JP3837374B6 - 関節炎診断剤および関節炎診断キット - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、関節炎の診断に利用することのできる関節炎診断剤および関節炎診断キットに関する。
【0002】
【従来の技術】
関節炎は、一つまたは複数の関節の炎症であり、加齢と共に生じてくる可能性の高い疾患である。この関節炎には様々な種類があり、例えば変形性関節炎やリウマチ性関節炎等が知られている。変形性関節炎は老化による関節の変形であり、リウマチは関節の炎症を伴うことが知られている。しかしながら、これらは症状が似ているため、判別が難しいことが知られている。
【0003】
従来、関節炎の診断にはリウマチ因子(抗ヒト免疫グロブリン抗体)の測定、抗核抗体の測定、関節液検査、関節X線検査等を行い、変形関節炎やリウマチ等の診断が行われている。また、赤沈(血沈)やC反応性タンパク質を測定することにより、関節リウマチの重篤度や症状の変化を知ることができる。しかしながら、上記検査では変形性関節炎については重篤度等の変化を知ることができない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、関節炎の新規マーカーを利用した、変形性関節炎やリウマチ等の関節炎の診断を行うことのできる関節炎診断剤および関節炎診断キットの提供を課題とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、関節炎と関連を有するマーカーについて、鋭意検索を行った結果、癌間質などの組織再構築部位に特異的に発現するテネイシンCの高分子スプライシングバリアントと変形性関節炎と密接な関係があることを見出した。そしてこのテネイシンC高分子スプライシングバリアント量を、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を利用した診断剤や診断キットで測定することにより、関節炎の診断等を行えることを見出し、本発明を完成した。
【0006】
すなわち本発明は、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を含有することを特徴とする関節炎診断剤を提供するものである。
【0007】
また本発明は、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識するする第一の抗体を含む第一の試薬と、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりNアミノ末端側を認識する第二の抗体を含む第二の試薬とを含有することを特徴とする関節炎診断キットを提供するものである。
【0008】
更に本発明は、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量を指標として変形関節炎と関節リウマチとを鑑別することを特徴とする関節炎診断方法を提供するものである。
【0009】
また更に本発明は、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量を指標として変形性関節炎の重篤度を判定することを特徴とする関節炎診断方法を提供するものである。
【0010】
【発明の実施の形態】
本発明の関節炎診断剤(以下、「本発明診断剤」という)は、関節炎の新規マーカーとしてテネイシンC高分子スプライシングバリアントを利用するものである。
【0011】
このテネイシンC高分子スプライシングバリアントは、テネイシンC(Tenascin−C)中にあるフィブロネクチンIII様ドメインがスプライシングされた結果生じるバリアントである。すなわち、テネイシンCは、細胞外マトリックス糖タンパク質の1種であり、分子量約25万以上のポリペプチドがN末端付近で3分子でコイル上に合わさり、更に、2つのジスルフィド結合によって6量体を形成している。各ポリペプチド鎖にはN末端側から、TAドメイン、上皮増殖因子様ドメイン、フィブロネクチンIII様ドメイン、フィブリノーゲン様ドメインが含まれている(Jones F.S.et al.,(2000)Dyv Dyn 208:235-259)。
【0012】
このうち、フィブロネクチンIII様ドメインは、基本的な8個の配列(1−8)が反復しており、その5番目と6番目との間に、9個のスプライシングされる反復配列(A1−A4、B、AD2、AD1、C、D)が選択的スプライシング部位として存在する。テネイシンC高分子スプライシングバリアントは、この反復配列が7個(A1、A2、A3、A4、B、C、D)挿入されるもの、7個がさまざまな組み合わせで挿入されるもの、または全く挿入されないものが大部分であろうとされている。このうち、癌などの病変組織では7個のドメインが入ったものが多く発現しており、後半の3つの反復(B、C、D)が癌間質に比較的特異的であると考えられる。他方、選択的スプライシング部位は、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)で切断されやすい部位であることが知られており、この部位のエピトープを測定に使用することにより、分子構造の保たれたテネイシンC高分子スプライシングバリアントのみを測定することができると考えられる。
【0013】
本発明診断剤で用いる、上記した分子構造の保たれたテネイシンC高分子スプライシングバリアントを測定するための抗体は、上記のいずれかのテネイシンC高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等を抗原として使用し、抗体産生の常法に従って製造されるものであり、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを測定可能なものであれば特に制限されない。
【0014】
上記抗体の製造において、抗原として用いられるテネイシンC高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等は、例えば、テネイシンCを産生している組織もしくは培養細胞から抽出したもの、前記培養細胞の培養液中のテネイシンCを濃縮・精製したもの、あるいはこれらのテネイシンCをプロテアーゼ等の酵素もしくは化学的に断片化したものや、ヒトやマウスのテネイシンCのアミノ酸配列や塩基配列(Accession No.:X56160、D90343)等から、認識させたい特定の部位をコードするcDNAに一致するポリヌクレオチドを作製し、これを常法によりベクターに組み込み、このベクターを用いて大腸菌等の宿主微生物、もしくは培養細胞を形質転換し、この大腸菌等の宿主微生物・培養細胞を培養して産生させたリコンビナントタンパク質や上記配列から特定の部位のアミノ酸配列に一致したポリペプチドを合成した後ニッケルカラム等で精製したもの等が挙げられる。
【0015】
上記したテネイシンC高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等を抗原として常法により、ウサギ、マウス等の動物に免役することができる。このように免疫した動物から脾細胞を調製し、脾細胞とマウスミエローマ細胞とを融合し、限界希釈法により目的とするクローンをクローニングすることができる。この抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、例えばポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で行うことができる。
【0016】
なお、上記の動物の免疫において、リコンビナントタンパク質を抗原として用いる場合には、エピトープのはっきりとしたモノクローナル抗体を作製することが可能である。また、動物に免疫を行う際に、内在性のテネイシンCの影響を除くために、テネイシンC遺伝子欠損マウスを使用することが好ましい。そのような遺伝子欠損マウスを用いることにより、種交差性の高いモノクローナル抗体を得ることが期待できる。更に、この際に融合細胞の選択は公知のHAT(ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン)選択法を用いて行うことが好ましく、ミエローマ細胞としては、融合した細胞を選択する方法が確立されている、HGPRT(Hypoxanthin-guanin phosphoribosyl transferase)欠損株を用いることが好ましい。このHGPRT欠損株のミエローマ細胞は、代謝系の欠損のためにアミノプテリン非存在下では生存できないが、融合したハイブリドーマ細胞では、脾細胞よりHGPRTが供給されるために、HAT培地中で生存することができ、その結果非融合細胞と容易に分離することができる。更に、限界希釈法によりHAT培地中で増殖するものの抗体を産生しないクローンを除くことにより、クローニングを確立することができる。
【0017】
以上によって得られるハイブリドーマ細胞の産生する抗体が、前記のように作製されたテネイシンC高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等とウエスタンブロット法等を用いることにより、目的とする適当な部位を認識しているかどうかを確認することが可能である。もしくは、プロテアーゼを用い酵素的にテネイシンCの断片を作製し、反応するポリペプチドのアミノ酸解析を行い、認識する部位を決定することなども行われる。
【0018】
具体的に本発明診断剤で用いる、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを測定することのできる抗体の好ましい例としては、次のような抗体を挙げることができる。
(a)テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体
(b)テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりNアミノ末端側を認識する抗体
【0019】
具体的に抗体(a)として、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体を作製する場合には、例えば、前記選択的スプライシング部位内のいずれかのドメイン、好ましくは選択的スプライシング部位内のBCDドメインをコードするcDNAのポリヌクレオチドをPCR法により作製し、これをpQEベクター等のベクターに組み込む。次いでこのベクターを大腸菌等の宿主微生物に導入し、この宿主微生物をLB培地で培養してリコンビナントタンパク質を産生させる。次いで、このリコンビナントタンパク質を上記した方法により動物に免役し、この動物から得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞を融合させハイブリドーマ細胞を作製する。このハイブリドーマ細胞の産生する抗体の認識部位を、上記免疫に用いたリコンビナントタンパク質を用いてクローニングする。最後に、このハイブリドーマ細胞を常法により培養することによって抗体(a)が得られる。
【0020】
また、具体的に抗体(b)として、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりNアミノ末端側を認識する抗体を作製する場合には、例えば、ヒト神経膠芽細胞腫培養細胞U−251MGの培養液からゲルろ過カラムとイオン交換カラムを用いて精製されたヒトテネイシンCを抗原として上記した方法により動物に免役し、この動物から得られた脾細胞と、マウスミエローマ細胞を融合させハイブリドーマ細胞を作製する。次いで、このハイブリドーマ細胞のうち、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりNアミノ末端側、すなわち、TAドメイン、上皮増殖因子様ドメイン等、好ましくは上皮増殖因子様ドメインを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、例えば前記ドメインのリコンビナントタンパク質やその断片等を用いてクローニングする。最後に、このハイブリドーマ細胞を培養することによって抗体(b)が得られる。
【0021】
以上のようにして得られるテネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体(a)(クローン名:19C4MS)とテネイシンCの選択的スプライシング部位のN末端側を認識する抗体(クローン名:4F10TT)を産生するハイブリドーマ細胞をそれぞれFERM P−19064およびFERM P−19063として、平成14年10月10日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(郵便番号305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に寄託した。
【0022】
具体的に寄託したハイブリドーマ細胞19C4MSは、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位のBCDドメインを認識する抗体を産生するものであり、ハイブリドーマ細胞4F10TTはテネイシンCの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体を産生するものである。
【0023】
上記の様にして得られるハイブリドーマ細胞を公知の方法により培養して、精製することにより、本発明診断剤で用いられるモノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマ細胞の培養は、培地中で培養することにより行うことが好ましい。また、マウス腹腔内にハイブリドーマ細胞を注射し、腹水からモノクローナル抗体を採取することもできる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法、硫安塩析法等の常法により精製することができる。
【0024】
また、これらの抗体は必要により標識することができる。この標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ(以下「HRP」と言う)、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、32P、125I等の放射性物質、化学発光物質などが挙げられる。
【0025】
かくして得られる抗体(a)および抗体(b)を含有する本発明診断剤は、下記の免疫学的測定方法に用いることができる。
【0026】
具体的な免疫学的測定方法としては、放射性同位元素免疫測定法(RIA法)、ELISA法(Engvall, E, Methods in Enzymol, 70, 419-439(1980))、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー(Ouchterlony)等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法(「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社R&Dプランニング発行、第30頁−第53頁、昭和57年3月5日)が挙げられる。そして、これらの方法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点からはELISA法が好ましい。
【0027】
より具体的な、テネイシンC高分子スプライシングバリアントの測定について、ELISA法の一つであるサンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。すなわち、まず、工程(A)として、本発明の抗体(a)を担体に固相化し、次いで、工程(B)として、抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。更に、工程(C)として、これに各種濃度のテネイシンC高分子スプライシングバリアントを含む検体を加え、テネイシンC高分子スプライシングバリアント−抗体複合体を生成させた後、工程(D)として、標識した抗体(b)を加え、固相化抗原−抗体複合体と結合させ、最後に工程(E)として、標識量を測定することにより、予め作成した検量線から検体中のテネイシンC高分子スプライシングバリアントの量を決定することができる。
【0028】
まず、工程(A)において、抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなく、免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の96穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば10mMのPBSを挙げることができる。緩衝液中の抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常0.01〜100μg/ml程度、好ましくは0.1〜20μg/mlが適している。また、担体として96ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、300μl/ウェル以下で20〜150μl/ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常4℃程度で一晩のインキュベーションが適している。
【0029】
また、工程(B)のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する検体中のテネイシンC高分子スプライシングバリアントが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、BSAやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース(Block−Ace:大日本製薬製(コードNo.UK−25B))等の市販のブロッキング剤を使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適量加え、約4℃で、一晩のインキュベーションをした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。
【0030】
次いで工程(C)において、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを含む検体を固相化抗体と接触させ、固相化抗体でテネイシンC高分子スプライシングバリアントを捕捉し、固相化抗体−テネイシンC高分子スプライシングバリアント複合体を生成させる。反応は限定されるわけではないが、37℃程度で約1時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、10mMのPBS(pH7.2)および0.05%(v/v)のTween20の組成のものが好ましい。
【0031】
更に工程(D)において、固相化抗体に捕捉されたテネイシンC高分子スプライシングバリアントの別のエピトープを認識する、標識抗体を加え、固相化抗体−テネイシンC高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、前記したものが使用される。この工程(D)において使用される標識抗体の量は、担体に結合した固相化抗体に対して約5000〜10000倍、好ましくは最終吸光度が1.0〜1.5となるように希釈した標識抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いることができ、反応は限定されるわけではないが、約4℃で約30分間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以上の反応により、担体に抗体−テネイシンC高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体を結合することができる。
【0032】
最後に工程(E)において、固相化抗体−テネイシンC高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からテネイシンC高分子スプライシングバリアントの量を算出することができる。
【0033】
標識抗体の標識物として、酵素であるペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と3,3',5,5'−テトラメチルベンジン(以下「TMB」という)を含む発色基質溶液を使用することができる。発色反応は、限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約25℃で約20分間反応させた後、2Nの硫酸を加えて酵素反応を停止させことにより行うことができる。TMBを使用する場合、発色は450nmの吸光度により測定する。一方、標識物として、酵素であるアルカリホスファターゼを使用する場合には、p−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、2NのNaOHを加えて酵素反応を止め、415nmでの吸光度を測定する方法が適している。なお、既知の濃度のテネイシンC高分子スプライシングバリアントを添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用いて、検体中のテネイシンC高分子スプライシングバリアントの濃度を算出できる。
【0034】
本発明診断剤を用いて上記のような測定を行うためには、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体(抗体(a))を含む第一の試薬と、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりNアミノ末端側を認識する抗体(抗体(b))を含む第二の試薬とを含有させた関節炎診断キット(以下、「本発明キット」という)を利用すればよい。
【0035】
より好ましい本発明キットの例としては、本発明の抗体(a)を担体上に固相化し、本発明の抗体(b)を上記した標識物質で標識化したキットを利用することが好ましい。
【0036】
上記のように作製された本発明キットは、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを定量できるものである。これを用いて関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアントを定量すれば、関節炎が変形性関節炎であるか、リウマチ性関節炎であるかの診断に使用することができる。
【0037】
本発明キットを用いて関節炎の診断を行うには、まず、本発明キットにより、被験者から採取した関節腔液を試料として用い、この中のテネイシンC高分子スプライシングバリアントを定量する。そして、このテネイシンC高分子スプライシングバリアント量により、変形性関節炎と関節リウマチとを鑑別する。関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量の高低で関節リウマチと変形性関節炎が鑑別でき、また特に変形性関節炎については、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量の測定で、レントゲン分類の重症度と相関が見られることにより判定することができる。
【0038】
また、上記のようにして測定されたテネイシンC高分子スプライシングバリアント量により変形性関節炎の重篤度を判定することができる。具体的には、変形性関節炎の関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量の増量により、骨破壊の重症度が判定できる。
【0039】
【実施例】
以下に実施例により本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【0040】
実 施 例 1
テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体の作製:
(1)免疫原の調製
テネイシンCのアミノ酸配列や塩基配列(Accession No.:X56160)から、フィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位のBCDドメイン(以下、単に「BCDドメイン」という)をコードするcDNAであるポリヌクレオチド(配列番号1)を常法により作製し、これをpQE−31ベクター(キアゲン製)に組換え、大腸菌のコンピテントセル(JM−109)に導入した。この大腸菌を培養し、イソプロピル−β−D(−)チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加した後一晩培養し、pQE−31ベクターに組込んだcDNAのリコンビナントタンパク質(配列番号2)を生成させた。大腸菌の細胞膜を破壊することによりリコンビナントタンパク質を抽出した後、His trapカラム(Pharmacia製)で精製した。
【0041】
(2)モノクローナル抗体の作製
テネイシンCの遺伝子欠失マウスは三重大学医学部付属動物実験施設で継体飼育されている、BALB/Cに戻し交配されたものを用いた。上記(1)で作製したBCD部分のリコンビナントタンパク質の100μgとコンプリートアジュバントとを等量混合してエマルジョンを作製し、これをマウスに2週間の間隔で2回免疫した。更に、細胞融合3日前にマウスの尾静脈内に100μgのリコンビナントタンパク質を注射した。免疫したマウスから脾臓を摘出し、これから脾細胞懸濁液を調整し、脾細胞とマウスミエローマ細胞(Sp2/0)を5:1で混合し、ポリエチレングリコール(PEG)溶液中で細胞融合を行い、ハイブリドーマ細胞を得た。
【0042】
その後、ハイブリドーマ細胞を含むPEG溶液からPEGを除去し、残ったハイブリドーマ細胞をBriclone(Bio Research製)5%と20%FCSを添加したIMDMに再浮遊し、96穴マイクロプレートに1×105個/穴の濃度でまきこみ、CO2濃度7%、37℃で培養を行った。4日後HAT培地を添加し、7〜10日後に精製ヒトテネイシンCを抗原としてプレートに吸着させ、培養液を反応させ、さらに希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGを反応させることにより、抗体産生を確認した。クローンはHT培地を用いてさらに選択培養し、限界希釈法によってクローニングを2回繰り返した。
【0043】
(3)抗体の精製
ハイブリドーマ細胞を無血清培地のGIT培地(和光純薬)で細胞の80%が死滅するまで抗体を産生させた。遠心(1,000rpm、15min)により細胞を取り除いた後、硫酸アンモニウム50%飽和状態にして4℃で一晩静置し、沈殿を遠心(1,000rpm、30min)して回収した。この沈殿を2倍に希釈したbinding buffer(Protein AMAPS IIkit製)に溶解させた後、Protein Aカラム(Pharmacia−Amersham製)にIgGを吸着させた。その後、PBS透析を一晩行って抗体を精製した。
【0044】
実 施 例 2
テネイシンCの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体の作製:
(1)免疫原の調製
精製ヒトテネイシンCは、オークヒル(Aukhil I.et al.(1990) Matrix 10:98-111)の方法に従い、ヒト神経膠細胞株U251の細胞株から50%硫酸アンモニウム飽和による塩析とSephacryl S500カラム、モノQカラム(Pharmacia Biotech製)を用いて精製した。
【0045】
(2)モノクローナル抗体の作製および精製
テネイシンCの遺伝子欠失マウスは三重大学医学部付属動物実験施設で継体飼育されている、BALB/Cに戻し交配されたものを用いた。上記(1)で精製した精製ヒトテネイシンCをマウスに免疫し、実施例1と同様の方法で、ハイブリドーマ細胞を得た。実施例1と同様の方法で、クローンのスクリーニングを行い、陽性クローンを培養し、培養上清から得られる抗体を精製した。
【0046】
実 施 例 3
ウエスタンブロット法による抗体の認識部位の解析:
実施例1および実施例2で作製した抗体の認識部位をウエスタンブロット法により解析した。
【0047】
(1)テネイシンCの上皮増殖因子様ドメインのリコンビナントタンパク質の作製
マウステネイシンC(Accession No.:D90343)の上皮増殖因子様ドメインのcDNA配列(配列番号3)から、上皮増殖因子様ドメインの両端にプライマーを設計し、マウステネイシンCのcDNAからPCRにより、遺伝子を増幅し、pSecベクターに同部の遺伝子を組み込んだ。これを用いて、CHO−K1細胞を形質転換し、テネイシンCの上皮増殖因子ドメインのリコンビナントタンパク質(配列番号4)を発現させた。培養上清に分泌されたリコンビナントタンパク質をHis trapカラム(Pharmacia製)で精製した。
【0048】
(2)ウエスタンブロット法による抗体の認識部位の解析
ポリアクリルアミド ゲル エレクトロフォレイシス(Polyacrylamide Gel Electrophoresis) MULTIGEL2/15(第一化学薬品製)上で、レムリ(Laemmli)の方法を用いて電気泳動(SDS−PAGE法)を行った。電気泳動されたタンパク質は、Immobilon Transfer Membranes(MILLIPORE製)へ電気的に転写した。メンブレンは0.5%スキムミルク添加50mM トリス−緩衝生理食塩水(TBS)でブロッキングし、0.1%スキムミルク添加TBSで1,000倍に希釈した実施例1および実施例2で作製したモノクローナル抗体と一晩反応させ、0.1%スキムミルク溶液で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG(H+L−chain:Biorad製)で500倍に希釈して2次抗体として反応させ、洗浄後DAB/H2O2溶液で発色させた。
【0049】
ウエスタンブロットの結果を図1に示す。実施例2で作製したモノクローナル抗体(クローン名:4F10TT)は幅広いバンドを認識し、特に、選択的スプライシング部位の挿入がないテネイシンCと考えられる210kDa付近(図1のL)および7つのフィブロネクチンIII様の反復が挿入されたバリアントであると考えられる300kDa付近(図1のH)に濃いバンドが見られた。この結果より、実施例2で作製したモノクローナル抗体は、ヒトテネイシンCを認識するとともに、上皮増殖因子様ドメインと反応し、同ドメインを認識することを確認した。
【0050】
一方、実施例1で作製したモノクローナル抗体(クローン名:19C4MS)は300kDa付近に濃いバンドがあるものの、210kDa付近のバンドは見られなかった。従って、このモノクローナル抗体は低分子のバリアントを認識せず高分子量のバンドのみを認識すると推測されたため、実施例1で作製したBCDドメインのリコンビナントタンパク質を用いて同様にウエスタンブロットを行った。その結果を図2に示す。図2において、BCDドメインのリコンビナントタンパク質を示す37kDa付近に濃いバンドが認められた。従って、実施例1で作製したモノクローナル抗体はBCDドメイン、すなわち、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内において正常ではスプライシングされる反復を含む、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを認識することを確認した。
【0051】
従って、実施例1で作製したモノクローナル抗体(19C4MS)と実施例2で作製したモノクローナル抗体(4F10TT)とを組合わせることにより、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを測定することができると判断された。
【0052】
実 施 例 4
サンドイッチELISA系の構築:
サンドイッチELISA法の構築は以下のように作製した。実施例1で作製したテネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識するモノクローナル抗体(19C4MS)の10μg/mlの濃度調整液を10μlずつ96wellELISA用プレートに加えた。4℃で一晩反応させた後、10%BSA/PBS/NaN3溶液にてブロッキングを行い、この状態をサンドイッチELISA用プレートとした。実施例2で作製したテネイシンCの選択的スプライシング部位のN末端側を認識する第二のモノクローナル抗体(4F10TT)とHRPとの結合抗体を標識抗体とした。これらのサンドイッチELISA用プレートと標識抗体の組合せでサンドイッチELISA系を作製した。標準テネイシンCは実施例2(1)で作製した精製ヒトテネイシンCを用い、既知のタンパク質量から得られる吸光度とタンパク質濃度の標準曲線をあらかじめ求め、実際のサンプル測定で得られる吸光度よりそのタンパク質量を測定した。
【0053】
実 施 例 5
ELISA法による変形性関節炎患者および関節リウマチ患者の関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量の測定:
テネイシンC高分子スプライシングバリアント量の測定は以下のように行った。サンドイッチELISA用プレートに被験者から採取した関節腔液サンプルを含む溶液を100μl加え、37℃で一時間反応させた。反応後、0.05%Tween20−PBSで4回洗浄、標識抗体を100μl加え、4℃で30分反応させた。反応後、0.05%Tween20−PBSで6回洗浄し、TMB(Tetramethyl benzidine)溶液を100μl加え、室温、遮光下30分放置した。1N硫酸で反応を止め、吸光度450nmで測定した。測定した吸光度は前項に示したように標準タンパク質曲線よりテネイシンC濃度を求めた。上記の方法により、リウマチ患者関節腔液(11例)、変形性関節症患者関節腔液(39例)について測定したテネイシンC高分子スプライシングバリアント量を表1に示す。
【0054】
【表1】
【0055】
表1より、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量は、変形関節炎(OA)と関節リウマチ(RA)ではRAに有意(p=0.01)な上昇が見られた。また、特にOAでは関節の破壊の程度を示す関節レントゲン分類で、III度とIV度の症例比較で、有意にIV度が高かった。この結果により、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量の高低でRAとOAが鑑別でき、また特にOAについてはレントゲン分類の重症度と相関が見られ、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量の測定により、骨破壊の程度が推測できる。
【0056】
【発明の効果】
本発明によれば、テネイシンC高分子スプライシングバリアントが関節炎のマーカーとして利用できることが明らかとなった。また、特に、変形性関節炎の重篤度とテネイシンC高分子スプライシングバリアント量との関係も明らかとなった。
【0057】
従って、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアントを測定することにより、関節炎の鑑別や変形関節炎の重篤度の判定が可能となる。
【0058】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】 実施例1および実施例2で作製したモノクローナル抗体のウエスタンブロットによる反応性を示す図面である(CBBはクマシーブリリアント青染色を示し、hTNCは精製ヒトテネイシンCを示し、rEGFはマウスのEGFリコンビナントタンパク質を示す)。
【図2】 実施例1で作製したモノクローナル抗体のウエスタンブロットによるエピトープ解析を示す図面である(6xHisは6xHistidin部位に対する抗体を示す)。
以 上
【発明の属する技術分野】
本発明は、関節炎の診断に利用することのできる関節炎診断剤および関節炎診断キットに関する。
【0002】
【従来の技術】
関節炎は、一つまたは複数の関節の炎症であり、加齢と共に生じてくる可能性の高い疾患である。この関節炎には様々な種類があり、例えば変形性関節炎やリウマチ性関節炎等が知られている。変形性関節炎は老化による関節の変形であり、リウマチは関節の炎症を伴うことが知られている。しかしながら、これらは症状が似ているため、判別が難しいことが知られている。
【0003】
従来、関節炎の診断にはリウマチ因子(抗ヒト免疫グロブリン抗体)の測定、抗核抗体の測定、関節液検査、関節X線検査等を行い、変形関節炎やリウマチ等の診断が行われている。また、赤沈(血沈)やC反応性タンパク質を測定することにより、関節リウマチの重篤度や症状の変化を知ることができる。しかしながら、上記検査では変形性関節炎については重篤度等の変化を知ることができない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、関節炎の新規マーカーを利用した、変形性関節炎やリウマチ等の関節炎の診断を行うことのできる関節炎診断剤および関節炎診断キットの提供を課題とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、関節炎と関連を有するマーカーについて、鋭意検索を行った結果、癌間質などの組織再構築部位に特異的に発現するテネイシンCの高分子スプライシングバリアントと変形性関節炎と密接な関係があることを見出した。そしてこのテネイシンC高分子スプライシングバリアント量を、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を利用した診断剤や診断キットで測定することにより、関節炎の診断等を行えることを見出し、本発明を完成した。
【0006】
すなわち本発明は、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を含有することを特徴とする関節炎診断剤を提供するものである。
【0007】
また本発明は、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識するする第一の抗体を含む第一の試薬と、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりNアミノ末端側を認識する第二の抗体を含む第二の試薬とを含有することを特徴とする関節炎診断キットを提供するものである。
【0008】
更に本発明は、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量を指標として変形関節炎と関節リウマチとを鑑別することを特徴とする関節炎診断方法を提供するものである。
【0009】
また更に本発明は、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量を指標として変形性関節炎の重篤度を判定することを特徴とする関節炎診断方法を提供するものである。
【0010】
【発明の実施の形態】
本発明の関節炎診断剤(以下、「本発明診断剤」という)は、関節炎の新規マーカーとしてテネイシンC高分子スプライシングバリアントを利用するものである。
【0011】
このテネイシンC高分子スプライシングバリアントは、テネイシンC(Tenascin−C)中にあるフィブロネクチンIII様ドメインがスプライシングされた結果生じるバリアントである。すなわち、テネイシンCは、細胞外マトリックス糖タンパク質の1種であり、分子量約25万以上のポリペプチドがN末端付近で3分子でコイル上に合わさり、更に、2つのジスルフィド結合によって6量体を形成している。各ポリペプチド鎖にはN末端側から、TAドメイン、上皮増殖因子様ドメイン、フィブロネクチンIII様ドメイン、フィブリノーゲン様ドメインが含まれている(Jones F.S.et al.,(2000)Dyv Dyn 208:235-259)。
【0012】
このうち、フィブロネクチンIII様ドメインは、基本的な8個の配列(1−8)が反復しており、その5番目と6番目との間に、9個のスプライシングされる反復配列(A1−A4、B、AD2、AD1、C、D)が選択的スプライシング部位として存在する。テネイシンC高分子スプライシングバリアントは、この反復配列が7個(A1、A2、A3、A4、B、C、D)挿入されるもの、7個がさまざまな組み合わせで挿入されるもの、または全く挿入されないものが大部分であろうとされている。このうち、癌などの病変組織では7個のドメインが入ったものが多く発現しており、後半の3つの反復(B、C、D)が癌間質に比較的特異的であると考えられる。他方、選択的スプライシング部位は、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)で切断されやすい部位であることが知られており、この部位のエピトープを測定に使用することにより、分子構造の保たれたテネイシンC高分子スプライシングバリアントのみを測定することができると考えられる。
【0013】
本発明診断剤で用いる、上記した分子構造の保たれたテネイシンC高分子スプライシングバリアントを測定するための抗体は、上記のいずれかのテネイシンC高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等を抗原として使用し、抗体産生の常法に従って製造されるものであり、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを測定可能なものであれば特に制限されない。
【0014】
上記抗体の製造において、抗原として用いられるテネイシンC高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等は、例えば、テネイシンCを産生している組織もしくは培養細胞から抽出したもの、前記培養細胞の培養液中のテネイシンCを濃縮・精製したもの、あるいはこれらのテネイシンCをプロテアーゼ等の酵素もしくは化学的に断片化したものや、ヒトやマウスのテネイシンCのアミノ酸配列や塩基配列(Accession No.:X56160、D90343)等から、認識させたい特定の部位をコードするcDNAに一致するポリヌクレオチドを作製し、これを常法によりベクターに組み込み、このベクターを用いて大腸菌等の宿主微生物、もしくは培養細胞を形質転換し、この大腸菌等の宿主微生物・培養細胞を培養して産生させたリコンビナントタンパク質や上記配列から特定の部位のアミノ酸配列に一致したポリペプチドを合成した後ニッケルカラム等で精製したもの等が挙げられる。
【0015】
上記したテネイシンC高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等を抗原として常法により、ウサギ、マウス等の動物に免役することができる。このように免疫した動物から脾細胞を調製し、脾細胞とマウスミエローマ細胞とを融合し、限界希釈法により目的とするクローンをクローニングすることができる。この抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、例えばポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で行うことができる。
【0016】
なお、上記の動物の免疫において、リコンビナントタンパク質を抗原として用いる場合には、エピトープのはっきりとしたモノクローナル抗体を作製することが可能である。また、動物に免疫を行う際に、内在性のテネイシンCの影響を除くために、テネイシンC遺伝子欠損マウスを使用することが好ましい。そのような遺伝子欠損マウスを用いることにより、種交差性の高いモノクローナル抗体を得ることが期待できる。更に、この際に融合細胞の選択は公知のHAT(ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン)選択法を用いて行うことが好ましく、ミエローマ細胞としては、融合した細胞を選択する方法が確立されている、HGPRT(Hypoxanthin-guanin phosphoribosyl transferase)欠損株を用いることが好ましい。このHGPRT欠損株のミエローマ細胞は、代謝系の欠損のためにアミノプテリン非存在下では生存できないが、融合したハイブリドーマ細胞では、脾細胞よりHGPRTが供給されるために、HAT培地中で生存することができ、その結果非融合細胞と容易に分離することができる。更に、限界希釈法によりHAT培地中で増殖するものの抗体を産生しないクローンを除くことにより、クローニングを確立することができる。
【0017】
以上によって得られるハイブリドーマ細胞の産生する抗体が、前記のように作製されたテネイシンC高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等とウエスタンブロット法等を用いることにより、目的とする適当な部位を認識しているかどうかを確認することが可能である。もしくは、プロテアーゼを用い酵素的にテネイシンCの断片を作製し、反応するポリペプチドのアミノ酸解析を行い、認識する部位を決定することなども行われる。
【0018】
具体的に本発明診断剤で用いる、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを測定することのできる抗体の好ましい例としては、次のような抗体を挙げることができる。
(a)テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体
(b)テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりNアミノ末端側を認識する抗体
【0019】
具体的に抗体(a)として、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体を作製する場合には、例えば、前記選択的スプライシング部位内のいずれかのドメイン、好ましくは選択的スプライシング部位内のBCDドメインをコードするcDNAのポリヌクレオチドをPCR法により作製し、これをpQEベクター等のベクターに組み込む。次いでこのベクターを大腸菌等の宿主微生物に導入し、この宿主微生物をLB培地で培養してリコンビナントタンパク質を産生させる。次いで、このリコンビナントタンパク質を上記した方法により動物に免役し、この動物から得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞を融合させハイブリドーマ細胞を作製する。このハイブリドーマ細胞の産生する抗体の認識部位を、上記免疫に用いたリコンビナントタンパク質を用いてクローニングする。最後に、このハイブリドーマ細胞を常法により培養することによって抗体(a)が得られる。
【0020】
また、具体的に抗体(b)として、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりNアミノ末端側を認識する抗体を作製する場合には、例えば、ヒト神経膠芽細胞腫培養細胞U−251MGの培養液からゲルろ過カラムとイオン交換カラムを用いて精製されたヒトテネイシンCを抗原として上記した方法により動物に免役し、この動物から得られた脾細胞と、マウスミエローマ細胞を融合させハイブリドーマ細胞を作製する。次いで、このハイブリドーマ細胞のうち、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりNアミノ末端側、すなわち、TAドメイン、上皮増殖因子様ドメイン等、好ましくは上皮増殖因子様ドメインを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、例えば前記ドメインのリコンビナントタンパク質やその断片等を用いてクローニングする。最後に、このハイブリドーマ細胞を培養することによって抗体(b)が得られる。
【0021】
以上のようにして得られるテネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体(a)(クローン名:19C4MS)とテネイシンCの選択的スプライシング部位のN末端側を認識する抗体(クローン名:4F10TT)を産生するハイブリドーマ細胞をそれぞれFERM P−19064およびFERM P−19063として、平成14年10月10日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(郵便番号305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に寄託した。
【0022】
具体的に寄託したハイブリドーマ細胞19C4MSは、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位のBCDドメインを認識する抗体を産生するものであり、ハイブリドーマ細胞4F10TTはテネイシンCの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体を産生するものである。
【0023】
上記の様にして得られるハイブリドーマ細胞を公知の方法により培養して、精製することにより、本発明診断剤で用いられるモノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマ細胞の培養は、培地中で培養することにより行うことが好ましい。また、マウス腹腔内にハイブリドーマ細胞を注射し、腹水からモノクローナル抗体を採取することもできる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法、硫安塩析法等の常法により精製することができる。
【0024】
また、これらの抗体は必要により標識することができる。この標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ(以下「HRP」と言う)、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、32P、125I等の放射性物質、化学発光物質などが挙げられる。
【0025】
かくして得られる抗体(a)および抗体(b)を含有する本発明診断剤は、下記の免疫学的測定方法に用いることができる。
【0026】
具体的な免疫学的測定方法としては、放射性同位元素免疫測定法(RIA法)、ELISA法(Engvall, E, Methods in Enzymol, 70, 419-439(1980))、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー(Ouchterlony)等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法(「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社R&Dプランニング発行、第30頁−第53頁、昭和57年3月5日)が挙げられる。そして、これらの方法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点からはELISA法が好ましい。
【0027】
より具体的な、テネイシンC高分子スプライシングバリアントの測定について、ELISA法の一つであるサンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。すなわち、まず、工程(A)として、本発明の抗体(a)を担体に固相化し、次いで、工程(B)として、抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。更に、工程(C)として、これに各種濃度のテネイシンC高分子スプライシングバリアントを含む検体を加え、テネイシンC高分子スプライシングバリアント−抗体複合体を生成させた後、工程(D)として、標識した抗体(b)を加え、固相化抗原−抗体複合体と結合させ、最後に工程(E)として、標識量を測定することにより、予め作成した検量線から検体中のテネイシンC高分子スプライシングバリアントの量を決定することができる。
【0028】
まず、工程(A)において、抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなく、免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の96穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば10mMのPBSを挙げることができる。緩衝液中の抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常0.01〜100μg/ml程度、好ましくは0.1〜20μg/mlが適している。また、担体として96ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、300μl/ウェル以下で20〜150μl/ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常4℃程度で一晩のインキュベーションが適している。
【0029】
また、工程(B)のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する検体中のテネイシンC高分子スプライシングバリアントが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、BSAやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース(Block−Ace:大日本製薬製(コードNo.UK−25B))等の市販のブロッキング剤を使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適量加え、約4℃で、一晩のインキュベーションをした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。
【0030】
次いで工程(C)において、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを含む検体を固相化抗体と接触させ、固相化抗体でテネイシンC高分子スプライシングバリアントを捕捉し、固相化抗体−テネイシンC高分子スプライシングバリアント複合体を生成させる。反応は限定されるわけではないが、37℃程度で約1時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、10mMのPBS(pH7.2)および0.05%(v/v)のTween20の組成のものが好ましい。
【0031】
更に工程(D)において、固相化抗体に捕捉されたテネイシンC高分子スプライシングバリアントの別のエピトープを認識する、標識抗体を加え、固相化抗体−テネイシンC高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、前記したものが使用される。この工程(D)において使用される標識抗体の量は、担体に結合した固相化抗体に対して約5000〜10000倍、好ましくは最終吸光度が1.0〜1.5となるように希釈した標識抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いることができ、反応は限定されるわけではないが、約4℃で約30分間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以上の反応により、担体に抗体−テネイシンC高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体を結合することができる。
【0032】
最後に工程(E)において、固相化抗体−テネイシンC高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からテネイシンC高分子スプライシングバリアントの量を算出することができる。
【0033】
標識抗体の標識物として、酵素であるペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と3,3',5,5'−テトラメチルベンジン(以下「TMB」という)を含む発色基質溶液を使用することができる。発色反応は、限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約25℃で約20分間反応させた後、2Nの硫酸を加えて酵素反応を停止させことにより行うことができる。TMBを使用する場合、発色は450nmの吸光度により測定する。一方、標識物として、酵素であるアルカリホスファターゼを使用する場合には、p−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、2NのNaOHを加えて酵素反応を止め、415nmでの吸光度を測定する方法が適している。なお、既知の濃度のテネイシンC高分子スプライシングバリアントを添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用いて、検体中のテネイシンC高分子スプライシングバリアントの濃度を算出できる。
【0034】
本発明診断剤を用いて上記のような測定を行うためには、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体(抗体(a))を含む第一の試薬と、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりNアミノ末端側を認識する抗体(抗体(b))を含む第二の試薬とを含有させた関節炎診断キット(以下、「本発明キット」という)を利用すればよい。
【0035】
より好ましい本発明キットの例としては、本発明の抗体(a)を担体上に固相化し、本発明の抗体(b)を上記した標識物質で標識化したキットを利用することが好ましい。
【0036】
上記のように作製された本発明キットは、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを定量できるものである。これを用いて関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアントを定量すれば、関節炎が変形性関節炎であるか、リウマチ性関節炎であるかの診断に使用することができる。
【0037】
本発明キットを用いて関節炎の診断を行うには、まず、本発明キットにより、被験者から採取した関節腔液を試料として用い、この中のテネイシンC高分子スプライシングバリアントを定量する。そして、このテネイシンC高分子スプライシングバリアント量により、変形性関節炎と関節リウマチとを鑑別する。関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量の高低で関節リウマチと変形性関節炎が鑑別でき、また特に変形性関節炎については、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量の測定で、レントゲン分類の重症度と相関が見られることにより判定することができる。
【0038】
また、上記のようにして測定されたテネイシンC高分子スプライシングバリアント量により変形性関節炎の重篤度を判定することができる。具体的には、変形性関節炎の関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量の増量により、骨破壊の重症度が判定できる。
【0039】
【実施例】
以下に実施例により本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【0040】
実 施 例 1
テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体の作製:
(1)免疫原の調製
テネイシンCのアミノ酸配列や塩基配列(Accession No.:X56160)から、フィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位のBCDドメイン(以下、単に「BCDドメイン」という)をコードするcDNAであるポリヌクレオチド(配列番号1)を常法により作製し、これをpQE−31ベクター(キアゲン製)に組換え、大腸菌のコンピテントセル(JM−109)に導入した。この大腸菌を培養し、イソプロピル−β−D(−)チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加した後一晩培養し、pQE−31ベクターに組込んだcDNAのリコンビナントタンパク質(配列番号2)を生成させた。大腸菌の細胞膜を破壊することによりリコンビナントタンパク質を抽出した後、His trapカラム(Pharmacia製)で精製した。
【0041】
(2)モノクローナル抗体の作製
テネイシンCの遺伝子欠失マウスは三重大学医学部付属動物実験施設で継体飼育されている、BALB/Cに戻し交配されたものを用いた。上記(1)で作製したBCD部分のリコンビナントタンパク質の100μgとコンプリートアジュバントとを等量混合してエマルジョンを作製し、これをマウスに2週間の間隔で2回免疫した。更に、細胞融合3日前にマウスの尾静脈内に100μgのリコンビナントタンパク質を注射した。免疫したマウスから脾臓を摘出し、これから脾細胞懸濁液を調整し、脾細胞とマウスミエローマ細胞(Sp2/0)を5:1で混合し、ポリエチレングリコール(PEG)溶液中で細胞融合を行い、ハイブリドーマ細胞を得た。
【0042】
その後、ハイブリドーマ細胞を含むPEG溶液からPEGを除去し、残ったハイブリドーマ細胞をBriclone(Bio Research製)5%と20%FCSを添加したIMDMに再浮遊し、96穴マイクロプレートに1×105個/穴の濃度でまきこみ、CO2濃度7%、37℃で培養を行った。4日後HAT培地を添加し、7〜10日後に精製ヒトテネイシンCを抗原としてプレートに吸着させ、培養液を反応させ、さらに希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGを反応させることにより、抗体産生を確認した。クローンはHT培地を用いてさらに選択培養し、限界希釈法によってクローニングを2回繰り返した。
【0043】
(3)抗体の精製
ハイブリドーマ細胞を無血清培地のGIT培地(和光純薬)で細胞の80%が死滅するまで抗体を産生させた。遠心(1,000rpm、15min)により細胞を取り除いた後、硫酸アンモニウム50%飽和状態にして4℃で一晩静置し、沈殿を遠心(1,000rpm、30min)して回収した。この沈殿を2倍に希釈したbinding buffer(Protein AMAPS IIkit製)に溶解させた後、Protein Aカラム(Pharmacia−Amersham製)にIgGを吸着させた。その後、PBS透析を一晩行って抗体を精製した。
【0044】
実 施 例 2
テネイシンCの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体の作製:
(1)免疫原の調製
精製ヒトテネイシンCは、オークヒル(Aukhil I.et al.(1990) Matrix 10:98-111)の方法に従い、ヒト神経膠細胞株U251の細胞株から50%硫酸アンモニウム飽和による塩析とSephacryl S500カラム、モノQカラム(Pharmacia Biotech製)を用いて精製した。
【0045】
(2)モノクローナル抗体の作製および精製
テネイシンCの遺伝子欠失マウスは三重大学医学部付属動物実験施設で継体飼育されている、BALB/Cに戻し交配されたものを用いた。上記(1)で精製した精製ヒトテネイシンCをマウスに免疫し、実施例1と同様の方法で、ハイブリドーマ細胞を得た。実施例1と同様の方法で、クローンのスクリーニングを行い、陽性クローンを培養し、培養上清から得られる抗体を精製した。
【0046】
実 施 例 3
ウエスタンブロット法による抗体の認識部位の解析:
実施例1および実施例2で作製した抗体の認識部位をウエスタンブロット法により解析した。
【0047】
(1)テネイシンCの上皮増殖因子様ドメインのリコンビナントタンパク質の作製
マウステネイシンC(Accession No.:D90343)の上皮増殖因子様ドメインのcDNA配列(配列番号3)から、上皮増殖因子様ドメインの両端にプライマーを設計し、マウステネイシンCのcDNAからPCRにより、遺伝子を増幅し、pSecベクターに同部の遺伝子を組み込んだ。これを用いて、CHO−K1細胞を形質転換し、テネイシンCの上皮増殖因子ドメインのリコンビナントタンパク質(配列番号4)を発現させた。培養上清に分泌されたリコンビナントタンパク質をHis trapカラム(Pharmacia製)で精製した。
【0048】
(2)ウエスタンブロット法による抗体の認識部位の解析
ポリアクリルアミド ゲル エレクトロフォレイシス(Polyacrylamide Gel Electrophoresis) MULTIGEL2/15(第一化学薬品製)上で、レムリ(Laemmli)の方法を用いて電気泳動(SDS−PAGE法)を行った。電気泳動されたタンパク質は、Immobilon Transfer Membranes(MILLIPORE製)へ電気的に転写した。メンブレンは0.5%スキムミルク添加50mM トリス−緩衝生理食塩水(TBS)でブロッキングし、0.1%スキムミルク添加TBSで1,000倍に希釈した実施例1および実施例2で作製したモノクローナル抗体と一晩反応させ、0.1%スキムミルク溶液で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG(H+L−chain:Biorad製)で500倍に希釈して2次抗体として反応させ、洗浄後DAB/H2O2溶液で発色させた。
【0049】
ウエスタンブロットの結果を図1に示す。実施例2で作製したモノクローナル抗体(クローン名:4F10TT)は幅広いバンドを認識し、特に、選択的スプライシング部位の挿入がないテネイシンCと考えられる210kDa付近(図1のL)および7つのフィブロネクチンIII様の反復が挿入されたバリアントであると考えられる300kDa付近(図1のH)に濃いバンドが見られた。この結果より、実施例2で作製したモノクローナル抗体は、ヒトテネイシンCを認識するとともに、上皮増殖因子様ドメインと反応し、同ドメインを認識することを確認した。
【0050】
一方、実施例1で作製したモノクローナル抗体(クローン名:19C4MS)は300kDa付近に濃いバンドがあるものの、210kDa付近のバンドは見られなかった。従って、このモノクローナル抗体は低分子のバリアントを認識せず高分子量のバンドのみを認識すると推測されたため、実施例1で作製したBCDドメインのリコンビナントタンパク質を用いて同様にウエスタンブロットを行った。その結果を図2に示す。図2において、BCDドメインのリコンビナントタンパク質を示す37kDa付近に濃いバンドが認められた。従って、実施例1で作製したモノクローナル抗体はBCDドメイン、すなわち、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内において正常ではスプライシングされる反復を含む、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを認識することを確認した。
【0051】
従って、実施例1で作製したモノクローナル抗体(19C4MS)と実施例2で作製したモノクローナル抗体(4F10TT)とを組合わせることにより、テネイシンC高分子スプライシングバリアントを測定することができると判断された。
【0052】
実 施 例 4
サンドイッチELISA系の構築:
サンドイッチELISA法の構築は以下のように作製した。実施例1で作製したテネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識するモノクローナル抗体(19C4MS)の10μg/mlの濃度調整液を10μlずつ96wellELISA用プレートに加えた。4℃で一晩反応させた後、10%BSA/PBS/NaN3溶液にてブロッキングを行い、この状態をサンドイッチELISA用プレートとした。実施例2で作製したテネイシンCの選択的スプライシング部位のN末端側を認識する第二のモノクローナル抗体(4F10TT)とHRPとの結合抗体を標識抗体とした。これらのサンドイッチELISA用プレートと標識抗体の組合せでサンドイッチELISA系を作製した。標準テネイシンCは実施例2(1)で作製した精製ヒトテネイシンCを用い、既知のタンパク質量から得られる吸光度とタンパク質濃度の標準曲線をあらかじめ求め、実際のサンプル測定で得られる吸光度よりそのタンパク質量を測定した。
【0053】
実 施 例 5
ELISA法による変形性関節炎患者および関節リウマチ患者の関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量の測定:
テネイシンC高分子スプライシングバリアント量の測定は以下のように行った。サンドイッチELISA用プレートに被験者から採取した関節腔液サンプルを含む溶液を100μl加え、37℃で一時間反応させた。反応後、0.05%Tween20−PBSで4回洗浄、標識抗体を100μl加え、4℃で30分反応させた。反応後、0.05%Tween20−PBSで6回洗浄し、TMB(Tetramethyl benzidine)溶液を100μl加え、室温、遮光下30分放置した。1N硫酸で反応を止め、吸光度450nmで測定した。測定した吸光度は前項に示したように標準タンパク質曲線よりテネイシンC濃度を求めた。上記の方法により、リウマチ患者関節腔液(11例)、変形性関節症患者関節腔液(39例)について測定したテネイシンC高分子スプライシングバリアント量を表1に示す。
【0054】
【表1】
【0055】
表1より、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量は、変形関節炎(OA)と関節リウマチ(RA)ではRAに有意(p=0.01)な上昇が見られた。また、特にOAでは関節の破壊の程度を示す関節レントゲン分類で、III度とIV度の症例比較で、有意にIV度が高かった。この結果により、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量の高低でRAとOAが鑑別でき、また特にOAについてはレントゲン分類の重症度と相関が見られ、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアント量の測定により、骨破壊の程度が推測できる。
【0056】
【発明の効果】
本発明によれば、テネイシンC高分子スプライシングバリアントが関節炎のマーカーとして利用できることが明らかとなった。また、特に、変形性関節炎の重篤度とテネイシンC高分子スプライシングバリアント量との関係も明らかとなった。
【0057】
従って、関節液中のテネイシンC高分子スプライシングバリアントを測定することにより、関節炎の鑑別や変形関節炎の重篤度の判定が可能となる。
【0058】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】 実施例1および実施例2で作製したモノクローナル抗体のウエスタンブロットによる反応性を示す図面である(CBBはクマシーブリリアント青染色を示し、hTNCは精製ヒトテネイシンCを示し、rEGFはマウスのEGFリコンビナントタンパク質を示す)。
【図2】 実施例1で作製したモノクローナル抗体のウエスタンブロットによるエピトープ解析を示す図面である(6xHisは6xHistidin部位に対する抗体を示す)。
以 上
Claims (8)
- 関節液中の、テネイシンC中にあるフィブロネクチン III 様ドメインの選択的スプライシング部位内のBCDドメインを有するテネイシンC高分子スプライシングバリアント量を指標として変形性関節炎と関節リウマチとを鑑別する方法。
- 関節液中の、テネイシンC中にあるフィブロネクチン III 様ドメインの選択的スプライシング部位内のBCDドメインを有するテネイシンC高分子スプライシングバリアント量を指標として変形性関節炎の重篤度を判定する方法。
- テネイシンC中にあるフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内のBCDドメインを認識する第一の抗体を含む第一の試薬と、テネイシンC中にあるフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりNアミノ末端側を認識する第二の抗体を含む第二の試薬とを含有することを特徴とする変形性関節炎と関節リウマチとを鑑別するためのキット。
- 第一の試薬が固相化された第一の抗体を含む試薬であり、第二の試薬が標識された第二の抗体を含む試薬である請求項第3項記載の変形性関節炎と関節リウマチとを鑑別するためのキット。
- 第二の抗体が、テネイシンCの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体である請求項第3項または第4項記載の変形性関節炎と関節リウマチとを鑑別するためのキット。
- テネイシンC中にあるフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内のBCDドメインを認識する第一の抗体を含む第一の試薬と、テネイシンCのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりNアミノ末端側を認識する第二の抗体を含む第二の試薬とを含有することを特徴とする変形性関節炎の重篤度を判定するためのキット。
- 第一の試薬が固相化された第一の抗体を含む試薬であり、第二の試薬が標識された第二の抗体を含む試薬である請求項第6項記載の変形性関節炎の重篤度を判定するためのキット。
- 第二の抗体が、テネイシンCの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体である請求項第6項または第7項記載の変形性関節炎の重篤度を判定するためのキット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002303091A JP3837374B6 (ja) | 2002-10-17 | 関節炎診断剤および関節炎診断キット |
Applications Claiming Priority (1)
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JP2002303091A JP3837374B6 (ja) | 2002-10-17 | 関節炎診断剤および関節炎診断キット |
Publications (3)
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JP2004138489A JP2004138489A (ja) | 2004-05-13 |
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