KR20090111307A - 전립선 특이적 전사물 및 전립선암의 치료 및 진단에 사용되는 이의 용도 - Google Patents

Abstract

사람의 전립선 종양 조직에서 상향 조절되는 유전자 및 해당하는 단백질이 동정된다. 상기 유전자 및 해당하는 항원은 전립선암의 치료, 진단 또는 예방에 적당한 표적이다.

Description

전립선 특이적 전사물 및 전립선암의 치료 및 진단에 사용되는 이의 용도{PROSTATE SPECIFIC TRANSCRIPTS AND THE USE THEREOF FOR PROSTATE CANCER THERAPEUTICS AND DIAGNOSTICS}

본 발명은 전립선암 세포에서 발현되는 유전자에서 선택적으로 스플라이싱된 경우(alternatively spliced events)에 해당하는 DNA 서열의 동정에 관한 것이다. 상기 유전자 또는 해당하는 단백질은 암의 치료, 예방 및/또는 진단에 표적이 되며, 상기 유전자는 특히 전립선암에서 상이하게 조절되고/되거나 스플라이싱된다.

인간 질환의 유전자 검출법은 빠르게 개발되고 있는 분야이다(Taparowsky 등, 1982; Slamon 등, 1989; Sidransky 등, 1992; Miki 등, 1994; Dong 등, 1995; Morahan 등, 1996; Lifton, 1996; Barinaga, 1996). 그러나 이러한 접근법에는 몇 가지의 문제점이 있다. 다수의 알려진 유전자 손상은 단지 개인의 특이적 질병의 발병 근원이다. 유전적 손상이 있는 개인에게서 질병이 발병하지 않을 수 있으며, 반면에 다른 개인에게서 특정의 유전적 손상을 가지고 있지 않는데도 질병이 발병할 수 있다. 인간 종양에서 아주 많은 다수의 알려진 종양 억제 유전자 및 원형 종양 유전자(proto-oncogene)에 유전적 결손이 발생할 가능성이 있다.

암의 유전자 검출법은 긴 역사를 가지고 있다. 암의 발병 원인으로 나타나는 몇몇 초기 유전자 손상은 ras 종양 유전자의 점 돌연변이로 변환된다(Taparowsky 등, 1982). ras 점 돌연변이의 변환은 양성 및 악성 직장암이 있는 개인에게서 검출될 수 있다(Sidransky 등, 1992). 그러나 이러한 종양 중 단지 50 %만이 ras 돌연변이가 있었다(Sidransky 등, 1992). 유방 및 전립선 암에서의 HER-2/neu의 확장(Slamon 등, 1989), 방광 암의 p53의 결손 및 돌연변이(Sidransky 등, 1991), 직장 암의 DCC 결손(Fearon 등, 1990) 및 유방 및 전립선 암의 BRCAl의 돌연변이(Miki 등, 1994)로 유사한 결과가 수득되었다.

이러한 유전자 손상 중 어떠한 것도 대부분의 암 환자를 예견할 수 없으며, 가장 필요로하는 의심되는 종양의 직접적인 견본 추출도 할 수 없고, 스크리닝도 어렵게 만든다. 또한 상기에서 기재한 표지 중 어떠한 것도 암의 전이 및 비-전이 형태 사이를 구별할 수 없다. 암 환자의 효과적인 관리에서 암이 이미 전이되었거나 또는 전이될 것 같은 개인을 규명하는 것이 중요하다. 전이 암으로 미국에서는 매년 560,000명의 사람이 사망하므로(ACS 홈 페이지), 전이성 전립선 암의 표지를 규명하는 것이 중요한 진척이 될 수 있을 것이다.

암의 검출법 및 진단법의 특정 문제점이 전립선 암에서 존재한다. 전립선의 암종은 미국에서 남성 중 가장 빈번하게 진단되는 암이다(Veltri 등, 1996). 전립선 암은 1998년에 대략 189,500명의 남성에게서 진단되었으며, 약 40,000명의 남성이 악성 종양으로 사망했다(Landis 등, 1998). 비록 환자의 수명 중에 아주 소수 의 전립선 암이 임상적으로 중요하게 악화되지만 사실상 악화되는 것은 검출될 때쯤에 전이될 것이다. 전이성 전립선 암 환자의 생존 확률은 매우 낮다. 이러한 극단적인 상태 중에서도 전이될 것이지만 아직 전이되지 않은 전립선 암 환자로 수술로 전립선을 제거하여 치유할 수 있는 환자가 있다. 이러한 군에 속하는 환자를 결정하는 것이 최적의 치료 및 환자 생존을 결정하는데 중요하다.

1984년의 혈청 전립선 특이 항원(PSA)의 FDA 승인 시험은 전립선 질환을 관리하는 방법을 변화시켰다(Allhoff 등, 1989; Cooner 등, 1990; Jacobson 등, 1995; Orozco 등, 1998). PSA는 전립선 암 환자에서의 치료적 반응을 검출 및 모니터하기 위한 혈청 생물표지로서 광범위하게 사용된다(Badalament 등, 1996; O'Dowd 등, 1997). PSA 분석에서의 몇 가지의 변형(Partin 및 Oesterling, 1994; Babian 등, 1996; Zlotta 등, 1997)으로 초기 진단이 가능하게 되었으며, 치료가 개선되었다.

PSA가 1988년 이래로 전립선 암의 임상적 표지로서 광범위하게 사용되었음에도 불구하고(Partin 및 Oesterling, 1994), 직장 수지 검사(digital rectal examination, DRE)과 결합하거나 또는 단독으로 PSA를 사용하는 스크리닝 프로그램으로 전립선 암이 있는 남성의 생존율을 개선시키는 것을 성공하지 못했다(Partin 및 Oesterling, 1994). 비록 PSA가 전립선 조직에 특이적이기는 하지만 악성 전립선 상피 조직뿐만 아니라 정상 및 양성에서도 생성되어 전립선 암 검출에 있어서의 가성 양성율을 높이는 결과를 가져왔다(Partin 및 Oesterling, 1994).

혈청 수준이 아주 높은 경우에는 효과적인 전립선 암의 표준인 반면에 PSA 혈청 수준이 2-10 ng/ml의 수준인 경우와 같이 약하게 올라가는 경우에는 전립선 암의 보다 확실치 않은 표준이다. 상기와 같이 약하게 올라가는 경우에는 혈청 PSA는 BPH(benign prostatic hyperplasia), 전립선염 또는 기타 신체적 외상과 같은 비-종양 질병으로부터 유래할 수 있다(McCormack 등, 1995). 혈청 PSA의 암 검출 한계 농도를 2.0 ng/ml로 낮추어 사용하면 특히 촉진할 수 없는 초기 단계 종양이 있는 젊은 남성에게서 전립선 암의 진단율이 증가하는데도 불구하고(Stage Tie) (Soh 등, 1997; Carter 및 Coffey, 1997; Harris 등, 1997; Orozco 등, 1998), 낮은 혈청 PSA 수준에서의 전립선 암 검출을 위한 PSA 분석의 특이성은 문제점이 있다.

몇명의 연구자들은 혈청 PSA 농도 이외의 여러 가지 다른 생물표지를 실험하여 전립선 암의 혈청학적인 검출법의 특이성을 개선시키기 위해 연구하였다(Ralph 및 Veltri, 1997). 이러한 다른 생물표지 중 가장 많이 연구된 것 중의 하나는 환자의 혈액 중의 총 PSA에 대한 유리된 것의 비율(f/t PSA)이다. 혈청 중의 대부분의 PSA는 예컨대 알파1-항키모트립신(ACT) 또는 알파2-마크로글로불린과 같은 다른 단백질과 결합되어 있는 분자 형태이다(Christensson 등, 1993; Stenman 등, 1991; Lilja 등, 1991). 유리 PSA는 다른 단백질에 결합되어 있지 않다. 유리된 PSA 대 총 PSA의 비율(f/tPSA)은 전립선 암으로 규정된 장기를 갖는 환자와 비교해서 BPH를 갖는 환자에게서 현저하게 높게 나타나는 것이 일반적이다(Marley 등, 1996; Oesterling 등, 1995; Pettersson 등, 1995). 적당한 한계가 f/t PSA 분석 용으로 결정되는 경우 f/t PSA 분석으로 혈청 PSA 수준이 단지 조금 증가한 경우에 전립선 암 환자로부터 BPH를 갖는 환자를 구별하는데 도움을 줄 수 있다(Marley 등, 1996; Partin 및 Oesterling, 1996). 불행하게도 f/t PSA는 전립선 암의 검출법을 개선시킬 수는 있지만 f/t PSA 비율의 정보는 목적하는 수준으로 전립선 암의 혈청학적인 검출법의 특이성 및 민감성의 개선에는 불충분하다.

전립선 암 검출법에 사용된 다른 표지는 전립선 산성 인산효소(PAP) 및 전립선 분비 단백질(PSP)을 포함한다. PAP는 호르몬 조절 하에서 전립선 세포에 의해 분비된다(Brawn 등, 1996). 상기는 PSA보다 덜 특이적이며 덜 민감하다. 결과로서 PAP가 초기 치료에는 실패한 전이성 환자를 모니터링하기 위한 몇몇 용도를 가지고 있지만 매우 적게 사용되고 있다. 일반적으로 PSP는 PAP보다 좀더 민감한 생물표지이지만 PSA만큼은 민감하지 않다(Huang 등, 1993). PSA와 같이 PSP 수준은 전립선 암 환자에서 뿐만 아니라 BPA 환자에게서 빈번하게 증가한다.

전립선 질병과 관련된 또 다른 혈청 표지는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)이다(Horoszewicz 등, 1987; Carter 및 Coffey, 1996; Murphy 등, 1996). PSMA는 타입 II 세포 막 단백질이며, 엽산 가수분해효소(FAH)로 알려져 있다(Carter 및 Coffey, 1996). PSMA에 대항하는 항체는 정상적인 전립선 조직 및 전립선 암 조직 둘 다와 반응한다(Horoszewicz 등, 1987). Murphy 등(1995)은 진행된 전립선 암에서 혈청 PSMA를 검출하기 위해 ELISA를 사용했다. 혈청 시험으로서 PSMA 수준은 전립선 암의 비교적 불량한 표준이다. 그러나 PSMA는 특정 환경에서 이용할 수 있다. PSMA는 전이성 전립선 종양 모세혈관상에서 발현되며(Silver 등, 1997), 전이성 암 환자의 혈액에서 보다 많이 있음이 보고되었다(Murphy 등, 1996). PSMA 전 달 RNA (mRNA)는 5-알파-디히드록시테스토스테론(DHT)에 노출된 후에 LNCaP 전립선 암 세포주에서 8-10 배 낮게 조절되며, 호르몬 결핍 상태에서 더 높은 수준으로 발현된다(Israeli 등, 1994). PSMA 발현의 호르몬 조절은 전립선 암에서의 이의 조절 및 중요성을 명백하게 이해하는 것에 도움을 줄 것이다.

두가지의 비교적 신규의 잠재적 생물표지는 인간 칼리크레인 2(HK2)(Piironen 등, 1996)와 전립선 특이 트랜스글루타미나아제(pTGase) (Dubbink 등, 1996)이다. HK2는 전립샘에서 분비되는 칼리크레인 패밀리 중의 하나이다(Piironen 등, 1996). 전립선 특이 트랜스글루타미나아제는 단백질의 번역 후 가교 결합을 촉진하는 전립선 세포에서 발현되는 칼슘-의존 효소이다(Dubbink 등, 1996). 이론적으로 HK2 또는 pTGase의 혈청 농도는 전립선 암 검출 또는 진단에 이용할 수 있지만 이러한 표지의 유용성은 여전히 평가되고 있다.

인터루킨 8(IL-8)도 또한 전립선 암의 표지로 보고되었다(Veltri 등, 1999). 혈청 IL-8 농도도 전립선 암의 단계 진행과 관련이 있으며, 악성 전립선 종양으로부터 BPH로 분화할 수 있는 것으로 보고되었다(Id.). 전립선 암의 검출 및 진단 용으로 상기 표지의 광범위한 응용력은 여전히 연구 중이다.

전립선 암 용의 이러한 단백질 표지에 더하여 몇 가지의 유전자 변화가 전립선 암과 관련되었다고 보고되었으며, 이에는 하기를 포함한다: 대립유전자 결손(Bova, 등, 1993; Macoska 등, 1994; Carter 등, 1990); DNA의 과도한 메틸화(Isaacs 등, 1994); 망막 모세포종(Rb), p53 및 KAI1 유전자의 점 돌연변이 또는 결손(Bookstein 등, 1990a; Bookstein 등, 1990b; Isaacs 등, 1991; Dong 등, 1995); 및 형광 동소 하이브리드법(fluorescence in situ hybridization, FISH)에 의해 검출되는 염색체의 이수배수체 및 aneusomy(Macoska 등, 1994; Visakorpi 등, 1994; Takahashi 등, 1994; Alcaraz 등, 1994). 이러한 것 들 중에서 무증상 전립선 암을 일반적으로 스크리닝하는 수단으로서 효과적으로 유용한 민감성 및 특이성을 나타내는 것으로 보고된 것은 없다.

현재 임상적인 실행에서 혈청 PSA 분석 및 직장 수지 검사(DRE)가 전립선 생체 검사를 받아야 하는 환자를 확인하기 위해 사용된다(Lithrup 등, 1994; Orozco 등, 1998). 생체 검사 조직의 조직 구조 시험은 전립선 암을 진단하기 위해 사용한다. 1998년에 전립선 암으로 진단된 189,500 경우(Landis, 1998)와 약 35 %의 알려진 암 검출 비율(Parker 등, 1996)을 근거로 1998년에 미국에서 150만 이상의 전립선 생체 검사를 미국에서 실행했다(Orozco 등, 1998; Veltri 등, 1998). 명확하게 상기에 의해서 대부분의 암이 아니거나 또는 임상적으로 심각하지 않은 상태의 환자를 배제시키기에 충분하게 특이적인 작거나 또는 초기 단계의 전립선 암을 검출하기에 충분하게 민감한 혈청학적인 시험으로부터 매우 유리한 결과를 얻을 수 있었다.

질병 진행을 모니터링하는 진단학적 방법의 개발과 전립선 암의 진행과 관련된 유전자를 규명하는 것에 관한 종래 문헌에는 결함이 있다. 게다가 전립선 암에서 다르게 스플라이싱되거나/되고 다르게 발현되는 유전자를 규명하는 것은 암을 진단하기 위한 신속하고 저렴한 방법을 개발하는데 매우 중요할 것이다. 소수의 전립선 특이 유전자(PSA, PSMA, HK2, pTGase, 등)가 클로닝되는 데도 불구하고 전 립선 암에서는 상향조절되지 않는 것이 통상적이다. 비-악성 전립선 조직과 비교해서 전립선 암에서 다르게 발현되는 신규의 전립선 특이 전사물을 규명하는 것은 전립선 암의 진단, 예후 및 치료에 중요하며 상당한 진전을 줄 수 있다.

CD8⁺ T 림프구 서브셋은 종양 형성에 대항하는 면역감시에 중요한 역할을 수행할 수 있다(Knutson 등, 2005). 질병 세포 상의 주요 조직 접합 유전자 복합체(MHC) 클래스 I 분자에 의해 존재하는 펩티드는 CD8⁺ T 세포에 의해서 인지될 수 있다(Flutter 등, 2004). 분열 증식을 유도하는 CD8⁺ T 세포의 활성은 펩티드 항원을 나타내는 수지상 세포, 특이적 항원 전달 세포(APC)와 상호작용하여 일어난다. 초기 활성 이후의 CD8⁺ T 세포는 자가 MHC 분자에 의해 나타나는 경우에 특이적인 활성 펩티드 항원을 발현시키는 세포를 라이싱할 수 있는 잠재 살상 세포이다. MHC 클래스 I 분자에 의해서 표시되는 펩티드는 시토졸 다-촉매 프로테아좀 복합체에 의해 주로 중재되는 세포내 단백질 가수 분해 과정에 의해 유도된다 (Guermonprez 등, 2005). MHC/펩티드 항원 복합체와 항원 특이 T 세포 수용체의 상용작용 시에 CD8⁺ 세포융해 T 립프구(CTL)는 공극-형성 단백질 퍼포린과 그랜자임 B를 포함하는 그랜자임을 분비한다. 이러한 과립 단백질은 표적 세포에서 캐스파제 일련의 반응 단계의 단백질 가수 분해 할성과 결합하여 세포 사멸(apoptotic death)을 유도한다(Ashton-Richardt, 2005). 선택적인 스플라이싱을 통해 생성되는 전립선 및 전립선 암 특이 전사물 및 단백질의 규명을 통해 신규의 전립선 암 백신을 개발하는데 매우 큰 잠재성이 있다.

항원 전달 수지 세포는 세포 암 백신(cell-based tumor vaccine) 치료법의 개발을 위해 초점을 맞추었다. 수지상 세포는 전문적인 항원 전달 세포이며, 단순한 T 세포의 가장 강력한 활성제이다(Banchereau 및 Steinman, 1998; Fong 및 Engleman, 2000; Schuler 등, 2003). 이러한 세포들은 항원 펩티드, 공동-자극 분자 및/또는 성장 인자를 기계적 및/또는 유전적으로 촉진시켜 특이적으로 표적 종양 세포를 파괴시키기 위해 CD8⁺ CTLs를 특이적으로 활성화시킬 수 있는 세포 군을 생성할 수 있다(Gabrilovich 등, 1996; Nair 등, 1997; Paglia 등, 1996; Zitvogel 등, 1996; Ashley 등, 1997; Mayordomo 등, 1996; Siders 등, 2003; Chen 등, 2003; Akiyama 등, 2000; Wan 등, 1997; Esslinger 등, 2002; Bonifaz 등, 2002). 다양한 수지상 세포 기본 암 백신으로 임상적인 시험이 진행 중이다(Berzofsky 등, 2004). 예를 들어 재발 및 전이성 전립선 암이 있고, 혈청 전립선 산성 인산염(PAP)이 증가한 21명의 환자를 대상으로 로던트 PAP를 적용한 수지상 세포로 치료하였다. 치료 환자 중 10명에서 PAP에 대한 T 세포-분열 증식 반응이 나타났다(Fong 등, 2001). 가장 최근에는 수지상 세포 전구물질을 PAP 퓨젼 단백질에 노출시킨 다음에 환자에게 투여하여 CTL 반응을 유도하였다(Drugs R&D, 2006).

표면 단백질을 표적으로 하는 암 치료 용의 치료 항체를 사용하는 것도 알려져 있다. 이것의 예로는 B 세포 임파종 상의 CD20을 표적으로 하는 RITUXAN®, 만성 림프성 백혈병에 의해 발현되는 표면 항원 CD52를 표적으로 하는 Campath®, 유 방 및 기타 암 상의 erbB2를 표적으로 하는 Herceptin® 및 백혈병 세포 상에서 발현되는 표면 항원 CD33를 표적으로 하는 Mybtara를 포함한다. 그러나 현재까지 전립선 암 치료 용의 단일클론 항체는 치료적 용도로 승인되지 않았다.

발명의 요약

본 발명은 전립선암 세포 또는 조직을 특징으로 하며, 피험체에서 증상의 치료 또는 진단에 대한 표적을 나타내는 신규한 핵산 및 아미노산 서열의 동정 방법에 관한 것이다.

본 발명은 특히 신규한 펩티드 서열을 코딩하는 23개의 특정 분리된 핵산 분자를 기술하고 있다. 상기 신규한 서열은 정상 전립선과 전립선암 사이에서 상이하게 발현되는 것을 발견하였다. 상기 서열 및 분자는 전립선암의 검출, 진단 및 치료에 대한 방법 및 물질을 개발하기 위한 표적 및 유용한 정보를 나타낸다.

본 발명의 목적은 전립선암의 치료 및 진단을 위한 방법 및 물질을 제공하는데 있다.

본 발명의 특정 목적은 전립선암의 치료 및 진단에 대한 가능한 유전자 표적물인 전립선암 조직에 의해서 발현된 신규한 엑손[신규한 스플라이스 변이체(splice variants)]을 동정하는데 있다.

본 발명의 특정 목적은 전립선암에 의해서 특이적으로 발현되는 신규한 유전자 표적물에 해당하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 처방 또는 사용을 포함하는 전립선암의 치료에 대한 신규한 치료법을 개발하는데 있다.

본 발명의 또다른 특정 목적은 엑손 및 전립선암 세포에서 특이적으로 상향조절되는 상기 엑손에 의해서 코딩된 해당하는 단백질 영역을 동정하는데 있다.

본 발명의 또다른 특정 목적은 이에 한정되는 것은 아니지만 모노클로날 항체를 포함하는 특정 전립선암에 의해 단백질 영역으로서 발현되는 엑손에 의해 코딩되는 항원을 결합하는 리간드를 제조하는데 있다.

본 발명의 또다른 특정 목적은 특정 전립선암에 의해서 발현되는 항원을 단독으로 또는 상기 항원을 발현하는 암세포에 대한 항원-특이적 세포독성 T-세포 임파구 반응을 유도하는 보조제와 조합하여 투여 또는 사용하는 단계를 포함하는 전립선암의 치료를 위한 신규한 치료법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 특정 전립선암에 의해서 발현되는 신규한 항원을 특이적으로 결합하는 리간드, 특히 모노클로날 항체의 투여 또는 사용 단계를 포함하는 전립선암의 치료에 대한 신규한 치료법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 및/또는 보조제와 조합하여, 상기에 정의된 리간드 또는 항원을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 항원 결합된 전립선 종양을 발현하는 바이러스 벡터, 전립선 종양-결합 항원의 직접 주입, 또는 네이키드(naked) DNA 발현 구조물로 형질도입(transduction)에 의해 세포계 항종양 백신화(cell based antitumor vaccination) 특히 펩티드가 직접 부하된 수지상 세포를 나타내는 항원의 투여 또는 사용을 포함하는 전립선암의 치료를 위한 신규한 치료법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기에 기술된 항원 펩티드가 부하된 수지상 세포를 포함하는 세포계 항종양 백신화의 투여 또는 사용을 포함하는 전립선암의 치료를 위한 신규한 치료법을 제공하는데 있으며, 박테리아성 LPS, TNFalpha, CD40 리간드, 단핵세포 조절 매질(monocyte conditioning media) 또는 사이토킨 칵테일(cytokine cocktails)로 성숙된다.

본 발명의 또다른 목적은 피험체가 전립선암의 발생 위험을 갖거나 또는 전립선암 발생의 증가된 위험 상태에 있는지를 검출하기위해서 특정 전립선암에 의해서 특이적으로 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 리간드, 예컨대 모노클로날 항체에 의해서 전립선암을 진단하는 신규한 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 특정 전립선암에 의해서 발현된 신규한 유전자 표적에 하이브리드화되는 레이블된 DNA의 사용에 의해서 전립선암을 갖거나 또는 전립선암 발생의 증가된 위험 상태에 있는 피험체를 검출하는 신규한 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 전립선암 세포에 의해서 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 리간드, 예컨대 모노클로날 항체, 및 검출가능한 레이블(detectable label), 예컨대 인디케이터 효소(indicator enzymes), 라디오레이블(radiolabels), 형광체(fluorophores) 또는 상자성 입자(paramagnetic particles)를 포함하는 전립선암을 갖거나 또는 전립선암 발생의 증가된 위험 상태에 있는 피험체의 검출을 위한 진단 시험 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 전립선암 세포에 의해서 특이적으로 발현된 신규한 유전자 표적물, 및 검출가능한 레이블, 예컨대 인디케이터 효소, 라디오레이블, 형광체 또는 상자성 입자에 특이적인 핵산(예컨대, DNA) 프라이머 또는 프로브를 포함하는 전립선암을 갖거나 또는 전립선암 발생의 증가된 위험 상태에 있는 피험체의 검출을 위한 진단 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 본 출원에 기술된 바와 같이 후보 화합물은 바람직하고 선택적으로 항원 또는 폴리뉴클레오티드를 결합하는지의 결정을 포함하는 생물학적 활성 화합물을 선택(selecting), 동정(identifying), 스크리닝(screening), 특징화(characterizing) 또는 최적화(optimizing)하는 방법을 제공하는데 있다. 상기 화합물은 약물 후보물질을 나타내거나 또는 암 질환, 특히 전립선암을 치료한다.

본 발명의 또다른 목적은 전립선암 세포에서 변형된 형태로 발현되는 유전자를 동정하는데 있다. 상기 형태는 유전자의 스플라이싱 변이체(splice variants)를 나타내며, DATAS™ 절편은 (1) 유전자내에서 발생하는 스플라이싱 경우(splice event)를 나타내거나, 또는 (2) 상이한 유전자 생성물을 만들도록 활발하게 스플라이싱된 유전자를 나타낸다. 상기 상이한 스플라이싱 변이체 또는 이성형(isoforms)은 치료적 중재(therapeutic intervention)에 대한 표적일 수 있다.

DATAS(Different Analysis of Transcripts with Alternative Splicing)는 발현된 유전자들 사이에서 구조적 차이를 분석하고, RNA 스플라이싱(splicing)에서 변경에 전체적으로 접근하도록 한다(U.S. 특허 제6,251,590호에 기술되었으며, 상기는 이의 전문이 참고문으로 통합됨). 세포 항상성(cellular homeostasis)에 중요한 상기 스플라이싱된 서열에 접근하는 것은 기능적 유전체(functional genomics)에서 유용한 진보를 나타낸다.

DATAS 기술은 2개의 시료, 가령 정상 조직 대 종양 조직을 비교하는 경우 2개의 라이브러리(library)를 생성한다. 각 라이브러리는 하나의 시료에서 존재하고 더 많이 발현하는 서열의 클론(clones)을 포함한다. 예를 들면, 라이브러리 A는 정상 시료의 유전자에는 존재하지만 종양 시료에서는 존재하지 않는 서열을 포함할 것이다. 상기 서열은 상기 종양 시료에서 유전자로부터 제거하거나 또는 스플라이싱되는 경우 동정된다. 대조적으로, 라이브러리 B는 종양 시료에만 존재하고 정상 시료에는 존재하지 않는 서열을 포함할 것이다. 상기는 종양 시료에서만 발현하는 유전자로 선택적으로 스플라이싱되는 엑손/인트론을 나타낸다.

본 발명은 DATAS를 사용하여 분리된 후 전립선 종양 시료에서 상이하게 조절되거나 또는 발현되는지를 측정하는 엑손의 동정(identification)에 기초한다. 또한, 본 발명은 세포 표면에서 발현되지 않는 특이적인 전립선 또는 특정 전립선 종양인 엑손을 제공하며, 예방 및 치료 백신을 포함하는 전립선 종양 백신의 제조에 유용할 수 있다. 특히, 23개의 발현된 서열 태그(tag)는 DATAS를 통해 동정되며, 정상 전립선 조직과 전립선 종양 조직 사이에서 상이하게 발현되는지를 확인한다. 상기 DATAS 절편(DF)는 하나의 시료에서 포함하거나 또는 배제되지만, 그러나 다른 하나의 시료에서는 그렇지 않은 것이 선택된 유전자의 작은 섹션이다. 상기 작은 섹션은 발현된 유전자 전사물의 일부이며, 유전자의 수개의 상이한 영역들, 이에 한정되는 것은 아니지만 1개의 엑손, 수개의 엑손, 인트론으로부터의 서열, 및 엑손 및 인트론으로부터의 서열의 일부로부터 유래된 서열로 구성될 수 있다. 상이한 생물학적 시료에서 엑손의 선택적 용도는 선택적 RNA 스플라이싱으로서 당분야에 잘 공지된 방법을 통해 동일한 유전자로부터의 상이한 유전자 생성물을 생성한다. 특히, 23개의 선택적으로 스플라이싱된 이소형은 DATAS 절편 서열로부터 동정되며, 하기에 표적 및 유전자 생성물의 모든 설명을 적합하게 하는 선택적 유전자 생성물을 생성한다.

선택적으로, 동일한 유전자로부터 생성된 스플라이싱된 mRNA는 상이한 리보뉴클레오티드 서열을 포함하며, 그러므로 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질로 해독된다. 선택적으로 유전자 생성물로 또는 유전자 생성물로부터 스플라이싱된 핵산 서열은 프레임(frame)에 삽입되거나 또는 결실될 수 있거나, 또는 원래의 유전자 서열로부터의 프레임 밖으로 삽입되거나 또는 결실될 수 있다. 차이점은 시료 서열 결실, 또는 유전자 생성물로 삽입된 신규한 서열 정보를 포함할 수 있다. 프레임 밖으로 삽입된 서열은 조기 종결 코돈(early stop codon)의 생성을 유도하고 단백질의 절단된 형태(truncated form)를 생성한다. 선택적으로, 핵산의 프레임내 삽입은 mRNA로부터 발현된 부가의 단백질 영역을 일으킬 수 있다. 마지막 단계 표적은 신규한 에피토프(epitope) 또는 기능(function)을 포함하는 신규한 단백질이다. 공지된 유전자의 많은 변이체가 동정되었으며, 단백질의 원래의 생물학적 활성과 작용하거나 또는 길항적일 수 있는 단백질 변이체를 생성한다.

그러므로, DATAS 절편은 전립선암 세포에서 상이한 조절 및 선택적 스플라이싱(들) 처리된 유전자 및 단백질을 동정한다. 그러므로, DATAS 절편은 전립선암의 진단 또는 치료에 적당한 표적 분자를 한정하고, 표적 분자는 DATAS 절편의 서열을 포함하는 유전자 또는 RNA, 또는 DATAS 절편의 서열이 유래되는 유전자 또는 RNA, 뿐만 아니라 해당하는 폴리펩티드 또는 단백질, 및 이의 변이체의 전부 또는 일부를 포함한다.

본 발명의 특정 목적은 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 (사람의 전립선암 세포에 의해서 발현된) 분리된 핵산(예컨대, DNA, RNA 등) 분자에 있다:

(i) 서열번호 1 내지 서열번호 23 중 어느 하나의 서열을 포함하는 핵산;

(ii) (i)의 변이체[상기 변이체는 열점(gap)을 허용하지 않고 정렬할 경우에 (i)의 서열과 70% 이상 동일한 핵산 서열을 가짐]; 및

(iii) 길이로 20개 이상의 뉴클레이티드의 크기를 갖는 (i) 또는 (ii)의 절편(fragment).

본 발명의 다른 목적은 (사람의 전립선암 세포에 의해서 발현된) 폴리펩티드(항원)에 있으며, 상기 폴리펩티드는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된다:

(i) 서열번호 1 내지 서열번호 23 중 어느 하나에서 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열에 의해서 코딩된 항원;

(ii) 서열번호 1 내지 서열번호 23 중 어느 하나에서 90% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 단밸질로부터 유래된 항원; 및

(iii) (i) 또는 (ii)의 항원 절편.

표적 분자의 제1 형태는 본 발명에 기술된 바와 같이 DATAS 절편의 서열을 포함하는 완전한 유전자 또는 RNA 분자의 서열을 포함하는 표적 핵산 분자이다. 실제로 DATAS는 전립선 종양과 결합된 유전적 탈조절(genetic deregulations)을 동정하기 때문에, 상기 DATAS 절편이 유래되는 전체 유전자 또는 RNA 서열은 치료적 중재 또는 진단의 표적으로서 사용될 수 있다.

유사하게, 표적 분자의 또다른 형태는 본 발명에서 기술된 바와 같이 DATAS 절편에 의해서 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 전체 길이의 단백질의 서열을 포함하는 표적의 폴리펩티드 분자이다.

표적 분자의 부가의 형태는 상기에 기술된 바와 같이 유전자 또는 RNA의 절편을 포함하는 표적의 핵산 분자이다. 실제로, DATAS는 전립선 종양 세포에서 변경된 유전자 및 RNA를 동정하기 때문에, DATAS 절편의 서열을 포함하지 않는 일부를 포함하는 상기 유전자 또는 RNA의 일부는 치료적 중재 또는 진단에 대한 표적으로서 사용될 수 있다. 상기 일부의 예로는 하기를 포함한다: DATAS 절편, 이의 일부, 상기 유전자 또는 RNA의 선택적 엑손 또는 인트론, 상기 RNA에서 스플라이싱에 의해서 생성된 엑손-엑손, 엑손-인트론 또는 인트론-인트론 정션 서열 등. 특정 부분은 폴리펩티드의 세포외 영역을 코딩하는 서열을 포함한다.

유사하게, 표적 분자의 또다른 형태는 본 발명에 기술된 바와 같이 DATAS 절편에 의해서 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 절편이다. 상기 절편은 DATAS 서열을 포함하거나 또는 포함하지 않으며, 예를들면 프레임 시프트(frame shift), 신규한 엑손-엑손 또는 엑손-인트론 정션, 새로운 정지 코돈의 형성 등으로부터 기인된 새롭게 형성된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 표적 분자(유전자, 절편, 단백질 및 이들의 변이체를 포함함)는 치료법의 개발에 대한 진단 제제 및 표적으로서 제공된다. 예를 들면, 상기 치료법은 전립선 종양 생존가능성(viability)과 결합된 생물학적 과정을 조절할 수 있다. 전립선 종양 세포에서 세포자멸사(세포사)의 유도와 결합된 제제가 동정될 수 있다. 단백질 또는 이의 변이체에 결합되고 세포 성장에 중요한 생물학적 과정을 변경하는 모노클로날 항체와 같은 다른 제제가 개발될 수 있다. 선택적으로, 항체는 세포 성장을 저해할 수 있고 세포사를 유도할 수 있는 독소를 운반할 수 있다.

특이적으로, 본 발명은 변이체 단백질에서 발현되고 전립선 종양 특이적이거나 또는 전립선 특이적인 서열을 제공한다. 상기 서열은 생물정보 분석을 통해 세포의 원형질 막에서 동정된 유전자의 일부이며, 본 발명의 특정 서열은 단백질의 세포외 영역에서 발현되며, 서열은 전립선 종양 백신의 제조(예방 및 치료 세포 및 비(非)-세포계 백신을 포함함)에 유용할 수 있다.

상기에 근거하여, 상이하게 발현된 서열 및 해당하는 변이체 단백질과 결합된 기술된 유전자는 전립선암 치료, 예방 또는 진단에 대한 적당한 표적일 수 있으며, 예를들면 항체, 작은 분자 저해제, 안티센스 치료법 및 리보좀의 개발에 있어서 적당한 표적일 것으로 기대된다. 가능한 치료법은 하기에 더 상세하게 기술되었다.

상기 치료법은 전립선암에서 상향조절되는 것으로 보이는 피험체의 핵산에 대해 안티센스 방향으로 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성을 포함할 것이다. 적당한 치료적 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이로 2개 내지 수백개의 뉴클레오티드의 길이, 특히 전형적으로 약 50-70개의 뉴클레오티드의 길이로 다양할 것이다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 네이키드 핵산 또는 보호된 형태, 예를들면 리포좀(liposome)으로 캡슐화된 형태로 투여될 수 있다. 리포좀 또는 다른 보호된 형태의 사용은 생체내 안정성을 향상시켜서 표적 부위, 예를 들면 전립선 종양 세포로의 송달을 용이하게 하므로 유익할 수 있다.

또한, 피험체의 유전자를 사용하여 전립선 종양 세포에서 해당하는 mRNA의 분해를 표적으로 하는 신규한 리보좀을 고안할 수 있다. 유사하게, 상기 리보좀은 유리(네이키드) 형태로 투여될 수 있거나 또는 안정성 및/또는 표적화를 향상시키는 송달 시스템, 예컨대 리포좀의 사용에 의해서 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 핵산, 예컨대 전립선 종양 세포를 발현하는 세포를 죽이고 선택적으로 표적화하기위해서 치료적 이펙터 부분, 예를들면 라디오레이블, (예컨대, ⁹⁰Y, ¹³¹I) 세포독성, 세포독성 효소 등에 부착된, 하기에 동정된 신규한 핵산 표적물로 하이브리드된 핵산 사용의 투여를 포함한다.

또한, 본 발명은 전립선 종양 세포에서 변경된 형태로 발현되는 변경된 유전자 또는 해당하는 변경된 단백질 특정 스플라이스 변이체를 표적화함으로써 전립선암의 치료 및/또는 진단을 포함한다. 상기 방법은 상기 변경된 형태를 발현함으로써 정상 세포로의 역효과를 최소화하는 세포의 선택적 검출 및/또는 세포의 소거(eradication)를 제공할 것이다.

또한, 본 발명은 비(非)핵산계 치료법을 포함한다. 예를들면, 본 발명은 본원에서 동정된 신규한 항원에 해당하는 신규한 cDNA들 중 하나를 포함하는 DNA의 사용을 포함한다. 코딩된 항원은 치료 또는 예방의 항종양 백신으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 항원의 특정 용도로 세포독성 T 임파구 반응을 유도하는 보조제와 함께 투여되는 것을 포함한다.

보조제와 결합된 본 신규한 항원의 투여로 상기 항원에 대한 체액의 면역 반응을 일으키고, 전립선암의 발생을 지연시키거나 또는 방지한다.

본 발명의 실시양태는 다른 것들 중에서 이상적인 보조제, 예를 들면 PROVAX™, ISCOM'S®, DETOX®, SAF, 프런드 보조제(Freund's adjuvant), Alum®, Saponin®와 함께 본원의 신규한 전립선암 항원들 중에 1 이상을 투여하는 것을 포함할 것이다. 상기 조성물은 예를들면 약 50-20,000 mg/kg 체중, 100-5000 mg/kg 체중으로 치료 또는 예방에 효과적인 충분한 양으로 투여될 것이다.

본 발명의 추가의 실시양태는 직접 혼합, 전립선 종양 결합 항원을 발현하는 바이러스 벡터의 형질도입, 전립선 종양-결합 항원의 직접 주입, 또는 네이키드 DNA 발현 구조물에 의해 신규한 항원 펩티드에 의해서 부하된 수지상 세포를 나타내는 항원의 투여를 포함할 것이다. 상기 부하된 수지상 세포는 투여 전에 박테리아 LPS, TNF알파, CD40 리간드, 단핵세포 조절 매질 또는 다른 사이토킨 칵테일로 성숙될 수 있다.

본 발명의 또다른 실시양태는 하기에 기술된 핵산 서열을 포함하는 신규한 유전자에 의해서 코딩되는 항원에 대한 모노클로날 항체의 제조를 포함할 것이다. 상기 모노클로날 항체는 종래의 방법에 의해서 제조될 수 있으며, 사람의 모노클로날 항체, 사람의 모노클로날 항체, 키메라 모노클로날 항체, 단쇄 항체, 예컨대 scFv's 및 항원-결합 항체 절편, 예컨대 Fab 및 Fab' 절편을 포함한다. 모노클로날 항체의 제조 방법은 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있다. 통상, 모노클로날 항체의 제조는 본 전립선암 항원에 의한 적당한(비-상동) 숙주의 면역화, 이로부터 면역 세포의 분리, 모노클로날 항체를 분리하기위한 상기 면역 세포의 사용 및 상기 항원에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 스크리닝을 포함할 것이다. 항체 절편은 공지된 방법, 예를들면 모노클로날 항체의 효소적 변화에 의해서 제조될 수 있다.

상기 모노클로날 항체 및 절편은 패시브 항종양 면역치료법(passive anti-tumor immunotherapy)에 유용하며, 또는 치료적 이펙터 부분(therapeutic effector moieties), 예를 들면 라디오레이블, 세포독성, 치료적 효소, 세포자멸사를 유도하는 제제 등에 부착되어 표적화된 세포독성을 제공하며, 예를들면 사람의 전립선 종양 세포를 죽인다. 본 유전자는 많은 정상 조직에 의해서 상당하게 발현되지 않는다는 사실을 제공하며, 이는 상당한 부작용[비(非)표적 조직에 대한 독성]을 일으키지 않아야 한다.

본 발명의 하나의 실시양태에서, 상기 항체 또는 절편은 레이블되거나 또는 레이블되지 않은 형태, 단독으로 또는 다른 치료제, 예를 들면 화학적 치료제, 가령 전립선암 치료에 적당한 시스플라틴(cisplatin), 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아미신(adriamycin) 등과 함께 투여될 것이다. 상기 투여된 조성물은 또한 전형적으로 치료적 용도에 대한 항체 조성물로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체, 및 선택적으로 보조제, 안정화제 등을 포함한다.

바람직하게, 본 모노클로날 항체는 높은 친화도를 갖는 표적 항원과 결합하며, 예를들면 약 10^-6 내지 10^-12 M의 결합 친화도(binding affinity, Kd)를 포함한다.

알려진 바와 같이, 본 발명은 또한 본원에 기술된 전립선 특이적 스플라이스 변이체의 발현의 검출을 제공하는 진단 용도를 포함한다. 상기는 RNA 수준 및/또는 단백질 수준에서 상기 1 이상의 유전자의 발현을 검출하는 단계를 포함할 것이다.

핵산에 있어서, 본 유전자의 발현은 공지된 핵산 검출 방법, 예를 들면 노던 블롯 하이브리드화(Northern blot hybridization), SDA(strand displacement amplification), CHA(catalytic hybridization amplification) 및 다른 공지된 핵산 검출 방법에 의해서 검출될 것이다. 바람직하게, cDNA 라이브러리는 본 출원에 기술된 신규한 이소폼에 해당하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해서 전립선암에 대한 시험될 피험체로부터 수득된 전립선 세포로부터 만들어질 것이다.

전립선암의 존재 또는 부재는 PCR 생성물이 수득되는지 여부 및 발현 수준에 근거하여 결정될 수 있다. 상기 PCR 생성물의 발현 수준은 특정 전립선암 환자의 예후를 결정하기위해서 정량화될 수 있다(PCR 생성물의 발현 수준은 질병이 진행됨에 따라서 상당히 증가되거나 또는 감소될 것이다).

선택적으로, 전립선암에 대한 시험될 피험체의 상태는 생물학적 유액, 예컨대 혈액, 소변, 림프 등을 본원에 기술된 신규한 전립선 종양 항원에 특이적으로 결합된 항체 또는 항체들 또는 절편으로 시험함으로써 평가될 수 있다.

항원 발현을 검출하기위한 항체들을 사용하는 방법은 잘 공지되어 있으며, ELISA, 경쟁적 결합 분석 등을 포함한다. 통상, 상기 분석은 검출에 제공되는 레이블에 직접 또는 간접적으로 결합된 표적 항원에 특이적으로 결합된 항체 또는 항체 절편, 예를들면 인디케이터 효소(indicator enzymes), 라디오레이블, 형광체, 또는 상자성 입자를 사용한다.

전립선 세포에서 항원의 개선된 존재에 대한 양성인 환자는 전립선암의 발생 위험을 갖거나 또는 전립선암의 발생 위험이 증가된 상태에 있는 것으로 진단될 것이다. 또한, 항원 발현 수준은 환자의 상태를 결정하는데 유용하며, 예를 들면 질병이 얼마나 진행되었는지(전립선암의 단계)를 결정하는데 유용할 것이다.

알려진 바와 같이, 본 발명은 사람의 전립선암과 연관된 항원을 코딩하는 신규한 스플라이스 변이체를 제공한다. 또한, 본 발명은 이의 변이체를 포함한다. 본원에서 사용된 "변이체(variants)"는 상기 DNA 서열이 약 50개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 본 DNA 또는 이의 절편을 코딩하는 핵산 서열과 비교하였을 때 약 75% 이상의 상동성, 더 바람직하게는 약 85% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성, 더욱더 바람직하게는 약 95-99% 이상의 상동성이 있는 서열을 의미한다. 상기는 본 유전자의 대립유전자 및 스플라이스 변이체를 포함한다. 또한, 본 발명은 하기에 기술된 바와 같이 높은, 중간 또는 낮은 엄격한 조건(stringency conditions)하에 본 스플라이스 변이체로 하이브리드화되는 핵산 서열을 포함한다.

또한, 본 발명은 목적하는 세포 공급원, 전형적으로 사람의 전립선 세포 또는 조직 시료로부터 수득된 mRNA 라이브러리에서 본 신규한 유전자 또는 이의 일부를 코딩하는 DNA의 증폭을 유도하는 프라이머 쌍을 제공한다. 전형적으로, 상기 프라이머는 약 12-100개 뉴클레오티드이며, 표적 유전자의 전체 또는 대부분의 증폭을 제공할 수 있도록 제조될 것이다.

또한, 본 발명은 완전한 길이의 항원에 특이적인 항체에 결합되거나 또는 유도되는 본 DNA 또는 이의 절편에 의해서 코딩된 항원을 포함한다. 전형적으로, 상기 절편은 길이로 10개 이상의 아미노산, 더 전형적으로 길이로 25개 이상의 아미노산일 것이다.

알려진 바와 같이, 본 DNA 절편은 시험된 전립선 종양 시료의 대부분에서 발현된다. 또한, 본 발명은 상기 유전자를 발현하고 이를 사용하여 상기 암을 검출하고 치료하여 다른 암의 동정을 포함한다. 예를 들면, 본 DNA 절편 또는 이의 변이체는 다른 암, 예를 들면 유방암, 난소암, 췌장암, 폐암 또는 전립선암에서 발현될 것이다. 본질적으로, 본 발명은 암의 검출을 포함하며, 본 신규한 유전자 또는 이의 변이체의 발현은 암 또는 증가된 암의 가능성과 관계가 있다. 본 발명의 연구를 이용하여, 하기의 정의가 제공된다.

"분리된 종양 항원 또는 종양 단백질(isolated tumor antigen or tumor protein)"은 정상의 세포 환경에는 존재하지 않는 단백질을 나타낸다. 상기는 예로서 하기에 기술된 유전자에 의해서 코딩되는 재조합 단백질, 정제된 단백질을 포함하는 약학적 조성물, 상기 정제된 단백질을 포함하는 진단 조성물 및 상기 단백질을 포함하는 분리된 단백질 조성물을 포함하는 조성물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 분리된 전립선 종양 단백질은 실질적으로 순수한 단백질을 포함하며, 이는 실질적으로 다른 단백질을 포함하지 않으며, 바람직하게는 적어도 90% 순수하며, 여기에 포함된 아미노산 서열 또는 본질적으로 동일한 서열을 갖는 천연 상동체 또는 변이체를 포함한다. 자연발생 변이체는 예를들면 본 발명에 따른 돌연변이된 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 종양 세포에서 발견될 수 있다.

"네이티브 종양 항원 또는 종양 단백질(native tumor antigen or tumor protein)"은 하기에 포함된 아미노산을 갖는 단백질의 사람이 아닌 영장류 상동체인 단백질을 나타낸다.

"분리된 전립선 종양 유전자 또는 핵산 서열(isolated prostate tumor gene or nucleic acid sequence)"은 예를들면 사람 또는 사람이 아닌 영장류 크로모좀 DNA에 포함되지 않는 정상의 사람의 세포 환경에는 존재하지 않는 본 발명에 따른 종양 항원을 코딩하는 핵산 분자를 나타낸다. 상기는 본 발명에 따른 유전자, 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 프로브, 검출가능한 부분(예컨대, 형광체 또는 방사성활성 레이블)에 직접 또는 간접적으로 부착된 핵산 서열, 상이한 DNA에 5' 또는 3' 말단에 융합된 본 발명에 따른 유전자를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 DNA 융합, 예컨대 검출가능한 마커 또는 이펙터 부분을 코딩하는 프로모터 또는 DNA를포함하는 벡터를 포함한다. 또한, 실질적으로 동일한 서열을 갖는 자연의 상동체 또는 변이체를 포함한다. 퇴화된 자연발생 상동체는 해당하는 아미노산 서열을 변화하지 않는 뉴클레오티드 차이를 포함하는 동일한 단백질을 코딩한다. 자연 발생 변이체는 종양 세포에서 발견되며, 상기 뉴클레오티드 차이는 변이체 종양 항원을 유도할 수 있다. 보존 치환(conservative substitutions)을 포함하는 자연발생 상동체가 또한 포함된다.

"전립선 종양 항원 또는 종양 단백질의 변이체(variant of prostate tumor antigen or tumor protein)"는 서열 상동성이 하기에 정의된 바와 같이 해당하는 네이티브 종양 항원에 대해서 적어도 90% 서열 상동성, 더 바람직하게는 적어도 91% 서열 상동성, 좀더 바람직하게는 적어도 92% 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 93% 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 94% 서열 상동성, 좀더 바람직하게는 적어도 95% 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 96% 서열 상동성, 좀더 바람직하게는 적어도 97% 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 서열 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 나타낸다. 바람직하게, 상기 변이체는 통상 네이티브 단백질과 함께 적어도 하나의 생물학적 특성을 포함할 것이다.

"전립선 종양 유전자 또는 핵산 분자 또는 서열의 변이체(variant of prostate tumor gene or nucleic acid molecule or sequence)"는 "서열 상동성(sequence identity)"이 하기에 정의된 바와 같이 해당하는 네이티브 사람의 핵산 서열에 대해서 적어도 90% 서열 상동성, 더 바람직하게는 적어도 91% 서열 상동성, 더 바람직하게는 적어도 92% 서열 상동성, 좀더 바람직하게는 적어도 93% 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 94% 서열 상동성, 좀더 바람직하게는 적어도 95% 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 96% 서열 상동성, 좀더 바람직하게는 적어도 97% 서열 상동성, 좀더 바람직하게는 적어도 98% 서열 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 핵산 서열을 나타낸다.

"핵산 분자 또는 서열을 코딩하는 전립선 항원의 절편(fragment of prostate antigen encoding nucleic acid molecule or sequence)"은 네이티브 사람의 유전자의 일부에 해당하는 핵산 서열을 나타내며, 상기 일부는 길이로 적어도 약 50개의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 길이로 적어도 150개의 뉴클레오티드이다.

"전립선 종양 항원의 항원 절편(antigenic fragments of prostate tumor antigen)"은 자체로 사용되거나 또는 면역 담체에 부착되어 사용될 때 단백질에 특이적으로 결합되는 항체를 유도하는 전립선 단백질의 절편 또는 이의 변이체 또는 상동체에 해당하는 폴리펩티드를 나타낸다. 전형적으로, 상기 항원 절편은 길이로 적어도 8-15개의 아미노산이며, 더 길 수도 있다.

서열 상동성 또는 상동성 비율은 2개의 서열들이 레이저진 바이오컴퓨팅 소프트웨어(Lasergene biocomputing software, DNASTAR, INC, Madison, WI)에서 다수의 서열 정렬의 Clustal method [Higgins et al., Cabios 8:189-191 (1992)] 또는 제네틱 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, GCG Wisconsin package, Accelrys, San Diego, CA)에서 이용할 수 있는 정렬 프로그램을 사용하여 정렬되는 경우, 사람의 단백질 A 또는 단백질 B 또는 유전자 A 또는 유전자 B에 대해서 2개의 서열들 사이에 공유하는 상기의 비율을 의미한다. 상기 방법에서, 다수의 정렬은 진행하는 방식으로 실시되며, 더 큰 정렬 그룹은 일련의 이중 정렬(pairwise alignments)로부터 계산된 유사성 스코어를 사용하여 조합된다. 최적의 서열 정렬은 최대 정렬 스코어를 찾음으로써 수득되며, 정렬에서 별개의 잔기들 사이에서 모든 스코어의 평균이며, 주어진 진화 간격에 대해서 2개의 연관된 단백질에서 발생되는 주어진 아미노산 변화의 가능성을 나타내는 잔기 중량 테이블로부터 결정된다. 정렬에서 오프닝(opening) 및 연장(lengthening) 갭에 대한 페널티가 스코어에 제공된다. 상기 프로그램에서 사용된 디폴트 파라미터(efault parameters)는 하기와 같다: 다중 정렬에 대한 갭 페널티(gap penalty)=10; 다중 정렬에 대한 갭 길이 페널티(gap length penalty)=10; 이중 정렬에서 k-tuple value=1; 이중 정렬에서 갭 페널티=3; 이중 정렬에서 윈도우 값(window value)=5; 이중 정렬에 저장된 다이아고날(diagonals)=5. 정렬 프로그램에 대해 사용된 잔기 중량 테이블은 PAM25O [Dayhoffet al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff, Ed., NDRF, Washington, Vol. 5, suppl. 3, p. 345, (1978)]이다.

보존 비율(percent conservation)은 2개의 잔기가 보존 치환[PAM250 잔기 중량 테이블에서 0.3 이상의 로그 오드 값(log odds value)을 갖는 것으로 정의됨]을 나타내는 위치의 비율에 동일한 잔기의 비율을 첨가함으로써 상기 정렬로부터 계산된다. 보존은 사람이 아닌 유전자 A 또는 유전자 B, 예를 들면 마우스 유전자 A 또는 유전자 B에 의해 보존 비율을 결정하는 경우, 보존 비율을 결정하는 경우 사람의 유전자 A 또는 유전자 B를 참고한다. 상기 요건을 만족하는 보존 아미노산 변화는 다음을 포함한다: R-K; E-D, Y-F, L-M; V-I, Q-H.

폴리펩티드 절편

본 발명은 상술된 단백질의 폴리펩티드 절편을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 절편은 단백질의 적어도 8개, 더 바람직하게는 적어도 25개, 좀 더 바람직하게는 적어도 50개의 아미노산 잔기 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 특히 상기 절편은 해당하는 유전자에 의해서 코딩된 폴리펩티드의 적어도 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 225개, 250개, 275개 잔기를 포함할 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 단백질 절편은 네이티브 단백질의 대부분, 예를들면 네이티브 단백질의 약 100개의 인접하는 잔기를 포함할 것이다.

생물학적 활성 변이체

본 발명은 또한 네이티브 단백질과 적어도 80%, 더 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95-99% 유사한 아미노산 서열을 포함하는 하기에 기술된 신규한 전립선 단백질의 변이체를 포함한다.

생물학적 또는 면역학적 활성을 없애지 않으면서 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 참고문은 당분야에 잘 공지된 컴퓨터 프로그램, 가령 DNASTAR 또는 소프트웨어(Genectics Computer Group, GCG)를 사용하여 알 수 있다. 바람직하게, 단백질 변이체에서 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 예를들면 유사하게 하전되거나 또는 하전되지 않은 아미노산의 치환이 있다. 보존적 아미노산 변화는 이들의 곁사슬에 관련된 아미노산 패밀리 중 하나의 치환을 포함한다. 자연발생 아미노산은 통상 3개의 패밀리로 나눈다: 산성 아미노산(아스파테이트, 글루타메이트), 염기성 아미노산(리신, 아르기닌,히스티딘), 비극성 아미노산(알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판) 및 하전되지 않은 극성 아미노산(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스틴, 세린, 트레오닌, 티로신). 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로서 함께 분류된다.

뮤테인(mutein)으로 불리는 돌연변이체의 서브세트(subset)는 세린과 같은 중성 아미노산이 디설파이드 결합에 관여하지 않는 시스테인 잔기로 치환된 폴리펩티드 그룹이다. 상기 돌연변이체는 원래 분비되는 단백질에서보다 더 넓은 온도 범위에서 안정하다. Mark et al., 미국 특허 제4,959,314호 참조.

이소루신 또는 발린에 의한 루신의 분리된 대체, 글루타메이트에 의한 아스파테이트의 분리된 대체, 세린에 의한 트레오닌의 분리된 대체 또는 구조적으로 관련된 아미노산에 의한 아미노산의 유사한 대체는 생성된 분리된 단백질 또는 폴리펩티드 변이체의 생물학적 특성에 주된 영향을 주지 않을 것으로 기대된다.

단백질 변이체는 글리코실화 형태, 다른 분자와 공격적 콘쥬게이트, 및 관련되지 않은 화학적 부분과 공유적 콘쥬게이트를 포함한다. 또한, 단백질 변이체는 대립유전자 변이체, 종 변이체 및 뮤테인을 포함한다. 유전자의 상이한 발현에 영향을 주지 않는 영역의 절단 또는 결실은 또한 변이체이다. 공유 변이체는 당분야에 공지된 바와 같이 N-말단 또는 C-말단 잔기에서 또는 아미노산 사슬에서 발견되는 그룹에 관능성을 연결시킴으로써 제조될 수 있다.

당분야에서 본 발명의 전립선 단백질의 일부 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능에서 상당한 효과 없이 변화될 수 있다. 서열에서 차이를 고려한다면, 활성을 결정하는 단백질에서 중요한 영역이 있음을 기억해야 한다. 통상, 유사한 기능을 실시하는 잔기가 사용된다면, 3차 구조를 형성하는 잔기를 대체할 수 있다. 다른 예에서, 잔기의 형태는 변경이 단백질의 중요하지 않은 영역에서 일어난다면 완전히 중요하지 않을 수 있다. 아미노산의 대체는 세포 표면 수용체에 결합의 선택도를 변경할 수 있다. Ostade 등의 Nature 361:266-268 (1993)에서는 2개의 공지된 형태의 TNF 수용체 중 하나에 TNF-알파의 선택적 결합을 일으키는 특정 돌연변이화를 기술하고 있다. 그러므로, 본 발명의 폴리펩티드는 자연 돌연변이화 또는 사람의 조작(human manipulation)으로부터 1 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 필적하는 발현 패턴을 나타내거나 또는 항원 영역을 포함하는 하기에 기술된 전립선 단백질의 변이를 포함한다. 상기 돌연변이체는 결실, 삽입, 역위, 반복 및 부위 치환을 포함한다. 아미노산 변화가 표현형이 사일런트(silent)되는 것과 관련된 참고문은 Bowie, J.U., 등의 "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990)에서 찾을 수 있다.

특히 하전된 아미노산이 다른 하전된 아미노산 및 중성 또는 음전하를 띤 아미노산으로 치환된 것이 흥미롭다. 후자의 예로는 기술된 단백질의 특성을 향상시키기위해서 감소된 양전하를 가진 단백질이 생성된다. 응집이 방지되는 것은 매우 바람직하다. 단백질의 응집은 활성이 손실될 뿐만 아니라 약학적 제제로 제조될 때 이들이 면역원(immunogenic)이 될 수 있기 때문에 문제가 될 수 있다(Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)).

기능에 있어서 필수적인 본 발명의 폴리펩티드에서 아미노산은 당분야에 공지된 방법, 가령 부위-지향 돌연변이화(site-directed mutagenesis) 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이화(alanine-scanning mutagenesis)에 의해서 동정될 수 있다(Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). 상기 후자의 절차는 분자내 모든 잔기에서 1개의 알라닌 돌연변이를 도입한다. 그후 수득된 돌연변이체 분자가 자연 또는 합성 결합 파트너에의 결합과 같은 생물학적 활성을 시험한다. 리간드-수용체 결합에 중요한 부위는 결정화, 핵자기공명 또는 광친화 레이블링(photoaffinity labeling)과 같은 구조적 분석에 의해서 결정될 수 있다(Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) and de Vos et al. Science 255: 306-312 (1992)).

상술된 바와 같이, 단백질의 폴딩(folding)과 활성에 상당한 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환과 같은 작은 특성의 변화는 바람직하다. 물론, 당분야의 통상의 지식을 가진 사람이 실시한 아미노산 치환의 수는 상술된 것을 포함하는 많은 요인에 따라 좌우될 수 있다. 통상, 주어진 폴리펩티드에 대한 치환의 수는 50 이하, 40 이하, 30 이하, 25 이하, 20 이하, 15 이하, 10 이하, 5 이하 또는 3 이하이다.

융합 단백질

본 전립선 종양 항원의 단백질 또는 폴리펩티드 절편을 포함하는 융합 단백질이 제조될 수 있다. 융합 단백질은 아미노산 서열에 대항하는 항체의 생성 및 다양한 분석 시스템에 사용하는데 유용하다. 예를들면 융합 단백질은 본 발명의 단백질과 반응하거나 이의 생물학적 기능을 방해하는 단백질을 동정하는데 사용될 수 있다. 물리적 방법, 가령 단백질 친화 크로마토그래피, 또는 단백질-단백질 반응에 대한 라이브러리계 분석(library-based assays), 가령 효모 2개 하이브리드 또는 파아지 디스플레이 시스템(yeast two-hybrid or phage display systems)이 상기 목적에 대해서 사용될 수 있다. 상기 방법은 당분야에 잘 공지되어 있으며 약물 스크린(drug screens)으로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 단백질의 하나의 서열 및/또는 막횡단 영역(transmembrane domain)을 포함하는 융합 단백질 또는 이의 절편이 사용되어 영역이 통상 발견되지 않은 세포 위치에 다른 단백질 영역을 표적화하고, 가령 세포막 또는 세포외 분비에 관련된다.

융합 단백질은 펩티드 결합에 의해서 함께 융합된 2개의 단백질 세그먼트를 포함한다. 알려진 바와 같이, 상기 절편은 약 8개의 아미노산 내지 완전한 길이의 단백질의 크기일 수 있다.

제2 단백질 세그먼트는 완전한 길이의 단백질 또는 폴리펩티드 절편일 수 있다. 융합 단백질 제조에 통상 사용되는 단백질은 β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 녹색 형광 단백질(GFP), 자동형광 단백질(청색 형광 단백질(BFP)을 포함함), 글루타티온-S-트란스퍼라제(GST), 루시퍼라제, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 및 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT)를 포함한다. 또한, 에피토프 태그(epitope tags)가 히스티딘(His) 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그를 포함하는 융합 단백질 제조에 사용될 수 있다. 다른 융합 제조는 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex a DNA 결합 영역(DBD) 융합, GAL4 DNA 결합 영역 융합 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus, HSV) BP 16 단백질 융합을 포함하는 융합 단백질 제조에 사용될 수 있다.

상기 융합은 예를들면 2개의 단백질 세그먼트를 공유 결합하거나 또는 분자 생물 분야에서 표준 절차에 의해서 제조될 수 있다. 재조합 DNA 방법을 사용하여 융합 단백질을 제조하며, 예를들면 당분야에 공지된 바와 같이 본 발명에 따른 가능한 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 DNA 제조물 또는 제2 단백질 세그먼트를 코딩하고 숙주 세포에서 DNA 제조물을 발현하는 뉴클레오티드를 갖는 적당한 리딩 프레임(reading frame)에서 이의 절편을 제조한다. 융합 단백질을 제조하는 많은 키트(kit)는 연구실에 실험 수단을 제공하는 회사로부터 입수할 수 있으며, 예를들면 Promega Corporation(Madison, WI), Stratagene(La Jolla, CA), Clontech(Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA), MBL International Corporation(MIC; Watertown, MA) 및 Quantum Biotechnologies(Montreal, Canada; 1-888-DNA-KITS)를 포함한다.

본 발명의 단백질, 융합 단백질, 또는 폴리펩티드는 재조합 DNA 방법에 의해서 제조될 수 있다. 재조합 단백질, 융합 단백질 또는 폴리펩티드의 제조에 있어서, 단백질을 코딩하는 서열은 당분야에 공지된 발현 시스템을 사용하여 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 상기 발현 시스템은 박테리아, 효모, 곤충 및 포유류 세포를 포함한다.

그후 생성된 발현된 단백질은 당분야에 공지된 정제 방법을 사용하여 배양 세포의 추출물 또는 배양 매질로부터 정제될 수 있다. 예를 들면, 배양 매질로 완전히 분비된 단백질에 있어서, 세포-유리 매질은 아세트산나트륨으로 희석될 수 있고 양이온 교환 수지와 접촉하여 소수성 반응 크로마토그래피를 실시한다. 상기 방법을 사용하여, 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드는 전형적으로 95% 이상 순수하다. 추가의 정제는 예를 들면 상술된 기술 중 어느 하나를 사용하여 실시될 수 있다.

효모 또는 박테리아에서 생성된 단백질을 변형하는, 예를들면 기능적 단백질을 수득하기위해서 적당한 부위의 인산화 또는 글리코실화가 필요할 수 있다. 상기 공유 부착물은 공지된 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 정제를 이용할 수 있는 형태로 배양된 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 예를 들면, 단백질 또는 폴리펩티드는 예를들면 말토스 결합 단백질, 글루타티온-S-트란스퍼라제 또는 티오레독신을 포함하는 융합 단백질로서 발현되고 시판용 키트를 사용하여 정제될 수 있다. 상기 융합 단백질의 발현 및 정제용 키트는 New England BioLabs, Pharmacia, 및 Invitrogen과 같은 회사로부터 이용할 수 있다. 단백질, 융합 단백질 또는 폴리펩티드는 에피토프, 가령 "플래그(Flag)" 에피토프(Kodak)로 태그를 달고, 상기 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 정제된다.

본원에 기술된 서열을 통해 동정된 단백질 변이체의 코딩 서열은 형질전환 동물(transgenic animals), 가령 마우스(mice), 래트(rats), 기니 피그(guinea pigs), 소(cows), 염소(goats), 돼지(pigs) 또는 양(sheep)을 제조하는데 사용될 수 있다. 그후 암컷 형질전환 동물은 이들의 우유에서 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 제조할 수 있다. 상기 동물을 제조하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다.

선택적으로, 합성 화학 방법, 가령 고체상 펩티드 합성이 사용되어 분비된 단백질 또는 폴리펩티드를 합성할 수 있다. 펩티드, 유사체 또는 유도체의 제조에 대한 일반적 수단은 Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins -- A Survey of Recent Developments, B. Weinstein, ed. (1983)에 개시되어 있다. 정상 L-입체이성질체에 대한 D-아미노산의 치환은 상기 분자의 반감기를 증가시키기위해서 실시될 수 있다.

전형적으로, 상동의 폴리뉴클레오티드 서열은 당분야에 공지된 바와 같이 엄격한 조건하에 하이브리드화에 의해서 확인될 수 있다. 예를 들면, 하기의 세정 조건: 2 x SSC (0.3 M NaCl, 0.03 M 시트르산나트륨, pH 7.0), 0.1% SDS, 실온 2번, 각각 30분; 그후 2 x SSC, 0.1% SDS, 50 ℃ 한번, 30분; 그후 2 x SSC, 실온 2번, 각각 10분을 사용하여, 약 25-30 % 이하의 염기쌍 미스매치(mismatch)를 포함하는 상동의 서열이 동정될 수 있다. 더 바람직하게는 상동의 핵산 가닥은 15-25%의 염기쌍 미스매치를 포함하며, 좀더 바람직하게는 5-15%의 염기쌍 미스매치를 포함한다.

본 발명은 또한 예를들면 노던 또는 서던 블로팅 또는 계내 하이브리드화(situ hybridizations)와 같은 하이브리드화 프로토콜에서 상보적 뉴클레오티드 서열을 검출하는데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브는 본원에 제공된 핵산 서열의 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 또는 40 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브는 검출가능한 레이블, 가령 라디오이소토프(radioisotopic), 형광, 효소 또는 화학발광(chemiluminescent) 레이블을 포함할 수 있다.

본원에 기술된 cDNA 서열에 해당하는 분리된 유전자가 또한 제공된다. 표준 분자 생물 방법은 본원에 제공된 cDNA 서열을 사용하여 해당하는 유전자를 분리하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 사람을 포함하는 포유류 동물, 게놈 라이브러리 또는 사람 게놈 DNA의 다른 공급원으로부터의 유전자를 동정 또는 증폭하는데 사용되는 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열로부터 프로브 또는 프라이머의 제조를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는 폴리뉴클레오티드 증폭 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드의 부가의 카피(copy)를 수득하기위해서 프라이머로서 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자는 당분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 벡터 및 세포주에서 증식될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자는 직쇄형 또는 환형 분자일 수 있다. 상기는 복제 서열 없이 자율 복제 분자 또는 분자에 존재할 수 있다. 상기는 당분야에 공지된 바와 같이 자체 또는 다른 조절 서열에 의해 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드 구조물

본원에 기술된 서열들을 통해 동정된 유전자 변이체의 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자는 폴리뉴클레오티드 구조물, 가령 DNA 또는 RNA 구조물에 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는 예를 들면 숙주 세포에서 단백질, 변이체, 융합 단백질 또는 단쇄 항체의 전부 또는 일부를 발현하기위해서 발현 구조물에 사용될 수 있다. 발현 구조물은 선택된 숙주 세포에서 관능성인 프로모터를 포함한다. 당분야의 통상의 지식을 가진 사람은 당분야에서 공지되고 사용되는 다수의 세포 타입-특이적 프로모터로부터 적당한 프로모터를 용이하게 선택할 수 있다. 발현 구조물은 또한 숙주 세포에서 관능성인 전사 종결자를 포함할 수 있다. 발현 구조물은 목적하는 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 세그먼트는 프로모터의 다운스트림에 위치한다. 폴리뉴클레오티드 세그먼트의 전사는 프로모터에서 개시된다. 발현 구조물은 직쇄형 또는 환형일 수 있으며, 목적한다면 자동 복제를 위한 서열을 포함한다.

결합된 단백질 코딩 서열 및/또는 검출가능하거나 또는 선택가능한 마커(marker)를 코딩하는 다른 서열에 연결된 본 신규한 유전자의 UTR 서열 및 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 또한 포함한다. 상기 프로모터 및/또는 UTR계 구조물은 단백질 발현의 전사 및 해독 조절을 연구하고, 활성 및 저해 조절 단백질을 동정하는데 유용하다.

숙주 세포

발현 구조물은 숙주 세포로 도입될 수 있다. 발현 구조물을 포함하는 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 박테리아에서 발현 시스템은 Chang et al., Nature 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature 281: 544 (1979); Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980); EP 36,776; U.S. 4,551,433; deBoer et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 80: 21-25 (1983); 및 Siebenlist et al., Cell 20: 269 (1980)에 기술된 것을 포함한다.

효모에서 발현 시스템은 Hinnnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929 (1978); Ito et al., J Bacteriol 153: 163 (1983); Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. 6: 142 (1986); Kunze et al., J Basic Microbiol. 25: 141 (1985); Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459 (1986), Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202: 302 (1986)); Das et al., J Bacteriol. 158: 1165 (1984); De Louvencourt et al., J Bacteriol. 154:737 (1983), Van den Berg et al., Bio/Technology 8: 135 (1990); Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25: 141 (1985); Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3376 (1985); U.S. 4,837,148; U.S. 4,929,555; Beach and Nurse, Nature 300: 706 (1981); Davidow et al., Curr. Genet. 10: 380 (1985); Gaillardin et al., Curr. Genet. 10: 49 (1985); Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112: 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26: 205-22 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 81: 1470-1474 (1984); Kelly and Hynes, EMBO J. 4: 475479 (1985); EP 244,234; 및 WO 91/00357에 기술된 것을 포함한다.

곤충에서 이종 유전자의 발현은 U.S. 4,745,051; Friesen et al. (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression" in: THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (W. Doerfier, ed.); EP 127,839; EP 155,476; Vlak et al., J. Gen. Virol. 69: 765-776 (1988); Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. 42: 177 (1988); Carbonell et al., Gene 73: 409 (1988); Maeda et al., Nature 315: 592-594 (1985); Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell Biol. 8: 3129 (1988); Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8404 (1985); Miyajima et al., Gene 58: 273 (1987); 및 Martin et al., DNA 7:99 (1988)에 기술된 바와 같이 실시될 수 있다. 다수의 바큐로바이러스 균주(baculoviral strains) 및 변이체 및 숙주로부터 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포는 Luckow et al., Bio/Technology (1988) 6: 47-55, Miller et al., in GENETIC ENGINEERING (Setlow, J.K. et al. eds.), Vol. 8, pp. 277-279 (Plenum Publishing, 1986); 및 Maeda et al., Nature, 315: 592-594 (1985)에 기술되어 있다.

포유류 발현은 Dijkema et al., EMBO J. 4: 761(1985); Gormanetal, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777 (1982b); Boshart et al., Cell 41: 521 (1985); 및 U.S. 4,399,216에 기술된 바와 같이 실시될 수 있다. 포유류 발현의 다른 특징은 Ham and Wallace, Meth Enz. 58: 44 (1979)에 기술된 바와 같이 실시할 수 있다.

발현 구조물은 당분야에 공지된 기술을 사용하여 숙주 세포로 도입될 수 있다. 상기 기술은 트란스페린-다중양이온-매개 DNA 전달(transferrin-polycation-mediated DNA transfer), 네이키드 또는 캡슐화 핵산에 의한 형질감염, 리포좀-매개 세포 융합, DNA-코팅된 라텍스 비드의 세포내 송달, 프로토플라스트 융합, 바이러스 감염, 일렉트로포레이션(electroporation), "유전자 건(gene gun)" 및 인산칼슘-매개 형질감염을 포함한다.

본 발명은 또한 융합 단백질, 절편 및 하이브리드, 및 특정 아미노산이 결실 또는 대체된 변형된 형태, 1 이상의 아미노산이 변형된 아미노산 또는 비정상의 아미노산으로 변경된 변형을 포함하는 하이브리드 및 이의 변형된 형태를 포함할 수 있다.

실질적으로 상동의 의미안에 본원에 기술된 유전자에 의해서 코딩된 단백질에 대한 항체와 교차-반응에 의해서 분리될 수 있거나 게놈 DNA, mRNA 또는 cDNA를 포함하는 코딩 뉴클레오티드 서열은 본원의 유전자의 게놈 또는 서브게놈 서열 또는 cDNA 또는 이의 절편의 상보 서열과 하이브리드화를 통해 분리될 수 있는 사람 또는 사람이 아닌 영장류 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 당분야의 통상의 지식을 가진 사람은 퇴화된 DNA 서열은 본 발명에 따른 종양 단백질을 코팅하고 본 발명안에서 본 유전자의 대립유전자 변이체를 포함하는 것을 이해할 것이다.

재조합 DNA 기술에 의해서 제조된 본 발명에 따른 전립선 단백질이 바람직하다. "순수 형태(pure form)" 또는 "순수한 형태(purified form)" 또는 "실질적으로 순수한 형태(substantially purified form)"라는 것은 단백질 조성물이 목적하는 단백질 아닌 다른 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 것을 의미한다.

본 발명은 또한 질환을 가지고 있는 환자를 치료하기위해 유효량의 본 발명에 따른 단백질을 포함하는 치료적 또는 약학적 조성물, 치료적 유효량의 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 상기 조성물 및 방법은 전립선암과 같은 본 단백질과 결합된 암을 치료하는데 유용하다. 당분야의 통상의 지식을 가진 사람은 당분야에 공지된 다양한 분석을 용이하게 사용하여 상기 단백질이 특정 세포 형태에서 생존을 촉진하거나 또는 기능화하는데 유용한지를 측정할 수 있다.

항전립선 항원 항체

알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 진단 및 치료에 사용되는 항-전립선 항원 항체 및 절편의 제조 및 용도를 포함한다. 상기 항체는 폴리클로날(polyclonal) 또는 모노클로날(monoclonal)일 수 있다. 폴리클로날 항체는 항원을 주입함으로써 토끼 또는 다른 동물을 면역화하고 적당한 간격에서 연이어 부스트(boost)함으로써 제조될 수 있다. 상기 동물에서 혈액을 채취하고 혈청은 해당하는 유전자의 작용을 차단할 수 있는 역량에 기초하여 ELISA 또는 생물학적평가법(bioassay)에 의해서 정제된 단백질에 대해서 분석한다. 조류, 예를 들면 닭, 칠면조 등을 사용하는 경우, 항체는 알의 난황으로부터 분리될 수 있다. 모노클로날 항체는 면역화된 마우스로부터의 비장세포(splenocyte)를 골수종(myeloma) 또는 임프종세포(lymphoma cells)와 같은 복제된 종양 세포와 융합함으로써 Milstein 및 Kohler 방법후에 제조될 수 있다. [Milstein and Kohler, Nature 256:495-497 (1975); Gulfre and Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone and Banatis eds., Academic Press, (1981). 상기는 참고문으로 통합됨]. 그후 형성된 혼성종양세포(hybridoma cells)는 희석 방법을 한정함으로써 클로닝되고 수퍼네이트(supernates)가 ELISA, RIA 또는 생물학적평가법에 의해서 항체 제조에 대해서 분석한다.

표적 단백질을 인식하고 특이적으로 결합하는 항체의 독특한 역량은 단백질 과발현을 처리하기위한 접근법을 제공한다. 그러므로, 본 발명의 다른 측면은 단백질에 대한 특정 항체로 환자를 치료함으로써 단백질을 과발현을 포함하는 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

단백질에 대한 특정 항체, 폴리클로날 또는 모노클로날이 상술된 바와 같이 당분야에 공지된 적당한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 예를들면 바람직하게는 진핵 세포 쥐의 골수기질(murine) 또는 사람의 모노클로날 항체에서 재조합 방법에 의해서 혼성종양세포 기술에 의해서 제조될 수 있으며, 또는 선택적으로 단백질, 또는 이의 면역 활성 절편, 또는 항-이디오타이프(anti-idiotypic) 항체, 또는 이의 절편이 동물로 투여되어 단백질을 인식하고 단백질에 결합할 수 있는 항체의 제조를 유도한다. 상기 항체는 이에 한정되는 것은 아니지만 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE를 포함하는 항체의 부류 또는 조류종의 경우 IgY 및 항체의 서브클래스로부터 유래된다.

분리된 단백질의 이용가능성은 HTS 방법(high-throughput screening methods)의 일반적 적용을 통해 결합 파트너에 대한 단백질의 결합을 저해하는 작은 분자 및 저분자량 화합물을 동정한다. HTS 방법은 통상 치료 가능성에 있어서 선두 화합물의 빠른 분석을 허용하는 기술을 나타낸다. HTS 기술은 시험 물질의 로보트 취급을 사용하여, 양성 시그날을 검출하고 데이터를 해석한다. 선두 화합물은 방사능의 혼입 또는 해석을 위해 흡광도, 형광 또는 발광에 따라 좌우되는 광학 분석을 통해 동정될 수 있다. [Gonzalez, J.E. et al., Curr. Opin. Biotech. 9:624-631 (1998)].

예를들면 리간드 결합에 대한 단백질과의 경쟁에 의해서 리간드와 단백질의 반응을 저해하는 화합물에 대한 스크리닝을 통해 사용을 위해 조절될 수 있는 모델 시스템이 이용가능하다. Sarubbi et al., Anal. Biochem. 237:70-75 (1996)에서는 IL-1 수용체의 활성 부위에 결합하기위한 자연 리간드와 경쟁하는 분자를 발견하기위해서 세포-유리, 비(非)-이소토프 분석을 기술하고 있다. Martens, C. et al., Anal. Biochem. 273:20-31 (1999)에서는 총칭적인 입자계 비(非)방사능 방법을 기술하고 있으며, 레이블된 리간드는 입자에 고정된 이의 수용체에 결합되고, 수용체 결합에 대한 레이블된 리간드와 경쟁하는 분자의 존재에서 입자상 레이블이 감소된다.

항체 제조

(i) 개시 물질 및 방법

면역글로불린(Ig) 및 이의 특정 변이체가 공지되어 있으며, 재조합 세포 배양으로 제조될 수 있다. 예를들면 미국 특허 제4,745,055호; EP 256,654; EP 120,694; EP 125,023; EP 255,694; EP 266,663; WO 30 88/03559; Faulkneret al., Nature, 298: 286 (1982); Morrison, J. Immun., 123: 793 (1979); Koehler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 2197 (1980); Raso et al., Cancer Res., 41: 2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol, 2: 239 (1984); Morrison, Science, 229: 1202 (1985); and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984). 재분류된 면역글로불린 사슬(reassorted immunoglobulin chains)이 또한 공지되어 있다. 예를들면 미국특허 제4,444,878호; WO 88/03565; 및 EP 68,763 및 그안에 인용된 참고문을 참조한다. 본 발명의 키메라(chimeras)에서 면역글로불린 부분은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 서브타입, IgA, IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 수득되며, 바람직하게는 IgG-1 또는 IgG-3으로부터 수득된다.

(ii) 폴리클로날 항체

본 전립선 항원에 대한 폴리클로날 항체는 항원 및 보조제의 다수의 피하(sc) 또는 복강(ip) 주사에 의해서 동물에서 일반적으로 증가된다. 이관능성 또는 유도체화 제제, 예를들면 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 콘쥬게이션), N-히드록시숙신이미드(리신 잔기를 통해), 글루타르알데히드 또는 숙신산 무수물을 사용하여 면역화될 종에서 면역종, 예를들면 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소의 티로글로불린(bovine thyroglobulin) 또는 통 트립신 저해제인 단백질에 대한 표적 아미노산 서열을 포함하는 항원 또는 절편을 콘쥬게이트하는데 유용할 수 있다.

약 1 mg 또는 또는 1.μg 의 펩티드를 결합하거나 또는 3 부피의 프런드(Freund) 경쟁 보조제와 콘쥬게이트(각각 토끼 또는 마우스에 대해서)함으로써 폴리펩티드 또는 절편, 면역원성 콘쥬게이트 또는 유도체에 대해서 동물이 면역화된다. 한달 후에, 동물은 다수의 부위에서 피하 주사에 의해서 프런드 경쟁 보조제에서 펩티드 원래 양의 1/5 내지 1/10으로 부스트된다. 7일 내지 14일 후에, 동물에서 혈액을 채취하고 혈청은 항체 역가 내지 항원 또는 이의 절편에 대해서 분석된다. 동물은 역가 플래토(titer plateaus)까지 부스트된다. 바람직하게, 상기 동물은 동일한 폴리펩티드 또는 이의 절편의 콘쥬게이트로 부스트되지만, 그러나 상이한 단백질에 콘쥬게이트되고/되거나 상이한 가교 시약을 통해 콘쥬게이트된다. 또한, 콘쥬게이트는 단백질이 융합될 때 제조합 세포 배양에서 만들어질 수 있다. 또한, 알룸(alum)과 같은 응집 제제가 적당하게 사용되어 면역 반응을 향상시킨다.

(iii) 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 실질적으로 상동인 항체의 개체로부터 수득되며, 예컨대 상기 개체를 포함하는 개개의 항체는 소량으로 존재하는 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 그러므로, 변형제 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다.

예를들면, 본 발명을 실시하기위해서 사용하는 모노클로날 항체는 Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975)에 의해서 기술된 혼성종양세포 방법을 사용하여 생성될 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법(Cabilly et al., supra)에 의해서 생성될 수 있다.

혼성종양세포 방법에서, 마우스 또는 다른 적당한 숙주 동물(가령 햄스터)이 상기에서 기술된 바와 같이 면역화되어 면역화에 사용되는 항원 또는 이의 절편에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 또는 생성할 수 있는 임파구를 유도한다. 선택적으로, 임파구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 그후 임파구는 적당한 융합 제제(fusing agent), 가령 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합되어 혼성종양세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 [Academic Press, 1986]).

이와 같이 제조된 혼성종양세포는 융합되지 않고 모체가 되는 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 1 이상의 물질을 포함하는 적당한 배양 배지에 시딩(seed)되고 성장한다. 예를 들면, 모체가 되는 골수종 세포는 효소인 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트란스퍼라제(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase)(HGPRT 또는 HPRT)가 부족하다면, 혼성종양세포에 대한 배양 배지는 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하며(HAT 배지), 상기 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 저해한다.

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생성 세포에 의해서 항체의 안정한 높은 수준의 생성을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감성이 있는 것이다. 상기들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 쥐의 골수종주, 가령 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA를 이용할 수 있음) 및 SP-2 세포(American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA를 이용할 수 있음)로부터 유래된 것이 바람직하다.

혼성종양세포가 성장하고 있는 배양 배지는 전립선 항원에 대해서 모노클로날 항체의 제조에 대해서 분석된다. 바람직하게, 혼성종양세포에 의해서 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침강법(immunoprecipitation) 또는 시험관내 결합 분석, 가령 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA) 또는 효소면역측정법(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)에 의해서 측정된다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를들면 스캐차드 분석(Scatchard analysis)에 의해서 측정될 수 있다[Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980)].

목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 혼성종양세포가 동정된 후에, 클론은 희석 절차를 한정함으로써 서브클로닝되고 표준 방법에 의해서 성장한다(Goding, supra). 상기 목적을 위한 적당한 배양 배지는 예를들면 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 혼성종양세포는 생체내에서 동물내 복수 종양(ascites tumors)으로서 성장할 수 있다.

서브들론(subdlones)에 의해서 분비되는 모노클로날 항체는 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 종래의 면역글로불린 정제 방법, 가령 예를들면 단백질 A-세파로스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기이동, 투석 또는 친화 크로마토그래피에 의해서 적당하게 분리된다.

본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 용이하게 분리되고 종래의 절차를 사용하여 시퀀싱된다(예를들면 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함). 본 발명의 혼성종양 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 일단 분리되면, 상기 DNA는 발현 벡터에 있고, 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 가령 E. coli 세포, 원숭이(simian) COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포로 형질감염되어 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서 재조합 발현에 관련된 문헌은 Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)을 포함한다.

상기 DNA는 또한 예를들면 상동의 쥐의 서열 대신에 사람의 중쇄 및 경쇄 일정 영역에 대한 코딩 서열을 치환하거나(Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 [1984]) 또는 비(非)면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변경될 수 있다. 상기 방식에서, 본원에서 항-전립선 항원 모노클로날 항체의 특이적 결합을 갖는 "키메라(chimeric)" 또는 "하이브리드(hybrid)" 항체가 제조된다.

전형적으로, 상기 비(非)면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 일정 영역에 대해 치환되거나, 또는 본 발명의 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 영역에 대해서 치환되어 본 발명에 따른 전립선 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 다른 항원에 대해서 특이성을 갖는 또다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 형성한다.

키메라 또는 하이브리드 항체는 가교제를 포함하는 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조된다. 예를들면 면역독성물질(immunotoxins)은 티오에테르 결합을 형성함으로써 또는 디설파이드-교환 반응을 사용하여 제조될 수 있다. 상기 목적에 대한 적당한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함한다.

(iv) 인간화된 항체(humanized antibodies)

사람이 아닌 항체를 인간화(humanizing)하는 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다. 통상, 인간화된 항체(humanized antibody)는 인간이 아닌 공급원으로부터 이로 도입된 1 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 상기 비(非)인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기라고 하고, 전형적으로 "임포트" 가변 영역으로부터 얻어진다. 인간화(humanization)는 본질적으로 Winter와 공동 연구자(Jones et al., Nature 321, 522-525 [1986]; Riechmann et al., Nature 332, 323-327 [1988]; Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 [1988])의 방법을 실시하고, 설치류 동물 CDRs 또는 CDR 서열을 해당하는 사람의 항체 서열로 치환함으로써 실시된다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 키메라 항체(Cabilly et al., supra)이며, 실질적으로 본래의 사람의 가변 영역보다 적게 사람이 아닌 종으로부터 해당하는 서열로 치환된다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 사람의 항체이며, 일부의 CDR 잔기 및 가능한 일부의 FR 잔기는 설치류 항체에서 유사 부위로부터의 잔기로 치환된다.

인간화 항체를 제조하는데 사용될 사람의 가변 영역(경쇄 및 중쇄)의 선택은 항원성(antigenicity)을 감소시키기위해서 매우 중요하다. 소위 최적 적합(best-fit) 방법에 따라서, 설치류 동물의 항체의 가변성 영역의 서열은 공지된 사람의 가변성-영역 서열의 전체 라이브러리에 대해서 스크린된다. 설치류 동물의 서열과 가장 가까운 사람 서열은 인간화 항체에 대한 사람 프레임워크(human framework, FR)로서 허용된다(Sims et al., J. Immunol, 151: 2296 [1993]; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol, 196: 901 [1987]). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 사람의 항체의 공통 서열(consensus sequence)로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 상기 동일한 프레임워크는 몇가지 상이한 사람의 항체에 대해서 사용될 수 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 [1992]; Presta et al., J. Immnol., 151: 2623 [1993]).

또한, 항체가 항원 및 다른 유익한 생물학적 특성에 대한 높은 친화도를 보유하도록 인간화되는 것이 중요하다. 바람직한 방법에 따라 상기 목표를 달성하기위해서, 인간화된 항체는 모체 서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용하여 모체 서열 및 다양한 개념 인간화된 생성물의 분석 방법에 의해서 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상 이용가능하며, 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 설명하고 나타내는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 상기 표시의 정밀 검사는 후보 면역글로불린 서열의 관능화에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 예를 들면 항원에 결합하기위한 후보 면역글로불린의 역량에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 상기 방법으로, FR 잔기는 공통 서열 및 임포트 서열로부터 선택되고 결합되어 목적하는 항체 특성, 가령 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성될 수 있다. 일반적으로, 상기 CDR 잔기는 직접적, 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는 것을 포함한다.

(v) 사람 항체

사람의 모노클로날 항체는 혼성종양세포 방법(hybridoma method)에 의해서 제조될 수 있다. 사람의 모노클로날 항체의 제조를 위해 사람의 골수종 및 마우스-사람 이종골수종 세포주(mouse-human heteromyeloma cell lines)가 예를들면 Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol, 147: 86-95 (1991)에 기술되어 있다.

현재 면역하에 내인성 면역글로불린 제조의 부재하에 사람의 항체의 완전한 레퍼토리(repertoire)를 생성할 수 있는 형질전환 동물(예를 들면, 마우스)을 제조할 수 있다. 예를 들면, 키메라 및 생식세포계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(J_H) 유전자의 동형접합성 결실(homozygous deletion)로 내인성 항체 생성의 경쟁적 저해를 일으키는 것이 기술되었다. 상기 생식세포라인 돌연변이체 마우스에서 사람의 생식세포라인 면역글로불린 유전자 배열의 전달로 항원 검사(antigen challenge)시에 사람의 항체의 생성을 이끌 것이다. 예를 들면 Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993)을 참조한다.

선택적으로, 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., Nature, 348: 552-553 [1990])은 비(非)면역화된 공여체로부터 면역글로불린 가변성(V) 영역 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 사람의 항체 및 항원 절편을 생성하기위해서 사용될 수 있다. 상기 기술에 따르면, 항체 V 영역 유전자는 필라멘트 박테리오파지, 가령 M13 또는 fd의 대부분 또는 일부 코트 단백질 유전자로 프레임내에서 클로닝되고, 파지 입자의 표면에서 기능성 항체 절편으로서 나타낸다. 상기 필라멘트 입자는 파지 유전자의 단일가닥 DNA 카피를 포함하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 상기 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선택을 이끈다. 그러므로, 상기 파지는 B-세포의 특성 일부와 흡사하다. 파지 디스플레이는 다양한 포멧(formats)으로 실시될 수 있다; 이들의 검토를 위해서, 예를들면 Johnson and Chiswell, Curr. Op. Struct. Biol, 3: 564-571 (1993)을 참조한다. V-유전자 세그먼트의 몇가지 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 작은 랜덤 조합 라이브러리(random combinatorial library)로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 분리한다. 비(非)면역화 사람 공여체로부터 V 유전자의 레퍼토리가 제조될 수 있고, 항원들(자기-항원을 포함함)의 다양한 배열에 대한 항체가 본질적으로 Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993)에 의해 개시된 기술에 의해서 분리될 수 있다.

자연 면역 반응에서, 항체 유전자들은 높은 속도로 돌연변이를 축적한다(체세포성 과변이). 도입된 변화의 일부는 더 높은 친화도를 부여하며, 높은 친화도 표면 면역글로불린을 나타내는 B 세포는 연이은 항원 검사 중에 우세하게 복제 및 분화된다. 상기 자연 방법은 "체인 셔플링(chain shuffling)"으로 알려진 기술을 사용함으로써 모방될 수 있다(Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 [1992]). 상기 방법에서, 파지 디스플레이에 의해서 수득된 "제1(primary)" 사람 항체의 친화도는 비면역화된 공여체로부터 수득된 V 영역 유전자의 자연 발생 변이체의 레퍼토리(레퍼토리)로 중쇄 및 경쇄 V 영역을 연이어 복제함으로써 향상될 수 있다. 상기 기술은 nM 범위에서 친화도를 갖는 항체들 및 항체 절편들을 제조한다. 매우 넓은 파지 항체 레퍼토리를 제조하는 전략은 Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)에 의해 기술되었다.

유전자 셔플링이 또한 사용되어 설치류 항체들로부터 사람의 항체들을 유도하며, 사람의 항체는 개시 설치류 항체에 대한 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅(epitope imprinting)"으로 불리는 상기 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기술에 의해서 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 영역 유전자는 사람의 V 영역 유전자의 레퍼토리로 대체되며, 설치류 동물-사람 키메라를 형성한다. 항원의 선택은 기능성 항원-결합 부위를 회복할 수 있는 사람의 분리를 유도하며, 예를 들면 상기 에피토프가 파트너 선택을 지배한다(각인시킨다). 상기 방법은 남아 있는 설치류 동물의 V 영역을 대체하기위해서 반복될 때, 사람 항체가 수득된다(PCT WO 93/06213, 1993.04.01 공개). CDR 그래프팅(CDR grafting)에 의한 설치류 동물 항체의 종래 인간화와 달리, 상기 기술은 설치류 기원의 프레임워크 또는 CDR 잔기를 갖지 않는 완전한 사람의 항체를 제공한다.

(vi) 이중특이성 항체(bispecific antibodies)

이중특이성 항체는 모노클로날, 바람직하게는 2개 이상의 상이한 항원에 대해서 결합 특이성을 갖는 사람 또는 인간화 항체이다. 본 경우에, 결합 특이성들 중 하나는 본 발명에 따른 전립선 항원에 대한 것이다. 이중특이성 항체를 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있다.

전통적으로, 이중특이성 항체의 재조합 제조는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현(co-expression)에 근거하며, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 [1983]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 분류 때문에, 상기 혼성종양세포(quadromas)는 10개의 상이한 항체 분자들의 가능한 혼합물을 생성하며, 이중 단 하나는 정확한 이중특이성 구조를 갖는다. 통상 친화도 크로마토그래피 단계로 실시되는 정확한 분자의 정제는 복잡하며, 생성물 수율은 낮다. 유사한 방법이 1993년 05월 13일자로 공개된 WO 93/08829 및 Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)에 기술되어 있다.

상이하고 더 바람직한 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체-가변성 영역(항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 일정-영역 서열에 융합된다. 적어도 일부의 힌지(hinge), CH2 및 CH3 영역들을 포함하는 면역글로불린 중쇄 일정 영역과 융합되는 것이 바람직하다. 적어도 하나의 융합에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 일정 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합 및 목적한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNAs가 별개의 발현 벡터로 삽입되고, 적당한 숙주 생물체로 함께 형질감염된다. 상기는 구조에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 다른 비율이 최적 수득율을 제공하는 경우 실시양태에서 3개의 폴리펩티드 절편들의 상호 비율을 조절하는데 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율로 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 생성물 고수율을 수득하는 경우 또는 상기 비율은 특정 중요성을 갖지 않는 경우 하나의 발현 벡터에서 2개 또는 모두 3개의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 삽입할 수 있다. 상기 접근법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이성 항체는 하나의 암(arm)에서 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 암에서 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)을 포함한다. 상기 비대칭 구조는 원치않는 면역글로불린 사슬 결합체로부터 목적하는 이중특이성 화합물의 분리를 용이하게 하며, 이중특이성 분자의 1/2에서 면역글로불린 경쇄의 존재는 용이한 분리 방법을 제공한다.

이중특이성 항체의 생성에 대한 추가의 상세는 예를 들면 Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)을 참조한다.

(vii) 헤테로콘쥬게이트 항체(heteroconjuqate antibodies)

헤테로콘쥬게이트 항체는 본 발명의 범위안에 있다. 헤테로콘쥬게이트 항체는 2개의 공유결합된 항체를 포함한다. 상기 항체는 예를들면 원치않는 세포에 대한 표적 면역계 세포를 제안하며(미국특허 제4,676,980호), HIV 감염 치료를 제안한다(WO 91/00360; WO 92/00373; 및 EP 03089). 헤테로콘쥬게이트 항체는 편리한 가교 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 적당한 가교제는 당분야에 공지되어 있으며, 다수의 가교 기술과 함께 미국특허 제4,676,980호에 기술되어 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 송달 운반체(gene delivery vehicles)에 사용될 수 있다. 유전자 송달 운반체는 바이러스 기원 또는 비(非)바이러스 기원을 가질 수 있다(통상, Jolly, Cancer Gene Therapy 1:51-64 (1994); Kimura, Human Gene Therapy 5:845-852 (1994); Connelly, Human Gene Therapy 1:185-193 (1995); 및 Kaplitt, Nature Genetics 6:148-153 (1994) 참조). 본 발명에 따른 치료의 코딩 서열을 포함하는 구조물 송달을 위한 유전자 치료 운반체는 국부적 또는 전체적으로 투여될 수 있다. 상기 구조물은 바이러스 또는 비(非)바이러스 벡터 접근법을 사용할 수 있다. 상기 코딩 서열의 발현은 내인성 포유류 동물 또는 이종성 프로모터를 사용하여 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구조성이거나 또는 조절될 수 있다. 유전자 치료에 대한 바람직한 운반체는 레트로바이러스(retroviral) 벡터 및 아데노바이러스(adeno-viral) 벡터를 포함한다.

대표적인 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector)의 예로는 Berkner, Biotechniques 6:616-627 (Biotechniques); Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); WO 93/19191; Kolls et al., P.N.A.S. 215-219 (1994); Kass-Bisleret al., P.N.A.S. 90: 11498-11502 (1993); Guzman et al., Circulation 88: 2838-2848 (1993); Guzman et al, Cir. Res. 73: 1202-1207 (1993); Zabner et al., Cell 75: 207-216 (1993); Li et al., Hum. Gene Ther. 4: 403-409 (1993); Cailaud et al., Eur. J. Neurosci. 5: 1287-1291 (1993); Vincent et al., Nat. Genet. 5: 130-134 (1993); Jaffe et al., Nat. Genet. 1: 372-378 (1992); and Levrero et al., Gene 101: 195-202 (1992)에 기술된 것을 포함한다. 또한, 본 발명에서 사용가능한 아데노바이러스 유전자 요법 벡터의 예로는 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655에 기술된 것을 포함한다. Curiel, Hum. Gene Ther. 3: 147-154 (1992)에 기술된 바와 같이 아데노바이러스를 죽이는데 관련한 DNA 투여가 사용될 수 있다.

하기를 포함하는 다른 유전자 송달 운반체 및 방법이 사용될 수 있다: 아데노바이러스 단독을 죽이는데 관련되거나 또는 관련되지 않은 다중양이온성 축합 DNA[예를들면, Curiel, Hum. Gene Ther. 3: 147-154 (1992)]; 리간드-연결된 DNA[예를들면, Wu, J. Biol. Chem. 264: 16985-16987 (1989)]; 진핵 세포 송달 운반체 세포[예를들면, U.S. Serial No. 08/240,030(1994.05.09 제출) 및 U.S. Serial No. 08/404,796; 광중합 히드로겔 물질의 침전; 휴대용 유전자 전달 입자 건(hand-held gene transfer particle gun)(U.S. 특허 제5,149,655호에 기술되어 있음); 전리방사선(U.S. 특허 제5,206,152호 및 WO 92/11033에 기술되어 있음); 세포막과 핵전하 중합(nucleic charge neutralization) 또는 융합. 추가의 접근법은 Philip, Mol. Cell Biol. 14:2411-2418 (1994), 및 Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:1581-1585 (1994)에 기술되어 있다.

네이키드 DNA가 또한 사용될 수 있다. 네이키드 DNA 도입 방법에 대한 예로는 WO 90/11092 및 U.S. 특허 제5,580,859호에 기술되어 있다. 흡수 효율(uptake efficiency)은 생분해성 라텍스 비드(biodegradable latex beads)를 사용하여 개선될 수 있다. DNA 코팅된 라텍스 비드는 비드에 의한 내포작용(endocytosis) 개시 이후에 세포로 효율적으로 송달된다. 상기 방법은 비드를 추가로 처리하여 소수성을 증가시키고 엔도좀(endosome)의 분열을 용이하게하고 세포질로 DNA를 분비한다. 유전자 송달 운반체로서 작용할 수 있는 리포좀은 미국특허 제5,422,120호, PCT 특허 공보 WO 95/13 796, WO 94/23697, 및 WO 91/14445, 및 EP 제0 524 968호에 기술되어 있다.

또한, 사용하기에 적당한 비(非)-바이러스 송달은 기계적 송달 시스템, 가령 Woffendin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24): 11581-11585 (1994)에 기술된 접근법을 포함한다. 더우기, 상기 코딩 서열 및 발현 생성물은 광중합 히드로겔 물질의 침전을 통해 송달될 수 있다. 코딩 서열의 송달을 위해서 사용될 수 있는 유전자 송달을 위한 다른 종래의 방법은 예를들면 U.S. 특허 제5,149,655호에 기술된 휴대용 유전자 전달 입자 건의 사용; U.S. 특허 제5,206,152호 및 PCT 특허 공보 WO 92/11033에 기술된 전달된 유전자의 활성화에 사용되는 전리방사선의 용도를 포함한다.

본 항체들 또는 항체 절편은 효과적 부분, 예컨대 방사성핵종(radionuclides), 독소, 화학요법제, 프로드러그(prodrugs), 사이토슬래틱제(cytoslatic agents), 효소 등에 직접 또는 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 절편은 킬레이트제의 사용에 의해서 또는 치료 또는 진단 라디오레이블에 직접 부착될 것이다. 적당한 라디오레이블의 예로는 잘 공지되어 있으며, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹I, ¹⁰⁵Rh, ¹⁵³Sm, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re 및 ¹⁸⁸Re를 포함한다.

항체에 결합될 수 있는 적당한 약물의 예로는 메토트렉세이트, 아드리아마이신 및 림포카인, 가령 인터페론, 인터루킨 등을 포함한다. 결합될 수 있는 적당한 독소는 리신(ricin), 콜레라 및 디프테리아 독소를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 본 항체는 치료 라디오레이블에 부착되고 방사선면역치료법(radioimmunotherapy)에 사용될 것이다.

안티-센스 올리고뉴클레오티드

일정한 환경에서 전립선 세포에 의해 발현되는 단백질의 양을 조정하거나 또는 줄이는 것이 바람직할 수 있다. 따라서 본 발명의 또 다른 측면에서 안티-센스 올리고뉴클레오티드를 제조하고, 1개 이상의 안티-센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 세포에 의해 본 발명에 따른 전립선 항원의 발현 수준을 감소시키기 위한 방법을 사용할 수 있다. 안티-센스 올리고뉴클레오티드에 의해 유전자 발현이 감소하도록 표적 발현과 관련된 특이적 상보 핵산 서열과 쌍을 이루는 염기를 통해 상호작용하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 참조로 제조한다. 바람직하게, 유전자 발현과 관련된 특이적 핵산 서열은 유전자를 암호화하는 게놈 DNA 분자 또는 mRNA 분자이다. 이러한 게놈 DNA 분자는 유전자의 조절 부위 또는 성숙한 유전자 용의 암호화 서열을 포함할 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드와 이에 따른 방법에서 뉴클레오티드 서열에 상보적이라는 용어는 생리학적 조건 하에서 세포 중의 서열과 하이브리드가 가능하도록 하는 서열에 효과적으로 상보적이라는 것을 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 약 8개 내지 약 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함하며, 보다 바람직하게 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 예를 들면 변형된 뉴클레오사이드내 계통[Uhlmann 및 Peyman, Chemical Reviews 90:543-548 (1990); Schneider 및 Banner, Tetrahedron Lett. 31:335, (1990), 상기는 참고문헌으로 혼입되어 있음], 5,958,773 및 여기서 밝히고 있는 환자에서 나타낸 것과 같은 변형된 핵산 염기 및/또는 당 등과 같은 핵산 간의 분해에 저항하는 다양한 변형을 포함할 수 있다.

안티센스 기술에 광범위하게 응용할 수 있는 종래 문헌에서 공지된 안티센스 분자의 임의의 변형 또는 변이는 본 발명의 범주에 포함된다. 이러한 변형은 미국 특허 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361, 5,625,050 및 5,958,773에서 밝히고 있는 인-함유 연결기의 제조를 포함한다.

본 발명의 안티센스 화합물은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 업테이크를 강화시키기 위해 1개 이상의 일부분 또는 콘쥬게이트에 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 연결하여 변형시킬 수도 있다. 이러한 일부분 또는 콘쥬게이트는 지질, 예컨대 콜레스테롤, 콜릭산, 티오에테르, 지방족 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 팔미틸 일부분, 및 예를 들면 미국 특허 5,514,758, 5,565,552, 5,567,810, 5,574,142, 5,585,481, 5,587,371, 5,597,696 및 5,958,773에 기재된 것들을 포함한다.

쉬메릭 안티센스 올리고뉴클레오티드도 또한 본 발명의 범주 내의 것이며, 예를 들어 미국 특허 5,013,830, 5,149,797, 5,403,711, 5,491,133, 5,565,350, 5,652,355, 5,700,922 및 5,958,773에서 기재하고 있는 방법을 사용하여 본 발명의 올리고뉴클레오티드로부터 제조할 수 있다.

안티센스 분야에서 특정 표적을 위한 최적의 안티센스 분자를 선별하기 위해서는 일정한 양의 기계적인 실험이 필요하다. 효과적으로 안티센스 분자는 표적 RNA 분자의 일부분에 노출되거나 또는 접근할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 몇몇 경우에 표적 mRNA 분자의 구조에 대해 이용할 수 있는 정보가 있는데도 불구하고 안티센스를 사용하여 억제시키는 현재의 접근법은 실험을 경유한다. 세포에서 mRNA 수준은 cDNA 수준을 분석하고, mRNA의 역 전사에 의해 세포를 조절하고 처리하는 것으로 기계적으로 측정할 수 있다. 종래 문헌에 공지되어 있는 실행 가능성 또는 세포 성장을 측정하여 생물학적인 결과를 측정할 수 있다.

cDNA 수준을 확인 및 분석하여 안티센스 활성의 특이성을 측정하는 것은 안티센스 결과를 확인하는 종래문헌에서 인지하고 있는 방법이다. 처리 및 조절 세포로부터의 RNA를 역-전사시키고, 수득된 cDNA 군을 분석할 것을 제안하고 있다[Branch, A. D., T.I.B.S. 23:45-50 (1998)].

본 발명의 치료학적 또는 약물학적 조성물은 예를 들어 정맥내, 피하, 근육내, 경피, 협막내 또는 뇌내를 포함하는 당업에 공지되어 있는 임의의 적당한 경로에 의해 투여할 수 있다. 주입에 의해 신속하게 투여할 수도 있으며, 또는 서서히 방출되는 제제의 투여 또는 서서히 확산되도록 일정 기간에 걸쳐 투여할 수도 있다.

또한 피험체 전립선 종양 단백질은 목적하는 약물학적 또는 약동학적 특성을 제공하는 제제와 결합시키거나 또는 콘쥬게이트할 수도 있다. 예를 들면 상기 단백질은 당업에 공지된 임의의 물질과 결합시켜 트랜스페린 수용체에 항체와 같은 혈액-뇌 장벽을 가로질러 투과 또는 전달을 촉진시킬 수 있으며, 정맥내 주입으로 투여할 수 있다(예를 들어 참고문헌으로 혼입된 Friden 등, Science 259:373-377 (1993) 참조). 또한 피험체 단백질 A 또는 단백질 B는 폴리머 예컨대 폴리에틸렌 글리콜과 안정하게 연결되어 목적하는 용해도, 안정성, 반감기 및 기타 약학적인 이점을 수득할 수 있다[예를 들어 참고문헌으로 혼입된 Davis 등, Enzyme Eng. 4:169-73 (1978); Buruham, Am. J Hosp. Pharm. 51:210-218 (1994) 참조].

조성물은 약물학적 조제의 형태로 이용하는 것이 일반적이다. 이러한 조제는 약물학적 분야에 잘 공지되어 있는 방법으로 제조한다. 예를 들어 Remington Pharmaceutical Science, 18th Ed., Merck Publishing Co. Eastern PA, (1990) 참조할 수 있다. 하나의 바람직한 조제는 기타 비-독성 염, 5 퍼센트 글루코스 용액, 멸균수 등의 생리학적 농도와 같은 기타 약물학적으로 허용가능한 담체도 또한 사용할 수 있다. 또한 조성물에는 적당한 완충액이 존재하는 것도 바람직할 수 있다. 목적한다면 이러한 용액은 동결건조할 수 있으며, 주입을 하기 위해 멸균수를 첨가하여 재구성하기 위해 멸균 앰플에 보관한다. 제1 용매는 수성 또는 대안적으로는 비-수성일 수 있다. 피험체 전립선 종양 항원, 이의 절편 또는 이의 변이체도 또한 치료를 요구하는 조직에 이식할 수 있는 고체 또는 반-고체의 생물학적으로 상용가능한 매트릭스에 혼입시킬 수도 있다.

담체는 또한 pH, 삼투성, 점도, 투명도, 색상, 중성(sterility), 안정성, 용해율 또는 제제의 냄새를 변형 또는 유지하기 위한 기타 약물학적으로 허용가능한 부형제(recipient)를 함유할 수도 있다. 유사하게 담체는 뇌혈관 장벽을 가로지르는 투과 또는 흡수 또는 방출을 변형 또는 유지하기 위한 기타 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 부형제는 연속 또는 주기적 주입에 의해 뇌척수액으로 직접 주입되도록 하거나, 또는 1회 투여 또는 다회 투여 형태로 근원이 되는 투여를 하는 조제를 제조하기 위해 일반적 및 관례상으로 이용하는 물질이다.

1회 투여는 사용하는 투여 경로 및 조제 제조의 약물 동력학적 파라메터에 따라 다르게 반복할 수 있다.

또한 피험체 항체 또는 핵산 길항제를 함유하는 일정한 제제는 구강으로 투여할 수도 있다. 이러한 제제는 고형 제제로 적당한 담체와 함께 제제화하고, 캡슐화하는 것이 바람직하다. 적당한 담체, 부형제 및 희석제의 몇몇 예로는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 검 아카시아, 칼슘 포스페이트, 알지네이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 젤라틴, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸- 및 폴리히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘, 스테아레이트, 물, 미네랄 오일 등을 포함한다. 제제는 추가로 윤활제, 침윤제, 유화제 및 현탁화제, 보존제, 감미료 또는 향료를 포함할 수 있다. 조성물은 당업에 잘 공지되어 있는 절차를 사용하여 환자에게 투여한 후에 활성 성분이 신속 방출, 지속 방출 또는 서방성 방출이 되도록 제제화할 수 있다. 상기 제제는 또한 예컨대 표면 활성제와 같은 것의 흡수를 촉진시키고, 단백질 가수 분해를 감소시키는 물질을 함유할 수도 있다.

특수한 투여량은 사용할 몸체 공간의 부피, 또는 환자의 대략적인 몸무게 또는 몸체 표면 영역에 따라 계산한다. 투여량은 또한 특별히 선택한 투여 경로에 따라서 계산할 것이다. 치료 용의 적당한 투여량을 측정하기 위해 필요한 계산의 추가적인 개선점은 당업에 통상의 지식을 가진 자들에 의해서 가능하다. 이러한 계산은 표적 세포의 분석 조제에서 여기에 기재된 활성을 고려하여 당업에 통상의 지식을 가진 자들에 의해서 과도한 실험 없이 할 수 있다. 정확한 투여량은 표준 투여량-반응 연구와 함께 결정한다. 실제로 투여되는 조성물의 양은 치료될 상태들 또는 상태를 포함하는 상응하는 환경, 투여될 조성물의 선택, 나이, 몸무게 및 개개 환자의 반응, 환자 증상의 심각성, 및 선택된 투여 경로를 고려하여 전문가에 의해서 결정될 수 있다는 것을 알아야 할 것이다.

본 발명의 하나의 실시양태에서 단백질은 단백질의 생물학적 활성 형태 또는 단백질의 전구물질, 즉 몸체에 의해 단백질의 생물학적 활성 형태로 용이하게 전환될 수 있는 분자를 생성할 수 있는 백터 또는 세포를 환자에게 이식함으로써 치료를 위해 투여할 수 있다. 하나의 접근법에서 단백질을 분비하는 세포는 환자에게로의 이식을 위해 반투가성 막으로 캡슐화할 수 있다. 세포는 통상적으로 단백질 또는 이의 전구물질 또는 세포를 발현시키는 세포가 단백질 또는 이의 전구물질을 발현시키기 위해 형질전환될 수 있는 세포이다. 인간 유래 세포 및 단백질은 환자가 인간인 경우에 인간 단백질인 것이 바람직하다. 그러나 아래에서 논의된 단백질의 비-인간 영장류 동족체도 또한 효과적일 수 있다는 것이 예상된다.

피험체 전립선 단백질 또는 핵산의 검출

여러 환경에서 환자의 단백질 또는 상응하는 mRNA의 수준을 결정하는 것이 바람직할 수 있다. 아래에 개시된 증거로 피험체 전립선 단백질이 몇몇 질환, 예를 들어 암 중에 상이한 수준으로 발현될 수 있다는 것을 알 수 있으며, 이러한 단백질의 존재로 세포 성장 및 생존과 관련된 정상적인 생리학적 기능을 제공한다는 결론에 있어서의 기본을 제공한다. 본 발명에 따른 내생적으로 생성된 단백질은 또한 일정한 질환 상태에서 역할을 수행할 수도 있다.

환자에게서 단백질의 존재를 검출하는 것과 관련하여 여기서 사용하는 "검출(detection)"이라는 용어는 환자에게서 단백질의 양을 발현시키는 능력 또는 단백질 양의 측정, 회복에 대한 기대 및 질환의 가능한 경과에 관한 진단 평가, 질병 상태를 측정하는 것과 같은 일정한 기간 동안의 단백질 수준의 모니터링, 및 예를 들어 전립선 암 환자에게서 바람직한 치료학적 처방계획을 결정하기 위해 단백질 수준의 모니터링을 포함할 수 있다.

환자에게서 본 발명에 따른 전립선 단백질의 존재를 검출하기 위해서 환자로부터 샘플을 취한다. 상기 시료는 조직 생체 검사 샘플일 수 있거나, 또는 혈액, 플라즈마, 혈청, CSF, 소변 등의 샘플일 수 있다. 단백질 검출 용의 샘플은 전립선 조직에서 취할 수 있다. 단백질의 말초부 수준을 평가하는 경우에는 혈액, 플라즈마 또는 혈청 샘플이 바람직하다. 중추 신경계에서 단백질 수준을 평가하기 위해서는 뇌척수액 또는 신경 조직에서 샘플을 취하는 것이 바람직하다. 샘플은 비-침입 방법, 예컨대 조직 수집(들) 또는 배양(들), 또는 직접 이용가능한 조직 물질(소변, 타액, 대변, 머리카락 등)을 사용하여 수득할 수 있다.

몇몇 경우에는 환자 내의 세포주 또는 조직 또는 환자에게서 유전자가 손상되지 않았는지의 여부를 결정하는 것이 바람직하다. 손상되지 않은 유전자에 의해서 점 돌연변이, 결손, 삽입, 염색체 파괴, 염색체 재배열 등과 같은 유전자의 변형이 없다는 것을 알 수 있으며, 이러한 변형으로 상응하는 단백질의 제조에 변화가 올 수 있거나, 또는 이의 생물학적 활성, 안정성 등에 변화가 나타나 질환의 진행을 유도할 수 있다. 따라서 본 발명의 하나의 실시양태에서 유전자에서 임의의 변경을 검출 및 특성화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유전자, 게놈 DNA 또는 이의 절편 또는 이의 유도체를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 유도체에 의해서 유도된 올리고뉴클레오티드는 실제로 유도된 서열이 유전자에 특이적으로 하이브리드되도록 유도하는 서열에 효과적으로 상보적인 서열을 갖도록 유도되는 서열과 동일하다. 유래된 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열로부터 물리적으로 유래된 것은 아니지만 예를 들면 화학적 합성 또는 DNA 증폭 또는 역 전사 또는 전사를 포함하는 방법으로 발생시킬 수 있다.

통상적으로 환자 게놈 DNA는 환자에서 취한 세포 샘플에서 분리하고, 예를 들면 TaqI 및 AluI와 같은 1개 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 분해한다. 당업에 잘 공지되어 있는 서던 블럿 방법을 사용하여 환자 또는 특정 환자 조직에서 본 발명에 따른 손상되지 않은 전립선 유전자 또는 유전자 이상이 있는지의 여부를 결정한다.

유전자 하이브리드는 단일-가닥 DNA를 수득하기 위해서 염색체 DNA를 변성시키며; 유전자 서열과 관련된 유전자 프로브와 단일-가닥 DNA를 접촉시키며; 및 하이브리드 DNA-프로브를 규명하여 일부 또는 전부의 유전자를 함유하는 염색체 DNA를 검출하는 것을 포함한다.

여기서 사용하는 "프로브(probe)"라는 용어는 표적 부위의 서열과 프로브 서열이 상보적이므로 표적 서열과 하이브리드 구조를 형성하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구조를 나타낸다. 프로브로 사용하기 적당한 올리고머는 최소한 표적 서열에 상보적인 약 8-12개의 인접 뉴클레오티드, 및 바람직하게는 최소 약 20개를 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 유전자는 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 예를 들면 절단, 전사 또는 화학적 합성과 같은 당업에 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 프로브는 예컨대 예를 들어 방사성 또는 형광 표지 또는 효소 표지와 같은 당업에 공지된 임의의 검출가능한 표지로 표지화할 수 있다. 프로브의 표지화는 PCR, 랜덤 프라임, 말단 표지화, 틈새 번역반응 등과 같은 당업에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 당업에 통상의 지식을 가진 자들은 또한 표지된 프로브를 사용하지 않는 다른 방법을 사용하여 하이브리드를 측정할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 하이브리드를 검출하기 위해 사용할 수 있는 방법의 예로는 서던 블럿팅, 형광동소보합법, 및 PCR 증폭으로 단일-가닥 구조 다형성을 포함한다.

하이브리드는 통상적으로 25 ℃ 내지 45 ℃ , 보다 바람직하게는 32 ℃ 내지 40 ℃, 및 보다 바람직하게는 37 ℃ 내지 38 ℃에서 실행한다. 하이브리드에 필요한 시간은 약 0.25 내지 약 96 시간, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 72 시간, 가장 바람직하게는 약 4 내지 약 24 시간이다.

유전자 이상은 또한 유전자 내에 있거나 또는 측면에 있는 프라이머와 PCR 방법을 사용하여 검출할 수 있다. PCR 방법은 당업에 잘 공지되어 있다. 간단하게 상기 방법은 유전자 내에 있는 표적 서열의 측면 핵산 서열에 하이브리드할 수 있으며, 표적 서열을 증폭시킬 수 있는 2개의 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 실행한다. 여기서 사용하는 "올리고뉴클레오티드 프라이머"라는 용어는 약 8개 내지 약 30개 염기 길이의 DNA 또는 RNA의 짧은 가닥을 나타낸다. 업스트림 및 다운스트림 프라이머는 통상적으로 길이가 약 20개 내지 약 30개 염기쌍이며, 뉴클레오티드 서열의 복제에 있어서 측면 부위에 하이브리드한다. 중합화는 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재로 DNA-폴리머라아제에 의해 촉진되어 이중-가닥 DNA 분자를 제조한다. 다음에 이중 가닥은 물리적, 화학적 또는 효소적 방법을 포함하는 변성 방법으로 분리시킨다. 통상적으로 물리적인 변성 방법은 핵산을 가열하는 것이며, 통상적으로 약 1 내지 약 10 분 동안 약 80 ℃ 내지 약 105 ℃의 온도에서 실행한다. 상기 방법은 원하는 사이클 수 만큼 반복한다.

프라이머는 실제로 증폭되는 DNA 가닥에 상보적인 것을 선택한다. 따라서 프라이머는 정확한 템플레이트 서열을 반영할 필요는 없지만 증폭할 가닥과 선택적으로 하이브리드하기 위해 효과적으로 상보적이여야 한다.

PCR 증폭 후 다음에 유전자 또는 이의 절편을 포함하는 DNA 서열을 직접 시퀀싱하고, 여기서 기재한 서열과 서열을 비교하여 분석하여 활성 또는 발현 수준 등을 변화시킬 수 있는 변경을 규명한다.

또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 종양 단백질을 검출하는 방법은 유전자를 발현시키는 조직을 분석하는 것을 기본으로 제공된다. 일정한 조직, 예컨대 전립선 조직은 피험체 유전자를 과발현시키는 것으로 확인되었다. 상기 방법은 유전자를 정상적으로 발현시키는 조직 샘플에서 취한 mRNA에 폴리뉴클레오티드를 하이브리드하는 것을 포함한다. 상기 샘플은 유전자 이상이 의심되는 환자에게서 취한다.

단백질을 암호화하는 mRNA 존재를 검출하기 위해서 환자 샘플을 취한다. 샘플은 혈액 또는 조직 생체 검사 샘플일 수 있다. 샘플은 여기서 함유하는 핵산을 추출하기 위해 처리할 수 있다. 샘플로부터 수득된 핵산으로 겔 전기영동과 기타 크기 분리 기술을 실행한다.

샘플의 mRNA와 프로브로서 제공되는 DNA 서열을 접촉시켜 하이브리드 이중체를 형성한다. 상기에서 설명한 표지 프로브를 사용하여 수득된 이중체를 검출한다.

프로브로서 cDNA 유도체 또는 단백질을 암호화하는 cDNA를 사용하는 경우 실제로 손상되지 않은 기능 유전자가 존재하지 않는 경우에 유전자 뉴클레오티드 서열의 정확한 검출과 하이브리드가 있는, 거짓 양성을 방지하기 위해서 아주 엄중한 조건을 사용할 수 있다. 유전자 cDNA에서 유래된 서열을 사용하는 경우에는 그러나 덜 엄중한 조건을 사용할 수 있으며, 거짓 양성의 가능성 때문에 덜 바람직한 접근법이 될 수 있다. 온도, 이온강도, 시간 길이 및 포름아미드 농도를 포함하는, 세척 절차 중 및 하이브리드 중에 다수의 인자에 의해서 하이브리드의 엄중함이 결정된다. 이러한 인자는 예를 들어 Sambrook 등에서 약술되어 있다[Sambrook 등 (1989), supra].

단백질 A 또는 단백질 B를 암호화하는 mRNA 샘플에서 검출의 민감성을 증가시키기 위해서 역 전사/중합 사슬 반응(RT/PCR) 기술을 사용하여 전립선 종양 항원을 암호화하는 mRNA로부터 전사된 cDNA를 증폭시킬 수 있다. RT/PCR 방법은 당업에 잘 공지되어 있으며, 하기와 같이 실행할 수 있다. 총 세포 RNA를 예를 들어 표준 구아니딘 이소티오시아네이트 방법을 사용하여 분리하고, 총 RNA는 역 전사한다. 역 전사 방법은 역 전사효소 및 3' 말단 프라이머를 사용하여 RNA 템플레이트 상에 DNA를 합성하는 것과 관련이 있다. 통상적으로 프라이머는 올리고(dT) 서열을 함유한다. 따라서 생성된 cDNA는 다음에 PCT 방법 및 유전자 A 또는 유전자 B 특이적 프라이머를 사용하여 증폭시킨다[Belyavsky 등, Nucl. Acid Res. 17:2919-2932 (1989); Krug 및 Berger, Methods in Enzymology, 152:316- 325, Academic Press, NY (1987) 참고문헌으로 통합되어 있음].

폴리머라아제 사슬 반응 방법은 증폭될 DNA 절편의 2개 측면 부위에 실제로 상보적인 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 상기에 기재된 것과 같이 실행한다. 증폭 후에 PCR 생성물은 전기영동하고, 에티듐 브로마이드 염색 또는 포스포이미징으로 검출한다.

또한 본 발명은 환자로부터 수득된 샘플에서 단백질의 존재를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 단백질 검출을 위한 당업에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 상기 방법은 이에 제한하지는 않지만 면역확산, 면역전기영동, 면역화학 방법, 바인더-리간드 분석, 면역조직화학적 기술, 응집 작용 및 보체 분석을 포함한다[Basic and Clinical Immunology, 217-262, Sites 및 Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, CT, (1991), 참고문헌으로 혼입되어 있음]. 본 발명에 따른 표지된 전립선 항원 또는 이의 유도체를 길항적으로 치환하고, 전립선 종양 항원 단백질의 에피톱 또는 에피톱들과 항체를 반응시키는 단계를 포함하는 바인더-리간드 면역분석 방법이 바람직하다.

여기서 사용하는 것과 같이 피험체 전립선 종양 항원의 유도체는 특정 아미노산이 변형되거나 또는 일반적이지 않은 아미노산으로 변경 또는 대체 또는 결손된 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 상기 유도체는 생물학적으로 유전자와 상응하며, 폴리펩티드 유도체는 단백질에 대항하는 항체와 교차 반응한다. 교차 반응에 의해서 항체는 이의 형성을 유도하는 것이 아니라 항원과 반응한다는 것을 의미한다.

다수의 길항적 및 비-길항적 단백질 결합 면역분석은 당업에 잘 공지되어 있다. 이러한 분석에 사용하는 항체는 예를 들어 응집 시험에 사용하는 것과 같이 표지화하지 않을 수 있으며, 또는 아주 다양한 분석 방법에 사용하기 위해서 표지화할 수 있다. 사용할 수 있는 표지는 방사성 면역 분석(RIA), 효소 면역 분석, 예를 들면 효소-연결 면역용매 분석(ELISA), 형광 면역 분석에 사용하는 방사성 핵종, 효소, 형광물질, 화학발광물질, 효소 기질 또는 보조-인자, 효소 억제제, 입자, 염료 등을 포함한다.

본 발명의 추가 측면은 후보 화합물이 바람직하게는 선택적으로 상기에서 기재한 표적 분자와 결합하는지의 여부를 결정하는 것을 포함하여, 생물학적 활성 화합물을 선별, 규명, 스크리닝, 특성화 또는 최적화하는 방법에 관한 것이다. 상기 표적 분자는 핵산 서열, 폴리펩티드 및 이의 절편, 통상적으로 전립선-특이적 항원, 보다 더 바람직하게는 이의 세포외 부분을 포함한다. 통상적으로 표적 분자는 임의의 적합한 장비에서 후보 화합물과 접촉하며, 복합체 형성이 결정된다. 표적 분자 및/또는 후보 화합물은 지지체 상에 고정될 수 있다. 규명 또는 선택된 화합물은 암 질병, 특히 전립선 암을 치료하기 위해 유도되거나, 또는 약물 후보물질을 나타낸다.

본 발명은 바람직한 실시양태를 포함하여 상기에 기재하였지만 하기 실시예를 통해 본 발명을 추가로 설명할 것이다.

조직 공급원:

연구 방법을 평가하기 위해서 적당한 환자 샘플을 획득하였다. 관련된 임상적 파라메터를 갖는 샘플을 환자의 동의 하에 준비하였다. 조직학적 검사를 모든 샘플에서 실행하여, 각 샘플 내 악성 종양의 존재 또는 부재를 확안하기 위해 병리학적으로 진단하였다. 임상적인 결과는 통상적으로 전립선 암 생리기능과 관련된 환자 병력, 생리병리학적 특성 및 파라메터를 포함한다. 유용한 임상 정보와 함께 10개의 정상 및 10개의 악성 샘플을 획득하였다. 추가로 정상 전립선 및 전립선 암 이외의 다른 조직에서 취한 10개 샘플을 획득하여 에피톱의 조직 특이적 발현 프로파일을 측정하였다. 정상 조직 샘플로부터 유래된 RNA는 공지된 상업적인 공급원으로부터 수득하였다.

추가의 환자 샘플은 세포독성 T 림프구(CTL) 분석 용으로 획득하였다. 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 환자의 동의 하에 관련된 임상 파라메터를 갖는 환자로부터 취한 혈액에서 분리하였다. 임상적인 결과는 통상적으로 전립선 암 생리 기능과 관련된 파라메터, 환자의 병력 및 조직병리학적 특성을 포함하는 것이 일반적이다. PBMCs는 연구에 필요한 6개의 전립선 암 환자로부터 수집하였다. 한 환자에게서 두개의 샘플을 수득하였다.

DATAS 라이브러리 생성;

이들의 병리학적 진단(정상 대 종양)을 기초로 샘플의 풀(pool)을 만들었다. 총 RNA의 균등량을 기초로 샘플의 풀을 만들어 총 풀의 RNA 샘플 100 ug을 생성하였다. DATAS 라이브러리는 전문이 참고문헌으로 혼입된 미국 특허 6,251,590에 기재된 것으로서 구성되었다. 간단하게 총 RNA를 정상 및 종양 풀의 샘플에서 분리하고, mRNA를 이후에 각 풀의 샘플 용으로 총 RNA에서 정제하였다. cDNA 합성은 비오틴화 올리고 (dT) 프라이머를 사용하여 실행하였다. 비오틴화 cDNA는 반대 샘플의 mRNA로 하이브리드화하여 cDNA와 mRNA 사이의 이형접합체를 형성하였다. 예를 들어 풀의 정상 전립선 샘플의 비오틴화 cDNA는 전립선 종양 mRNA와 하이브리드화하였다. 유사하게 전립선 종양 비오틴화 cDNA는 전립선 정상 RNA와 하이브리드화하여 두번째 DATAS 라이브러리를 생성하였다. 스트렙타비딘 코팅 비드를 사용하여 cDNA 상에 존재하는 비오틴을 결합시킴으로써 복합체를 정제하였다. 이형접합체를 RNAse H로 분해하여 cDNA에 상보적인 RNA를 분해하였다. cDNA와 상이한 모든 mRNA 서열은 손상되지 않았다. 이러한 단일 가닥 RNA 절편 또는 "루프(loops)"는 이후에 퇴화 프라이머로 증폭시키고, pGEM-T 또는 pCR II TOPO 벡터(회사 공급)로 클로닝하여 DATAS 라이브러리를 생성하였다.

클론 시퀀싱 및 생물정보 분석;

DATAS 라이브러리를 사용하여 E. coli에 형질전환시켜 개개 클론을 표준 분자 생물 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 이러한 라이브러리를 통하여 10,665개 클론을 분리하고, 자동 응용 바이오시스템 3100 시퀀서를 사용하여 시퀀싱하였다. 수득된 뉴클레오티드 서열은 분석을 위해 생물정보 파이프라인에 적용시켰다. PCR 증폭 DNA로 준비된 DATAS 라이브러리와 같이 동일한 서열의 많은 복제가 라이브러리에서 분리된 클론에 존재하였다. 따라서 분리된 독특하고 비반복적인 서열의 수를 구명하기 위해서 중복된 클론을 줄이는 것이 중요하다. DATAS 절편의 큰 셋트로부터 1699의 독특하고 중복되지 않은 서열을 규명하고, 각 DATAS 절편을 후보 유전자로 주석을 달았다. 주석 달기는 하기 2가지 방법에 의해 인간 게놈 서열에 DATAS 절편을 결합시켜 실행하였다; 1) 공개적으로 이용가능한 정렬 및 게놈 뷰어, Blat(Kent 등, 2002); 및 2) 시판되어 이용가능한 게놈 정렬 및 뷰어 툴, Prophecy(Doubletwist). 각 DATAS 절편 서열은 DATAS 절편을 함유하는 게놈 서열에 오버랩되는 상응하는 유전자로 주석을 달았다. 유전자는 RefSeq 등록 번호 또는 상이한 알고리즘, 예를 들면 Genscan, Twinscan 또는 Fgenesh++로부터의 가언 유전자 예언으로 주석을 달았다. 규명된 유전자는 DATAS 절편 서열과 매치되거나(엑손과 절편의 매치의 경우) 또는 DATAS 절편과 오버랩되며(인트론과 절편의 매치의 경우), 유전자의 완전한 길이 서열이 규명되었다. 이러한 서열은 추가로 분석하여 모든 잠재적인 막 스패닝 단백질을 검출하였다. 막 단백질은 상이한 알고리 즘의 공개적으로 이용가능한 것을 사용하여 예측하였다. 예를 들면 TMHMM(CBS)를 사용하여 후보 유전자의 아미노산 서열 내에 존재하는 막-스패닝 도메인을 규명하였다. DATAS 절편을 서열 내에 배치하여 스플라이싱이 세포내 또는 세포외 도메인에 영향을 미치는 지의 여부를 결정하였다. 서열과 관련된 유전자는 성공적인 치료 표적의 규명을 최적화하기 위해서 분류하였다.

단일클론 항체 표적 선별:

항체 치료 개발을 위한 가장 우선시되는 유전자는 유전자가 공지된 막 단백질이며, 유전자의 기능이 공지되어 있고, DATAS 절편이 단백질의 세포외 도메인 상의 인트론에 맵핑되어 DATAS 절편이 세포 외부에 존재하는 것을 나타내고, 단일 클론 항체에 의해 치료적 중재에 이용가능할 수 있는 특성을 가진다.

생물정보 분석을 기초로 단일클론 항체 치료 개발과 관련된 클론으로 우선 사항을 결정하였다.

CTL 에피톱 규명:

CTL 스크리닝 분석에 포함되는 가장 우선시되는 DATAS 절편은 신규의 서열 정보를 함유하는 것, 예컨대 신규의 엑손 또는 엑손 확장을 함유하는 것이다. 바람직한 DATAS 절편 클론은 암 개시 또는 진행과 연결되어 있으며, 세포질 단백질을 암호화한다.

192개의 선택된 DATAS 절편을 라이브러리 벡터에서 PCR 증폭시켜, 개시 부위 의 개시 코돈을 동요시켜 진핵 생물 발현 벡터의 다운 스트림에 클로닝한다. 이러한 구성으로 모든 오픈 리딩 프레임에 DATAS 절편이 발현되며, 상기는 올바른 리딩 프레임이 항상 용이하게 식별가능한 것이 아니므로 요구된다.

플라즈미드 정제를 실행하고, 선택된 DATAS 절편 클론을 함유하는 발현 벡터를 96 웰 플레이트에 재배열하며, 상기는 이후에 전문이 참고문헌으로 혼입된 국제 특허 출원 번호 PTC/US2005/032392에서 이전에 기재한 CTL 분석에서 사용하기 위해 유리 슬라이드에 스팟팅하는데 사용하였다.

DATAS 발현 벡터의 목적하는 마이크로어레이 위치를 함유하는 디자인 파일을 고해상 스캐너로 전송하였다. DATAS 절편을 함유하는 발현 벡터를 젤라틴 및 리포펙타민과 혼합한 다음에 고해상 마이크로에레이 스캐너에 전송된 디자인 파일과 매칭이 되는 패턴으로 중복해서 스팟팅하였다. 하기의 양성 대조군, 음성 대조군 및 실험 샘플을 어레이 상에 스팟팅하였다.

a) 삽입하지 않은 벡터(음성 대조군)

b) 강화된 그린 형광 단백질을 암호화하는 벡터(EGFP)

c) DATAS 절편 삽입물을 함유하는 벡터

d) cDNA를 암호화하는 인플루엔자 NP를 함유하는 벡터(양성 대조군)

다음에 스팟팅된 어레이는 부착성의 293T 세포를 발현시키는 HLA 클래스 I(예를 들어 HLA-A2)와 오버레이하여 48-72 시간 동안 배양하여 벡터가 암호화된 전사물을 발현하도록 세포에 시간을 준다.

다음에 CTL 반응성을 위한 분석을 4 시간 동안 배양된 역 전사 마이크로어레 이 슬라이드 상에 전립선 암 환자와 정상인으로부터 HLA-매칭 CD8⁺ T 세포를 배양하여 실행하였다. 어레이를 배양하기 전에 정상 또는 환자로부터의 T 세포를 실험실내에서 적게 또는 크게 확장시켜 T 세포에 대한 반응 빈도수를 강화시킬 필요가 있다. 활성화 캐스파제, 형광-표지화(설포-로다민)-Z-VAD의 억제제를 세포 배양 내내 존재하도록 하여 특정 스팟 상에 부착 세포를 발현시키는 항원이 CTL에 의한 사멸이 유도되는 경우에 활성화되는 캐스파제와 결합시킨다. 다음에 슬라이드를 세척하여 마이크로어레이 스캐너로 확인되는 마이크로어레이 슬라이드의 결합하지 않은 형광 Z-VAD 및 2-색상 (그린 및 레드) 형광 이미지를 제거한다.

이후에 스캔된 이미지를 눈으로 관찰하여 결과를 분석 및 확인한다. 역전사의 성공은 EGFP 벡터 대조군 스팟에서 그린 형광을 관찰하여 평가한다. 다음에 형광의 경계(들)를 마이크로어레이 스캐너 상에서 조정하여 관련된 배경과 양성 대조군 강도를 확립할 필요가 있다. 다음에 T 세포가 가지는 DATAS 스팟이 양성 반응을 보이는 것을 레드 형광 신호의 존재로 규명한다. 스팟의 조화된 위치를 사용하여 cDNAs 수율의 양성 반응을 규명한다.

발현 모니터링:

전립선 암의 유용한 에피톱 표적은 에피톱의 발현이 전립선 조직, 바람직하게는 전립선 종양에만 제한되어야 한다. 각 우선시되는 서열의 발현 프로파일의 평가는 당업에 공지되어 있는 RT-PCR로 실행한다. Biosystems에서 제공하는 GeneAmp PCR system 9700의 사용자 매뉴얼에 기재되어 있는 터치다운 PCR로 알려진 방법을 사용하였다. 요약하면 PCR 프라이머는 DATAS 절편으로 도안하고, 엔드 포인트 RT-PCR 분석 용으로 사용하였다. 각 RT 반응물은 5 μg의 총 RNA를 함유하며, Archive RT 키트(Biosystems제)를 사용하여 100 μl로 실행하였다. RT 반응물은 물로 1:50으로 희석하고, 희석된 양 중 4 μl를 사용하여 어닐링 온도를 각 사이클 마다 0.5 도씩 감소시켜 1 사이클 94 ℃ 3 분, 5 사이클 94 ℃ 30 초, 60 ℃ 30 초 및 72 ℃ 42 초로 구성된 50 μl PCR 반응을 실행하였다. 다음에는 30 사이클 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초 및 72 ℃ 45 초 동안 실행하였다. 15 μl를 각 반응물에서 취해 분석하고, 반응물은 추가 10 사이클을 진행시킨다. 상기로 인해 30 및 40 사이클에서의 분석 용 반응물이 생성되며, 40 사이클 반응물이 포화되는 발현에서 차이를 검출한다. DATAS 절편의 발현 프로파일의 수준은 뇌, 심장, 간, 폐, 신장, 결장, 골수, 근육, 비장 및 고환의 정상 샘플로부터의 총 RNA뿐만 아니라 정상 및 종양 전립선 총 RNA에서 측정하였다. 발현 프로파일은 전립선 종양에서의 특이적으로 발현하고, 정상적인 전립선을 포함하는 정상 조직에서는 적게 발현되는 것을 우선시하였다.

RNA 구조의 증명:

DATAS로 실험 샘플 사이에서 달라진 서열을 규명한다. 그러나 DATAS 절편에서 나타나는 접합점 또는 경계의 온전한 서열은 분리된 DATAS 절편 서열로부터 직접 측정할 수 있다. 그러나 DATAS 절편을 사용하여 각 샘플에 나타나는 각 전사물 의 서열을 밝하고 실험을 도안하였다. 프라이머는 제안된 DATAS 절편 서열 보다 더 큰 유전자 부위를 증폭하도록 도안하였다. 이러한 앰플리콘을 이후에 클로닝하고, 모든 엑손과 인트론의 온전한 접합점의 규명을 위해서 시퀀싱하였다. 상기는 이종형의 제1 구조(서열)를 밝히기 위해 규명된 샘플로부터의 이종형의 부분적인 클로닝이 필요하다. DATAS 라이브러리를 생성하기 위해 초기에 사용한 20개의 모든 샘플(10개의 정상 및 10개의 종양 샘플)을 사용하여 우선시된 유전자의 mRNA 구조를 밝혔다.

이종형의 총길이 클론의 분리:

두 개의 이종형을 함유하는 총길이 클론의 분리는 구조 확인 공정 중에 생성된 DNA 절편과 정보를 사용하여 완료했다. 총길이 클론의 분리를 위해서는 몇 가지의 방법을 사용할 수 있다. 암호화 서열과 관련된 완전한 서열 정보를 이용할 수 있는 유전자 특이 프라이머를 서열로부터 도안하고, 조직 샘플의 총 RNA로부터 직접 암호화 서열을 증폭하기 위해 사용하였다. RT-PCR 반응은 상기 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 설정하였다. RT 반응물은 하기에 기재한 것과 같이 cDNA 용의 가장 중요한 올리고 dT를 사용하여 실행하였다. 두번째 가닥은 표준 방법으로 생성하여 이중 가닥 cDNA를 생성하였다. 유전자의 PCR 증폭은 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 완성하였다. PCR은 30 사이클 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초 및 72 ℃ 45 초로 구성된다. 반응 생성물은 1 % 아가로스 겔에서 분석하고, 앰플리콘은 앰플리콘 클로닝을 위해 A 오버행으로 준비된 벡터에 라이게이션하였다. 라이 게이션 혼합물 중 1 μl를 사용하여 앰플리콘의 클로닝과 분리를 위해 E. coli에 형질전화시켰다. 정제 시에 앰플리콘 함유 플라즈미드를 ABI 3100 자동 시퀀서에서 시퀀싱하였다.

제한된 서열 정보가 이용가능한 올리고 풀링 방법을 이용하였다. 요약하면 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드를 DATAS 절편을 기본으로 도안하였다. 올리고뉴클레오티드를 비오틴으로 표지화하고, 이후의 Sambrook 등(1989)의 절차에 따라 정상 전립선 조직 또는 전립선 종양 조직으로부터 제조된 단일 가닥 플라즈미드 DNA 라이브러리와 하이브리드화하는데 사용하였다. 하이브리드된 cDNA를 스트렙타비딘 콘쥬게이트 비드로 분리하고, 가열하여 용출시켰다. 용출된 cDNA를 이중 가닥 플라즈미드 DNA로 전환시키고, E. coli 세포에 형질 전환시켜 가장 긴 cDNA 클론을 DNA 시퀀싱하였다.

결과

상기에서 기재한 방법을 사용하여 추정으로 전립선 종양 조직에 의해 발현되는 엑손(신규의 스플라이싱 변이체)과 반응하며, CTL에 많이 반응하는 것으로 도출된 23개의 DNA 절편을 규명하였다. 양성 결과가 수득된 서열 Ids와 상응하는 환자의 IDs를 표 1에 요약하였다. DATAS 절편 클론에 의해 나타나는 스플라이싱 타입과 반복적으로 반응하는 것도 또한 표 1에 나열하였다.

이러한 DNA 서열을 표 1에 나타냈으며, 서열 번호 1-23을 갖는 핵산 서열에 상응한다. 게놈 서열 위치는 March 2006 인간 게놈 어셈블리를 참조하는 UCSC Genome Browser와 BLAT를 사용하여 생성하였다.

기재된 CTL 분석에서 모니터링된 CLT 반응을 자극하는 각 DATAS 절편 클론에 함유된 항원 펩티드에 대응할 수 있는 잠재적인 HLA-A2 결합 펩티드를 규명하기 위해서 예측 알고리즘을 사용하였다. 상기 분석 결과를 표 3에 나타냈다. 발현 벡터에 클로닝된 절편에 의해 암호화되는 각각의 가능한 프레임에 있어서의 펩티드를 나열하였다. 각각의 예측된 펩티드 에피톱의 왼쪽의 숫자는 왼쪽에 나열된 모 단백질에서의 펩티드의 N-말단 아미노산의 위치를 나타낸다. 각 펩티드의 오른쪽에는 1에서 30까지의 점수가 있는데 이것은 숫자가 30까지 증가할 때 HLA-A2와의 결합의 높은 친화도의 가능성을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Exonhit Therapeutics SA <120> PROSTATE SPECIFIC TRANSCRIPTS AND THE USE THEREOF FOR PROSTATE CANCER THERAPEUTICS AND DIAGNOSTICS <130> B0498WO <160> 23 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 340 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctaccggggg aagggtcaaa gagcgtgccg aagcgctgga gggagcttca cggacgcgag 60 ctaggcaccg gctcgcctaa tccggtacta atccggcttg ctgcttcccg tccaggcctc 120 gctcgccatg ggggaggtgg agatctcggc cctggcctac gtgaagatgt gcctgcatgc 180 tgcccggtac ccacacgccg cagtcaacgg gctgtttttg gcgccagcgc cgcggtctgg 240 agaatgcctg tgcctcaccg actgtgtgcc cctcttccac agccacctgg acctgtccgt 300 catgttggag gtcgccctca accaggtgcc tccgttgcat 340 <210> 2 <211> 434 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggctcagggg gcacgtttgc gtttggacct gtctgcgcgt tctcctgcgt ggcagtcctg 60 atttccatac ttctggagaa tccatttcgt taacactgaa agccagttct cttttcctgg 120 cagttttttt cattttattt ttggcatttt ttacaagata ccgttcggga aaggcttttg 180 aaaggacgga agcgtattca ctgtgcgcca gtactcctgg ctgtgctgtg gtttctcccg 240 acgtgcacat cgatctcgta tgtgtggcat ctgatattaa acgggaggtt ttaagaagcg 300 tctgccgtga tcatggagct tcggaagcgg gaatggttct tccgggtttg ctgttttgtc 360 tgtttccccc ttgtgtggtt tccgcctgcg acagttccag aatttgctct cccactcagt 420 gtgctctgca gctg 434 <210> 3 <211> 328 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ccaggcagct ggcgaggggg tcaccctaga gtttgctcag gtatggactt gggacatgtg 60 atgggagagt gtgggagccg ggggagaccc aagtgtgcaa cagtggagtg tgtgcttggt 120 gtgtctgcat atgtctgggc atttctttat ctgtgacaga cacattttat tccaacaagc 180 attcattgta gaggccactg tgggtgctgg ggaatgctgt ggggagtaaa attaggcaca 240 gttcatgccc ttgtatggtg aaacggggag atataaatca aacatttatg tgatattact 300 tttttctgag agaatctcac tccgtcac 328 <210> 4 <211> 376 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gtaagggatg gaagaatggg atatgctgaa gaagcccctt atgatgccat tcatgtggga 60 gctgcagccc ctgttgtacc ccaggcgcta atagatcagt taaagcccgg aggaagattg 120 atattgcctg ttggtcctgc aggcggaaac caaatgttgg agcagtatga caagctacaa 180 gatggcagca tcaaaatgaa gcctctgatg ggggtgatat acgtgccttt aacagataaa 240 gaaaagcagt ggtccaggtg gaagtgattt tatcttctgc tctttcttct tccacacatg 300 caaggtgaaa gggtgtggat tttaagacat tagactacaa gagctgtttt tggttgtcac 360 ctttatgctc ctcaga 376 <210> 5 <211> 385 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gtaaaggcat gtggaatcca ggggcagctt tggctggcac gcaggatcca gagtcagctc 60 agctgggctg gtactcagga tcagctccat ccggtgtgta gggtctagtg taggggtcag 120 cttggctggg ccagggctca gagtcagctc ttgcctatgc acaggatcca ggttcagctg 180 agtcaggctg ggagccaagg tcacctgctg ctaggttgca ggtggctcag tgccaggctg 240 gaggttaaga ccccagtctc caggcagtag catctcttca gaccacagtg gctctcctca 300 tgttgatgct ggcctctggg atgttccgcg tcctagctcc gcacagctgg gtatctcact 360 cagtcgccac ctcggcctcc caaca 385 <210> 6 <211> 460 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gccgaggtct tccctaagga cagggagact tgttgagctc ccagtgttgc ctgcagctct 60 cgcagggaga gcacacttcc ctccctgaga cctccacacg cactacacag atggtcacag 120 ccctattctc cagccctgcc cccgtcagct catcccagca ccaacccctc tcctgggaaa 180 cctggattct ccttacaact ggcggtgcct gtgctgaatg cagctctgga gttcagcttc 240 agggaaagaa attcccagct ctgaaactat agggctctat cagtgccatg gaatccccct 300 cttattcacc caacggcttg gttctgctga accaatttcc cactcctcac tgaaccccac 360 ccaggacaca caggcgcctg tttcccctct ggcatgcaca cactcttctg gagcacacgc 420 gaccctccct aggccgcctg cttctcggct cccctgcaca 460 <210> 7 <211> 424 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ccgatcgggg aagtttgcag ggcaggcggc ggcaagttat ttaagcactg gctcgaagtg 60 aggacagaga actgggcagg aggttaccca ggccaattct tgggccattc cgccccaagg 120 aacatgggag ctgtccccaa gctttcttga gccccgccgg gcggacgctt ctcggctaat 180 ctttctgcaa cttttacaaa gctgcctcct ccccagtttg atctctgcaa acacatcctg 240 ggcgtccgcg gcagattgga aactattttt accgtctggg gccgaggagg tgcattgaaa 300 taaggaaggc gaggcgcctt ctctagcgtt tcaccccgga ccaggctggg tcacccagtg 360 gtctctttgc tcccccgccc cacccttcgt gcgccttcca gagccgccat cgaatctctc 420 ttgc 424 <210> 8 <211> 393 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gtagcagggc agcagacttg ggagaacgcg ggggatacat ccggcccact ggaagaaaag 60 ggggagctgt aggatggtta ctgctggtca acagcagtga gtacaagggc cttactcaaa 120 acagcaagaa agtttacaca ctatacaacc agagtcacca acttaaatgt ctagaagctc 180 aaggcaggta acacaagcag gtaaatggcc tcatgggcat catcgacaac tggaatgctt 240 aaaggagtgg cagggattct gttccagtca actcaagcta cgcagcaagg caagctcagt 300 tgacagaatt tcctgtaatt caaaagaaac taaaaatttt ctatggcttc tattgattta 360 tttatttaga gacagggtat cgctctgttc ccc 393 <210> 9 <211> 155 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gggcaaagga tgttgcccct gtcctgaagg ctgtcgcccg atcgctctat ccaaggctgc 60 cctggggcag cgtcacctgg gggtcctgcg ggggcttctc agcacagcat ccagcactgc 120 cacctagtgt gttcccgtca cgtctcctcc ccccg 155 <210> 10 <211> 139 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gtggcgaggc ggttcgggac ggaggacgcg ctagtgttct tctgtgtggc agttcagaat 60 gatggatcaa gctagatcag cattctctaa cttgtttggt ggagaaccat tgtcatatac 120 ccggttcagc ctgctctcc 139 <210> 11 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gacaccctag ctgcaaggga ggttagaaaa aatgagggac aggattatca tggtcagcat 60 attacttggg ggccagatat atcacttccc acacaaaagc aggcctctgt cagtgaggaa 120 gaagtggaga atggatttgg ggtgggcatc tgacagcatt tgccacactg ccctccccaa 180 tcctaatgca ggccagtcaa cgcaccaccc ccactcccca cccacactcc aacccccaca 240 gtcctagggt ctctcaggga gaccatcggt ggaatccata acattctaag accctgcagt 300 ttgtaggcaa aatcaggctt cctttgggtg cccccg 336 <210> 12 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gttgagacct cgaattacag gcatgagcca ccgtgcctgg ccttttcttt tcttttaagc 60 tactttttaa tatatagtaa tgactgttaa tatagtatat actatgctat tcatcaatgc 120 tgtaactttc ttagtttcat tttctcactc aattgaagtc caggtaccca ggtccacacg 180 <210> 13 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ggaggaggtc ggcatcacca gtaacaggaa tccctctccc tttgaaggca gtgatggcca 60 gcgactttgc agtgccgaaa ttccgatacc tggagaggct cttgattctt cacgggcatt 120 ggtgctactc ccgacttgcc aacatggtgc tgtacttctt ctacaaaaac acaatgttcg 180 tgggcctcct gttttggttc cagtttttct gtggcttctc tgcatctacc atgattgacc 240 agtggtatct aatcttcttt aatctgctct tctcgtcacc tccaacga 288 <210> 14 <211> 203 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 cggaccagga caaaatcatg acgatgctcc atcccaagcc ttccaggtta caaaccgcct 60 ttccagttcg ctggctctta tgatccagct cctgcccgac gatgtggaca ctgtcatcac 120 ctccatttta cagataggaa agctgaggcc cagagaagcg aagcgactgt gtctgtccaa 180 gaccacgcgc cctcctccct gtc 203 <210> 15 <211> 139 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 cggcgcacct ggtacgtggt gtatgttcca tttgtgctgg ccacggtgat gatgatgatg 60 atgccatctc tccggctaca ctgcgagcac agatcacagc tctctgtagc tgatgctggc 120 tctacccact gtattcggg 139 <210> 16 <211> 122 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ggggaggcac cccaggaaaa ctcacccttc tctggatcct ctttgccttc ttctctccca 60 tcctcttttc cctcctcatc ctctccgtcc actctggagc ccttctccac agcctcgcac 120 cc 122 <210> 17 <211> 476 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 gccgcgggat tgaaacgtta tacagcggac ccagtgagac accagctggg gtggccaaag 60 gagtgctagt gtcacccctc tcctaactcc agaaagcaca gcttgcagct ctaggagaga 120 ctccttttgg ttgaggaaag gaaagggaag agtaaagagg attttgtctg gcaactggga 180 taccagccca gccacagtaa cataaaacaa caagcagatc cctgaagtct ccattccagg 240 ccctagctcc tggataacat ttctagaccc accttgggcc agaaaagaac ctgttaccct 300 gaaggaaaaa acaaagtcct ggaagaactc accacctgct gactaaagag cccgtagtcc 360 ttgaataaac attagtagca gccaggcagt actcatcaca gacctagaac agtgacggcc 420 atgggaaaag actctttttg aagaaaggag agggaggagt aaaaaggact ttgtct 476 <210> 18 <211> 239 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 ggccttaggg gcacgaggat gtgaatcgac ctactactta atataatggc tgtgagaaaa 60 ggcctctttc ctttcctttc cacttttgct ccaccctatc aggagccaga aaggcctgat 120 ggtgacaagg tgtgaaccgt gtggacagtc ctgcacacag ggctcactgt ggacaccttc 180 ccagggcacg catcagctgt gtgaacaaag ccaccaaagc cattctttcc ctcccccgc 239 <210> 19 <211> 379 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ggggacaggc agaggttgca ctgcactcca gcctgggtga cagatcaaga ttctgtctca 60 agtaataata atgatgatga tgatgatgat gatgatgatg ataataacac accttgttaa 120 tgttaattca ctgtgttaaa tcaattaact cattttctca taattaccct tgaacgagta 180 agttattgac attctctcca tgggaaaaaa aacccttgga gaaaggtaac ttgaatatgg 240 ccaaatgggc aatttggata gaactgggat ttgaacctag gacatctgat tccacatcct 300 tttcatgagc cacaatgctc tacatgtggt tttatttctt ggatcacatg taacacatcc 360 ataaaagtgc ctccccccg 379 <210> 20 <211> 214 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ctcccggccg ccatggccgc gggatgtccc gaattcttgt aaaactgctg aacaaactct 60 ccagtttctc ttaagaagag tcaccaggat aggcagtttc tcaacatttg tgcttcatgg 120 caagctaagg agagagagga atgagaaaag taagacttta ttagcaggta ttagcagaga 180 gatttcactg tgctgctccc tctccacctc cccc 214 <210> 21 <211> 267 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 ggcggcaggt ctaatctggc acacttgcta acttctaata aagaatcaaa tggtcttcca 60 actcacataa tgactaattc taaagcatgc aacctcaaag tactacattc tccctgttct 120 agaaatacaa ccctagaggg ccagtcttcc ttcagcattc aaatattgag tagaacaact 180 gaactgtaag gttcaactaa aggaatgcaa ctgtgacttg agctgtggaa cggctatggc 240 ctaagtcaag aattctcaac ctcccac 267 <210> 22 <211> 314 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gttaggaggt agaggggctg agcttgctca gaccttgcag taaattctgt ccctgttgca 60 ggtccagttt ggcagggaag ggacacccgg tataccctcc gttttcttta cagaactcca 120 ggaatctgtg gggtacagag gagtgccagc agagactgga ggctaagcca cggtcctgtc 180 ccatctgagc tgtacttgct caacctctgg atgtcattta acttataaat acaatagtga 240 tgctgtgaaa atggacacat ctgcggatta actgagcgat aagcaagcgc ttaaaaaaga 300 tccacctgcc ccca 314 <210> 23 <211> 120 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gcccccacct gctgcccagt tcctctatga tccagctcta atgcttccca aattataagg 60 tgaataaaaa tccttaagga ccttgtcaaa atgacaacac tgatttagta ggtccgcacg 120

Claims (38)

1. (i) 서열번호 1 내지 서열번호 23 중 어느 하나에 포함된 서열을 포함하는 핵산;

   (ii) (i)의 변이체[상기 변이체는 열점(gap)을 허용하지 않고 정렬할 경우에 (i)의 서열과 70% 이상 동일한 핵산 서열을 가짐]; 및

   (iii) 길이로 20개 이상의 뉴클레이티드의 크기를 갖는 (i) 또는 (ii)의 절편(fragment)으로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 사람의 전립선암 세포에 의해서 발현되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산(isolated nucleic acid).
2. 제 1 항에 있어서,

   서열번호 1 내지 서열번호 23 중 어느 하나에 포함된 핵산 서열 또는 이의 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
3. 제 1 항의 핵산 서열들 중 하나의 특이적 증폭을 일으키는 프라이머를 포함하는 프라이머 혼합물(primer mixture)
4. 사람의 전립선 세포 시료가 표적의 핵산 분자를 발현하는지를 측정하는 단계를 포함하는 전립선암을 검출하는 방법으로서,

   상기 표적 핵산 분자는 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 그룹으로부 터 선택된 핵산 서열을 포함하는 유전자 또는 RNA 서열, 또는 길이로 20개 이상의 뉴클레오티드의 크기를 갖는 상기 유전자 또는 RNA의 절편의 서열, 또는 상기 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서,

   특이적으로 하이브리드(hybridize)되는 핵산 서열을 사용하여 상기 표적 핵산 분자의 발현을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서,

   증폭을 일으키는 프라이머를 사용하여 상기 표적 핵산 분자의 발현을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 5 항에 있어서,

   상기 표적 핵산 분자의 발현은 상기 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드 분석에 의해서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서,

   상기 분석은 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합된 모노클로날 항체(monoclonal antibody) 또는 절편의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서,

   상기 분석은 ELISA 또는 경쟁적 결합 분석(competitive binding assay)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. (i) 서열번호 1 내지 서열번호 23 중 어느 하나에서 90% 이상의 서열 상동성(sequence identity)을 갖는 핵산 서열에 의해서 코딩된 항원;

    (ii) 서열번호 1 내지 서열번호 23 중 어느 하나에서 90% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 단백질로부터 유래된 항원; 및

    (iii) (i) 또는 (ii)의 항원 절편으로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 사람의 전립선암 세포에 의해서 발현되는 것을 특징으로 하는 항원.
11. (i) 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 그룹으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 코딩된 아미노산 서열;

    (ii) 서열번호 1 내지 서열번호 23으로부터 유래된 아미노산 서열; 또는

    (iii) (i) 또는 (ii)의 항원 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선 항원.
12. (i) 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 유전자 또는 RNA의 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해서 코딩된 폴리펩티드, 또는 길이로 20개 이상의 뉴클레오티드의 크기를 갖는 상기 유전자 또는 RNA의 절편에 의해서 코딩된 폴리펩티드, 또는 서열번호 1 내지 서열번호 23으로부터 유래된 폴리펩티드;

    (ii) 제 10 항 또는 제 11 항에 따른 항원; 및

    (iii) (i) 또는 (ii)의 항원 절편으로부터 선택된 표적의 폴리펩티드 분자에 특이적으로 결합되는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 절편.
13. 제 11 항의 항원에 특이적으로 결합되는 모노클로날 항체 또는 이의 절편.
14. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,

    검출가능한 레이블(label)에 직접 또는 간접적으로 부착되는 것을 특징으로 하는 항원.
15. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,

    검출가능한 레이블에 직접 또는 간접적으로 부착되는 것을 특징으로 하는 항체.
16. 제 1 항에 따른 핵산(예컨대, DNA) 및 검출가능한 레이블을 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암의 검출을 위한 진단 키트(diagnostic kit).
17. 제 3 항에 따른 프라이머 및 진단에 허용가능한 담체(diagnostically acceptable carrier)를 포함하는 전립선암의 검출을 위한 진단 키트.
18. 제 12 항 또는 제 13 항에 따른 모노클로날 항체 및 검출가능한 레이블을 포함하는 전립선암의 검출을 위한 진단 키트.
19. 전립선암을 치료하는 방법으로서,

    피험체(subject)에 치료적 유효량의 리간드를 투여하는 단계를 포함하며,

    상기 리간드는 (i) 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 유전자 또는 RNA, 이의 변이체, 또는 길이로 20개 이상의 뉴클레오티드의 크기를 갖는 상기 유전자 또는 RNA의 절편; 및 (ii) 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 유전자 또는 RNA, 이의 변이체, 또는 길이로 20개 이상의 뉴클레오티드의 크기를 갖는 상기 유전자 또는 RNA의 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 서열번호 1 내지 서열번호 23으로부터 유래된 폴리펩티드로부터 선택된 표적 분자에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 19 항에 있어서,

    상기 리간드는 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 그룹으로부터 선택된 DNA 서열을 갖는 유전자, 또는 절편, 또는 이의 변이체, 또는 서열번호 1 내지 서열번호 23으로부터 유래된 폴리펩티드의 발현을 저해하는 리보자임 또는 안티센 스(antisense) 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,

    상기 리간드는 이펙터 부분(effector moiety)에 직접 또는 간접적으로 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 21 항에 있어서,

    상기 이펙터 부분은 치료적 라디오레이블(radiolabel), 효소(enzyme), 세포독소(cytotoxin), 성장 인자(growth factor) 또는 약물(drug)인 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 10 항 또는 제 11 항에 따른 치료적 유효량의 항원, 및 선택적으로 상기 항원에 대한 체액 또는 세포독성 T-임파구 반응을 유도하는 보조제를 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암의 치료 방법.
24. 세포에 존재하는 항원의 치료적 유효량을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암의 치료 방법.
25. 제 24 항에 있어서,

    세포에 존재하는 항원은 수지상 세포(dendritic cell)인 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 25 항에 있어서,

    상기 수지상 세포(i)는 제 10 항 또는 제 11 항에서 유래된 펩티드로 펄스되거나 또는 부하되고 세포 백신(cellular vaccine)으로 사용되어 상기 펩티드에 대한 T 세포 면역을 자극하여 종양(tumor)에 대항하거나, 또는 (ii)는 제 10 항 또는 제 11 항에서 유래된 펩티드를 코딩하는 발현 구조물(expression construct)에 의해 변형되고 세포 백신으로 사용되어 펩티드에 대한 T 세포 면역을 자극하여 종양에 대항하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 24 항에 있어서,

    제2 또는 다수의 종양-결합 HLA-제한 펩티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 치료적 유효량의 리간드를 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 전립선암의 치료 방법으로서,

    상기 리간드는 치료적 이펙터 부분에 선택적으로 직접 또는 간접적으로 부착된 서열번호 1 내지 서열번호 23으로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 유전자 또는 RNA 또는 절편 또는 이의 변이체에 의해서 코딩된 단백질에 특이적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 28 항에 있어서,

    상기 이펙터 부분은 라디오레이블, 효소, 세포독성, 성장 인자 또는 약물인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 29 항에 있어서,

    상기 라디오레이블은 이트륨인 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 29 항에 있어서,

    상기 라디오레이블은 인듐인 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 28 항에 있어서,

    상기 리간드는 모노클로날 항체 또는 이의 절편인 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 28 항에 있어서,

    상기 리간드는 작은 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 28 항에 있어서,

    상기 리간드는 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 28 항에 있어서,

    상기 리간드는 상기 단백질의 세포외 영역을 결합하는 하는 것을 특징으로 하는 방법.
36. (i) 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 유전자 또는 RNA에 의해 코딩되는 단백질의 세포외 영역의 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및

    (ii) (i)의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분자(molecule).
37. 제 36 항에 있어서,

    상기 폴리펩티드는 길이로 8개 내지 100개의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
38. 생물학적 활성 화합물을 선택(selecting), 동정(identifying), 스크리닝(screening), 특징화(characterizing) 또는 최적화(optimizing)하는 방법으로서,

    후보 화합물을 표적 분자와 접촉시키는 단계와 상기 후보 화합물이 상기 표적 분자를 결합하는지를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 표적 분자는 (i) 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 구성된 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 유 전자 또는 RNA의 서열을 포함하는 핵산 분자, (ii) 길이로 20개 이상의 뉴클레오티드의 크기를 갖는 상기 유전자 또는 RNA의 절편, 및 (iii) (i) 또는 (ii)에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 서열번호 1 내지 서열번호 23으로부터 유래된 폴리펩티드로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.