用する固定を示す。24時間の室温スライドは、処理プロトコルが’195出願に開示されたものと比較される所望の標準である。’195出願の図5を参照のこと。組織染色に対する固定の影響を扱うこのセクションの目的のために、’195出願に開示される一般的な検討がここに提供される。
’195特許出願に開示されたように、該方法の第一工程は、サンプルの実質的に断面全体にわたる組成物の実質的に完全な拡散を可能にするのに効果的な条件下で組織サンプルを固定組成物に供することである。第一工程の効果的な温度範囲は-20℃より高い温度から少なくとも15℃まで、好ましくは0℃より高い温度から典型的には約10℃の上部温度まで、更により典型的には約3℃から約5℃までである。実験を伴う実施例では、温度は典型的には約4℃であった。
’195特許出願の教示によれば、温度が増加すると、架橋速度が増大する。そしてこの最初の処理工程は、架橋の初期化に関連する影響を最小にしながら組織サンプルの断面全体にわたる固定組成物の実質的に完全な拡散に関連する有益な性質をバランスさせることを試みる。しかしながら、拡散はまた温度の増加と共に増加するため、与えられたサンプルでは、架橋速度の増加に関連する任意の有害な影響を最小にしながら拡散速度を最大にすることは有益性を増大させるようであることが知見された。
教示は、組織サンプル中への固定組成物の拡散は、サンプルの実質的に断面全体にわたる組成物の拡散に効果的な時間の間、一般的に続くことを続ける。最初の処理工程の期間は、約15分から約4時間まで、最も典型的には15分より長い時間から約3時間までの範囲であり、良好な結果は、典型的には約1.5時間から約2時間、固定組成物拡散工程を実施することによって得られる。
’195特許出願はまた第二処理工程に関連する温度が典型的には周囲温度より高く、例えば約22℃より高いことを教示している。その出願に記載された実験を伴う実施例では、温度は典型的には周囲温度より高く少なくとも55℃まで、より典型的には約35℃から約45℃までであったが、この温度範囲が比較的速い組織架橋を可能にするのに十分に架橋速度を増加させたためである。第二処理工程の期間は、15分より長い時間から少なくとも約5時間の範囲であり、より典型的には少なくとも約1時間から約4時間であり、より典型的には約2時間から約3時間までである。’195出願中のある開示された実験を伴う実施例が実施され、そこでは、第二処理工程は45℃で1.5時間の間であった。
例として’195特許出願において、そこの図4A及び4Bは同出願の図3G及び3Hの拡大画像である。図4Bに対するそこの矢印は、これらの例示的実施態様に対して4℃で10%ホルマリン固定溶液中での2時間の予浸を使用してつくられた画像に対しての結果の拡大された詳細を示している。組織形態は、4℃で10%ホルマリン固定溶液中での2時間の予浸を使用してつくられた組織サンプルに対してより良好であることが示されている。4℃で10%ホルマリン固定溶液中での2時間の予浸に供せられなかった組織サンプルでは、ホルマリンは内部に拡散しなかった-4℃で10%ホルマリン固定溶液中での2時間の予浸を使用してつくられた組織サンプルの形態(図4B)ほど保存されていない組織サンプルの形態(図4A)を参照のこと。前記は’195特許出願に詳細に記載されここで適用された2+2法の簡単な説明及び教示である。
図6は2時間の4℃のNBFと続く2時間の45℃のNBFを使用する固定を示し;図7は4時間の4℃のNBFと続く2時間の45℃のNBFを使用する固定を示し;図8は6時間の4℃のNBFと続く2時間の45℃のNBFを使用する固定を示し;図9は24時間の4℃のNBFと続く2時間の45℃のNBFを使用する固定を示す。図5-9から、これら特定のマイクロRNAに対する最良のシグナル・ノイズ比は、「2+2」(図6)又は「4+2」(図7)固定法の何れかで処理されたサンプルで見ることができるようである。
均等
別途定義されない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語はこの技術の属する分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を持つ。
ここに例証的に記載された本技術は、ここに特に開示されていない任意の要素又は要素群、限定又は限定群がない状態で好適に実施されうる。よって、例えば、「含む(comprising)」「含む(including)」、「含む(containing)」等の用語は広く限定なしに読まれるべきである。加えて、ここで用いられる用語及び表現は、説明の用語として使用されており、限定するものではなく、示され記載された特徴の任意の均等物又はその一部を除外するというそのような用語及び表現の使用を意図するものではないが、請求された本技術の範囲内で様々な変更が可能であることが認識される。
よって、ここに提供された材料、方法、及び実施例は好ましい態様の代表的なもので、例示的であり、本技術の範囲に対する限定は意図されていないことが理解されるべきである。
本技術はここで広くかつ上位概念的に記載された。上位概念の開示に入るより狭い種概念及びサブジェネリック分類のそれぞれが本技術の一部をまた構成する。これは、削除される材料がここに特に記載されているかどうかにかかわらず、上位概念から任意の主題事項を除外する否定的限定又は条件付きで本技術の上位概念的記載を含む。
また、本技術の特徴又は態様がマーカッシュ群によって記載されている場合、当業者は、本技術がマーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループの観点からもまたそれについて記載されていると認識するであろう。
ここで述べられた全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の文献は、それぞれが個々に出典明示により援用されるかの如く、同じ範囲で、その全体が出典明示により明示的に援用される。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先するであろう。
他の態様は次の特許請求の範囲内に記載される。
Claims (32)
- 標的RNAに特異的なX個の一意的2’-O-メチルRNAプローブを含むプローブセットを含み、X≧2であり、該プローブは標的RNA内のX個の別個の部分を標的にし、各2’-O-メチルRNAプローブは少なくとも一つの検出可能部分にコンジュゲートされ、検出可能部分は、シグナル増幅のための反応性色原体コンジュゲート系に結合するように適合化されている、明視野インサイチューハイブリダイゼーションのためのシステム。
- 2’-O-メチルRNAプローブが、それぞれ長さが15から30のヌクレオチド、20から50のヌクレオチド、40から80のヌクレオチド、20から100のヌクレオチド、又は20から200のヌクレオチドを含む、請求項1に記載のシステム。
- 2’-O-メチルRNAプローブが、少なくとも二つの検出可能部分、少なくとも三つの検出可能部分、少なくとも四つの検出可能部分、又は 少なくとも五つの検出可能部分にそれぞれコンジュゲートされる、請求項1又は2に記載のシステム。
- X=3である、請求項1から3の何れか一項に記載のシステム。
- X=4である、請求項1から3の何れか一項に記載のシステム。
- 検出可能部分がハプテンを含む、請求項1から5の何れか一項に記載のシステム。
- ハプテンがジニトロフェノール(DNP)を含む、請求項6に記載のシステム。
- 反応性色原体コンジュゲート系がチラミド-ハプテンコンジュゲートを含む、請求項1から6の何れか一項に記載のシステム。
- プローブがそれぞれ、プローブの20塩基対当たり少なくとも一つの検出可能部分を含む、請求項1から8の何れか一項に記載のシステム。
- 標的マイクロRNAを可視状態にする手段を更に含む、請求項1から9の何れか一項に記載のシステム。
- 標的マイクロRNAを可視状態にする手段が、プローブの検出可能部分に特異的な反応性色原体コンジュゲート系にプローブを接触させる手段を含み、反応性色原体コンジュゲート系が色を発する、請求項10に記載のシステム。
- 標的マイクロRNAを可視化する手段を更に含み、検出可能部分が反応性色原体コンジュゲート系によって可視状態にされ、検出可能部分の可視性が、標的マイクロRNAを示している、請求項10に記載のシステム。
- 標的マイクロRNAを可視化する手段が明視野顕微鏡を含む、請求項12に記載のシステム。
- マイクロRNA標的の明視野インサイチュー検出のためのシステムにおいて、
標的マイクロRNAに特異的な一意的2’-O-メチルRNAプローブを含む標的プローブであって、2’-O-メチルRNAプローブがプローブの3’端又は5’端の何れかに配された少なくとも一つの検出可能部分とコンジュゲートされている標的プローブと;
シグナル増幅に効果的な反応性色原体コンジュゲート系であって、標的プローブの検出可能部分に結合するように適合化されている反応性色原体コンジュゲート系と
を含むシステム。 - 2’-O-メチルRNAプローブが15から30のヌクレオチドを含む、請求項14に記載のシステム。
- プローブが、プローブの3’端に配された第一検出可能部分とプローブの5’端に配された第二検出可能部分とを含む、請求項14又は15に記載のシステム。
- 検出可能部分がハプテンを含む、請求項14から16の何れか一項に記載のシステム。
- ハプテンがジニトロフェノール(DNP)を含む、請求項17に記載のシステム。
- 反応性色原体コンジュゲート系がチラミド-ハプテンコンジュゲートを含む、請求項14から18の何れか一項に記載のシステム。
- 標的マイクロRNAを可視状態にする手段を更に含む、請求項14に記載のシステム。
- 標的マイクロRNAを可視状態にする手段が、プローブの検出可能部分に特異的な反応性色原体コンジュゲート系にプローブを接触させる工程を含み、反応性色原体コンジュゲート系が色を発する、請求項20に記載のシステム。
- 標的マイクロRNAを可視化する手段を更に含み、検出可能部分が反応性色原体コンジュゲート系によって可視状態にされ、検出可能部分の可視性が、標的マイクロRNAを示している、請求項20に記載のシステム。
- 標的マイクロRNAを可視化する手段が明視野顕微鏡を含む、請求項22に記載のシステム。
- 標的RNAに対して発色性に染色がなされた複数の細胞を含むスライドであって、請求項1から23の何れか一項に記載のシステムを使用して作製されているスライド。
- サンプルを抗原回収試薬と接触させる工程;
プローブがサンプル中の標的RNAにハイブリダイズするのに十分な条件下で請求項1から23の何れか一項に記載のシステムのプローブとサンプルを接触させる工程;
サンプルをすすいで未結合プローブを除去する工程;及び
検出可能部分を可視状態にすることにより標的RNAを検出する工程
を含む、明視野インサイチューハイブリダイゼーション法。 - 細胞形態を保つ条件を使用する、請求項25に記載の方法。
- プローブセットがサンプル中の標的RNAにハイブリダイズするのに十分な条件下で標的RNAに特異的なプローブとサンプルを接触させる工程であって、プローブセットがX個の一意的2’-O-メチルRNAプローブを含み、X≧2であり、2’-O-メチルRNAプローブは標的RNA内のX個の別個の部分を標的にし、各2’-O-メチルRNAプローブは少なくとも一つの検出可能部分にコンジュゲートされている工程;
第一酵素にコンジュゲートされた第一抗検出可能部分抗体とサンプルを接触させる工程であって、第一抗検出可能部分抗体がX個の一意的RNAプローブに特異的である工程;
反応性色原体コンジュゲートにサンプルを接触させる工程であって、第一抗検出可能部分抗体の第一酵素が反応性色原体コンジュゲートを第一抗検出可能部分抗体と周囲の組織に結びつける工程;及び
第二酵素にコンジュゲートされた第二抗体とサンプルを接触させる工程であって、第二抗体が反応性色原体コンジュゲートに対して特異的であり、第二酵素が色原体の可視性を触媒し、色原体の可視性が標的RNAを示す工程
を含む、インサイチューハイブリダイゼーション法。 - 2’-O-メチルRNAプローブがサンプル中の標的RNAにハイブリダイズするのに十分な条件下で標的RNAに特異的な2’-O-メチルRNAプローブとサンプルを接触させる工程であって、2’-O-メチルRNAプローブが、5’端か3’端の何れかに配された少なくとも一つの検出可能部分にコンジュゲートされ、長さが15から30のヌクレオチドである工程;
第一酵素にコンジュゲートされた第一抗検出可能部分抗体とサンプルを接触させる工程であって、第一抗検出可能部分抗体が2’-O-メチルRNAプローブに特異的である工程;
反応性色原体コンジュゲートにサンプルを接触させる工程であって、第一抗検出可能部分抗体の第一酵素が反応性色原体コンジュゲートを第一抗検出可能部分抗体に結びつける工程;及び
第二酵素にコンジュゲートされた第二抗体とサンプルを接触させる工程であって、第二抗体が反応性色原体コンジュゲートに対して特異的であり、第二酵素が色原体の可視性を触媒し、色原体の可視性が標的RNAを示す工程
を含む、インサイチューハイブリダイゼーション法。 - 2’-O-メチルRNAプローブが二つの検出可能部分とコンジュゲートされている、請求項28に記載の方法。
- 検出可能部分がジニトロフェノール(DNP)を含む、請求項28又は29に記載の方法。
- 第一ハプテンがプローブの3’端に位置させられ、第二ハプテンがプローブの5’端に位置させられる、請求項29に記載の方法。
- 反応性色原体コンジュゲートがチラミド色原体コンジュゲートを含む、請求項28に記載の方法。
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