JP2011500070A - 母性体液からの胎性細胞、胚性細胞及び核酸の分離・検出方法及び手段 - Google Patents

母性体液からの胎性細胞、胚性細胞及び核酸の分離・検出方法及び手段 Download PDF

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Abstract

本発明は、母性体液からの胎性細胞及び胚性細胞の検出のためのＨＭＧＡファミリーの高移動性基タンパクの相互作用パートナーの利用に関する。

Description

本発明は、母性体液における／からの、胎性細胞、胚性細胞、また、胎性クロマチン及び／または胚性クロマチン、及び／または胎性核酸及び／または胚性核酸の検出、分離及び濃縮方法、腫瘍細胞、及び／または腫瘍を有する患者の体液からの腫瘍からのクロマチン、及び／または核酸の検出及び／または検出、分離方法、この種の方法におけるＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーの利用に関する。
出生前の診断における大きな挑戦は、非侵襲性の出生前診断を行えるような、母性の血液または尿における胎性細胞、好ましくは無細胞ＤＮＡをそれぞれ検出することである。また、大きな挑戦は、癌患者の体液における腫瘍ＤＮＡの選択及び分離でもある。
これらの試みは、胎性の検出源の特異的な細胞の検出を可能にするツールがないために困難であった。例えば、母性の血液における循環する栄養芽細胞の検出は、再生産可能な栄養芽細胞特異的な抗体がないために挑戦にすぎない。一方、一旦検出した胎性細胞は、特に蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）のような分子細胞遺伝学的な方法を用いることでこれらの染色体の補完物を分析するために容易に用いられるため、これらのツールの利用可能性は、胎性の染色体異常の出生前診断の方法を大きく改善する。
本発明の根底にある課題は、母性の血液または体液において胎性及び胚性の細胞を検出する手段を提供することである。
更なる本発明の根底にある課題は、母性の血液または体液から胎性及び胚性の細胞を分離する手段を提供することである。
また更なる本発明の根底にある課題は、血液を含む母性の体液において胎性及び胚性のクロマチン、及び／または、好ましくは胎性及び胚性の無細胞核酸を分離する手段を提供することである。
本発明の根底にあるもう１つの課題は、母性の細胞、及び／または、母性の組織から胎性及び胚性の細胞を識別するための、及び、母性の無細胞ＤＮＡからの胎性及び胚性の無細胞ＤＮＡを識別するための手段を提供することである。
本発明の根底にあるさらなる課題は、腫瘍から、好ましくは腫瘍細胞からの無細胞クロマチン、及び／または、核酸の検出、及び／または、望ましくは選択的単離のための手段、及び、腫瘍由来のクロマチン、及び／または、核酸を正常細胞由来のものと識別するための手段を提供することである。
本発明の根底にあるこれら課題及びその他の課題は、添付された独立請求項の対象により解決される。好ましい実施形態は従属項から理解されるであろう。
第１の態様において、本発明の根底にある課題は、
ａ） 胎性、及び／または、胚性の細胞を含む、または、含むと推定される母性の体液の試料を供給し、
ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
ｃ） 試料と相互作用パートナーとを反応させ、好ましくはそこですぐ、相互作用パートナーと胎性及び胚性の細胞との複合体が形成され、
ｄ） 複合体を検出する
段階を含む母性の体液における胎性及び胚性の細胞の検出方法により解決される。
第２の態様において、本発明の根底にある課題は、
ａ） 母性の体液の試料を供給し、
ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
ｃ） 試料と相互作用パートナーとを反応させ、好ましくはそこですぐ、相互作用パートナーと胎性及び胚性の細胞との複合体が形成され、
ｄ） 試料から複合体を分離する
段階を含む母性の体液に含まれる胎性及び胚性の細胞の分離、及び／または、濃縮方法により解決される。
第２の態様の実施形態において、分離は沈殿またはクロマトグラフィにより行う。
第３の態様において、本発明の根底にある課題は、
ａ） 胎性、及び／または、胚性のクロマチン、及び／または、胎性、及び／または、胚性の核酸を含む、または、含むと推定される母性の体液の試料を供給し、
ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
ｃ） 試料と相互作用パートナーとを反応させ、好ましくはそこですぐ、相互作用パートナーと胎性、及び／または、胚性のクロマチン、及び／または、胎性、及び／または、胚性の核酸との複合体が形成され、
ｄ） 複合体を検出する
段階を含む母性の体液における胎性、及び／または、胚性のクロマチン、及び／または、胎性、及び／または、胚性の核酸の検出方法により解決される。
第４の態様において、本発明の根底にある課題は、
ａ） 母性の体液の試料を供給し、
ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
ｃ） 試料と相互作用パートナーとを反応させ、好ましくはそこですぐ、相互作用パートナーと胎性、及び／または、胚性のクロマチン、及び／または、胎性、及び／または、胚性の核酸との複合体が形成され、
ｄ） 試料から複合体を分離する
段階を含む母性の体液に含まれる胎性及び胚性の細胞の分離、及び／または、濃縮方法により解決される。
第４の態様の実施形態において、分離は沈殿またはクロマトグラフィにより行う。
第５の態様において、本発明の根底にある課題は、
ａ） 胎性、及び／または、胚性の細胞を含む、または、含むと推定される母性の体液の試料を供給し、
ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクをコードする遺伝子または遺伝子転写物を特定するプライマーまたはプローブを供給し、
ｃ） 試料とプライマーまたはプローブとを反応させ、そこですぐ、プライマーまたはプローブが胎性及び胚性の細胞に含まれる遺伝子または転写物に結合し、
ｄ） ハイブリダイゼーションまたは転写物、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応を行うプライマーの使用により得られる転写物を検出する
段階を含む母性の体液における胎性、及び／または、胚性の細胞の検出方法により解決される。
第５の態様の実施形態において、プライマーまたはプローブは胎性、及び／または、胚性の細胞に導入される。
第６の態様において、本発明の根底にある課題は、
ａ） 胎性、及び／または、胚性のクロマチン、及び／または、胎性、及び／または、胚性の核酸を含む、または、含むと推定される母性の体液の試料を供給し、
ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクをコードする遺伝子または遺伝子転写物を特定するプライマーまたはプローブを供給し、
ｃ） 試料とプライマーまたはプローブとを反応させ、そこですぐ、プライマーまたはプローブが胎性及び胚性の細胞に含まれる遺伝子または転写物に結合し、
ｄ） ハイブリダイゼーションまたは転写物、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応、さらに好ましくは定量ポリメラーゼ連鎖反応を行うプライマーの使用により得られる転写物を検出する
段階を含む母性の体液における胎性、及び／または、胚性のクロマチン、及び／または、胎性、及び／または、胚性の核酸の検出方法により解決される。
第１〜第６の何れの態様の実施形態においても、母性の体液は尿、血液及び大腿骨頸部洗浄液を含む群から選択される。
第７の態様において、本発明の根底にある課題は、
ａ） 胎性、及び／または、胚性の細胞、且つ、母性の細胞、及び／または、母性の組織を含む試料を供給し、
ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
ｃ） 試料と相互作用パートナーとを反応させ、そこですぐ、好ましくはそこですぐ、相互作用パートナーと、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパク、または、その遺伝子、または、その遺伝子転写物との複合体が形成され、
ｄ） 胎性細胞、または、胚性細胞と、母性の組織、及び／または、母性の細胞と比較するより一層の複合体を提示する
段階を含む母性の細胞、及び／または、母性の組織からの胎性、及び／または、胚性の細胞の識別方法により解決される。
第７の態様の実施形態において、母性の細胞、及び／または、母性の組織は、母性の胎盤組織、及び、胎盤性の間質細胞を含む群から選択される。
第７の態様の実施形態において、胎性及び胚性の細胞は、栄養芽層及び栄養膜細胞層由来である。
第７の態様の実施形態において、胎性及び胚性の細胞、及び、母性の細胞、及び／または、母性の組織は、絨毛膜絨毛検査により得られる試料に含まれる。
第８の態様において、本発明の根底にある課題は、
ａ） 腫瘍または癌の患者、または、腫瘍または癌が疑われる患者の体液の試料を供給し、
ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
ｃ） 試料と相互作用パートナーとを反応させ、好ましくはそこですぐ、相互作用パートナーとＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクとの複合体が形成され、
ｄ） 複合体を検出する
段階を含む腫瘍または癌の患者の腫瘍または癌からのクロマチン、及び／または、核酸の検出方法により解決される。
第９の態様において、本発明の根底にある課題は、
ａ） 腫瘍または癌の患者、または、腫瘍または癌が疑われる患者の体液の試料を供給し、
ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
ｃ） 試料と相互作用パートナーとを反応させ、好ましくはそこですぐ、相互作用パートナーとＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクとの複合体が形成され、
ｄ） 試料から複合体を分離する
段階を含む腫瘍または癌の患者の腫瘍または癌からのクロマチン、及び／または、核酸の
分離、単離、及び／または、濃縮方法により解決される。
第１７の態様の実施形態において、分離は沈殿またはクロマトグラフィにより行う。
第８及び９の態様の実施形態において、体液は、腫瘍を形成する細胞と接触していたものである。
第８及び９の態様の実施形態において、試料は、腫瘍または癌由来の細胞を含む。
第８及び９の態様の実施形態において、体液は、血液、尿、喀痰、滲出液、洗浄液、便及び唾液を含む群から選択される。
第８及び９の態様の実施形態において、体液は、唾液、便及び血液を含む群から選択される。
第８及び９の態様の実施形態において、クロマチン、及び／または、核酸は、腫瘍または癌を患うと想定される患者、または、腫瘍または癌を発症するリスクのある患者からの試料に含まれ、試料は、好ましくは尿、血液、血清、大腿骨頸部洗浄液、喀痰、胸水、腹水、唾液、生検及び便を含む群から選択される。
第８及び９の態様の実施形態において、腫瘍または癌は、上皮癌、悪性間葉系腫瘍、内分泌及び神経内分泌由来の腫瘍、白血病及びリンパ腫を含む群から選択される。
第８及び９の態様の実施形態において、腫瘍または癌は、肺癌、乳癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、子宮癌、子宮体癌、前立腺癌、及び膵臓癌を含む群から選択される。
第１〜第９の何れの態様の実施形態においても、核酸は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、プロセシングされたｍＲＮＡを含む群から選択される。
第１〜第９の何れの態様の実施形態においても、核酸は、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパク、好ましくは、ＨＭＧＡ１、及び／または、ＨＭＧＡ２に結合する核酸である。
第１〜第９の何れの態様の実施形態においても、相互作用パートナーは、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパク、または、その遺伝子、または、その遺伝子をコードする転写物に対する抗体、ペプチドアプタマー、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｅ）、アプタマー、シュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）、プロマー（ｐｒｏｍｅｒ）及びプローブを含む群から選択される。
第１０の態様において、本発明の根底にある課題は、母性の体液中の胎性及び胚性の細胞を検出するために、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを利用することにより解決される。
第１１の態様において、本発明の根底にある課題は、母性の体液から胎性及び胚性の細胞を分離するために、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを利用することにより解決される。
第１０及び１１の態様の実施形態において、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクは、ＨＭＧＡ１及びＨＭＧＡ２を含む群から選択される。
第１０及び１１の態様の実施形態において、相互作用パートナーは、抗体、ペプチドアプタマー、アンチカリン、アプタマー及びシュピーゲルマーを含む群から選択される。
第１０及び１１の態様の実施形態において、母性の体液は、尿、血液及び大腿骨頸部洗浄液を含む群から選択される。
第１２の態様において、本発明の根底にある課題は、母性の体液中の胎性及び胚性のクロマチン、及び／または、胎性及び胚性の核酸を検出するために、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを利用することにより解決される。
第１３の態様において、本発明の根底にある課題は、母性の体液中の胎性及び胚性のクロマチン、及び／または、胎性及び胚性の核酸を分離するために、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを利用することにより解決される。
第１２及び１３の態様の実施形態において、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクは、ＨＭＧＡ１及びＨＭＧＡ２を含む群から選択される。
第１２及び１３の態様の実施形態において、相互作用パートナーは、抗体、ペプチドアプタマー、アンチカリン、アプタマー及びシュピーゲルマーを含む群から選択される。
第１２及び１３の態様の実施形態において、母性の体液は、尿、血液及び大腿骨頸部洗浄液を含む群から選択される。
第１２及び１３の態様の実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、プロセシングされたｍＲＮＡを含む群から選択される。
第１２及び１３の態様の実施形態において、核酸は、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパク、好ましくは、ＨＭＧＡ１、及び／または、ＨＭＧＡ２に結合する核酸である。
第１４の態様において、本発明の根底にある課題は、母性の細胞、及び／または、母性の組織からの胎性及び胚性の細胞の識別するために、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを利用することにより解決される。
第１５の態様において、本発明の根底にある課題は、母性の胎盤組織、及び、胎盤性の間質細胞を含む群から選択される母性の細胞、及び／または、母性の組織を利用することにより解決される。
第１４及び１５の態様の実施形態において、胎性及び胚性の細胞は、栄養芽層及び栄養膜細胞層由来である。
第１４及び１５の態様の実施形態において、胎性及び胚性の細胞、及び、母性の細胞、及び／または、母性の組織は、絨毛膜絨毛検査により得られる試料に含まれる。
第１４及び１５の態様の実施形態において、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクは、ＨＭＧＡ１及びＨＭＧＡ２を含む群から選択される。
第１４及び１５の態様の実施形態において、相互作用パートナーは、抗体、ペプチドアプタマー、アンチカリン、アプタマー及びシュピーゲルマーを含む群から選択される。
第１６の態様において、本発明の根底にある課題は、母性の体液中の胎性及び胚性の細胞の検出方法において、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクをコードする核酸の増幅のために、ポリメラーゼ連鎖反応を利用することにより解決される。
第１６の態様の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応は、ＲＴ−ＰＣＲである。
第１７の態様において、本発明の根底にある課題は、母性の体液中の胎性及び胚性の細胞の検出、及び／または、増幅のために、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクをコードする核酸と特異的に相互作用、及び／または、ハイブリッド形成するプローブを利用することにより解決される。
第１８の態様において、本発明の根底にある課題は、母性の体液中の胎性及び胚性の細胞の検出、及び／または、増幅のために、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクをコードする核酸と特異的に相互作用、及び／または、ハイブリッド形成するプライマーを利用することにより解決される。
第１６〜１８の態様の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応は、定量ポリメラーゼ連鎖反応である。
第１６〜１８の態様の実施形態において、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクは、ＨＭＧＡ１及びＨＭＧＡ２を含む群から選択される。
第１６〜１８の態様の実施形態において、母性の体液は、尿、血液及び大腿骨頸部洗浄液を含む群から選択される。
第１８の態様において、本発明の根底にある課題は、腫瘍から、好ましくは腫瘍細胞からのクロマチン、及び／または、核酸の検出、及び／または、望ましくは単離のために、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを利用することにより解決され、腫瘍細胞は患者の血液中、患者の血液試料中を循環し、または、患者の体液中、患者の体液試料中に存在し、体液は、好ましくは、喀痰、尿、滲出液、洗浄液を含む群から選択され、試料は癌細胞と接触していたであろうと思われる試料であり、試料は、好ましくは、便及び唾液を含む群から選択される。
第１９の態様の実施形態において、相互作用パートナーは、抗体、ペプチドアプタマー、アンチカリン、アプタマー及びシュピーゲルマーを含む群から選択される。
第１９の態様の実施形態において、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクは、ＨＭＧＡ１及びＨＭＧＡ２を含む群から選択される。
第１９の態様の実施形態において、クロマチン、及び／または、核酸は、腫瘍を患うと想定される、または、腫瘍を発症するリスクのある患者からの試料に含まれ、試料は、好ましくは、尿、血液、血清、大腿骨頸部洗浄液、喀痰、胸水、腹水、唾液、生検及び便を含む群から選択される。
第１９の態様の実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、プロセシングされたｍＲＮＡを含む群から選択される。
第１９の態様の実施形態において、核酸は、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパク、好ましくは、ＨＭＧＡ１、及び／または、ＨＭＧＡ２に結合する核酸である。
第１９の態様の実施形態において、腫瘍は、上皮癌、悪性間葉系腫瘍、内分泌及び神経内分泌由来の腫瘍、白血病及びリンパ腫を含む群から選択される。
第１９の態様の実施形態において、腫瘍は、肺癌、乳癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、子宮癌、子宮体癌、前立腺癌、及び膵臓癌を含む群から選択される。
本発明の方法は、in vitroの方法が好ましいことが当業者に理解されるであろう。
一実施形態において、胎性細胞、胚性細胞及び腫瘍細胞は試料及び相互作用パートナーの反応前、または、反応に続いて溶解してもよい。
好ましい実施形態において、本発明による様々な方法において参照される複合体は、相互作用パートナー、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパク、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクに好んで結合する、または、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクにより好んで結合されるいくつかの核酸分子からなるものである。
図１は、ＨＭＧＡ２をコードする核酸配列を示す。 図２は、ＨＭＧＡ２のアミノ酸配列を示す。 図３は、ＨＭＧＡ１、特にバリアント１のアミノ酸配列を示す。 図４は、ＨＭＧＡ１ａのアミノ酸配列を示す。 図５は、ＨＭＧＡ１、特にバリアント１のアミノ酸配列を示す。 図６は、ＨＭＧＡ１ｂのアミノ酸配列を示す。
本発明者は、驚くべきことに、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクが胎性及び胚性の細胞により強く発現するのみでなく、例えば、胎性または胚性の細胞由来、または、腫瘍細胞由来の無細胞ＤＮＡにも結合することを見出した。そのような強い発現は、胎性及び胚性の細胞の検出及び、特に他の組織及び細胞のバックグラウンドを考慮して、好ましくは母性の細胞及び組織の分離をそれぞれ可能にする。また、そのような強い発現は、非胎性及び非胚性の細胞及び組織、好ましくは母性の細胞及び組織からの、胎性及び胚性の細胞及び組織の分離を可能にする。強い発現に基づく胚性及び胎性の細胞の検出及び分離により、胚性及び胎性の細胞の検出及び分離により、検出及び分離可能な胚性及び胎性、好ましくは、無細胞核酸も利用可能にする。
本発明者は、さらに驚くべきことに、胚性及び胎性のクロマチン及び核酸が、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクとの複合体として、より特異的にＨＭＧＡ２との複合体として存在するという知見に基づいて、胚性及び胎性の核酸は、母性の血液、及び／または、体液から単離、及び／または、分離することもできることを見出した。
両方の場合において、胚性及び胎性の核酸及びクロマチンはそれぞれ、例えば、出生前の診断のための分析に供することもできる。当業者に対して、検出され、状況に応じて分離された核酸及びクロマチンそれぞれを、さらに特徴付けることを可能にする当該技術分野において公知の方法がある。
またさらに、本発明者は、腫瘍患者からの試料がＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクを含み、腫瘍の指標またはマーカーとして利用出来ることを見出した。さらに特異的に、そのようなタンパク、すなわちＨＭＧＡファミリーのタンパクは、腫瘍由来のいくつかの核酸分子またはクロマチンそれぞれとの複合体として利用できる。腫瘍が診断、さらに特徴付けが可能であることは、そのような核酸分子及びクロマチンそれぞれに基づいている。いかなる理論にも束縛されることなく、本発明者は、核酸分子及びクロマチンが、個々の腫瘍単位のフィンガープリントを提供し、当該技術分野において一般的に知られているように、高移動度タンパクと核酸との一般的な結合特性のために、そのような腫瘍単位の核酸及びクロマチンそれぞれが、ＨＭＧＡタンパクと結合する。当業者に対して、検出され、状況に応じて分離された核酸及びクロマチンそれぞれを、さらに特徴付けることを可能にする当該技術分野において公知の方法がある。
いかなる理論にも束縛されることなく、本発明者は、特にそれらの腫瘍及び癌が、浸潤性の成長を示し、及び／または、体液において、特に血液やリンパ液において複合体の存在を説明する新血管形成と関連する現出願及び現発明の様々な方法それぞれに供される。しかし、現発明がこの種の腫瘍に限定されるものではないことを認識すべきである。
ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの検出が、高移動度タンパクの相互作用パートナーを利用することであることは、本発明の範囲である。そのような相互作用パートナーは、好ましくは、当該技術分野において知られており、当業者各自の知識に基づいて、特に本願の教示を考慮して作成可能な抗体、ペプチドアプタマー、アンチカリン、アプタマー及びシュピーゲルマーを含む群から選択される。この種の相互作用パートナーに関連して、個々で定義されるＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパク及びその一部が目的物であることは認識されるべきである。目的物は、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクと、胎児、胚及び腫瘍の核酸、及び／または、クロマチンそれぞれとの相互作用で生成される構造またはエピトープであることも、本発明の範囲である。
目的物特異的な抗体の作成は、当業者に公知であり、例えば、Harlow, E., and Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)に記載されている。好ましくは、KohlerとMilsteinのプロトコル及びそれに基づくさらなる成果により作成されるモノクローナル抗体は、本発明に関して用いてもよい。ここで用いられる抗体は、安定で、目的物に結合可能であれば、完全な抗体、抗体のフラグメント、または、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃフラグメント及び１本鎖抗体のような誘導体、またはアンチカリンを含み、これらに限定されるものではない。モノクローナル抗体とは別に、ポリクローナル抗体も使用、及び／または、生成してもよい。ポリクローナル抗体の生成も当業者に知られており、例えば、Harlow, E., and Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)に記載されている。
本発明により用いられる抗体は、いくつかのマーカーやラベルを有する。そのようなマーカーやラベルは、その診断的な応用やその治療的な応用において抗体を検出するために有用である。好ましくは、そのようなマーカーやラベルは、アビジン（avidin）、ストレプトアビジン（streptavidin）、ビオチン（biotin）、金及び蛍光色素を含む群から選択され、例えば、ＥＬＩＳＡ法に用いられる。これら及び更なるマーカー、同様に方法は、例えば、Harlow, E., and Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)に記載されている。また、ここに記載される抗体、同様に他の目的物アンタゴニストまたは相互作用パートナーは、ここに一般的に記載されるようなラベルされたアンタゴニストであってもよい。
ラベルまたはマーカーが他の分子と相互作用するような、検出とは別の付加的な機能を示すことも、本発明の範囲である。そのような相互作用は、例えば、他の化合物との特定的な相互作用であってもよい。これらの他の化合物は、ヒトや動物の体のような抗体が用いられる系、または、個々の抗体を用いることにより分析される試料に特有のものであってもよい。適当なマーカーは、例えば、ビオチンや蛍光色素と、アビジンやストレプトアビジンのようなその特異的な相互作用パートナー、及び、個々の化合物に存在するようなもの、または、マークまたはラベルした抗体と相互作用する構造とであってもよい。また、これは、アプタマーやシュピーゲルマーのような、ここに記載される他の目的物相互作用パートナーにも適用する。
相互作用パートナーのもう一つの種類は、他の物の中で、ドイツ特許出願ＤＥ １９７ ４２ ７０６に記載されたアンチカリンである。
抗体と同じ方法で、同じ目的のために使用できる相互作用パートナーの更なる種類としては、いわゆるペプチドアプタマーがある。目的物を用い、ここにより詳細に記載されるようなポリペプチドライブラリを利用するスクリーニングプロセスを用いて、ペプチドアプタマーを生成できる。選択基準は、選択したポリペプチドが目的物に実質的に、且つ、特異的に結合していることである。
さらに明確に、そのようなペプチドアプタマーは、ファージディスプレイのような人工の状態による方法を用いることで生成してもよい。基本的に、ペプチドのライブラリは、ファージの形状で生成され、この種のライブラリは、目的分子と接触する。目的分子と結合しているそれらのペプチドは、その後、好ましくは目的分子との複合体として、個々の反応から除去される。結合特性は、少なくともある程度、塩濃度やそのようなもののような特別に実現された実験的な設定に依存することは、当業者に知られている。ライブラリの非結合膜から高親和性または大きな力で目的分子に結合するそれらのポリペプチドを分離した後、また、状況に応じて目的分子とポリペプチドとの複合体から目的分子を除去した後、個々のポリペプチドは、続いて特徴付けられる。特徴付けの前に、状況に応じて、例えば、ファージをコードするポリペプチドを増殖させることにより、増幅工程が実現される。特徴付けは、好ましくは、目的物結合ポリペプチド、及び、最終的に、ここで定義するようなアンタゴニストとして働くポリペプチドまたは目的物の相互作用パートナーの配列決定を含む。基本的に、ポリペプチドは、それらの長さに制限はないが、好ましくは、約８〜２０の長さのアミノ酸を有するポリペプチドが、個々の方法において好適に得られる。ライブラリの大きさは、約１０２〜１０１８、好ましくは１０８〜１０１５の異なるペプチドでよいが、これらに限定されるものではない。
本発明により用いられる相互作用パートナーのさらなる種類は,アプタマーである。アプタマーは１本鎖または２本鎖で、特に目的分子と相互作用するＤ−核酸である。アプタマーの製造及び選択は、例えば、欧州特許ＥＰ ０ ５３３ ８３８に記載されている。基本的に、以下の工程が実現される。まず、核酸の混合液、すなわち可能性があるアプタマーが供給され、各核酸はいくつかの、好ましくは少なくとも８個のランダム化された核酸の断片を典型的に含む。この混合液は、続いて目的分子に接触し、キャンディデイト（candidate）の混合液に比して、目的物に対する親和性が増加に基づいて、または、それに対する大きな力で、核酸が目的分子に結合する。結合している核酸は、続いて混合液の残存物から分離される。状況に応じて、得られた核酸は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅する。これらの工程は何回か繰り返し、最終的に結合している核酸が状況に応じて選択される目的物に、特異的に結合している核酸の割合が増加した核酸の溶液を最終的に与えるようにしてもよい。アプタマーの生成または同定のための方法どの工程でも、個々の核酸の混合液の試料は、標準技術を用いてその配列を決定するために用いても良いことは、明らかである。アプタマーが、例えば、アプタマーを生成する当業者に知られている明確な化学基を導入することなどにより、安定化することは本発明の範囲である。そのような修飾は、例えば、核酸の糖鎖の２’位にアミノ基を導入に属する。アプタマーは、治療薬及び診断薬として最近用いられている。しかし、選択または生成されたアプタマーが本発明による様々な方法の実行に適していることは、本発明の範囲である。
本発明に関連して用いられる相互作用パートナーのまたさらなる種類は、シュピーゲルマーである。シュピーゲルマーは、アプタマーの特別な形状である。目的物を用いる本発明により利用または生成されるシュピーゲルマーの生成または製造は、同様の原理に基づく。シュピーゲルマーの製造は、国際特許出願ＷＯ ９８／０８８５６に記載されている。シュピーゲルマーはＬ−核酸で、Ｄ−核酸からなるアプタマーというよりは、Ｌ−核酸からなることを意味する。シュピーゲルマーは、生物系において、非常に高い安定性を有し、アプタマーに比して、それらが目的とする目的分子に特異的に相互作用するという事実により特徴付けられる。シュピーゲルマーを生成する目的において、Ｄ−核酸の不均一な集団が生じ、この集団が目的分子の鏡像異性体、本件においては、例えば、自然に生じる目的物のＬ型光学異性体のＤ型光学異性体と接触する。つづいて、目的分子の鏡像異性体と相互作用しない、それらのＤ型光学異性体は分離される。しかし、目的分子の鏡像異性体と相互作用するそれらのＤ型光学異性体は分離され、状況に応じて決定、及び／または、配列決定され、相当するＬ−核酸は、Ｄ−核酸から得られた核酸配列情報に基づいて合成される。目的分子の鏡像異性体と相互作用する上述のＤ型光学異性体と配列に関して同一であるこれらのＬ−核酸は、自然に生じる目的分子と、その鏡像異性体とよりも特異的に相互作用する。アプタマーの生成方法と同様に、様々な工程を何回か繰り返すことも可能で、目的分子の鏡像異性体と特異的に相互作用するそれらの核酸を濃縮することもできる。
プライマー及びプローブが相互作用パートナーのいくつかの種類として用いられ、これらの相互作用パートナーは、もちろん、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクをコードする核酸を標的にすることは、当業者に認識されるであろう。そのようなプライマー及びプローブのデザインは、当業者の技術範囲である。
本発明は、ここで、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクに対する抗体を用いる方法の例により、さらに説明する。
本出願は、母性の血液、同様に母性の尿中に存在する胎性及び胚性の細胞を抽出し、特徴付けるために、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの発現を利用する研究の結果を述べる。ＨＭＧＡ２に対する抗体により、同様にその遺伝子のｍＲＮＡに対する定量ＲＴ−ＰＣＲにより、本発明は、母性の血液及び尿中の胎性細胞が高レベルのＨＭＧＡ２により特徴付けられることを示すことができた。したがって、遺伝子の転写産物、同様にその翻訳産物は、胎性及び胚性の細胞の抽出に用いることができた。
尿試料からの細胞は、例えば、遠心分離などの適当な方法により分離し、スライドに移した。従来の確立された免疫細胞化学（ＩＣＣ）により、ＨＭＧＡ２に対する抗体は、このタンパクが陽性の細胞を染色するために用いることができ、したがって、胚性または胎性由来である。用いた抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルの抗体の群から用いた。つづいて、ＨＭＧＡ２が陽性な細胞だけが、さらに、例えばＦＩＳＨやＰＣＲのような細胞遺伝学的、分子細胞遺伝学的及び分子の分析に供された。
また、胚性細胞または胎性細胞の抽出は、セルソーティング（cell sorting）、好ましくは、抗ＨＭＧＡ２抗体で陽性に染色した細胞の蛍光標示式細胞分取によりうまく行うこともできる。好ましくは、相互作用パートナーが、この種の技術の応用を可能にするそれぞれのラベルを提供する。
本発明のもう一つの態様において、ＨＭＧＡタンパクに対する抗体は、ＨＭＧＡタンパクとＤＮＡを含むクロマチン複合体の免疫沈降に用いられる。クロマチンの免疫沈降は、例えば、転写因子とＤＮＡとの相互作用を研究するために、特異的なタンパク−ＤＮＡ相互作用を同定するためのよく適した方法であり、例えば、Dahl J.A (Dahl JA, Collas P. A quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay for small cell samples. Front Biosci. 2007 Sep 1;12:4925-31)または、Haring M et al. (Haring M, Offermann S, Danker T, Horst I, Peterhaensel C, Stam M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data nemalization)により述べられている。
血液、体液、喀痰、便、羊水が、さらなる分析に用いられる無細胞ＤＮＡを含むことは、良く知られている（Hsu et al, 2007, Levenson, 2007, Schwarzenbach et al, 2007, Zanetti-Dallenbach et al, 2007）。しかし、これらの供給源から特異的なＤＮＡ、または、例えば、母性の血液からの胚性または胎生のＤＮＡを分離すること（Maron et al, 2007, Tsang and Lo, 2007）（胎生／胚性 対 母性のＤＮＡ）、または、例えば喀痰、尿または血液から特異的な腫瘍のＤＮＡを分離すること（腫瘍細胞からのＤＮＡ 対 正常細胞からのＤＮＡ）は、さらに未解決の課題である。
本発明は、ＨＭＧＡ、特にＨＭＧＡ２タンパクと結合するＤＮＡ分子、すなわち、胎生／胚性または腫瘍細胞のＤＮＡの特異的な分離を目的とする。
ここに、本発明は、あらゆる種類のＨＭＧＡタンパク、特にＨＭＧＡ２と結合するこれらのＤＮＡフラグメントの分離、濃縮それぞれに関する。ＨＭＧＡ２及び他のＨＭＧＡタンパクが癌細胞及び、胎性及び胚性の細胞に豊富に発現することが知られている。我々の実験において、ＨＭＧＡタンパクとそのＤＮＡ結合パートナーとの結合は、安定性が高いことを見出した。このように、それらの複合体は、組織や細胞以外の他の試料からも見出され、単離された。癌の場合において、それらは、例えば血液中を循環し、喀痰や便から、または悪性の滲出液から単離できる。このように、それらの複合体は、限定されるものではないが、喀痰や便を含む癌細胞と接触した全ての物質から、癌細胞に由来するＤＮＡフラグメントを特異的に集めるために利用することができる。ほとんど全ての癌単位において、死細胞が比較的早い段階で現れ、それらのクロマチンフラグメントを放出するので、これは、様々な試料からの初期の、すなわち小さい癌細胞のスクリーニングの明らかなブレイクスルーである。確かに、基本的には、同じ方法は、母性の血液からの胎生のクロマチンを単離するにも用いることができ、非侵襲的な出生前診断における大きな進歩を示す。
ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクという用語は、粗尿なタンパクのフラグメントも含むことは認識されるであろう。好ましくは、そのようなタンパクは、タンパク全体、または、少なくとも１つのＡＴ−ｈｏｏｋの特徴を有する。ここで用いるように、高移動度タンパクＨＭＧＡ１のという用語は、２つのバリアント、すなわちＨＭＧＡ１ａ及びＨＭＧＡ１ｂを含む。
ＨＭＧＡタンパクに対する抗体は、特にＨＭＧＡ２及び、アプタマー、シュピーゲルマー、ペプチドアプタマー及びアンチカリンのような、ＨＭＧＡタンパクとＨＭＧＡ２に結合する他の分子は、腫瘍ＤＮＡを特異的に単離するために用いることができる。これらの分子は、タンパク全体、あるいはその特定のドメインのいずれも標的とすることができる。標的のドメインとして、非常に興味深いのは、ＤＮＡに結合するタンパクの部分、すなわち、当該分野（Wisniewski and Schwanbeck, 2000）で述べられたようないわゆるＡＴ−ｈｏｏｋである。どの場合においても、ＨＭＧＡタンパクを特異的に標的とする抗体を含む分子は、ＨＭＧＡ−腫瘍ＤＮＡ複合体を単離するため、および複合体からＤＮＡを除去するためのツールである。
本発明に係る課題に応じるために用いることができる、マトリクス等への抗体または他の特異的な結合分子、例えばクロマチン免疫沈降（Dahl and Collas, 2007, Gao et al, 2007, Haring et al, 2007, McCann et al,2007）のようなタンパク−ＤＮＡ複合体を単離するためのよく確立された技術が幾つかある。単離の前に、ＨＭＧＡタンパクは、ＤＮＡに対するＨＭＧＡタンパクの高い親和性と複合体の高い安定性のために、よく確立された方法、例えば、ホルマリンによる架橋（cross-linking）により、その目的とするＤＮＡと共有結合することができるが、この工程は同様に削除することができる。本発明の実施、またＤＮＡとクロマチンからなる複合体の安定化の方法において、そのような複合体に相互作用パートナーを添加することにより、複合体を形成した（Kuras L. 2004. Characterization of protein-DNA association in vivo by chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol.;284:147-63）。
複合体の適当な単離の後に、複合体からＤＮＡを除去するためのよく確立された方法がある。この種の工程は、さらに実施例において説明し、特に脱架橋（decross-linking）としてそこで言及する。
これらのＤＮＡ分子は、癌を検出可能で（Helmig and Schneider, 2007, Taback et al, 2006）、癌の特定の予後のサブグループと関係し（Chin et al, 2007）、または、各種治療の成功を予期可能な癌の特定のサブグループと関係する（Riesterer et al, 2007）変化をそれぞれ分析できる。
上記で概説したＤＮＡを特徴付ける方法、腫瘍のＤＮＡまたは特定の疾患単位またはサブグループを特徴付ける変化は、
特異的／ランダムではないＤＮＡのメチル化パターン（Jing et al, 2007, Ongenaert et al, 2007）
例えば、ＤＮＡの配列決定（Soussin and Wiman, 2007）、ヘテロ接合の欠損（Schwarzenbach et al, 2007）、制限酵素消化、固相オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（solid phase oligonucleotide ligation assay）、ＰＣＲ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、マススペクトロメトリー（Hwang and Bowen, 2007）、ＳＮＰ解析による変異の認識可能なタイプの存在
（genomic imbalance）は、ＣＧＨ及びｍａｔｒｉｘ−ＣＧＨ（Climent, et al, 2007）、すなわち、ＤＮＡのチップへのハイブリダイゼーション（van Beers and Nederlof, 2007）、または染色体（Dehan et al, 2007）、マススペクトロメトリー（Olikainen et al, 2007）等により検出可能なゲノムの不均衡
マイクロサテライト解析（Castagnaro et al, 2007）。
出生前診断の方法は、当業者に知られており、雑誌「Prenatal Diagnosis」に例が報告されている。
本発明は、さらなる特徴、実施形態及び効果を理解できる図面及び実施例を参照して、ここでさらに説明する。
実施例１：母性の血清から胎生のＤＮＡを分離するためのクロマチン分離ベースのＨＭＧＡ（ＨＡＣＳ）の利用
妊娠１４〜１６週の範囲の８人の妊婦からの血清試料は、ＨＡＣＳ技術、その後の定量ＰＣＲに用いた。全ての女性が、羊水穿刺後の出生前細胞遺伝学診断を依頼した。クロマチン免疫沈降法のルーチンプロトコルに従って、ＨＭＧＡ２に対する抗体を用いて、５ｍｌの血清をクロマチン免疫沈降に用いた。すぐに、ホルマリンを単離及び免疫沈降工程のためのクロマチン構造を維持するためのクロスリンクのために添加した。クロマチン沈降は、ＨＭＧＡ２に対するポリクローナル抗体（例えば、Santa Cruz Biotechnology Inc, Sata Cruz, USA）を用いて行い、ＤＮＡの脱架橋を行った。脱架橋したＤＮＡは、定量ＰＣＲ実験に用いた。これらのために、Ｙ染色体及び２１番染色体のリアルタイムＰＣＲ（Taqman, Applied Biosystems, Foster City, USA）のための適当なプローブとともに、２つのプライマーのペアを用いた。８試料中３つにＹ特異的配列が検出され、Ｙ染色体配列と２１番染色体特異的配列との割合は、それぞれ０．４１：１、０．３９：１及び０．３３：１であった。羊水穿刺及び出生全染色体診断の後に、これらの婦人のために、明らかに正常雄性核の胎児を鑑別した。残りの５つのケースにおいて、雌性核が見つかった。これは、好適に胎生のＤＮＡが分離されたことを示す。
実施例２：患者の血清から腫瘍のＤＮＡを分離するためのクロマチン分離ベースのＨＭＧＡ（ＨＡＣＳ）の利用
肺癌（adenocarcinoma）を患う患者からの血清試料は、最初の手術前にとられた。遠隔転移の兆候はなかった。クロマチン免疫沈降法のルーチンプロトコルに従って、ＨＭＧＡ２に対する抗体を用いて、５ｍｌの血清をクロマチン免疫沈降に用いた。すぐに、ホルマリンを単離及び免疫沈降工程のためのクロマチン構造を維持するためのクロスリンクのために添加した。クロマチン沈降は、ＨＭＧＡ２に対するポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc, Sata Cruz, USA）を用いて行い、ＤＮＡの脱架橋を行った。脱架橋したＤＮＡは、定量ＰＣＲ実験に用いた。これらの実験ために、２１番染色体及び８番染色体のリアルタイムＰＣＲ（Taqman, Applied Biosystems, Foster City, USA）のための適当なプローブとともに、２つのプライマーのペアを用いた。試料中、２１番染色体及び８番染色体特異的配列が検出され、８番染色と２１番染色体との割合は、２．９：１であった。患者は、明らかな正常の４６，ＸＹ核を有した。これは、好適に腫瘍のＤＮＡが分離され、腫瘍が８番染色体の多染色体性を有することを示す。
実施例３：ヒトゲノムにおけるＨＭＧＡ２の多数且つ、良く拡散した共通認識ＤＮＡ配列
の存在
ごく最近、目的ＤＮＡに対する高親和性結合のコンセンサス配列が説明された（Cui and Leng, Specific recognition of AT-rich DNA sequences by the Mammalian High Mobility Group Protein AT-hook2: A SELEX Study, Biochemistry, published on Web 10/23/2007）。我々は、これらの配列をヒトゲノム中のそれらの分布のin silico解析に用いた。表１に示したように、ヒト染色体全体に拡散した無数のコンセンサス配列がある。
一般に、高親和性結合配列は、大まかに平均９０，０００〜１００，０００塩基対毎に生じる。このように、これらの配列の知見及びこれらの分布は、例えば定量ＰＣＲのようなＨＡＣＳにより分離されるクロマチンの利用方法のさらなる改善に有用である。
実施例４：詳細な操作工程
以下は、羊水からの胚性ＤＮＡの調製をより詳細に説明する詳細な操作工程である。
羊水は、１００×ｇで１０分間遠心し、２ｍｌの上清を１３ｍｌのチューブに移した。タンパクＤＮＡ複合体をクロスリンクするために、３７％ホルムアルデヒドを最終濃度１％で添加した。室温で１０分間のインキュベーション後、１Ｍグリシンを最終濃度０．１２５ｍＭで添加することでクロスリンク反応を停止した。１０％の試料が投入コントロールとして供給され、１．５ｍｌのチューブに移され、−２０℃で凍結された。残りの試料は、半分に分けられ、２つの１．５ｍｌのチューブに移され、５０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ＰＬＵＳ−Ａｇａｒｏｓｅがそれぞれのチューブに添加された。試料は４℃で３０分間撹拌し、つづいて１４，０００ ｒｐｍ（２０，８００×ｇ）で５分間、室温で遠心した。上清は、新たな１．５ｍｌのチューブに移した。１μｇのＨＭＧＩ−Ｃ特異抗体を含む５μｌを１つのチューブに添加し、両方のチューブを４℃で回転しながら１晩インキュベーションした。
次の日に、３０分間、４℃で回転することで、各試料に５０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ＰＬＵＳ−Ａｇａｒｏｓｅが３μｇのサケの精子のＤＮＡ及び２５０μｌ １×ＰＢＳと混合した。アガロース／サケ精子ＤＮＡ混合液は試料、抗体なしのコントロールに添加し、２時間、４℃で回転した。アガロースビーズは、１２，０００ ｒｐｍ（１５，３００×ｇ）で１分間遠心することで回収し、上清を捨て、チューブを氷上に置いた。アガロースビーズを洗浄するために、１ｍｌのＬｙｓｉｓ Ｈｉｇｈ Ｓａｌｔ Ｂｕｆｆｅｒを各チューブに添加し、チューブはローターで室温、２分間インキュベーションした。１分間、１２，０００ ｒｐｍ（１５，３００×ｇ）での遠心の後、上清を捨てた。この洗浄工程はもう１度繰り返し、ビーズは、ローターで２分間、１ｍｌの洗浄緩衝液で２回洗浄した。１分間の１２，０００ ｒｐｍ（１５，３００×ｇ）での遠心の後、上清を捨て、アガロースビーズは、１５０μｌの１％ ＳＤＳ溶液で再懸濁した。投入コントロールは解けて、次の工程へ復帰した。試料はクロスリンクを外すために、６５℃で２時間、振盪式のウォーターバスでインキュベーションし、１２，０００ ｒｐｍ（１５，３００×ｇ）で３分間遠心し、６５℃の振盪式のウォーターバスで１晩インキュベーションした。
残ったアガロースビーズを除去するために、試料は、１２，０００ ｒｐｍ（１５，３００×ｇ）で３分間遠心し、上清を新しい２．０ｍｌチューブに移した。それらは、沈殿を防ぐため、水で１：２に希釈し、各試料に５倍量のｂｕｆｆｅｒ ＰＢＩ（Qiagen PCR Purification Kit）を添加した。７００μｌの各試料は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Qiagen）に添加し、１３，０００ ｒｐｍ（１７，９００×ｇ）で１分間遠心した。この工程は、カラムに完全に試料が供給されるまで繰り返した。カラムは７００μｌのｂｕｆｆｅｒ ＰＥで洗浄し、１３，０００ ｒｐｍ（１７，９００×ｇ）で１分間遠心し、フロースルーを捨て、カラムは残りの緩衝液を除去するため再度遠心した。ＤＮＡを溶出するために、カラムは１．５ｍｌチューブに移し、カラムの膜に４０μｌの水を供給した。続いて、室温で１分間インキュベーションし、カラムを１３，０００ ｒｐｍ（１７，９００×ｇ）で１分間遠心した。最終のＤＮＡ濃度を増やすために、フロースルーをカラムの膜に供給し、室温で１分間インキュベーションし、カラムを１３，０００ ｒｐｍ（１７，９００×ｇ）で１分間再度遠心した。最終的に、溶出したＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣにすぐに用いるか、−２０℃で保存した。
実施例５：ＨＭＧ−ＤＮＡ複合体の免疫沈降
前の実施例で概説した方法の他に、以下に概説するさらなる方法は、ＨＭＧＡ及びＨＭＧＢファミリーのタンパク向けの抗体を用いるＨＭＧ−ＤＮＡ複合体の免疫沈降に用いることができる。
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
羊水は、１０００×ｇで１０分間遠心し、２ｍｌの上清を１３ｍｌのチューブに移した。タンパクＤＮＡ複合体をクロスリンクするために、３７％ホルムアルデヒドを最終濃度１％で添加した。クロスリンクは、羊水穿刺から２〜６時間でそれぞれおこなった。室温で１０分間のインキュベーション後、１Ｍグリシンを最終濃度０．１２５ｍＭで添加し、５分間インキュベーションすることでクロスリンク反応を停止した。試料は２つに分け、１．５ｍｌのチューブに移し、各チューブに５０μｌのＤｙｎａｌｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（Invitrogen, Karsruhe, Germany）を添加した。試料は４℃で３０分間撹拌し、ビーズは室温下で、磁気ラックで除去した。上清は、新たな１．５ｍｌのチューブに移した。２μｇのＨＭＧＡ２特異抗体（Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany）を含む１０μｌを１つのチューブに添加し、両方のチューブを４℃で回転しながら１晩インキュベーションした。
次の日に、３０分間、４℃で回転することで、各試料に５０μｌのＤｙｎａｌｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇが５．５μｇのサケの精子のＤＮＡ及び２５０μｌ １×ＰＢＳと混合した。Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓ／サケ精子ＤＮＡ混合液は試料、抗体なしのコントロールに添加し、２時間、４℃で回転した。Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓは、磁気分離機で回収し、上清を捨てた。以下の工程は、４℃の部屋で行った。Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓを洗浄するために、１ｍｌのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany）を各チューブに添加し、チューブはローターで３分間インキュベーションした。ビーズを回収後、上清を捨てた。この洗浄工程は、もう１度繰り返し、ビーズは、ローターで３分間、１ｍｌのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓａｌｔ（Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany）で４回洗浄し、つづいて、それぞれ、１ｍｌのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany）で４回洗浄した。最後の洗浄工程は、１ｍｌのＴＥで１回行った。上清を捨てた後、ビーズは１５０μｌの１％ ＳＤＳ溶液で再懸濁した。試料はクロスリンクを外すために、６５℃で２時間、振盪式のウォーターバスでインキュベーションし、Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓは磁気分離機で除去し、５μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋで２時間、６５℃の振盪式のウォーターバスでインキュベーションした。
試料は沈殿を防ぐため、水で１：２に希釈し、各試料に５倍量のｂｕｆｆｅｒ ＰＢＩ（Qiagen PCR Purification Kit）を添加した。７００μｌの各試料は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Qiagen, Hilden, Germany）に添加し、１３，０００ ｒｐｍ（１７，９００×ｇ）で１分間遠心した。この工程は、カラムに完全に試料が供給されるまで繰り返した。カラムは７００μｌのｂｕｆｆｅｒ ＰＥで洗浄し、１３，０００ ｒｐｍ（１７，９００×ｇ）で１分間遠心し、フロースルーを捨て、カラムは残りの緩衝液を除去するため再度遠心した。ＤＮＡを溶出するために、カラムは１．５ｍｌチューブに移し、カラムの膜に４０μｌの水を供給した。室温で１分間のインキュベーション後、カラムを１３，０００ ｒｐｍ（１７，９００×ｇ）で１分間遠心した。最終のＤＮＡ濃度を増やすために、フロースルーをカラムの膜に供給し、室温で１分間インキュベーションし、カラムを１３，０００ ｒｐｍ（１７，９００×ｇ）で１分間再度遠心した。最終的に、溶出したＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣにすぐに用いるか、−２０℃で保存した。
先に概説した方法と同様に、これは、肺癌、乳癌、及び結腸直腸癌を患う患者の悪性の滲出液（胸膜及び腹膜）から、肺癌を患う患者の喀痰試料から、同様に妊婦からの血清試料から無細胞ＤＮＡを濃縮するために、うまく利用された。
また、異なる診断の場合、ＤＮＡが概説した実施例に述べた方法の何れによっても濃縮できるという事実は、悪性転換した細胞の集団が存在し、そのようなものが診断のパラメータとして利用できるという証拠を与える。
ゲノムＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ
ＣｈＩＰ実験の結果得られた濃縮の可能性なＤＮＡを測定するために、試料はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（濃度及びサイクル条件は上記のプロトコルを参照）。３μｌの各試料、ＧＡＰＤＨ遺伝子を検出するために抗体なしのコントロールを用いた。ＧＡＰＤＨ遺伝子の配列は、蛍光色素プローブの５’−６−ＦＡＭ−ＡＡＡ ＧＡＧ ＣＴＡ ＧＧＡ ＡＧＧ ＡＣＡ ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＴＧ ＧＣ−ＴＡＭＲＡ−３’、フォワードのプライマーの５’−ＣＣＣ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＴ ＧＣＡ ＣＴＴ ＡＣＣ−３’、リバースのプライマーの５’−ＣＣＴ ＡＧＴ ＣＣＣ ＡＧＧ ＧＣＴ ＴＴＧ ＡＴＴ−３’(Operon, Cologne, Germany)であった。結果は、対応するＮｏＡｂ−ｃｏｎｔｒｏｌから試料のＣｔ値を引き、リアルタイムＰＣＲに供給した試料の初期物質量がｘ倍高いことを確認するため、２（試料−ＮｏＡｂ−ｃｏｎｔｒｏｌ）より計算した。
文献
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明細書、配列表、特許請求の範囲及び／または図面に開示した本発明の特徴は、別々に及び、そのいかなる組合せでもその変形において本発明を実現するためのものである。

Claims (60)

  1. ａ） 胎性、及び／または、胚性の細胞を含む、または、含むと推定される母性の体液の試料を供給し、
    ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
    ｃ） 前記試料と前記相互作用パートナーとを反応させ、好ましくはそこですぐ、前記相互作用パートナーと前記胎性及び胚性の細胞との複合体が形成され、
    ｄ） 前記複合体を検出する
    段階を含む母性の体液における胎性及び胚性の細胞の検出方法。
  2. ａ） 母性の体液の試料を供給し、
    ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
    ｃ） 前記試料と前記相互作用パートナーとを反応させ、好ましくはそこですぐ、前記相互作用パートナーと前記胎性及び胚性の細胞との複合体が形成され、
    ｄ） 前記試料から前記複合体を分離する
    段階を含む母性の体液に含まれる胎性及び胚性の細胞の分離、及び／または、濃縮方法。
  3. 前記分離は沈殿またはクロマトグラフィにより行う請求項２による方法。
  4. ａ） 胎性、及び／または、胚性のクロマチン、及び／または、胎性、及び／または、胚性の核酸を含む、または、含むと推定される母性の体液の試料を供給し、
    ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
    ｃ） 前記試料と前記相互作用パートナーとを反応させ、好ましくはそこですぐ、前記相互作用パートナーと前記胎性、及び／または、胚性のクロマチン、及び／または、胎性、及び／または、胚性の核酸との複合体が形成され、
    ｄ） 前記複合体を検出する
    段階を含む母性の体液における胎性、及び／または、胚性のクロマチン、及び／または、胎性、及び／または、胚性の核酸の検出方法。
  5. ａ） 母性の体液の試料を供給し、
    ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
    ｃ） 前記試料と前記相互作用パートナーとを反応させ、好ましくはそこですぐ、前記相互作用パートナーと胎性、及び／または、胚性のクロマチン、及び／または、胎性、及び／または、胚性の核酸との複合体が形成され、
    ｄ） 前記試料から前記複合体を分離する
    段階を含む母性の体液に含まれる胎性及び胚性の細胞の分離、及び／または、濃縮方法。
  6. 前記分離は沈殿またはクロマトグラフィにより行う請求項５による方法。
  7. ａ） 胎性、及び／または、胚性の細胞を含む、または、含むと推定される母性の体液の試料を供給し、
    ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクをコードする遺伝子または遺伝子転写物に特異的なプライマーまたはプローブを供給し、
    ｃ） 前記試料と前記プライマーまたはプローブとを反応させ、そこですぐ、前記プライマーまたはプローブが前記胎性及び胚性の細胞に含まれる前記遺伝子または転写物に結合し、
    ｄ） ハイブリダイゼーションまたは前記転写物、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応を行う前記プライマーの使用により得られる転写物を検出する
    段階を含む母性の体液における胎性、及び／または、胚性の細胞の検出方法。
  8. ａ） 胎性、及び／または、胚性のクロマチン、及び／または、胎性、及び／または、胚性の核酸を含む、または、含むと推定される母性の体液の試料を供給し、
    ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクをコードする遺伝子または遺伝子転写物に特異的なプライマーまたはプローブを供給し、
    ｃ） 前記試料と前記プライマーまたはプローブとを反応させ、そこですぐ、前記プライマーまたはプローブが前記胎性及び胚性の細胞に含まれる前記遺伝子または転写物に結合し、
    ｄ） ハイブリダイゼーションまたは前記転写物、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応を行う前記プライマーの使用により得られる転写物を検出する
    段階を含む母性の体液における胎性、及び／または、胚性の細胞の検出方法。
  9. 前記プライマーまたは前記プローブが前記胎性、及び／または、胚性の細胞に導入される請求項７による方法。
  10. 前記母性の体液は尿、血液及び大腿骨頸部洗浄液を含む群から選択される請求項１乃至第９の何れの方法。
  11. ａ） 胎性、及び／または、胚性の細胞、且つ、母性の細胞、及び／または、母性の組織を含む試料を供給し、
    ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
    ｃ） 前記試料と前記相互作用パートナーとを反応させ、そこですぐ、好ましくはそこですぐ、前記相互作用パートナーと、前記ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパク、または、その遺伝子、または、その遺伝子転写物との複合体が形成され、
    ｄ） 前記胎性細胞、または、胚性細胞と、前記母性の組織、及び／または、母性の細胞と比較する複合体を１つ以上提示する
    段階を含む母性の細胞、及び／または、母性の組織からの胎性、及び／または、胚性の細胞の識別方法。
  12. 前記母性の細胞、及び／または、母性の組織は、母性の胎盤組織、及び、胎盤性の間質細胞を含む群から選択される請求項１１による方法。
  13. 前記胎性及び胚性の細胞は、栄養芽層及び栄養膜細胞層由来である請求項１１乃至１２の何れの方法。
  14. 胎性及び胚性の細胞、及び、母性の細胞、及び／または、母性の組織は、絨毛膜絨毛検査により得られる試料に含まれる請求項１１乃至１３の何れかの方法。
  15. ａ） 腫瘍または癌の患者、または、腫瘍または癌が疑われる患者の体液の試料を供給し、
    ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
    ｃ） 前記試料と前記相互作用パートナーとを反応させ、好ましくはそこですぐ、前記相互作用パートナーと前記ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクとの複合体が形成され、
    ｄ） 前記試料を検出する
    段階を含む腫瘍または癌の患者の腫瘍または癌からのクロマチン、及び／または、核酸の
    検出方法。
  16. ａ） 腫瘍または癌の患者、または、腫瘍または癌が疑われる患者の体液の試料を供給し、
    ｂ） ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを供給し、
    ｃ） 前記試料と前記相互作用パートナーとを反応させ、好ましくはそこですぐ、前記相互作用パートナーと前記ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクとの複合体が形成され、
    ｄ） 前記試料から複合体を分離する
    段階を含む腫瘍または癌の患者の腫瘍または癌からのクロマチン、及び／または、核酸の分離、単離、及び／または、濃縮方法。
  17. 前記分離は沈殿またはクロマトグラフィにより行う請求項１６による方法。
  18. 前記体液は、前記腫瘍を形成する細胞と接触していたものである請求項１５乃至１７の何れかによる方法。
  19. 前記試料は、前記腫瘍または癌由来の細胞を含む請求項１５乃至１８の何れかによる方法。
  20. 前記体液は、血液、尿、喀痰、滲出液、洗浄液、便及び唾液を含む群から選択される請求項１５乃至１９の何れかによる方法。
  21. 前記体液は、唾液、便及び血液を含む群から選択される請求項２０による方法。
  22. クロマチン、及び／または、核酸は、腫瘍または癌を患うと想定される患者、または、腫瘍または癌を発症するリスクのある患者からの試料に含まれ、前記試料は、好ましくは尿、血液、血清、大腿骨頸部洗浄液、喀痰、胸水、腹水、唾液、生検及び便を含む群から選択される請求項１５乃至２１による方法。
  23. 前記腫瘍または癌は、上皮癌、悪性間葉系腫瘍、内分泌及び神経内分泌由来の腫瘍、白血病及びリンパ腫を含む群から選択される請求項１５乃至２２の何れかによる方法。
  24. 前記腫瘍または癌は、肺癌、乳癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、子宮癌、子宮体癌、前立腺癌、及び膵臓癌を含む群から選択される請求項１５乃至２３の何れかによる方法。
  25. 前記核酸は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、プロセシングされたｍＲＮＡを含む群から選択される請求項１乃至２４の何れかによる方法。
  26. 前記核酸は、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパク、好ましくは、ＨＭＧＡ１、及び／または、ＨＭＧＡ２に結合する核酸である請求項１乃至２５の何れかによる方法。
  27. 前記相互作用パートナーは、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパク、または、その遺伝子、または、その遺伝子をコードする転写物に対する抗体、ペプチドアプタマー、アンチカリン、アプタマー、シュピーゲルマー、プロマー及びプローブを含む群から選択される請求項１乃至２６の何れかによる方法。
  28. 母性の体液中の胎性及び胚性の細胞を検出するための、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーの利用。
  29. 母性の体液中の胎性及び胚性の細胞を分離するための、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーの利用。
  30. 前記ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクは、ＨＭＧＡ１及びＨＭＧＡ２を含む群から選択される請求項２８乃至３０の何れかによる利用。
  31. 前記相互作用パートナーは、抗体、ペプチドアプタマー、アンチカリン、アプタマー及びシュピーゲルマーを含む群から選択される請求項２８乃至３０の何れかによる利用。
  32. 前記母性の体液は、尿、血液及び大腿骨頸部洗浄液を含む群から選択される請求項２８乃至３０の何れかよる利用。
  33. 母性の体液中の胎性及び胚性のクロマチン、及び／または、胎性及び胚性の核酸を検出するための、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーの利用。
  34. 母性の体液中の胎性及び胚性のクロマチン、及び／または、胎性及び胚性の核酸を分離するための、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーを利用。
  35. 前記ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクは、ＨＭＧＡ１及びＨＭＧＡ２を含む群から選択される請求項３１乃至３４の何れかによる利用。
  36. 前記相互作用パートナーは、抗体、ペプチドアプタマー、アンチカリン、アプタマー及びシュピーゲルマーを含む群から選択される請求項３３乃至３５の何れかによる利用。
  37. 前記母性の体液は、尿、血液及び大腿骨頸部洗浄液を含む群から選択される請求項３３乃至３６の何れかよる利用。
  38. 前記核酸は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、プロセシングされたｍＲＮＡを含む群から選択される請求項３３乃至３７の何れかによる利用。
  39. 前記核酸は、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパク、好ましくは、ＨＭＧＡ１、及び／または、ＨＭＧＡ２に結合する核酸である請求項３３乃至３８の何れかによる利用。
  40. 母性の細胞、及び／または、母性の組織からの胎性及び胚性の細胞の識別するための、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーの利用
  41. 前記母性の細胞、及び／または、母性の組織は、胎盤組織、及び、胎盤性の間質細胞を含む群から選択される請求項４０による利用。
  42. 前記胎性及び胚性の細胞は、栄養芽層及び栄養膜細胞層由来である請求項４０乃至４１の何れかによる利用。
  43. 前記胎性及び胚性の細胞、及び、母性の細胞、及び／または、母性の組織は、絨毛膜絨毛検査により得られる試料に含まれる請求項４０乃至４２の何れかによる利用。
  44. 前記ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクは、ＨＭＧＡ１及びＨＭＧＡ２を含む群から選択される請求項４０乃至４３の何れかによる利用。
  45. 前記相互作用パートナーは、抗体、ペプチドアプタマー、アンチカリン、アプタマー及びシュピーゲルマーを含む群から選択される請求項４０乃至４４の何れかによる利用。
  46. 母性の体液中の胎性及び胚性の細胞の検出方法において、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクをコードする核酸の増幅のための、ポリメラーゼ連鎖反応の利用。
  47. 前記ポリメラーゼ連鎖反応は、ＲＴ−ＰＣＲである請求項４６による利用。
  48. 母性の体液中の胎性及び胚性の細胞の検出、及び／または、増幅のための、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクをコードする核酸と特異的に相互作用、及び／または、ハイブリッド形成するプローブの利用。
  49. 母性の体液中の胎性及び胚性の細胞の検出、及び／または、増幅のための、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクをコードする核酸と特異的に相互作用、及び／または、ハイブリッド形成するプライマーの利用。
  50. 前記ポリメラーゼ連鎖反応は、定量ポリメラーゼ連鎖反応である請求項４６乃至４９の何れかによる利用。
  51. 前記ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクは、ＨＭＧＡ１及びＨＭＧＡ２を含む群から選択される請求項４６乃至５０の何れかによる利用。
  52. 前記母性の体液は、尿、血液及び大腿骨頸部洗浄液を含む群から選択される請求項４６乃至５１の何れかによる利用。
  53. 腫瘍から、好ましくは腫瘍細胞からのクロマチン、及び／または、核酸の検出、及び／または、望ましくは単離のための、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクの相互作用パートナーの利用であって、前記腫瘍細胞は患者の血液中、患者の血液試料中を循環し、または、患者の体液中、患者の体液試料中に存在し、前記体液は、好ましくは、喀痰、尿、滲出液、洗浄液を含む群から選択され、前記試料は癌細胞と接触していたであろうと思われる試料であり、前記試料は、好ましくは、便及び唾液を含む群から選択される。
  54. 前記相互作用パートナーは、抗体、ペプチドアプタマー、アンチカリン、アプタマー及びシュピーゲルマーを含む群から選択される請求項５３による利用。
  55. 前記ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパクは、ＨＭＧＡ１及びＨＭＧＡ２を含む群から選択される請求項５３乃至５４の何れかによる利用。
  56. 前記クロマチン、及び／または、核酸は、腫瘍を患うと想定される、または、腫瘍を発症するリスクのある患者からの試料に含まれ、前記試料は、好ましくは、尿、血液、血清、大腿骨頸部洗浄液、喀痰、胸水、腹水、唾液、生検及び便を含む群から選択される請求項５３乃至５５の何れかによる利用。
  57. 前記核酸は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、プロセシングされたｍＲＮＡを含む群から選択される請求項５３乃至５６の何れかによる利用。
  58. 核酸は、ＨＭＧＡファミリーの高移動度タンパク、好ましくは、ＨＭＧＡ１、及び／または、ＨＭＧＡ２に結合する核酸である請求項５３乃至５７の何れかによる利用。
  59. 前記腫瘍は、上皮癌、悪性間葉系腫瘍、内分泌及び神経内分泌由来の腫瘍、白血病及びリンパ腫を含む群から選択される請求項５３乃至５８の何れかによる利用。
  60. 前記腫瘍は、肺癌、乳癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、子宮癌、子宮体癌、前立腺癌、及び膵臓癌を含む群から選択される請求項５３乃至５９の何れかによる利用。
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