CN104987366A - 一种类风湿关节炎自身抗体结合抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明为一种类风湿关节炎自身抗体结合抗原及其应用。本发明公开了一种新型的类风湿关节炎抗体的检测抗原，具体地，所述的检测抗原可以作为RA的诊断和早期诊断指标，并优于临床上开展的CCP、CRP、IgG-RF和IgM-RF等的检测，因此可作为临床上对RA进行早期治疗或预防的一个非常有价值参考的指标，同时也可作为RA病程发展指标。

Description

一种类风湿关节炎自身抗体结合抗原及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其是涉及一种新的类风湿关节炎的诊断、治疗用蛋白。 

背景技术

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、全身性、自身免疫性疾病，其特征是外周关节的非特异性、对称性慢性炎症，关节滑膜的慢性炎症、增生，形成血管翳，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，造成关节软骨、骨和关节囊破坏，最终导致关节畸形和功能丧失，部分患者伴不同程度的全身表现。RA在中国是一个常见的多发性自身免疫疾病，患病率约为0.3％-0.4％，美国本病患者约占人群的1％，女性发病率较男性高2-3倍。各年龄组人群均可发病，但25-50岁为本病的好发年龄。目前尚无有效地根治RA、防治患者受累关节畸形和功能丧失的治疗方法，早期诊断、早期治疗是唯一有效延缓病变发展、减少不可逆关节病变的措施。 

1987年美国风湿病学会(ACR)制定的RA诊断标准为病变持续6周，并有以下七个方面的表现可确诊为类风湿关节炎(RA)：①关节运动受阻一小时以上或②关节炎发生三个以上关节或③关节炎发生在手关节上或④对称性关节炎或⑤风湿性小结在关节上出现或⑥血清RF阳性或⑦X光显示关节出现变形。2009年ACR修订了RA诊断标准，以下指标获得6分及以上肯定RA诊断：①受累关节情况，最高得5分或②血清学抗体检测，包括类风湿因子(RF)或抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体至少一项低滴度阳性的2分，高滴度阳性得3分，两者均阴性不得分或③滑膜炎持续超过6周得1分或④CRP或ESR增高得1分。从两个标准可看出，风湿病学专家们已经充分认识到血清学抗体检测在RA诊断中的重要价值。由于RF对于RA的特异性差，CCP抗体已经成为辅助临床早期诊断和鉴别诊断RA的最特异性实验室指标。 

然而，目前临床上常用的CCP抗体检测试剂辅助诊断RA的特异性高达95％，但敏感性不够，在50-75％之间(Fan LY,et al.ClinicaChimicaActa2010,411: 2049-2053)。因此，本领域迫切需要开发一种特异性高、灵敏度强的RA相关自身抗原，以满足临床辅助诊断的检测需求。 

发明内容

本发明提供了一种能够特异性识别样本中RA抗体的多肽。 

本发明第一方面，提供了一种式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐： 

[Xaa0]-CEGRS(Cit)RSTSPEER(Cit)GPG-[Xaa1] 

式(I)； 

其中，Xaa0和Xaa1分别为无，或1-5个氨基酸构成的肽段。 

在另一优选例中，所述式I所式的多肽或其衍生多肽具有RA自身抗体的结合活性。 

在另一优选例中，所述的Xaa0和Xaa1分别为1-4个，较佳地为2-3个氨基酸构成的肽段。 

在另一优选例中，所述的多肽包括线性肽或非线性肽。 

在另一优选例中，所述的多肽由Cit和Arg之间、Cit和Cit之间的氢键构成环肽。 

在另一优选例中，所述的多肽由Cit和Arg之间的氢键构成环肽。 

本发明第二方面，提供了一种偶联蛋白，所述的偶联蛋白具有以下结构： 

Y-X 

其中， 

Y为载体蛋白； 

X为式I所示的多肽； 

“-”表示连接X和Y的肽键或肽接头。 

在另一优选例中，所述的载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)，或血蓝蛋白(KLH)。 

在另一优选例中，本发明还提供了一种分离的核苷酸，其编码权利要求1所述的多肽。 

本发明第三方面，提供了一种类风湿关节炎诊断抗原组合，所述的抗原组合包括本发明第一方面所述的多肽或本发明第二方面所述的偶联蛋白，和选自以下一种或两种的多肽： 

CGRPGTAS(Cit)PSTSTRYVT    式II， 

CEESA(Cit)HLL(Cit)EYQDINVK    式III。 

本发明第四方面，提供了本发明第一方面所述多肽、本发明第二方面所述偶联蛋白，或本发明第三方面所述的抗原组合的用途，用于制备检测样本中类风湿关节炎自身抗体、和/或制备诊断类风湿关节炎的试剂或试剂盒。 

在另一优选例中，所述的样本包括血液样本、关节液样本。 

在另一优选例中，所述的血液样本包括血清、血浆和/或全血。 

在另一优选例中，所述的检测为早期检测。 

在另一优选例中，所述的早期指的是类风湿关节炎发病在1年半之内。 

本发明第五方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括基片(支撑板)、测试条，所述的测试条固定有本发明第一方面所述的多肽或其衍生多肽、本发明第二方面所述的偶联蛋白，或本发明第三方面所述的抗原组合。 

在另一优选例中，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成。 

在另一优选例中，所述层析材料预包被有经胶体金标记或有色标记的权利要求1所述的多肽或其衍生多肽、权利要求3所述的偶联蛋白，或权利要求5所述的抗原组合。 

本发明第六方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，和位于容器内的(i)本发明第五方面所述的检测板；或(ii)本发明第一方面所述的多肽或其衍生多肽、本发明第二方面所述的偶联蛋白，或本发明第三方面所述的抗原组合；和(iii)使用说明书。 

在另一优选例中，所述的说明书记载了检测样本中是否存在类风湿关节炎自身抗体的方法，包括步骤： 

(a)将样本与本发明第一方面所述多肽、或本发明第二方面所述偶联蛋白，或本发明第三方面所述的抗原组合接触； 

(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中，形成复合物就说明样本中存在类风湿关节炎自身抗体。 

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有抗本发明第一方面所述的多肽或其衍生多肽、本发明第二方面所述的偶联蛋白，或本发明第三方面所述的抗原组合的抗体，用于阳性对照。 

本发明第七方面，提供了一种体外非诊断性的检测样本中是否存在类风湿关节炎自身抗体的方法，包括步骤： 

(a)将样本与本发明第一方面所述多肽、或本发明第二方面所述偶联蛋白，或本发明第三方面所述的抗原组合接触； 

(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中，形成复合物就说明样本中存在类风湿关节炎自身抗体。 

在另一优选例中，所述的诊断为早期诊断，和/或所述对象为类风湿关节炎疑似患者。 

本发明第八方面，提供了一种诊断类风湿关节炎的方法，包括步骤： 

(a)将检测对象的样本与本发明第一方面所述多肽或其衍生多肽、或本发明第二方面所述偶联蛋白，或本发明第三方面所述的抗原组合接触； 

(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中，形成复合物就说明所述对象患有类风湿关节炎。 

在另一优选例中，所述的样本包括血、关节液。 

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。 

附图说明

图1显示了精氨酸在肽精氨酸脱亚胺基酶、水分子和钙离子的作用下进行脱氨并释放出氢离子而形成瓜氨酸的反应过程。 

图2显示了在三羧酸循环和尿素代谢中，主要以鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酰合成酶的作用下，氨基甲酰磷酸与瓜氨酸(Cit)之间可作转化代谢，从而在多肽蛋白合成代谢中产生精氨酸(R)的非正常衍生物瓜氨酸(Cit)多肽的反应过程。 

图3显示了当精氨酸的衍生物瓜氨酸在蛋白多肽代谢中形成后，其多肽中的精氨酸和瓜氨酸在结构上，精氨酸与瓜氨酸或瓜氨酸与瓜氨酸可能会形成环化结构的二种模式。 

图4显示了CCP5F、CCP5G、CCP5H多肽-BSA偶联蛋白质的氨基酸顺序，其中BSA为牛血清蛋白，瓜氨酸(Cit)是从精氨酸(R)代谢中的衍生物。瓜氨酸(Cit)和瓜氨酸(Cit)之间和或瓜氨酸(Cit)和精氨酸(R)之间的边线为其多肽结构中可能存在的环化。例如，在CCP5G的二个环化连线中，链线(1) 和链线(2)是两种环化可选择的可能性(也是造成抗原多样性一方面)或除了瓜氨酸(Cit)三字母代码外，其它英文字母为氨基酸单字母代码。 

图5显示了制备的抗CCP5F、CCP5G和CCP5H抗血清经三倍系列稀释后分别与对应多肽-BSA抗原蛋白反应，并经二抗-HRP信号放大反应后，在96孔ELISA板上显示出不同中的吸光度(OD)和梯度曲线，以代表羊抗CCP5F-H抗体与CCP5F-H抗原的效价。 

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过对多种商品化类风湿关节炎自身抗原(CCP)进行了研究，对这些抗原结构进行了变构、变性改造，并对合成的多肽进行了大量筛选，从而获得了数十种具有新构型的环化瓜氨酸多肽并制备了含有这些多肽的偶联蛋白，然后，通过对含有这些多肽的偶联蛋白与RA血清内自身抗体的结合反应性研究，进一步筛选到数条具有与RA血清自身抗体结合活性的多肽，其中，以本发明多肽(CCP5G)的反应性最佳，而将这些多肽进行组合后，也能够有良好的反应性效果。此外，本发明人采用本发明多肽对大量临床病例进行了验证，实验证明，在RA患者，尤其是早期RA患者中，本发明多肽的阳性检出率显著高于现有的CCP检测，因此本发明多肽可用于对RA患者尤其是早期患者的诊断和检测，其特异性高、灵敏度强。在此基础上，完成了本发明。 

类风湿关节炎 

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、全身性、自身免疫性疾病，其特征是外周关节的非特异性、对称性慢性炎症，关节滑膜的慢性炎症、增生，形成血管翳，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，造成关节软骨、骨和关节囊破坏，最终导致关节畸形和功能丧失，部分患者伴不同程度的全身表现。RA在中国是一个常见的多发性自身免疫疾病。 

目前，RA的发病机制尚未完全阐明，且也未出现有效地根治RA、防治患者受累关节畸形和功能丧失的治疗方法。 

RA相关抗体 

在RA患者血清中可检测多种抗体，包括类风湿因子、RA33抗体、抗II性 胶原抗体、抗环瓜氨酸肽抗体(CCP抗体)等等。其中CCP抗体是目前公认的辅助诊断RA的特异性最高的指标。但是目前市售的不同品牌CCP抗体试剂检测均存在着检测结果对RA诊断敏感度不高的缺憾，特别是对早期RA诊断敏感度低于50％，导致部分早期RA得不到及时诊断和治疗。 

瓜氨酸 

瓜氨酸不是人体内的天然氨基酸、也不是代谢必须氨基酸，而由是精氨酸在体内去氨基后的衍生物。如图1所示，肽链中的精氨酸在肽精氨酸脱亚胺酶(PAD＝peptidgl arginine deiminase)、水分子和钙离子的作用下进行脱氨并释放出氢离子而形成瓜氨酸(Citrulline or Cit)。 

精氨酸(Arginine,Arg or R)与赖氨酸(Lysine,Lys or K)和组氨酸(Histidine,His or H)一样是一种碱性氨基酸，是人体20种天然氨基酸之一，也是人体正常蛋白质合成、分解代谢中(如三羧酸循环)不可缺少的原料之一。 

瓜氨酸也是在三羟酸循环和尿素代谢中的中间体。如图2所示，在三羧酸循环和尿素代谢中，主要以鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酰合成酶的作用下，氨基甲酰磷酸与瓜氨酸(Cit)之间可作转化代谢，从而在多肽蛋白合成代谢中产生精氨酸(R)的非正常衍生物瓜氨酸(Cit)多肽。 

如果在人体蛋白质多肽链中，过多地出现瓜氨酸，一方面该受累蛋白的许多生物学特性、甚至功能将发生改变，另一方面此多肽蛋白就可能被人体的免疫机制看作是一个外来抗原而产生自身抗体。自身抗体与抗原的结合物会沉积在人体一些关节中，激活补体而造成局部组织损伤，是潜在的类风湿关节炎(RA)病的发病基础。 

活性多肽 

在本发明中，术语“本发明多肽”、“CCP5G多肽”、“本发明变性变构型瓜氨酸多肽”、“本发明环瓜氨酸多肽”可互换使用，都指具有类风湿关节炎自身抗体结合活性的肽CCP5G氨基酸序列的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有类风湿关节炎自身抗体结合活性的、SEQ ID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为1-2个以内)氨基酸。例如， 在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。 

本发明多肽还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。优选地，本发明多肽为环肽形式，例如，本发明多肽的Cit和Arg之间、Cit和Cit之间可形成氢键，从而构成结构稳定的环肽。更优选地，本发明的多肽结构如下所示： 

CEGRS(Cit)RSTSPEER(Cit)GPG    式(I) 

本发明还包括CCP5G多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持类风湿关节炎自身抗体结合活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)CCP5G多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇、载体蛋白(优选为BSA和KLH))融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。 

发明还提供CCP5G多肽的类似物。这些类似物与天然CCP5G多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。 

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。 

本发明多肽还可以以由药学上或生理学上可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或 碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。 

此外，本发明还提供了一种抗原组合，即将本发明多肽与其他相同用途的多肽进行组合。通常，这些组合中的多肽数量可以为一个或多个，优选地，所述其他相同用途的多肽也能够与血清中类风湿关节炎抗体结合，例如如式II或式III所示的多肽： 

CGRPGTAS(Cit)PSTSTRYVT       式II(SEQ ID NO.:2)， 

CEESA(Cit)HLL(Cit)EYQDINVK   式III(SEQ ID NO.:3)。 

将式I-III的抗原联合应用于类风湿关节炎抗体，能够提高单一抗原的抗原-抗体识别反应率，从而进一步提高抗体的检出率。 

多肽的制备方法 

本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。 

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环 己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。 

在一优选例中，本发明多肽CCP5F、CCP5G和CCP5H，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。 

此外，本发明多肽和蛋白质载体的连接可使用本领域已知的任何连接方式以构成偶联蛋白。例如但不限于：碳二亚胺法(EDC)、戊二醛法等。 

可用于本发明的蛋白质载体包括(但不限于)：牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)。优选地，为BSA。 

RA相关抗体检测板 

可采用本领域常规检测技术，利用本发明多肽或其偶联蛋白对样本内的RA相关抗体进行检测。较佳地，所述的检测采用常规间接ELISA酶标法、金标法、比浊法、生物芯片法、膜点杂交法等等血清学或体液学的诊断方法。优选地，可采用间接ELISA酶标法或金标法。例如，可将RA相关抗体-载体蛋白固定于硝酸纤维膜上的检测区(固相抗体)，待检样品溶液中的RA相关抗体(游离抗体)与固相抗体竞争结合胶体金标记的本发明多肽或其偶联蛋白(标记抗原)。待检样品中含有的RA相关抗体，将抑制标记抗体与固定抗原的结合，抑制在硝酸纤维素膜的检测区形成色带。测定后检测区如果形成色带，则结果为阴性，待测样品不含RA相关抗体；反之，不形成色带，则结果为阳性，检测样品含有RA相关抗体。 

本发明的检测板可采用本领域常用的检测板材料，采用常规的检测板制备方法制成。本发明检测的检测板包括测试条和支撑测试条的支撑板，如可采用聚乙烯ELISA反应板等；所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，搭接部位可以采用常规的方法，如胶带等固定连接；其中：层析材料预包被胶体金标记或有色标记的本发明多肽或其偶联蛋白。 

检测方法与结果判定： 

平放检测板，将样本(如血清)滴加在滤样纸上，1.5-5min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果。 

阴性：质控区、检测区均出现明显的色带，示为阴性；阳性：只在质控区出现明显色带，而在检测区无色带，示为阳性；无效：质控区、检测区无任何色带或 在质控区未出现色带而在检测区出现色带，表明检测方法错误或检测板变质或失效，应重新换取检测板检测。 

试剂盒 

本发明还提供了一种检测RA相关抗体的试剂盒。一般地，本发明的试剂盒可以含有上述的检测板，或所述的试剂盒可以包括以下组分：容器或载体；以及位于所述容器内或载体上的本发明多肽或其偶联蛋白。在另一优选例中，所述试剂盒还包括酶结合液、反应底物和任选的说明书。较佳地，所述的试剂盒还可包括选自下组的组分：反应终止液、样本稀释液、和洗涤液。一种优选的可用于检测RA相关抗体的试剂盒包括：容器以及位于容器内的包被液、辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG(H+L)抗体、底物液TMB、稀浓硫酸反应终止液和样本稀释液。更佳地，还含有空白对照、阳性和阴性对照和作以监控检测过程是否符合标准。 

本发明的有益效果： 

利用本发明CCP5G多肽作为检测RA相关抗体的抗原，敏感性高，特异性也较高，能够有效地诊断RA，尤其是早期RA的患者，比目前已临床上开展的CCP、CRP、IgG-RF和IgM-RF，特别是比CCP检出方法要优越得许多。此外，制备获得的本发明多肽的多克隆抗体，可用于RA的特异性治疗。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。 

实施例1 CCP5F-H多肽及其BSA偶联蛋白的制备、鉴定与保存 

按常规多肽合成方法制备获得本发明CCP5F、CCP5G和CCP5H多肽，经鉴定它们的理化特性分别为： 

本发明CCP5F多肽为18个氨基酸长的环状多肽(图4)，分子量为2100.85道尔顿(Dal)，在与BSA偶联之前，氨基(-NH₂)末端的修饰为氢链(H)，羟基(COOH)末端的修饰为羟基(OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它 在220um波长的迁移紫外吸收峰为在0-2分钟达到95％A峰(主峰)，在2～10分钟后为5％的B峰。此多肽经BSA偶联后，浓度仍然按照CCP5F多肽的浓度计算(BSA为载体，浓度在反应中忽略不计)，经冷冻干燥后，配成1.0mg/ml在PBS缓冲液中(可溶性佳)的多肽蛋白溶液并经0.22um过滤，无菌保存在4℃冰箱中。 

本发明CCP5G多肽为18个氨基酸长的多肽(图4)，分子量为1967.23道尔顿(Dal)，在与BSA偶联之前，氨基(-NH2)末端的修饰为氢链(H)，羟基(COOH)末端的修饰为羟基(OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它在220um波长的迁移紫外吸收峰为在0-2分钟达到95％A峰(主峰)，在2-10分钟后为5％的B峰。此多肽经BSA偶联后，浓度仍然按照CCP5G多肽的浓度计算(BSA为载体，浓度在反应中忽略不计)，经冷冻干燥后，配成1.0mg/ml在PBS缓冲液中(可溶性佳)的多肽蛋白溶液并经0.22um过滤，无菌保存在4℃冰箱中。 

本发明CCP5H多肽为18个氨基酸长的环状多肽(图4)，分子量为2239.24道尔顿(Dal)，在与BSA偶联之前，氨基(-NH2)末端的修饰为氢链(H)，羟基(COOH)末端的修饰为羟基(OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它在220um波长的迁移紫外吸收峰为在0-2分钟达到95％A峰(主峰)，在2～10分钟后为5％的B峰。此多肽经BSA偶联后，浓度仍然按照CCP5e多肽的浓度计算(BSA为载体，浓度在反应中忽略不计)，经冷冻干燥后，配成1.0mg/ml在PBS缓冲液中(可溶性佳)的多肽蛋白溶液并经0.22um过滤，无菌保存在4℃冰箱中。 

实施例2 CCP5F、CCP5G和CCP5H多肽特征和抗原抗体的比较 

CCP5F、CCP5G和CCP5H多肽BSA偶联蛋白，分别用加强免疫法免疫美国得克萨斯州的纯种山羊，以产生较高滴度的抗血清。图5鉴定抗CCP5F-H抗体与抗原的反应性(反应滴度)，抗CCP5F-H抗血清经三倍系列稀释后与对应的抗原CCP5G多肽-BSA抗原蛋白反应，并经二抗-HRP信号放大反应后，在96孔ELISA板上显示出不同中的吸光度(OD)和梯度曲线，以代表羊抗CCP5F、CCP5G和CCP5H抗体的效价。 

羊抗CCP5F-H抗血清ELISA效价反应的鉴定，方法和步骤为：在PBS中 CCP5F-H以0.5微克/微升(ug/ml)的浓度100微升/孔(ul/well)包被于96孔ELISA板上(MaxiSorb plate,Nunc,Inc.)室温过夜。第二天，用1.5％BSA/PBST(牛血清白蛋白/磷酸盐/吐温-20缓冲液)封闭一小时，然后分别加上已经三倍系列稀释的羊抗CCP5F、CCP5G、CCP5H和相应的羊的血清(在免疫羊之前收集的，作为本底对照)，室温反应1小时；用PBST洗涤三次后加上100ul/well经1∶4000稀释后的HRP偶联的兔抗羊抗体(美国Jackson ImmunoLab公司)，室温哺育反应1小时，再用PBST洗涤四次后，加HRP的底物TMB和过氧化氢溶液进行显色；最后在Dynatech MR5000酶标阅读仪上取λ＝450nm波长阅读OD值和λ＝590nm波长参比OD值(减少本底的读数)而取得相对的抗体滴度效价。从图5的结果上，CCP5G抗体效价达1:6000±，效价最高，CCP5F抗体和CCP5H抗体效价分别为1:2000±和1:1500±。 

从图5中可以看到，在免疫羊血清本底对照组中，CCP5F-H有一些本底，原因可能此类动物羊的聚球蛋白与BSA有一些非特异性的吸附，或者在兔抗羊抗体中有非特异性反应，但是这些本底并不是太高，不会影响到测定的OD读数。 

实施例3 CCP5F-H多肽的BSA偶联蛋白与临床上应用CCP多肽蛋白的诊断价值和意义比较 

选择临床常用的CCP方法作为参考方法(试剂盒购自德国欧蒙医学实验诊断股份公司)对21例类风湿关节炎(RA)患者血清测定，将其低、中和高三种结果各7例RA血清选出，同时随机选取20例正常人血清进行混合。将混合正常人血清分别稀释此21例高、中和低CCP值的RA患者血清(稀释至理论正常参考范围)。然后用参考方法和CCP5F～H的ELISA分别进行检测，所得结果如表1所示。 

表1 在检测临界值区域CCP抗体与CCP5F～H比较 

表1可见，当将CCP5F、CCP5G和CCP5E蛋白多肽和CCP多肽互相比较，CCP5G为抗原的ELISA检测CCP抗体的值相对最高、CCP5F次之，CCP5H相对较低。 

实施例4 CCP5G多肽的KLH偶联蛋白的制备、鉴定与保存 

采用锁孔血蓝蛋白(KLH，约56kDa分子量大小)制备了CCP5G多肽的KLH偶联蛋白。 

将实施例1中的BSA偶联蛋白和本实施例的KLH偶联蛋白分别以0.5ug/mL，100ul/well包被于96孔ELISA反应板上并室温过夜，反应板封闭后，将已经1:100稀释的混合正常人血清(用德国欧蒙医学实验诊断股份公司的抗CCP抗体ELISA检测试剂盒而检测到CCP约为1个单位)和1:100稀释的已用欧蒙试剂盒检测过的RA患者血清(CCP中度阳性)100ul/well加在已包被和封闭好的ELISA反应板上，室温1小时后洗涤三次，再加100ul/well以1:30,000稀释HRP偶联的羊抗人IgG，室温1小时后再洗涤四次，加HRP底物溶液(TMB和过氧化氢)并显色10分钟，读取OD 450/590nm值，表2显示了BSA和KLH分别偶联的CCP5G与正常人和RA患者血清反应的比较。 

注：RA患者血清的阳性对照是以已临床测定的RF、IgM-RF、CRP和CCP等的中间值域(OD值)的患者血清(各3例)混合而成。CCP5G RU/ml是由取各3份混合阳性血清OD值及各3份混合正常人血清OD值除得平均值为相应的抗CCP5单位(RU/ml)(重复三次)。 

从表3的结果分析看，KLH偶联的CCP5G也能够用于RA的检测，但BSA偶联的CCP5G更优。 

实施例5间接ELISA法测定样本内抗CCP5G抗体以及与现有方法的比较 

5.1抗CCP5G单位的定义 

本实施例采用间接ELISA法，临床上的血清标本用生理盐水作1∶100稀释后为样本进行检测。酶标的封闭液采用1.5％BSA/1.0％牛血清/PBST缓冲液(pH7.4的磷酸盐、Tween-20和牛血清白蛋白缓冲液)。 

CCP5G蛋白多肽诊断单位的定值，采用10份CCP5G阳性血清和10份混合正常人血清(其CCP值在1.0RU/ml，即欧蒙公司相对单位)进行间接ELISA检测并重复3次，然后分别计算其混合阳性血清和混合正常人阴性血清的平均吸光度值。其中，定义该混合正常人阴性血清的抗CCP5G自身抗体水平吸光度值(A₀)的为一个抗CCP5G单位。再将混合阳性血清平均吸光度值(A₁)除以混合正常阴性血清的平均吸光度值，其商(A₁/A₀)即为混合阳性血清抗CCP5G单位(U)。以混合阳性血清用含10％牛血清/PBS中作系列稀释，在测定后得到相应的吸光度值，然后再和以混合正常人阴性血清的抗CCP5G检测平均吸光度值(A₀)相除获得的商值，分别作为各阳性对照品的抗CCP5G单位(RU/ml)。在本发明中，以参考方法测得的1RU/ml的血清样本，再用CCP5G ELISA测定，得到的吸光度值就当作是CCP5G试剂测得的1RU/ml，待测样本检测获得 的吸光度值除以此吸光度值，获得的倍数就是该样本中CCP5G抗体的RU/ml，该方法获得的称为相关单位。 

5.2本发明检测方法与临床四种方法对RA患者的确诊率对照 

用单盲法将配制的试剂、材料和操作方法检测90例已在临床确诊为RA(源自上海市东方医院、上海市光华风湿病综合医院)的患者新鲜血清检测抗CCP5G自身抗体，还同时对CCP、CRP、IgG-RF、IgM-RF作比较检测。 

CCP的检测是用进口试剂盒(德国欧蒙医学实验诊断股份公司的抗CCP抗体ELISA检测试剂盒)和其相应的标准(即大于25.0RU/ml为阳性)，CRP和RF-IgG、RF-IgM为西门子特定蛋白仪及其免疫比浊法配套试剂，CRP>8mg/L为“+”阳性、RF-IgG测定结果大于16g/L、IgM-RF的测定结果大于2.3g/L为异常升高。 

用四种对照方法的临床90例患者结果都一一与CCP5G间接ELISA结果作比较，并采用2x2卡方(X²)检验方法进行统计学处理。在90例类风湿关节炎(RA)患者中，首先进行以男女性别分组处理，其结果发现所有5项指标之间都没有男女性别的差异(未示出)。 

5.2.1以年龄方面分组(如表3所示)，男女平均年龄都小于40岁的有16个样本，其RA的发病史在平均5年左右。通过统计结果分析，RA患者的CCP5G结果与CRP、RF-IgG、RF-IgM测定结果没有显著差异。然而，CCP5G的阳性率为68.8％(11/16)，而CCP只有37.5％(6/16)，两者之间结果经卡方检验的统计学分析显示，它们之间的差异有显著意义。 

结果说明，CCP5G自身抗体对40岁以下年龄组的检出率比CCP自身抗体要高得多。 

表3.CCP5G ELISA在诊断年轻RA患者中的诊断价值 

5.2.2为了说明检测CCP5G的自身抗体能作为RA早期诊断的一个首选指标，从90例RA患者中选出其发病史短于1年半的22例患者血清测定数据编成一组(如表4所示)。以如上相同的五种检出方法作比较，其中抗CCP5G自身抗体的检出率不仅最高，而且它与CCP结果比较有着非常显著的差异(P<0.01)。 

由此可见，抗CCP5G自身抗体的检测是对RA患者发病早期诊断的好方法。 

表4.CCP5G ELISA在诊断早期RA中的价值 

5.2.3将所有90例RA患者以男女性别分开，以患者血清的五项检测指标(包括CCP5G、CCP、CRP、RF-IgG、RF-IgM)结果陈列于表5中。所有90例RA患者的平均年龄在53.8岁左右，平均发病史在5.8年左右，他们的性别与发病和检测结果没有差异。 

通过对包括CCP5G、CCP、CRP、IgG-RF、IgM-RF五项检测指标的结果进行两两X²卡方检验和统计学处理。除了CRP外，抗CCP5G自身抗体的检测结果都与CCP、IgG-RF和IgM-RF的结果有着非常显著的差异。 

即抗CCP5G自身抗体与其它三者CCP、IgG-RF和IgM-RF结果比较，其检出率高，灵敏性强，并且它的阳性高低与临床症状和诊断符合率高。 

表5.CCP5G ELISA在诊断RA中的价值 

进一步分析90例患者检测结果，可以看到虽然CRP与抗CCP5G自身抗体的结果没有明显的差异，但是这90例标本是以临床上诊断RA阳性患者的血清标本，而CRP是一个急性时相反应蛋白，其与疾病的活动度有一定关系，但作为诊断特异性公认为不高。 

综上所述，抗CCP5G自身抗体检测的特异性和检出率总体上，比抗CCP自身抗体检测要好和高许多。比如在这组90 RA患者中检测指标与临床诊断符合情况为，CCP5G有19例漏检或为阴性(21.1％)，而CCP却有32例漏检或为阴性(35.4％)，其比较有显著差异(P<0.05)。 

如果将漏检或阴性的RA病例作CCP5G和CCP两两比较，在CCP5G的19例阴性中，CCP只有4例为阳性占21％；而在CCP 32例阴性中，CCP5G却有17例为阳性占53.1％；在CCP 58例阳性，CCP5G仅6例阴性占10.3％。虽然其漏检或为阴性结果的真正原因和二边的误差性都有待于探讨和研究，但是从这些结果的比较上看，CCP5G比CCP检出阳性率显著高，其意义是非常明显的。 

抗CCP5G自身抗体的检测不仅敏感性能达到CRP那样高，其特异性也非常好。在这五个项目检测中，都以100例正常人血清的平均值为阴性的低值(基础值)。 

讨论： 

本发明人认为，当精氨酸的衍生物瓜氨酸在蛋白多肽中形成后，其多肽中的精氨酸和瓜氨酸在结构上，精氨酸与瓜氨酸或瓜氨酸与瓜氨酸会形成环化结构(如图3所示)，并且这样的变性变构型环瓜氨酸多肽结构更容易被人体的免疫机制所识别成为自身抗原，这可能就是潜在的类风湿关节炎(RA)或自身免疫疾病的重要发病机制之一，也是本发明的理论基础。 

CCP5G在结构上有着一个或一个以上环状结构。虽然这个环多肽是人工合成的，但是模拟了RA患者血清中自身抗原的一些蛋白质多肽在代谢中的变性变构的性质。 

本发明CCP5G变性变构型环瓜氨酸多肽是根据多肽结构和RA的自身抗原结构为依据，独立创新设计的一种新型、具有临床诊断意义，特别是对RA病可作早期诊断价值的人工合成自身抗原。为此建立了一个特异强、稳定性好、敏感性高的间接ELISA CCP5G诊断新方法。用单盲法对临床上90例类RA患者检出结果显示，它不仅可作RA的诊断和早期诊断指标，而且比目前已临床上开展的CCP、CRP、IgG-RF和IgM-RF，特别是比CCP检出方法要优越得许多，是今后将会发展成一个在中国乃至在世界对RA诊断方面可靠、可依赖早期诊断和首选的方法。检出这一CCP5G自身抗体也是临床上对RA进行早期治疗或预防的一个非常有价值参考的指标，同时也可作为RA病程发展指标。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.一种式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐：

[Xaa0]-CEGRS(Cit)RSTSPEER(Cit)GPG-[Xaa1]

式(I)；

其中，Xaa0和Xaa1分别为无，或1-5个氨基酸构成的肽段。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽包括线性肽或非线性肽。

3.一种偶联蛋白，其特征在于，所述的偶联蛋白具有以下结构：

Y-X

其中，

Y为载体蛋白；

X为式I所示的多肽；

“-”表示连接X和Y的肽键或肽接头。

4.如权利要求3所述的偶联蛋白，其特征在于，所述的载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)，或血蓝蛋白(KLH)。

5.一种类风湿关节炎诊断抗原组合，其特征在于，所述的抗原组合包括权利要求1所述的多肽或权利要求3所述的偶联蛋白，和选自以下一种或两种的多肽：

CGRPGTAS(Cit)PSTSTRYVT       式II，

CEESA(Cit)HLL(Cit)EYQDINVK   式III。

6.权利要求1所述多肽、权利要求3所述偶联蛋白，或权利要求5所述的抗原组合的用途，其特征在于，用于制备检测样本中类风湿关节炎自身抗体、和/或制备诊断类风湿关节炎的试剂或试剂盒。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的检测为早期检测。

8.一种检测板，其特征在于，所述的检测板包括基片(支撑板)、测试条，所述的测试条固定有权利要求1所述的多肽或其衍生多肽、权利要求3所述的偶联蛋白，或权利要求5所述的抗原组合。

9.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器，和位于容器内的(i)权利要求7所述的检测板；或(ii)权利要求1所述的多肽或其衍生多肽、权利要求3所述的偶联蛋白，或权利要求5所述的抗原组合；和(iii)使用说明书。

10.一种体外非诊断性的检测样本中是否存在类风湿关节炎自身抗体的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将样本与权利要求1所述多肽、或权利要求3所述偶联蛋白，或权利要求5所述的抗原组合接触；

(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中，形成复合物就说明样本中存在类风湿关节炎自身抗体。