CN102445545B - 融合有v5标签重组蛋白的elisa定量检测试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种融合有V5标签重组蛋白的ELISA检测试剂盒和方法，该方法用待测样品对抗-V5单克隆抗体进行稀释，得混合液，抗-V5单克隆抗体的工作浓度为：1∶500-64000；在包被有V5多肽的微孔板中每孔加入100μl上述混合液，孵育；所述微孔板每孔包被V5多肽100μL，V5多肽的浓度为0.015μg/mL-2μg/mL 0.25μg/mL；清洗；检测OD值。所述ELISA方法的具有快速、简便、能准确的定量的优点，所述试剂盒检测范围可达：0.1～2.0ng。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体是涉及一种融合有V5标签重组蛋白的ELISA定量检测试剂盒和方法。
背景技术
目前，在重组蛋白的表达中，为了便于重组蛋白的鉴定分析，常常在蛋白中融合一个“蛋白标签”，如：6×His tag、V5 tag、GFP tag、GST tag、flagtag、c-myc tag等。在常见的真核表达载体中，常用的标签有：6×His tag、V5tag和GFP tag。与6×组氨酸标签相比，V5 tags在真核蛋白的鉴定分析中具有更好的特异性，由于只有14个氨基酸，V5标签的插入几乎对重组蛋白的结构没有影响。
标签多肽的使用使本领域的技术人员可以应用商品化的标签抗体快速地鉴定出外源蛋白的表达情况。到目前为止，标签蛋白及其抗体大多使用在对目的蛋白的定性分析中，很少用于对目的蛋白的定量分析。本发明建立了一种对溶液中融合有V5标签重组蛋白的通用、快速、简便、准确的定量方法，并且提供了应用本检测方法测定目的蛋白的一套试剂系统；与较多使用的“双抗夹心法”相比，“竞争法”只用一种商业化抗便可完成对目的蛋白的定量分析。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种融合有V5标签重组蛋白的ELISA定量检测试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下：
一种融有V5标签蛋白的ELISA定量检测试剂盒，其包括有：
(A)包被有V5多肽的微孔板，每个微孔包被100μL的V5多肽，V5多肽的浓度为0.015μg/mL-2μg/mL；
(B)1mg/mL的抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度的稀释比例为：1∶500-64000，用量为每微孔100μL。
本发明的另一目的是提供一种融有V5标签的蛋白的ELISA检测方法。
实现上述目的的技术方案如下：
一种融有V5标签的蛋白的检测方法，包括以下步骤：
(1)用待测样品对抗-V5多肽单克隆抗体进行稀释，得混合液，抗-V5多肽单克隆抗体(1mg/mL)的稀释比例为：1∶500-64000；混合液4℃孵育过夜；
(2)在包被有V5多肽的微孔板中每孔加入100μL上述混合液，37℃孵育0.8-1.2小时；所述微孔板每孔包被V5多肽100μL，V5多肽的浓度范围为0.015μg/mL-2μg/mL；
(3)清洗，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗体，37℃孵育；清洗后加入TMB底物溶液显色；
(4)于各反应孔中加入终止液反应，在酶标仪450nm波长下检测OD值。
优选地，所述V5多肽的浓度为0.125μg/mL-0.5μg/mL，最优选为0.25μg/mL；所述抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度为0.25-1μg/mL，最优选的工作浓度为0.5μg/mL。
本发明的有益效果如下：
(1)与“双抗夹心法”相比，仅使用V5多肽标准品及其商品化抗体便可实现对液体中目的蛋白的精确定量，无须使用目的蛋白的特异性抗体；
(2)原材料使用少，该方法中商品化多肽及其抗体的使用量较低，如：V5多肽包被浓度为0.25μg/mL，V5单抗的使用浓度为0.5μg/mL，对于重组蛋白的定量分析，使用2.5μg的多肽抗体，便可对约80个样品进行定量分析，试剂盒组装成本低；
(3)分析了细胞上清中其它蛋白成分(FBS)对该检测方法准确性的影响，发现不同倍数稀释的FBS对标准曲线的建立无影响，重组蛋白所在溶剂中的FBS对V5多肽与其抗体的免疫结合无影响，同时也说明应用V5标签进行免疫反应的特异性较好，这一实验证明该方法对V5融合蛋白定量分析的准确性和可靠性；
(5)可以分析溶液中低至0.15ng/mL的目的蛋白，可以用于定量分析微量表达的融合蛋白；该试剂盒的检测范围是：0.1～2.0ng/mL，线性范围足以检测细胞表达上清中目的蛋白的含量。
附图说明
图1“棋盘滴定”法确定最佳的抗原抗体用量；
图2血清对标准曲线干扰的分析；
图3不同样品稀释倍数下的ELISA标准曲线；
图4ELISA标准曲线。
具体实施方式
本发明中所用到的包被缓冲液、清洗液、酶标反应板、封闭液、TMB底物、羊抗鼠IgG-HRP抗体等是本领域中ELISA法公知的试剂。可购买也可以自己配制。
实施例1
一、方法与步骤
1.应用“棋盘滴定”法确定抗原与抗体使用浓度
(1)将已精确定量的干粉状态的V5多肽(GKPIPNPLLGLDST，Sigma公司产品)稀释为4mg/mL，再用包被液(包被缓冲液)将浓度为4mg/mL的V5多肽液稀释为：2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL，0.125μg/mL，0.062μg/mL，0.03μg/mL，0.015μg/mL，共8个浓度梯度，每孔100μL横向加于酶标反应板中，4℃包被过夜；
(2)倾去包被缓冲液，用清洗液清洗3次，加入100μL含5％BSA的PBST溶液(封闭液)，37℃封闭1小时；
(3)倾去封闭液，用清洗液再次清洗2次；将Anti-V5 monoclonal antibody(抗V5多肽单克隆抗体，浓度为1mg/mL，Sigma公司产品)用PBST稀释为：1/500，1/1000，1/2000，1/4000，1/8000，1/16000，1/32000，1/64000，共8个浓度，每孔100μL纵向加于酶标反应板中，37℃孵育1小时；
(4)清洗液洗涤三次，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗体100μL，37℃孵育1小时；
(5)清洗液洗涤三次，于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μL，室温孵育10～20分钟；
(6)终止反应，于各反应孔中加入2mo l/L H2SO450μL(终止液)；在酶标仪450nm波长下检测吸光度OD值，打印结果；
(7)选择各行OD 450为1.0左右时V5多肽与anti-V5 antibody的稀释倍数做竞争ELISA，取半数抑制(IC50)最低的V5多肽与anti-V5 antibody的稀释倍数为其最佳工作参数。
2.对分泌蛋白的定量分析步骤建立
(1)“竞争ELISA”标准曲线的建立
用倍比稀释的标准样品(V5多肽)绘制竞争ELISA的可测量的线性范围；同时分析FBS是否影响定量结果，做了以下分析：
a.分析“棋盘滴定”数据，根据技术人员的积累的经验，确定一个最佳的抗原(V5多肽，最佳值为0.25μg/mL)和最适的抗体浓度(Anti-V5monoclonalantibody，0.5μg/mL)。适量稀释4mg/mL的V5多肽至0.25μg/mL，按每孔100μL滴加于酶标板中，4℃包被过夜；同时用含有不同含量的对照溶剂(即含有10％FBS的细胞培养基或蛋白透析液，用PBS稀释为：1/25，1/50，1/100，1/200，1/400)对ant i-V5monoclonal antibody进行2000倍稀释，分别用以上溶液稀释V5多肽标准品，至浓度为(16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL)，形成V5-anti-V5antibody混和液。一个浓度的对照溶剂对应两个重复的标准品，4℃预孵育过夜(方法如图1所示)；
b.清洗液(PBST)清洗3次，100μL封闭液37℃封闭1小时；
c.充分清洗后，将a.中“V5-anti-V5 antibody混和液”按每孔100μL加于酶标反应板中，37℃孵育1小时；
d.清洗液清洗三次，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗体100μL，37℃孵育1小时；清洗三次后，加入TMB底物溶液100μL，显色；
e.于各反应孔中加入2mo l/L H2SO4(终止液)50μL终止反应，在酶标仪450nm波长下检测OD值，记录结果。以结合率B/B0(％)为纵坐标(B是V5多肽不同标准浓度的OD450，B0是不加V5多肽的OD450)，以不同浓度V5多肽的值为横坐标，绘制标准抑制曲线，进行相关回归分析，计算出相关系数。
(2)竞争性ELISA对分泌蛋白的定量
根据上述分析，确定一个最佳的V5抗原和V5抗体的包被浓度，确定一个最佳的样品稀释倍数或稀释范围-25，50，100，200，400倍稀释样品，根据上述操作步骤绘制标准曲线的线性范围确定融合有V5标签重组蛋白的浓度值。Office Excel 2003分析结果。
二、结果分析与应用
1.最适抗原包被量与最适抗体浓度
通过“棋盘滴定”法确定最适的抗原包被量与液相中抗体的稀释倍数。不同浓度包被抗原(V5多肽)与不同稀释倍数抗体的组合所测OD值如表1。取半数抑制(IC50)最低的V5多肽与anti-V5 antibody的稀释倍数为其最佳工作参数，根据表中数据分布，本试验选择OD450＝1.815处对应的抗原抗体稀释值作为最佳参数(优选的参数)：V5多肽包被浓度为0.25μg/mL，anti-V5 antibody稀释倍数为2000(浓度为0.5μg/mL)。
表1“棋盘滴定”法确定最佳的抗原包被量与抗体稀释倍数*
*注：灰色背景区域为OD 450下的吸光度读数。
2.建立竞争性ELISA标准曲线
确定抗原抗体最佳工作参数后，应用倍比稀释的V5多肽标准品绘制标准曲线，由于诱导表达的上清中常常含有2-10％的FBS，为了排除血清中未知成分对结果的干扰，我们对对照溶剂(含10％的细胞培养上清)的干扰作用进行了分析，如表2所示。
表2竞争ELISA标准曲线的建立*
*注：灰色背景区域为OD450下的吸光度读数。
通过对标准品与不同倍数稀释的阴性对照上清的组合，发现该竞争ELISA受上清中FBS的影响不大，如图2(图中，1/25，1/50，1/100，1/200，1/400分别是对照样品的稀释倍数)，各抑制曲线几乎重合或平行，这说明，为了样品分析的结果落在标准曲线的线性范围之内，可以以不同倍数稀释样品而忽略其中血清成分的影响。
如图3(1/25，1/50，1/100，1/200，1/400是阴性对照上清的稀释倍数，对应于样品的稀释倍数。纵坐标Y轴是结合率B/B0(％)(B是V5多肽不同标准浓度的OD450，B0是不加V5多肽的OD 450)，横坐标X轴为不同浓度V5多肽)所示，上清中标准V5多肽的浓度超过2ng/mL时，曲线进入平台期，抗原抗体的结合率基本无变化，因此，在标准曲线绘制时，去掉V5多肽浓度超过2ng/mL的参数。另外，根据多次分析结果，排除样品稀释400倍的情况。绘制标准曲线如图4，四种稀释方式得出线性方程的相关系数为：R2＞0.94，按照100和200
稀释方式，二者的线性回归方程相同：y＝-32.658x+72.391。优化得到的最佳的含有V5标签的蛋白的ELISA定量检测试剂盒的主要有：
(A)包被有V5多肽的微孔板，每个微孔包被的V5多肽的量为100μL，V5多肽的浓度为0.25μg/mL；
(B)抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度为：0.5μg/mL，用量为每微孔100μL。
实施例2
应用1：293T细胞培养上清中猪干扰素α的定量分析
应用最优化的竞争性ELISA定量检测试剂盒(如实施例1所述)对收集的293T细胞培养上清中猪干扰素α(融合有V5标签)进行定量检测，检测方法如实施例1所述。为了避免因抗原抗体的稀释及反应条件不完全一致等因素引起的随机误差，每次定量均做标准曲线，液相中标准品的浓度从大到小依次为：2ng/mL，1ng/mL，0.5ng/mL，0.25ng/mL和0.125ng/mL；待测上清的系列稀释分数：1/25，1/50，1/100，1/200，1/400。根据标准品和样品的线性关系，确定样品对应的浓度。由于抗原抗体的结合量取决于参与反应的分子数，因此，需参考标准品和样品的分子量确定样品中实际的猪干扰素质量百分比浓度，公式为：
标准曲线图4所示(纵坐标Y轴是结合率B/B0(％)(B是V5多肽不同标准浓度的OD 450，B0是不加V5 peptide多肽的OD 450)，横坐标X轴为不同浓度V5多肽)。
根据以上方法所测上清中猪干扰素α的浓度为：1.34μg/mL。将所测上清冻干后用冻干前体积1/5、1/10和1/20的PBS溶解，SDS-PAGE胶电泳，将目的条带与设置的BSA标准品对比，换算后结果(1.25μg/mL)与ELISA法测得的蛋白浓度基本一致。
实施例4：293T细胞细胞裂解液中猪干扰素γ的定量分析
本实施例所述含有V5标签的蛋白的ELISA检测试剂盒的主要有：
(A)包被有V5多肽的微孔板，每个微孔包被的V5多肽的量为100mL，V5多肽的浓度为0.25μg/mL；(包被有V5多肽的微孔板的制备：V5多肽0.25μg/mL，按每孔100μL滴加于酶标板中，4℃包被过夜，清洗液(PBST)清洗3次，100μL封闭液37℃封闭1小时)
(B)抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度为：0.5μg/mL，用量为每微孔100μL。
检测方法为：
(1)用1/50，1/100，1/200稀释的待测样品(293T细胞细胞裂解液，含融合有V5标签猪干扰素γ)与抗-V5多肽单克隆抗体进行混合，抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度为：0.5μg/mL；混合液4℃预孵育过夜；
(2)在包被有V5多肽的微孔板中每孔加入100μL上述混合液，37℃孵育1小时；
(3)按常规方法，清洗液清洗三次，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗体100μL，37℃孵育1小时；清洗三次后，加入TMB底物溶液100μL，显色；
(4)于各反应孔中加入2mol/L H2SO450μL终止反应，在酶标仪450nm波长下检测OD值，
(5)根据保准曲线，确定融合有V5标签重组蛋白猪干扰素γ的浓度值，最终测得猪干扰素γ的浓度为31.3μg/mL。将所测裂解液原液、1/2和1/4稀释液(PBS稀释)进行SDS-PAGE胶电泳，将目的条带与设置的BSA标准品对比，换算后结果(29.5μg/mL)与ELISA法测得的蛋白浓度基本一致。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (7)
1.一种融有V5标签蛋白的ELISA定量检测试剂盒，其特征是，包括有：
(A)包被有V5多肽的微孔板，每个微孔包被100μL的V5多肽，V5多肽的浓度为0.015μg/mL-2μg/mL；
(B)1mg/mL的抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度的稀释比例为：1∶500-64000，用量为每微孔100μL。
2.根据权利要求1所述的融有V5标签的蛋白的ELISA定量检测试剂盒，其特征是，所述V5多肽的包被浓度为0.125μg/mL-0.5μg/mL，所述抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度为0.25-1μg/mL。
3.根据权利要求2所述的融有V5标签的蛋白的ELISA定量检测试剂盒，其特征是，所述V5多肽的包被浓度为0.25μg/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的融有V5标签的蛋白的ELISA定量检测试剂盒，其特征是，所述抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度为0.5μg/mL。
5.一种融有V5标签的蛋白的检测方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)用待测样品对抗-V5多肽单克隆抗体进行稀释，得混合液，1mg/mL的抗-V5多肽单克隆抗体稀释比例为：1∶500-64000；混合液4℃预孵育过夜；
(2)在包被有V5多肽的微孔板中每孔加入100μL上述混合液，37℃孵育0.8-1.2小时；所述微孔板每孔包被V5多肽100μL，V5多肽的浓度为：0.015μg/mL-2μg/mL；
(3)清洗，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗体，37℃孵育；清洗后加入TMB底物溶液显色；
(4)于各反应孔中加入终止液反应，在酶标仪450nm波长下检测OD值。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是，所述V5多肽的包被浓度为0.25μg/mL。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是，所述抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度为0.5μg/mL。
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